CN104611254A

CN104611254A - 多粘芽胞杆菌kn-03及其培养方法和用途

Info

Publication number: CN104611254A
Application number: CN201410777999.0A
Authority: CN
Inventors: 周莉; 余娜; 邹维; 李青; 程治国; 刘华梅; 唐纬坤; 杨克华; 王晓辉; 姚金伍; 胡虓; 孙刚忠; 刘荷梅; 向东; 万俊
Original assignee: WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2014-12-15
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2034-12-15
Also published as: CN104611254B

Abstract

本发明公开了一种能同时防治多种作物病害的多粘芽胞杆菌(BaciIllus polymyxa)KN-03，保藏编号为CCTCC NO:M2012077，本发明还公开了所述多粘芽胞杆菌的培养方法和用途。本发明公开的多粘芽胞杆菌不仅能同时有效防治作物青枯病、枯萎病、黄萎病、核盘病、全蚀病、赤霉病、早疫病、灰霉病和炭疽病，而且具有很强的产胞能力，其发酵液的芽胞数能达到30亿cfu/ml，同时还具有明显的促生长作用，能显著提高作物产量。

Description

多粘芽胞杆菌KN-03及其培养方法和用途

技术领域

本发明涉及一种多粘芽胞杆菌及其培养方法和用途。

背景技术

植物青枯病和枯萎病素有植物“癌症”之称，是危害最大、损失最重、分布最广的世界性土传病害，目前国内外尚无能同时防治青枯病、枯萎病等细菌性和真菌性土传病害的有效农药，更没有可同时防治青枯病、枯萎病等细菌性和真菌性土传病害及叶部病害的微生物杀菌剂。例如：CN101712941A公开的多粘芽胞杆菌只可用于防治植物青枯病。CN102851243A公开的多粘芽胞杆菌可用于制备广谱性抑制病原真菌和病原细菌的生防制剂，所述病原真菌为苹果轮纹病菌、棉花黄萎病菌、桃褐腐病菌、小麦纹枯病菌、百合基腐病菌和甘蓝枯萎病菌；所述病原细菌为黄瓜角斑病菌和桃冠瘿病菌；所述植物真菌病害为枯萎病。CN102851250A公开的多粘芽胞杆菌只能有效防治烟草黑胫病。

另外，现有的多粘芽胞杆菌产芽胞能力很差，造成细菌生产效率低、周期长，成本高，从而限制了它的应用。例如：CN101869181A公开的一种1千亿活芽胞每克多粘芽胞杆菌原粉的制备方法，其发酵液芽胞数仅为20亿cfu/ml，发酵过程中即使补充碳源和氮源，发酵液的芽胞数也只能达到25亿cfu/ml。

发明内容

本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种能同时防治多种作物病害的多粘芽胞杆菌，本发明还提供所述多粘芽胞杆菌的培养方法和用途。

本发明所提供的多粘芽胞杆菌(BaciIllus polymyxa)KN-03，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO.M2012077。

本发明进一步提供所述多粘芽胞杆菌的培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)菌种活化：挑取一环多粘芽胞杆菌KN-03于斜面培养基上，将接种好的斜面置于30℃温控培养箱中培养72h；

(2)种子培养：取步骤(1)活化的多粘芽胞杆菌KN-03一环接种于种子培养基中，将接种好的种子培养液在温度为30℃、转速为150rpm的条件下培养14-18h；

(3)发酵培养：将培养好的种子液接入发酵培养基中，在温度为30℃、转速为150rpm的条件下培养60h，得到多粘芽胞杆菌KN-03发酵液，

所述斜面培养基的成份是：葡萄糖20g，去皮土豆200g,琼脂粉15g，定容至1L，pH7.0；

所述种子培养基的成份是：蔗糖5-15g/l、酵母抽提物5-20g/l、大米粉8-16g/l、玉米粉5-20g/l、麸皮10-30g/l、氯化钙0.1-1g/l、氯化锰0.09-1g/l、硫酸镁3-10g/l，pH7.2-7.5；

