CN104109644A - 一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用 - Google Patents

Abstract

一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用，属于微生物技术清洁生产天然产物领域，解决现有富含木质纤维素的天然产物生产过程中提取收率低、成本高、大量使用化学溶剂和环境污染难以治理的问题。本发明涉及到一种芽孢杆菌及其降解天然产物原料中木质纤维素等组成分离有效成分的应用。该方法代替常用的物理化学预处理方法处理富含木质纤维素的天然产物原料，促进存在于植物组织中被木质纤维素、果胶质、淀粉等包裹的天然产物有效成分的暴露与释放，以提高天然产物有效成分提取收率和效率、减少化学试剂用量及环境污染治理难度，降低生产成本，显著增加效益。

Description

一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中的应用

技术领域

本发明属于利用微生物技术清洁生产天然产物领域。更具体的说，本发明涉及一种芽孢杆菌，同时，还涉及到所述的芽孢杆菌在富含木质纤维素的天然产物清洁生产中的应用。 

背景技术

天然产物活性成分是指从再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的化合物，其中许多有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础。天然产物安全性高，已成为医药、食品及饲料的重要来源。 

天然产物所含化学成分复杂，其有效成分包括黄酮、酚类、萜类等几百种，其相对分子质量较低，从几百到几千，根据极性主要分为水溶性和脂溶性两种形式。 

天然产物中有效成分在天然植物资源中含量比较低，因此，分离纯化的第1步便是将目标产物从大量的植物组织中提取出来，达到富集目标产物的目的。传统的天然产物提取方法主要是采用水或有机溶剂提取有效成分，这种提取方法简便易操作，但存在处理时间较长、部分有效成分易分解、收率和纯度偏低等缺点。 

为提高有效成分的提取收率，人们采用了自然发酵法、强酸强碱预处理、复合酶技术、超声波及微波处理等多种方式在水或有机溶剂提取有效成分之前对原料进行预处理，以提高提取收率。例如，在黄姜皂素生产过程中采用自然发酵法预处理黄姜原料，这样可提高黄姜皂素的收率20％左右；早在20世纪50年代，人们就把超声波用于提取花生油和啤酒花中的苦味素、鱼组织中的鱼油等；Ganzler在用溶剂法提取鹰爪豆碱前采用微波 预处理可将提取收率由52.3％提高到80.3％。这些方法在一定程度上提高了有效成分提取收率，但都不同程度地存在各种问题，如：自然发酵法存在处理时间偏长、收率偏低等问题；强酸强碱预处理存在成本高、环境污染严重等问题；复合酶技术存在处理时间偏长、成本高、效率偏低等问题；超声波及微波等物理处理存在能耗偏高、难以实现工业放大等突出问题。 

当然，目前，也新兴发展起超临界萃取技术、动态逆流提取技术和半仿生提取技术等天然产物提取分离新方法。这些技术设备造价偏高，运行成本较高，应用范围目前还有很大的局限性。 

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种芽孢杆菌及其在天然产物提取中应用的方法，该方法利用芽孢杆菌发酵方法替代上述预处理，采用芽孢杆菌高效预处理天然产物原料，促进存在于植物组织中被木质纤维素、果胶质、淀粉等包裹的天然产物中有效成分更充分的提取与释放。进一步提高天然产物中有效成分的提取收率和效率、减少化学试剂用量及环境污染治理难度，降低生产成本，显著增加效益。 

本发明提供的芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55已于2014年保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏日期为2014年5月16日，保藏编号为CCTCC NO:M 2014208。Bacillus sp.RBB55是一株革兰氏阳性细菌，其形态特征是：菌株RBB55在37℃下，固体LB培养基上倒置培养12h后，生长为乳白色圆形菌落，菌落边缘整齐，表面湿润光滑，通过革兰氏染色后再显微镜下，菌体呈短杆状，近乎椭球形，单个或呈短链排列，长1.7-2.0μm，宽0.7-0.9μm。周生纤毛，能运动，芽孢椭圆形，中生或次端生，VP反应呈阳性。 

上述芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55保藏编号为M2014208菌株的16S rDNA序列的V3可变区序列如下所示，片段长度为249bp，该序列与Genbank中己知序列进行比对，所述序列与芽孢杆菌的16S rDNA序列有99％～100％的相似性，因此命名为Bacillus sp.RBB55。 

TATTTTTTTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTTTGGTTAGGTACCGTCAAGGCACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGCCCCCCGTGCCCCCGCCCCGCCCGCCGCGGGGGGGGGGGGGGGCG 

本发明所述的一种芽孢杆菌在天然产物提取中的应用，其特征在于： 

第1步制备芽孢杆菌种子液步骤 

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55，保藏编号为M2014208菌株1～2环，接种在装有灭菌的LB培养基的容器中，置于摇床上，在30℃～38℃条件下，以120～180rpm的转速培养8～16h，得所述菌株的种子液； 

其中所述的液体LB培养基配方为：每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0；所述固体LB培养基是在上述配方的基础上加入15～20g/L的琼脂； 

第2步芽孢杆菌处理天然产物原料浆料步骤 

所述天然产物原料浆料按照天然产物原料干重与水的质量比为1:5～1:10混合均匀制成浆液，在浆液中接种第1步中芽孢杆菌种子液进行微生物处理，得到发酵混合物；其中微生物处理条件为：接种量10～20％(体积比)，处理温度30℃～38℃，以120～180rpm的转速处理3～10h，自然pH。 

第3步从第2步得到的发酵混合物中分离提取天然产物中的有效成分。 

分离提取可以根据发酵混合物有效成分的水溶性和脂溶性特点选择对应的方式进行处理的。 

上述技术方案可以采用下述一种或几种方式进行改进：所述天然产物原料为鲜料或者干料，鲜料经洗净去杂后，在温度120～130℃、压力0.1～ 0.2MPa条件下，蒸汽膨化处理15～20min，冷却至室温后使用；干料由天然产物原料干燥后粉碎至30目～100目得到，或进一步采用与鲜料相同条件的蒸汽膨化处理后得到。 

本发明提供的微生物处理天然药物原料的菌株为芽孢杆菌，即芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55 CCTCC NO：M2014208菌株，能以天然产物原料为碳源，通过微生物发酵方法替代其他物理化学预处理方法，处理天然产物原料的微生物是分泌纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、木聚糖酶活力高且淀粉酶活力很低的细菌或真菌，这些微生物能高效预处理天然产物原料，使存在于植物组织中被木质纤维素、果胶质、淀粉等包裹的有效成分充分暴露或者直接释放到溶液中，对于水溶性强的有效成分可先后采用固液分离，膜分离技术富集有效成分。本发明还可通过在天然产物原料制成浆液前利用蒸汽膨化处理，进一步增强天然产物有效成分的暴露或者释放，以提高天然产物有效成分提取收率和效率、减少化学试剂用量及环境污染治理难度，降低生产成本，显著增加效益。 

本发明方法克服了现有技术存在的诸多不足，例如在金银花绿原酸提取过程中，预先利用芽孢杆菌处理金银花浆料，绿原酸提取收率较超声处理后提取提高25％左右，可减少分离提取过程中有机溶剂用量20％左右；在黄姜皂苷提取过程中，预先利用芽孢杆菌处理黄姜浆料，黄姜皂苷提取收率较微波处理后提取提高10％左右，生产过程废水量少且污染程度大大降低，且微生物处理成本低、用时短；在桂花精油提取过程中，预先利用芽孢杆菌代替复合酶处理桂花浆料，桂花精油提取收率提高约5.5倍，且微生物处理成本低、用时短，显著增加了效益。 

利用芽孢杆菌处理天然产物原料为天然产物提取工艺开辟了新思路，对推动天然产物清洁提取技术具有重大意义。 

具体实施方式

针对从富含木质纤维素的天然植物中提取天然产物中有效成分的情 况，特定微生物预处理因微生物具有繁殖快、易培养、生产效率高等优点备受人们青睐，有望克服上述预处理方式的诸多不足。利用微生物降解天然产物原料中木质纤维素等组成促进有效成分的分离，这将作为一种新技术，为富含木质纤维素的天然产物原料提取有效成分提供新途径，对我国越来越多的天然产物及其有效成分的清洁提取具有重要意义。 

