CN109796394A - 一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法 - Google Patents

一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109796394A
CN109796394A CN201811613035.7A CN201811613035A CN109796394A CN 109796394 A CN109796394 A CN 109796394A CN 201811613035 A CN201811613035 A CN 201811613035A CN 109796394 A CN109796394 A CN 109796394A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation liquid
auxin
paenibacillus polymyxa
extracting
methanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811613035.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109796394B (zh
Inventor
张晓明
李青
刘华梅
程治国
周莉
刘荷梅
孙刚忠
胡虓
马朋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd
Original Assignee
WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd filed Critical WUHAN KERNEL BIO-TECH Co Ltd
Priority to CN201811613035.7A priority Critical patent/CN109796394B/zh
Publication of CN109796394A publication Critical patent/CN109796394A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109796394B publication Critical patent/CN109796394B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法，它包括以下步骤：1)调节多粘类芽胞杆菌发酵液的pH为1‑4，微波加热后离心，2)取离心后的上清液，调节pH为6‑8，然后加入乙醚进行萃取；3)取乙醚萃取相，上SPE固相萃取小柱，先用甲醇、丙酮、水的混合溶剂进行洗脱，然后用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液，过0.22μM滤膜，将滤液冻干，即得。本发明提取的植物生长激素具有纯度高、产率大、工艺简单、能耗低、环境友好等优点，且对植物的生长具有正向调节作用。