所述发酵培养基的成份是：蔗糖25-50g/l、酵母抽提物3-10g/l、大米粉8-16g/l、玉米粉12-20g/l、麸皮8-20g/l、玉米浆10-20g/l、豆粕6-15g/l、玉米浆10-20g/l、氯化钙0.1-1g/l、氯化锰0.09-1g/l、硫酸镁3-10g/l，pH7.2-7.5。

室内抑菌活力测定结果表明：本发明所提供的多粘芽胞杆菌KN-03对番茄青枯病菌、辣椒枯萎病菌、水稻黄萎病菌、玉米全蚀病菌、油菜核盘病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和黄瓜炭疽病菌有明显地抑制效果。

室内毒力测定结果表明：10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂对姜青枯病菌和西瓜枯萎病菌表现出了较高的抑制作用。对姜青枯病菌的最小抑制浓度为5mg/L，效果优于蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂；对西瓜枯萎病菌的EC50为16.8772mg/L，EC90为69.9283mg/L，效果优于枯草芽胞杆菌可湿性粉剂。

田间效果试验表明：本发明所提供的多粘芽胞杆菌KN-03菌剂能有效预防草莓青枯病和西瓜枯萎病的发生，且增产效果明显，对草莓的增产率达到18.40％，对西瓜的增产率达到137％。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的多粘芽胞杆菌能同时有效防治作物多种细菌性和真菌性土传病害及叶部病害，包括青枯病、枯萎病、黄萎病、核盘病、全蚀病、赤霉病、早疫病、灰霉病和炭疽病，而且防治效果优于其它微生物杀菌剂。

2.本发明提供的多粘芽胞杆菌繁殖能力强，具有很强的产胞能力，结合本发明所提供的培养方法，在不需要补充碳源和氮源的前提下，发酵液的芽胞数就能达到30亿cfu/ml，而且发酵周期短、生产成本低，处于国内领先水平。

3.本发明提供的多粘芽胞杆菌不仅能防治作物病害，还具有明显的促生长作用，能显著提高作物产量。

附图说明

图1：多粘芽胞杆菌KN-03对番茄青枯病菌的抑菌活力测定结果。

图2：多粘芽胞杆菌KN-03对辣椒枯萎病菌的抑菌活力测定结果。

图3：多粘芽胞杆菌KN-03对水稻黄萎病菌的抑菌活力测定结果。

图4：多粘芽胞杆菌KN-03对玉米全蚀病菌的抑菌活力测定结果。

图5：多粘芽胞杆菌KN-03对油菜核盘病菌的抑菌活力测定结果。

图6：多粘芽胞杆菌KN-03对小麦赤霉病菌的抑菌活力测定结果。

图7：多粘芽胞杆菌KN-03对番茄灰霉病菌的抑菌活力测定结果。

图8：多粘芽胞杆菌KN-03对番茄早疫病菌的抑菌活力测定结果。

图9：多粘芽胞杆菌KN-03对黄瓜炭疽病菌的抑菌活力测定结果。

具体实施方式

下面将通过实施例更详细地说明本发明。

实施例1多粘芽胞杆菌KN-03的筛选

1.菌种的热处理筛选：

称取土壤样品(山东番茄种植示范基地的土样)1.0g装入小三角瓶中，加入9mL灭菌的PDA培养液(葡萄糖20g，去皮土豆200g(用自来水煮沸30min),琼脂粉15g，定容至1L，pH7.0)。在温度30℃与220rpm的恒温摇床上培养3天后，于水浴锅中80℃水浴30min。充分振荡后静置，取上清液做浓度梯度稀释。用移液枪吸取稀释液100ul均匀涂布在PDA营养琼脂培养基上(成分同前，添加1.5％琼脂粉)，于30℃温控培养箱中培养3-5d后，挑取单菌落镜检,挑选出具有多粘芽胞杆菌形态特征的菌株，进行抑菌圈试验。

2.拮抗试验筛选生防菌株：

以细菌青枯假单胞菌(Pseudomanas solanacearum)为生测指示菌，在PDA营养琼脂培养基中以0.5％的菌浓加入指示菌，混匀后倒平板。用无菌牙签挑取步骤(1)筛选得到的菌株单菌落，点种于培养基上，于30℃温控培养箱中培养48h后取出，检查抑菌圈大小情况。综合试验结果后，挑选出抑菌圈大且具有多粘芽胞杆菌形态特征的菌株进行菌种保藏，作为备用菌株。

将步骤(2)筛选得到的备用菌种用API-50CHB进行菌种初步鉴定。最后，备用菌株进行发酵摇瓶实验，500mL摇瓶装量为30mL，摇床转速为200rpm，30℃摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵周期36小时以内)、生物量高的菌株作为目标菌株。

经过3d的培养后，平板上会出现明显的环状透明抑菌圈，各菌株的抑菌圈大小不一，经过反复试验，终于发现一株透明带宽约16.48mm的单菌落，挑取单菌落进行下一步验证试验。

3.平板抑菌能力的验证

挑取在步骤(2)得到的抑菌圈透明带最大的单菌落用无菌牙签点种于含有青枯假单胞菌的平板上；同时挑取其他抑菌稍小的两个单菌落进行对照试验，在30℃温控培养箱中培养48h后取出，检查抑菌圈大小情况。最终确认抑菌能力最强的菌株。

经过测定，平板上的环状透明抑菌圈可达16.52mm。

该菌株命名为多粘芽胞杆菌KN-03(BaciIllus polymyxa KN-03)，于2012年3月13日在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2012077。

4.菌种鉴定

(1)菌种16SrDNA序列鉴定

对步骤(3)中筛选得到的菌株进行了形态和生理生化特征研究，根据该菌株在Genebank中的16SrDNA序列进行分子分类。该菌株的16SrDNA共测定1424个有效碱基，系统发育资料及分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定该菌株为多粘芽胞杆菌。

(2)所述多粘芽胞杆菌(BaciIllus polymyxa)KN-03具有如下特征：

菌体形态特征：杆状，有荚膜，鞭毛侧生或周生。菌体大小为(0.6～0.8um)×(2.0～5.0um)；

芽胞形态特征：椭圆形芽胞使胞囊膨大，芽胞中生到端生。

菌落形态特征：在PDA平板上，菌落较小，白色、圆形、菌面稍凸，边缘整齐，表面有光泽、光滑、湿润、半透明。兼性厌氧。

生理生化特性：革兰氏染色阳性，接触酶、酪朊水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性；氧化酶、酪氨酸水解、脲酶、卵黄卵磷脂水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、甘油，且均产酸、产气。菌株在45℃条件下不生长，超过7％含量的氯化钠中不生长。

实施例2多粘芽胞杆菌KN-03的培养

(1)菌种活化：

制备含有下述成分的斜面培养基：葡萄糖20g，去皮土豆200g(用自来水煮沸30min),琼脂粉15g，定容至1L，pH7.0；

挑取一环多粘芽胞杆菌KN-03于所述斜面培养基上，将接种好的斜面置于30℃温控培养箱中培养72h。

(2)种子培养：

制备含有下述成分的种子培养基：蔗糖5-15g/l、酵母抽提物5-20g/l、大米粉8-16g/l、玉米粉5-20g/l、麸皮10-30g/l、氯化钙0.1-1g/l、氯化锰0.09-1g/l、硫酸镁3-10g/l，pH7.2-7.5；

取步骤(1)活化的多粘芽胞杆菌KN-03一环接种于所述的种子培养基中(500ml三角瓶中装入100ml液体种子培养基)，将接种好的种子培养液放在温度30℃与150rpm的条件下培养14-18h。

(3)发酵培养：

制备含有下述成分的发酵培养基：蔗糖25-50g/l、酵母抽提物3-10g/l、大米粉8-16g/l、玉米粉12-20g/l、麸皮8-20g/l、玉米浆10-20g/l、豆粕6-15g/l、玉米浆10-20g/l、氯化钙0.1-1g/l、氯化锰0.09-1g/l、硫酸镁3-10g/l，pH7.2-7.5；