所述的芽孢杆菌在天然产物提取中应用的方法，包括下述步骤： 

第1步制备芽孢杆菌种子液步骤： 

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌(Bacillus sp.RBB55)，保藏编号为M2014208菌株1-2环，接种在装有灭菌的100mL液体LB培养基的250mL锥形瓶中，置于摇床上，在30℃～38℃条件下，以120～180rpm的转速培养8h～16h，得所述菌株的种子液； 

其中，所述的液体LB培养基配方为：每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0；所述固体LB培养基是在上述配方的基础上加入15g/L-20g/L的琼脂； 

第2步芽孢杆菌处理天然产物浆料释放活性成分步骤： 

所述的天然产物按照干重与水的质量比为1:5～1:10混合均匀制成浆液，在浆液中接种第1步中芽孢杆菌种子液进行微生物处理，得到发酵混合物；其中微生物处理条件为：接种量10～20％，处理温度30℃～38℃，以120～180rpm的转速处理3～10h，自然pH。 

第3步天然产物中有效成分的分离提取步骤： 

针对水溶性强的有效成分，先采用固液分离法分离上述发酵混合物得到富含有效成分的发酵液，再根据有效成分的分子量和极性，采用膜分离技术等手段富集发酵液中的有效成分；对于同时富含木质纤维素及淀粉的天然产物原料，可先采用双酶法(液化糖化作用)处理上述发酵混合物进一步释放有效成分，再先后采用固液分离法和膜分离技术等手段富集发酵液中的有效成分； 

这里提到的双酶法是用专一性很强的淀粉酶和糖化酶作为催化剂将淀粉水解为葡萄糖的方法，根据淀粉酶和糖化酶使用说明书上最佳条件使用即可。 

针对既可水溶又可脂溶的有效成分，可在第2步的发酵混合物中按照最佳提取剂配比添加有机溶剂用量提取相应有效成分； 

这里提到的最佳提取剂配比是指根据实验得到的最佳提取剂条件，如提取甘草中黄酮物质时采用50％乙醇进行提取；提取金银花中绿原酸时采用60％的乙醇进行提取。 

针对脂溶性强的有效成分，先采用固液分离法分离得到富含有效成分的固体成分，再根据有效物质的极性选择相应的有机溶剂提取精制即可得到产品。 

这里提到的相应的有机溶剂是指能有效提取有效成分的溶剂，例如提取桂花精油时采用石油醚作为提取剂。 

以上所有步骤中用到固液分离均采用板框过滤或离心分离，分离得到的液体部分能达到后续膜分离技术的要求。 

下面通过具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。 

首先说明以下各实施例所用的测量方法： 

黄姜皂素的定量测定方法：高效液相色谱法，色谱条件为：C₁₈反相柱(syncronis C₁₈250×4.6mm),检测波长204nm，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，进样量10μL。 

黄姜皂苷释放百分数表示为皂素在水相中的含量与样品中总含量的百分比。 

绿原酸的定量测定方法：高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱为KromasⅡ-C18-5u(10μm，50×4.6mm)不锈钢柱，流动性为：甲醇：水＝40:60，1％冰醋酸，流速0.3mL/min，进样量20μL。 

桂花精油定量测定方法：气相条件，Agilent7890/5975C气质连用仪，HP-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。程序升温如下：50℃保温1min，10℃/min升高到100℃；然后以5℃/min升高到250℃，最后以20℃/min升高到280℃，280℃保温5min。载气：氦气(99.999％)，流速1.5mL/min，分流比50:1。检测器温度250℃。 

酚类物质(总酚)定量测定方法：取0.2mL提取液，加入到25mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10ml，加入0.5mL福林酚试剂，混匀后加入10mL7.5％碳酸钠溶液，混匀后放入25℃水浴锅中水浴60min。然后加蒸馏水定容至25mL，于750nm下测吸光值。用福林酚法测定总酚，总酚含量用没食子酸当量(gallic acid equivaient,GAE)表示。 

黄酮物质定量测定方法：标准品配制：准确称取干燥恒重的黄酮标准品--芦丁，用甲醇溶解，配制成0.1mg/mL的芦丁标准品溶液，分别取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，置于7支10mL试管中，各支试管中添加甲醇至5mL，再各加0.5ml10％KOH溶液，充分摇匀显色5min后，用甲醇定容至10mL，摇匀，用Unico紫外-可见分光光度计测定其在410nm处的吸收值。以芦丁溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取样品溶液，按照上面方法测定黄酮物质含量。 

实施例1 利用芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55 CCTCC NO：M2014208菌株处理黄姜原料提取黄姜皂素，包括下列步骤： 

1.制备芽孢杆菌种子液步骤 

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55，保藏编号为M2014208菌株1-2环，接种在装有灭菌的100mL液 体LB培养基的250mL锥形瓶中，置于摇床上，在38℃条件下，以180rpm的转速培养8h，得所述菌株的种子液； 

其中所述的液体LB培养基配方为：每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0；所述固体LB培养基是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂； 

2.黄姜原料预处理步骤 

500克黄姜块根干燥后粉碎至30目，在温度120～130℃、压力0.1～0.15MPa条件下，蒸汽膨化处理15min，冷却至室温； 

3.芽孢杆菌处理释放黄姜皂苷步骤 

上述黄姜干粉按照黄姜干粉：水＝1:10(w/v)加水搅拌均匀；然后接入20％上述细胞液体培养液，于pH值6.0、温度38℃条件下，搅拌转速180rpm，发酵处理10h后结束。 

4.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并从发酵液的固体颗粒中进一步释放黄姜皂苷步骤 

上述发酵液置于高温下灭活菌种，适当冷却后向其中加入3万单位α-淀粉酶,在pH值7.0、温度90℃条件下液化5min，冷却至60℃以下；再加入3万液态糖化酶，在pH值4.0、温度60℃条件下糖化6h，得到黄姜糖化醪。 

5.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤 

步骤4中糖化醪再通过固液分离(5000rpm离心8min)去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法处理形成的含有大量黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到其葡萄糖浓度为59g/L。 

6.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤 

上述含有大量水溶性黄姜皂苷和糖分的混合液进一步通过微滤得到清液，再通过孔径为1nm的纳滤装置，截留分子量较大(M≥869.05)的黄姜 皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。 

7.水解含黄姜皂苷的浓缩液获得黄姜皂素粗品步骤。 

本实例中，上述浓缩的黄姜皂苷溶液中，加入一定浓度硫酸，使硫酸终浓度为1.5mol/L，在100℃条件下酸解2h，水洗除去液体部分即得黄姜皂素粗品。 

所述黄姜皂素粗品再以石油醚混合0.3％活性炭为提取剂，在85℃温度下回流提取4h，趁热除去活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。 

生产结果：每100克干黄姜生产出皂素2.97克。 

实施例2 利用芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55 CCTCC NO：M2014208菌株处理金银花原料提取绿原酸，包括下列步骤： 

1.制备芽孢杆菌种子液步骤 

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55，保藏编号为M2014208菌株1～2环，接种在装有灭菌的100mL液体LB培养基的250mL锥形瓶中，置于摇床上，在30℃条件下，以120rpm的转速培养16h，得所述菌株的种子液； 

其中所述的液体LB培养基配方为：每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0；所述固体LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂； 

2.芽孢杆菌处理金银花浆料步骤 

将10g金银花低温干燥后粉碎至100目，按照金银花干重与水的质量比为1:5混合均匀制成浆液，在浆液中接种第1步中细胞培养液进行微生物处理；其中微生物处理条件为：接种量15％，处理温度35℃，以150rpm的转速处理3h，自然pH。 

3.金银花绿原酸分离提取步骤 

选择乙醇作为提取试剂，加入120mL乙醇及30mL水到第2步的混合物中，使乙醇的最终提取浓度达到60％，在60℃条件下提取2h，固液分离后的上清液即为绿原酸粗提物。 

4.金银花绿原酸精制步骤 

采用经预处理后的大孔树脂D101对第3步中的绿原酸粗提物进行纯化处理，每克树脂上样量为绿原酸浓度为0.5mg/ml的提取液6ml，上样液pH为2，上样流速为4BV/h。用5BV的20％乙醇可以将绿原酸洗脱出来，收集合并洗脱液旋转蒸发浓缩后低温冷冻干燥，得到淡黄色粉末状绿原酸产品，经高效液相检测其纯度为60.1％。 

生产结果：每100克干燥金银花生产出绿原酸5.88克。 

实施例3 利用芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55 CCTCC NO：M2014208菌株处理桂花原料提取桂花精油，包括下列步骤： 

1.制备芽孢杆菌种子液步骤 

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55，保藏编号为M2014208菌株1～2环，接种在装有灭菌的100mL液体LB培养基的250mL锥形瓶中，置于摇床上，在34℃条件下，以150rpm的转速培养12h，得所述菌株的细胞液体培养物； 

其中所述的液体LB培养基配方为：每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0；所述固体LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂； 

2.芽孢杆菌处理金银花浆料步骤 

将桂花清洗甩干后称重，取10g按照桂花干重与水的质量比为1:5混合均匀制成浆液，在浆液中接种第1步中细胞培养液进行微生物处理；其中 微生物处理条件为：接种量10％，处理温度30℃，以120rpm的转速处理3h，自然pH。 

3.桂花浸膏提取步骤 

将步骤2中的混合物进行固液分离，得到固体部分后，再用1：3的石油醚常温提取2小时(置于摇床上转速120rpm)，提取3次。减压抽滤，合并滤液。回收石油醚，最后加入无水乙醇脱水，得黄色浸膏，将浸膏密封保备用。 

4.桂花精油提取步骤 

称取10g浸膏样品，加入500倍无水乙醇溶解在60℃冷凝回流1h。将浸膏无水乙醇溶液置于-20℃冰箱中静置过夜。快速减压抽滤，用冰无水乙醇反复冲洗。回收无水乙醇至恒重，得到黄色油状精油。 

生产结果：每10克水洗甩干的桂花生产出桂花精油25.3毫克。 

实施例4 利用芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55 CCTCC NO：M2014208菌株处理紫苏叶提取酚类物质，包括下列步骤： 

1.制备芽孢杆菌种子液步骤 

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55，保藏编号为M2014208菌株1～2环，接种在装有灭菌的100mL液体LB培养基的250mL锥形瓶中，置于摇床上，在36℃条件下，以150rpm的转速培养10h，得所述菌株的细胞液体培养物； 

其中所述的液体LB培养基配方为：每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0；所述固体LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂； 

2.芽孢杆菌处理紫苏叶浆料步骤 

将5g紫苏叶低温干燥后粉碎至40目，按照紫苏叶干重与水的质量比为1:6混合均匀制成浆液，在浆液中接种第1步中细胞培养液进行微生物处 理；其中微生物处理条件为：接种量10％，处理温度35℃，以120rpm的转速处理3h，自然pH。 

3.酚类物质分离提取步骤 

选择乙醇作为提取试剂，加入80mL乙醇和90mL水到第2步的混合物中，使乙醇的最终提取浓度达到40％，在100W微波功率下提取120s，固液分离后的上清液即为酚类物质粗提物。 

4.酚类物质精制步骤 

采用经预处理后的大孔树脂AB-8对第3步中的酚类物质粗提物进行纯化处理，上样液浓度为2mg/ml，上样液流速为1ml/min，上样液体积为6BV。先用纯水洗脱糖和蛋白质(至苯酚硫酸，茚三酮显色反应呈阴性)，再用5BV的70％乙醇可将酚类物质洗脱出来，收集合并洗脱液旋转蒸发浓缩后低温冷冻干燥，得到粉末状酚类物质，经高效液相检测其纯度为76.6％。 

生产结果：每100克干燥紫苏叶生产出酚类物质2.98克。 

实施例5 利用芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55 CCTCC NO：M2014208菌株处理甘草原料提取黄酮物质，包括下列步骤： 

1.制备芽孢杆菌种子液步骤 

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55，保藏编号为M2014208菌株1～2环，接种在装有灭菌的100mL液体LB培养基的250mL锥形瓶中，置于摇床上，在36℃条件下，以160rpm的转速培养8h，得所述菌株的细胞液体培养物； 

其中所述的液体LB培养基配方为：每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0；所述固体LB培养基是在上述配方的基础上加入20g/L的琼脂； 

2.芽孢杆菌处理甘草浆料步骤 

将甘草低温干燥后粉碎至60目，取10g甘草粉末，按照甘草干重与水的质量比为1:5混合均匀制成浆液，在浆液中接种第1步中细胞培养液进行微生物处理；其中微生物处理条件为：接种量12％，处理温度35℃，以150rpm的转速处理4h，自然pH。 

3.黄酮物质分离提取步骤 

选择乙醇作为提取试剂，加入70mL乙醇和20mL水到第2步的混合物中，使乙醇的最终提取浓度达到50％，在100W超声功率下提取20min，固液分离后的上清液即为黄酮粗提物。 

4.黄酮物质精制步骤 

采用经预处理后的大孔树脂AB-8对第3步中的黄酮粗提物进行纯化处理，动态吸附量：16mg/mL(泄漏前)；28mg/mL(饱和)；甘草总黄酮浓度：2mg/mL；上样流速：3BV/h；洗脱液：50％乙醇；洗脱液用量：4BV。以此工艺参数可以有效地使甘草总黄酮的含量达到60％以上，收率80％以上。 

生产结果：每100克干燥甘草生产出黄酮物质4.22克。 

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。 

Claims (8)

1.一种芽孢杆菌，其特征在于：其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.RBB55，于2014年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏编号为M2014208。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌在天然产物提取中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述天然产物为富含木质纤维素的天然产物原料。

4.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述天然产物为黄姜皂苷、金银花绿原酸、桂花精油、紫苏酚类物质或甘草黄酮物质。

5.权利要求1所述的芽孢杆菌在天然产物清洁生产中应用的方法，包括下述步骤：

第1步制备芽孢杆菌种子液步骤：

挑取固体LB培养基斜面培养基斜面培养的芽孢杆菌(Bacillus sp.RBB55)，保藏编号为M2014208菌株1-2环，接种在装有灭菌液体LB培养基的容器中，置于摇床上，在30℃～38℃条件下，以120～180rpm的转速培养8h～16h，得所述菌株的种子液；

第2步芽孢杆菌处理天然产物浆料释放活性成分步骤：

所述的天然产物按照干重与水的质量比为1:5～1:10混合均匀制成浆液，在浆液中接种第1步中芽孢杆菌种子液进行微生物处理，得到发酵混合物；其中微生物处理条件为：接种量10～20％，处理温度30℃～38℃，以120～180rpm的转速处理3～10h，自然pH；

第3步从第2步得到的发酵混合物中分离提取天然产物中的有效成分。

6.权利要求5所述芽孢杆菌在天然产物提取中应用的方法，其特征在于，

第3步中所述的分离提取是根据发酵混合物有效成分的水溶性和脂溶性特点选择对应的方式进行处理的：

针对水溶性强的有效成分，先采用固液分离法分离上述发酵混合物得到富含有效成分的发酵液，再根据有效成分的分子量和极性，采用膜分离技术等手段富集发酵液中的有效成分；对于同时富含木质纤维素及淀粉的天然产物原料，先采用双酶法处理上述发酵混合物进一步释放有效成分，再先后采用固液分离法和膜分离技术等手段富集发酵液中的有效成分；

针对既可水溶又可脂溶的有效成分，可在第2步的发酵混合物中按照最佳提取剂配比添加有机溶剂用量提取相应有效成分；

针对脂溶性强的有效成分，先采用固液分离法分离得到富含有效成分的固体成分，再根据有效物质的极性选择相应的有机溶剂提取精制即可得到产品。

7.权利要求5所述芽孢杆菌在天然产物提取中应用的方法，其特征在于，所述天然产物原料为鲜料或者干料，鲜料经洗净去杂后，在温度120～130℃、压力0.1MPa～0.2MPa条件下，蒸汽膨化处理15min～20min，冷却至室温后使用；干料由天然产物原料干燥后粉碎至30目～100目得到，或进一步采用与鲜料相同条件的蒸汽膨化处理后得到。

8.权利要求5所述芽孢杆菌在天然产物提取中应用的方法，其特征在于，所述的天然产物主要包括黄姜皂苷、金银花绿原酸、桂花精油、紫苏酚类物质或甘草黄酮物质，但不仅限于此，对富含木质纤维素的天然产物原料均适用。