Description

一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法
技术领域
本发明涉及一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物生长激素是由具分裂和增大活性的细胞区产生的调控植物生长方向的激素，在植物细胞分裂和分化、果实发育、根的形成和落叶过程中发挥了重要作用。最重要的天然存在的植物生长激素为吲哚乙酸，人工合成的还有芸苔素、细胞分裂素、赤霉素、萘乙酸钠、胺鲜酯(DA-6)等。目前主要采用化学合成或者从植物中提取的方法制备植物生长激素，其中化学合成法具有工艺复杂、能耗高、环境污染大等缺点，植物提取法具有纯度和收率低、效率低等缺点。
多粘类芽孢杆菌能防治多种由病原细菌、病原真菌、根结线虫引起的植物病害，是在农业生产中广泛应用的一种生防剂，目前已有研究表明多粘类芽孢杆菌发酵产物除了能帮助农作物抗病，还能在一定程度上促进农作物的增收，其中可能含有一定数量的植物生长激素，但目前尚未见利用多粘类芽孢杆菌制备植物生长激素的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法。
本发明提供的方法包括以下步骤：
1)调节多粘类芽胞杆菌发酵液的pH为1-4，微波加热2-10min后离心，所述微波功率为300-800W；
2)取离心后的上清液，调节pH为6-8，然后加入非极性有机溶剂进行萃取；
3)取有机萃取相，上SPE固相萃取小柱，先用甲醇、丙酮、水的混合溶剂进行洗脱，然后用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液，过微孔滤膜，将滤液冻干，即得。
优选地，步骤1)中，调节多粘类芽胞杆菌发酵液的pH为2，微波加热3min后离心，所述微波功率为560W。
优选地，所述非极性有机溶剂为乙醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、石油醚。
优选地，所述混合溶剂中，甲醇、丙酮的体积百分比均为1-5％。
优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.22μM。
本发明的有益效果是：
本发明首次从多粘类芽胞杆菌发酵液中通过提取获得高纯度的植物生长激素，与传统的化学合成法或植物提取法相比，本发明具有纯度高、产率大、工艺简单、能耗低、环境友好等优点。本发明提供的植物生长激素能够促进辣椒、黄瓜等多种作物的生长，说明其对植物的生长具有正向调节作用。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
用于提取植物生长激素的菌种来源于武汉科诺生物科技股份有限公司，命名为多粘类芽孢杆菌(BaciIllus polymyxa)KN-03，保藏编号为CCTCC NO:M 2012077，该菌种已在CN 104611254A的专利文献中公开，但本发明的实施例不局限于KN-03。
实施例1
步骤一：发酵液的制备
采用常规的方法制备多粘类芽孢杆菌发酵液，该方法包括菌种活化、种子培养、发酵培养等步骤，具体如下：
(1)将多粘类芽胞杆菌KN-03菌株在LB固体培养基上培养24小时，接种于5000mL种子培养基中，种子培养基配方为玉米粉3％；豆粕2.0％；酵母侵粉0.5％；氯化钠0.1％；磷酸二氢钾0.08％；余量为水，pH为7.0。121℃灭菌30分钟，接种后于30℃下培养18小时至对数期。
(2)取对数期菌株种子液转接于发酵培养基中，接种量4wt％，发酵培养基配方为:玉米粉3％；豆粕2.0％；酵母侵粉0.5％；氯化钠0.1％；磷酸二氢钾0.08％，余量为水，pH值7.0。121℃灭菌30分钟，冷却后接种，然后在30℃、140rpm条件下震荡培养140小时；培养完成后即得多粘类芽胞杆菌KN-03的发酵液。
步骤二：植物生长激素的提取
(1)取50mL发酵液，加盐酸调节pH为2.0，微波加热3min，微波功率为560W，然后超高速(30000rpm)离心30min使蛋白质等杂质沉淀；
(2)将上清取至新的50mL离心管中，加入氢氧化钠将上清pH调至7.0，然后加入2倍体积的乙醚进行萃取；
(3)将乙醚萃取相用SPE固相萃取小柱(Poly-Sery HLB SPE)进行进一步分离，首先用50％(体积)甲醇水溶液活化小柱，随后将发酵液加入活化后的小柱上，放入固相萃取仪器中，打开真空泵，控制流速在每秒0.5滴左右，先用甲醇、丙酮、水的混合溶剂(体积比为1:1:48)进行洗脱，以去除部分杂质，然后用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，过0.22μM微孔滤膜后冻干，得成品0.05g，进行检测。
实施例2
步骤一与实施例1相同。
步骤二：1)调节多粘类芽胞杆菌发酵液的pH为3.0，微波加热6min后离心，所述微波功率为350W；
2)取离心后的上清液，调节pH为8，然后加入氯仿进行萃取；
3)取氯仿萃取相，上SPE固相萃取小柱，先用甲醇、丙酮、水的混合溶剂(体积比为2.5:0.5:47)进行洗脱，然后用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液，过0.22μM微孔滤膜，将滤液冻干，即得。
实施例3
步骤一与实施例1相同。
步骤二：1)调节多粘类芽胞杆菌发酵液的pH为1.0，微波加热2min后离心，所述微波功率为750W；
2)取离心后的上清液，调节pH为6，然后加入乙酸乙酯进行萃取；
3)取乙酸乙酯萃取相，上SPE固相萃取小柱，先用甲醇、丙酮、水的混合溶剂(体积比为1.5:2.5:46)进行洗脱，然后用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液，过0.22μM微孔滤膜，将滤液冻干，即得。
将实施例1-3制得的产物进行液相-质谱检测，具体检测条件如下：
Aglient1290高效液相色谱仪(美国aglient公司)；色谱柱：poroshell 120SB-C18反相色谱柱(2.1×150,2.7μm)；柱温：30℃；流动相：A:B＝(甲醇/0.1％甲酸):(水/0.1％甲酸)；洗脱梯度；进样体积：2μL。
SCIEX-6500Qtrap(美国AB公司)；气帘气：15psi；喷雾电压：4500v；雾化气压力：65psi；辅助气压力：70psi；雾化温度：400℃，质子化或去质子化的反应监测条件见表1，各成品的含量检测数据见表2。
表1质子化或去质子化的反应监测条件([M+H]+or[M-H]-)
表2冻干产品中各种植物生长激素的含量
以上化学物质都是已知的几种植物生长激素，从检测结果可以看出，本发明能够获得高纯度的植物生长激素产品，总含量达到90％以上。
实施例2
为进一步验证产品对作物生长的调节作用，我们进行了以下田间试验：
整理田间土地，撒施底肥，将植物生长激素用水稀释50000倍后，对辣椒、黄瓜分别进行灌根施药，每株浇药液约300mL，施药量为24g/亩，同时以未施药的辣椒、黄瓜作为对照，进行常规的施肥、浇水和田间管理，待七天后，考察施药后对两种作物茎长，计算促长率，结果见表3。
表3植物生长激素对辣椒、黄瓜茎长的促长率
作物名称 茎长促长率(％)
辣椒 8
黄瓜 11
以上结果表明，本发明提取获得的植物生长激素能够促进辣椒、黄瓜的茎长，说明对植物生长具有正向调节作用，有利于提高农作物的产量。

Claims (5)

1.一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)调节多粘类芽胞杆菌发酵液的pH为1-4，微波加热2-10min后离心，所述微波功率为300-800W；
2)取离心后的上清液，调节pH为6-8，然后加入非极性有机溶剂进行萃取；
3)取有机萃取相，上SPE固相萃取小柱，先用甲醇、丙酮、水的混合溶剂进行洗脱，然后用甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱液，过微孔滤膜，将滤液冻干，即得。
2.如权利要求1所述从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法，其特征在于：步骤1)中，调节多粘类芽胞杆菌发酵液的pH为2，微波加热3min后离心，所述微波功率为560W。
3.如权利要求1所述从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法，其特征在于：所述非极性有机溶剂为乙醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、石油醚。
4.如权利要求1所述从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法，其特征在于：所述混合溶剂中，甲醇、丙酮的体积百分比均为1-5％。
5.如权利要求1所述从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法，其特征在于：所述微孔滤膜的孔径为0.22μM。
CN201811613035.7A 2018-12-27 2018-12-27 一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法 Active CN109796394B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811613035.7A CN109796394B (zh) 2018-12-27 2018-12-27 一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811613035.7A CN109796394B (zh) 2018-12-27 2018-12-27 一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109796394A true CN109796394A (zh) 2019-05-24
CN109796394B CN109796394B (zh) 2021-05-18