将培养好的种子液取2滴接入上述发酵培养基中(500ml三角瓶中装入30ml发酵培养液)，在温度30℃与150rpm的条件下培养60h，得到多粘芽胞杆菌KN-03发酵液。

经测定，该发酵液的活芽胞数达到30亿CFU/ml。

实施例3多粘芽胞杆菌KN-03的室内抑菌活力测定试验

1.多粘芽胞杆菌KN-03对番茄青枯病菌、辣椒枯萎病菌、水稻黄萎病菌、玉米全蚀病菌和油菜核盘病菌的抑菌活力测定试验

试验步骤如下：

1)试验药剂：多粘芽胞杆菌KN-03粉剂。

2)药剂配置：将多粘芽胞杆菌KN-03粉剂直接用无菌水稀释至适宜浓度，设无药空白对照。

3)采用平板培养法进行测定：将稀释混匀后的药剂取0.1ml均匀涂布于灭菌PDA培养基平皿上。用接种针将青枯病菌划线涂布于含药的PDA平板上，设置空白对照。将培养好的病原菌(番茄青枯病菌、辣椒枯萎病菌、水稻黄萎病菌、玉米全蚀病菌和油菜核盘病菌)，在无菌条件下用灭菌打孔器自菌落边缘切取菌饼，用接种器将菌饼接种于含药平板中央，于适宜温度的培养箱中培养。

根据空白对照培养皿中菌的生长情况调查病原菌菌丝生长情况，再结合含药平板中菌的生长情况进行对比，观察其抑菌情况。

由图1-5可以看出，多粘芽胞杆菌KN-03对番茄青枯病菌、辣椒枯萎病菌、水稻黄萎病菌、玉米全蚀病菌和油菜核盘病菌有明显地抑制效果。番茄青枯病菌、辣椒枯萎病菌、水稻黄萎病菌、玉米全蚀病菌和油菜核盘病菌在含药平板上均不能正常生长，尤其是对番茄青枯病菌和油菜核盘病菌的抑制效果更为明显。

2.多粘芽胞杆菌KN-03对小麦赤霉病、番茄灰霉病、早疫病和黄瓜炭疽病的抑菌活力测定试验

试验步骤如下：

1)试验药剂：多粘芽胞杆菌KN-03发酵液上清液。

2)药剂配置：直接用无菌水稀释，设置5个稀释浓度，设无药空白对照。

试验方法参照《NYT1156.10-2008农药室内生物测定试验准则杀菌剂第二部分》进行。

3)采用平板培养法进行测定：试验药液用无菌水稀释200倍、400倍、600倍、800倍和1000倍。取6ml与定量的54ml灭菌PDA培养基均匀混合，分别均匀倒入4个灭菌培养基，冷却后制得含药平板。

将培养好的病原菌(小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和黄瓜炭疽病菌)，在无菌条件下用灭菌打孔器自菌落边缘切取菌饼，用接种器将菌饼接种于含药平板中央，菌丝面朝上，盖上皿盖，于适宜温度的培养箱中培养。

根据空白对照培养皿中菌的生长情况调查病原菌菌丝生长情况，用卡尺测量菌落直径，每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各一次，取其平均值。根据调查结果，计算各浓度对供试靶标菌的菌丝生长抑制率。

试验结果

表1 多粘芽胞杆菌KN-03对小麦赤霉病菌的抑菌活力测定结果

稀释倍数	2000×	4000×	6000×	8000×	10000×	空白对照
							药剂(cm)	0	0	0	0	0	4.8
抑制率(％)	100	100	100	100	100	—

表2 多粘芽胞杆菌KN-03对番茄灰霉病菌的抑菌活力测定结果

稀释倍数	2000×	4000×	6000×	8000×	10000×	空白对照
							药剂(cm)	0	0	0	0	0	5.2
抑制率(％)	100	100	100	100	100	—

表3 多粘芽胞杆菌KN-03对番茄早疫病菌的抑菌活力测定结果

稀释倍数	2000×	4000×	6000×	8000×	10000×	空白对照
							药剂(cm)	0.7	0.8	0.7	1.1	1.1	4.5
抑制率(％)	84.44	82.22	84.44	75.56	75.56	—

表4 多粘芽胞杆菌KN-03对黄瓜炭疽病菌的抑菌活力测定结果

由图6-9可以看出，多粘芽胞杆菌KN-03对小麦赤霉菌、番茄灰霉病、早疫病和黄瓜炭疽病菌有明显地抑制效果。表1-4中的试验数据显示，稀释2000倍、4000倍、6000倍、8000倍、10000倍的多粘芽胞杆菌KN-03(发酵液上清液)对小麦赤霉菌、番茄灰霉病和黄瓜炭疽病的抑制率均为100％；对番茄早疫病的抑制率在75.56％—84.44％之间。

实施例4多粘芽胞杆菌KN-03的室内毒力测定试验

1.多粘芽胞杆菌KN-03对姜青枯病菌的室内毒力测定试验

试验步骤如下：

(1)剂量设置：每个药剂用LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，pH7.2-7.4)稀释，按有效成分含量分别设6个剂量处理，设无药LB液体培养基空白对照；

(2)具体处理剂量为：10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂和8亿CFU/克蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂1、2、5、10、20、40mg/L；每个浓度处理重复4次；

(3)采用平板培养法进行测定：姜青枯病菌菌悬液用无菌水稀释100倍，取6ml与定量的54ml灭菌LB培养基均匀混合，分别均匀倒入4个灭菌培养皿中，冷却后制得菌平板；

在平板上中心处打孔，将上述浓度的待测药剂于25℃、190rpm的条件下振荡活化24h后注入孔内，每孔约75ul，每个处理重复4次，以注入LB液体培养基处理为对照。

(4)将平板置于25℃的恒温培养箱中培养24h后，测定每个处理组的药剂菌落宽度以及抑菌圈宽度，求出平均值并观察最小抑制浓度。

结果见表5-7。

表5 10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂对姜青枯病菌的毒力测定结果

表6 8亿CFU/克蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂对姜青枯病菌的毒力测定结果

表7 10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03、8亿CFU/克蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂对姜青枯病菌的抑菌圈宽度(mm)结果分析表

药剂浓度(mg/L)

1

2

5

10

20

40

多粘芽胞杆菌

0a A

1.00a A

5.25a A

11.75a A

18.25a A

蜡质芽胞杆菌

0a A

0.75a A

5.00a A

10.00a A

17.75a A

由表5-7中数据可知，10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂对姜青枯病菌表现出了较高的抑制作用。10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂、8亿CFU/克蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂对姜青枯病的最小抑制浓度均为5mg/L。从两药剂抑菌圈宽度来看，多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂对姜青枯病抑制效果总体上高于蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂。

2.多粘芽胞杆菌KN-03对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定试验

试验步骤如下：

1)剂量设置：每个药剂用LB液体培养基稀释，按有效成分含量分别设6个剂量处理，设无药LB液体培养基空白对照；

具体处理剂量为：10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂5、10、20、40、80mg/L；10亿CFU/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂10、20、40、80、120mg/L；每个浓度处理重复4次；

2)试验方法参照《NYT1156.10-2008农药室内生物测定试验准则杀菌剂》进行。采用菌丝生长速率法测定药剂对西瓜枯萎病菌的毒力。

具体方法：经转接活化的西瓜枯萎病菌菌株用PDA培养基培养，待菌落长至培养皿四分之三大小时，用内径为8mm的打孔器从边缘打孔，打成的菌丝块作为接种体。

分别取配好的浓度为上述设计浓度10倍的各处理药液6ml与定量的54ml灭菌PDA培养基均匀混合，分别均匀倒入4个灭菌培养皿中，冷却后制得含药平板，以无菌水与培养基混合为空白对照，每个处理设置4个重复组。

将接种菌丝倒置于平板中央，放入25℃恒温培养箱内培养。5天后用十字交叉法测量菌落直径，计算各处理净生长量、菌丝生长抑制率。

结果见表8-10。

表8 10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂对西瓜枯萎病菌的毒力测定结果

表9 10亿CFU/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对西瓜枯萎病菌的毒力测定结果

表10 10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03、10亿CFU/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对西瓜枯萎病菌的毒力测定结果分析表

供试药剂	b±SD	EC50(mg/L)95％置信限	EC90(mg/L)95％置信限
				多粘芽胞杆菌	2.0759±0.4592	16.8772(9.9828-36.7296)	69.9283(32.8499-217.5737)
枯草芽胞杆菌	1.8579±0.4417	33.7477(15.6827-122.0068)	165.2022(55.8098-1038.3296)

由表8-10中数据可知，10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂对西瓜枯萎病菌表现出了较高的毒力。10亿CFU/克多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂、10亿CFU/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对西瓜枯萎病菌的EC50分别为16.8772mg/L和33.7477mg/L，对西瓜枯萎病菌的EC90分别为69.9283mg/L和165.2022mg/L。多粘芽胞杆菌KN-03可湿性粉剂毒力总体上高于对照药剂枯草芽胞杆菌可湿性粉剂。

实施例5多粘芽胞杆菌KN-03的田间效果试验

(1)多粘芽胞杆菌KN-03制剂防治草莓青枯病田间试验

应用药剂：50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂。

施用地和对照地均为山东省郯城县草莓基地的大棚，草莓基地连年种植，重茬现象严重，灌溉方便，水源充足，管理良好。土壤pH在6.0-6.5，土壤类型为棕壤，肥力中等，试验地和对照地栽培品种、用肥用药和其它管理措施一致。

应用方法：移栽时第一次施用50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌菌剂300倍灌根，亩用量1000g；第二次施用在第一次用后30天，用600倍灌根，亩用量500g；第三次施用在第二次用后隔30天，再用600倍灌根，亩用量500g。

试验结果见表11-12。

表11 50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂防治草莓青枯病田间试验调查数据表

表12 50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂的草莓田间试验产量表

由表11、12中试验数据可知，50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂防治草莓青枯病，第一次药后30d病株率为0，第二次药后30d病株率为1.09％，第三次药后30d病株率为2.17％，青枯病发病率极低，能有效预防草莓青枯病的发生，增产效果明显，增产率达到18.40％。

(2)多粘芽胞杆菌KN-03制剂防治西瓜枯萎病田间试验

应用药剂：50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂。

应用地点：江西省余干县，面积1000亩西瓜田，土壤类型为黄棕壤，肥力中等，试验地和对照地栽培品种、用肥用药和其它管理措施一致。

应用方法：移栽时第一次施用50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂300倍灌根，亩用量1000g；第二次施用在第一次用后20天，用600倍灌根，亩用量500g；第三次施用在第二次用后隔20天，再用600倍灌根，亩用量500g。

试验结果见表13-14。

表13 50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂防治西瓜枯萎病田间试验调查数据表

处理	药剂	调查总株数	发病总株数	比病情指数％	防治效果％
						1	多粘芽胞杆菌制剂	50	10	0.09	88.4
2	对照	50	44	0.6881

表14 50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂的西瓜田间试验产量表

由表13、14中试验数据可知，50亿活芽胞/克多粘芽胞杆菌KN-03菌剂每亩2kg，分三次施用，可有效防治西瓜枯萎病，相对防效达80％以上，增产效果明显，达到137％。

Claims

1.一种防治作物病害的多粘芽胞杆菌(BaciIllus polymyxa)KN-03，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012077。

2.一种培养权利要求1所述多粘芽胞杆菌KN-03的方法，其特征在于包括以下步骤：

3.权利要求1所述的多粘芽胞杆菌KN-03在防治作物青枯病、枯萎病、黄萎病、核盘病、全蚀病、赤霉病、早疫病、灰霉病和炭疽病中的用途。

4.一种防治作物青枯病、枯萎病、黄萎病、核盘病、全蚀病、赤霉病、早疫病、灰霉病和炭疽病的生防制剂，含有权利要求1所述的多粘芽胞杆菌KN-03。