Family

ID=66557811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811613035.7A Active CN109796394B (zh) 2018-12-27 2018-12-27 一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109796394B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666604A (zh) * 2018-12-24 2019-04-23 光明乳业股份有限公司 一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂及其制备方法和使用方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113387747A (zh) * 2021-06-16 2021-09-14 黑龙江植今农业科技有限责任公司 一种农作物提质增效营养液的制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用
CN103014078A (zh) * 2012-11-16 2013-04-03 淮海工学院 海洋多粘类芽孢杆菌l1-9发酵产物提取dehp的方法与用途
CN104109644A (zh) * 2014-05-29 2014-10-22 华中科技大学 一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用
CN104611254A (zh) * 2014-12-15 2015-05-13 武汉科诺生物科技股份有限公司 多粘芽胞杆菌kn-03及其培养方法和用途
CN106631748A (zh) * 2016-12-16 2017-05-10 中国科学院合肥物质科学研究院 一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素k2的方法
CN108048357A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 武汉科诺生物科技股份有限公司 一种枯草芽孢杆菌及其培养方法
CN108300673A (zh) * 2017-12-28 2018-07-20 武汉科诺生物科技股份有限公司 一种多粘类芽孢杆菌发酵废液的回收利用方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用
CN103014078A (zh) * 2012-11-16 2013-04-03 淮海工学院 海洋多粘类芽孢杆菌l1-9发酵产物提取dehp的方法与用途
CN104109644A (zh) * 2014-05-29 2014-10-22 华中科技大学 一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用
CN104611254A (zh) * 2014-12-15 2015-05-13 武汉科诺生物科技股份有限公司 多粘芽胞杆菌kn-03及其培养方法和用途
CN106631748A (zh) * 2016-12-16 2017-05-10 中国科学院合肥物质科学研究院 一种分离纯化纳豆芽孢杆菌中维生素k2的方法
CN108048357A (zh) * 2017-12-26 2018-05-18 武汉科诺生物科技股份有限公司 一种枯草芽孢杆菌及其培养方法
CN108300673A (zh) * 2017-12-28 2018-07-20 武汉科诺生物科技股份有限公司 一种多粘类芽孢杆菌发酵废液的回收利用方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666604A (zh) * 2018-12-24 2019-04-23 光明乳业股份有限公司 一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂及其制备方法和使用方法
CN109666604B (zh) * 2018-12-24 2022-05-06 光明乳业股份有限公司 一种高度浓缩植物乳杆菌增殖剂及其制备方法和使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109796394B (zh) 2021-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111500489B (zh) 一株凝结芽孢杆菌及其在茶叶种植上的应用
CN107371960A (zh) 一种沃柑的种植方法
CN103086771A (zh) 一种生物有机肥的制备方法和生物有机肥及应用
CN110358696A (zh) 一种降解土壤中莠去津农药残留的微生物菌剂
CN104892152A (zh) 一种黄芩种植用的生物肥的制备方法
CN102249752A (zh) 微生物肥料及其制备方法、应用
CN105875198B (zh) 一种提高蛹虫草菌种稳定性的培养方法
CN103882080A (zh) 一种制备阿维菌素的有效方法
CN103288552B (zh) 一种防治五叶铁线莲白粉病复混肥及其制备方法
CN107164297B (zh) 一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法
CN109796394A (zh) 一种从多粘类芽孢杆菌发酵液中提取植物生长激素的方法
CN102363796B (zh) 一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法
CN106577058B (zh) 一种能够消减龙牙百合连作障碍的施药方法
CN108551973A (zh) 一种蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取方法
CN108299097A (zh) 一种氮肥的制备方法
CN112521948B (zh) 一种用于改良次生盐渍化大棚土壤的施肥方法
CN108834764A (zh) 一种油茶菇活化液体菌种的制备方法
KR100861473B1 (ko) 쥐오줌풀 뿌리의 생산방법, 그에 의해 생산되는 쥐오줌풀뿌리 및 그로부터 발레렌산 및 발레포트리에이트를생산하는 방법
CN108353721A (zh) 一种套种野豌豆的葡萄高效种植方法
CN104807925A (zh) 一种从三七根际土壤提取分离化感自毒物质的方法
CN112125717A (zh) 一种利用棉籽壳和香蕉茎叶生产高氨基酸磷钾肥料的方法
CN109731015A (zh) 一种基于中国被毛孢菌的免疫增强剂及制备方法
CN115281218B (zh) 一种木霉菌发酵液提取物的应用
CN103202318B (zh) 茅苍术挥发油积累促进剂及其制备方法
CN108967077A (zh) 一种水果玉米的生态高产栽培方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant