CN103554287B - 一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法 - Google Patents
一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法,该方法包括以下步骤:⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基;⑵制备种子培养基;⑶制备发酵培养基;⑷将美味牛肝菌菌丝接种至马铃薯葡萄糖斜面培养基,经恒温培养得菌丝体;⑸菌丝体接种至种子培养基,经振荡培养得菌种种子液;⑹菌种种子液接种至发酵培养基,经振荡培养得发酵液;离心、洗涤、烘干、磨粉后,得到菌丝体干粉末;⑺菌丝体干粉末先超声提取再浸提得到多糖浸提液;⑻多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液混合后离心后即得多糖提取液;⑼多糖提取液加乙醇静置,得沉淀物;⑽沉淀物离心、洗涤、干燥,即得美味牛肝菌多糖。本发明操作简单,成本低,多糖得率高。
Description
技术领域
本发明涉及真菌多糖技术领域,尤其涉及一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法。
背景技术
真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体及发酵液中分离出的活性物质,具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗辐射、降血脂、血糖和胆固醇、健胃护肝等多种药理作用。真菌多糖的多种生物活性功能在临床上的广泛应用,使其已成为生命科学、生物学、医学和食品科学等领域的研究热点。
美味牛肝菌(Boletusedulis)属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、牛肝菌科中的一种与高等植物共生的外生菌根真菌,是一种药、食兼用的珍稀食用菌。我国美味牛肝菌资源丰富,主要分布于河南、四川、云南、内蒙古、福建、陕西等地。研究表明,美味牛肝菌菌丝体中主要含有碳水化合物、粗蛋白、胞内多糖以及少量的脂类和纤维等成分,具有降低血脂,提高人体免疫力和明显的抗癌作用。由于其优良的食疗保健功效,已成为我国出口创汇的重要菌类产品。美味牛肝菌多糖是一种有效的生物免疫调节剂,具有调节血糖、血脂及胆固醇水平、改善免疫系统功能以及显著的抗肿瘤等作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低、多糖得率高的美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法。
为解决上述问题,本发明所述的一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入5~10g葡萄糖和5~10g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养4~10天后,置于4℃冰箱中,得到活化培养后的菌丝体;
⑸接一环所述活化培养后的菌丝体至装有10mL所述种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液;
⑹将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天,即得发酵液;所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体;所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末;所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30%;
⑺在所述菌丝体干粉末中按1g:5mL~20mL的料液比加入去离子水,在功率为100~300W的条件下超声提取10~20min后,在温度为70~90℃的条件下浸提次数2~4次,每次1~3h,合并提取液,得到多糖浸提液;
⑻将所述多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按1mL:1mL的比例,充分混合,在转速150r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质,将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液,反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液;
⑼在所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A;
⑽将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r/min离心10min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得美味牛肝菌多糖。
所述步骤⑷中美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌BoletusedulisKX920NG按常规方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝;所述美味牛肝菌BoletusedulisKX920NG在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:M2012113(保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学;保藏日期:2012年4月13日),其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086386。
所述步骤⑻中正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按5mL:1mL混合而成的混合液。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用超声波辅助热水浸提法取代传统的水提醇析法,与原来工艺相比,降低了提取液黏度、缩短了提取时间,多糖得率显著提高。同时,超声波辅助提取能加速真菌胞内多糖的释放、扩散及溶解,具有提取效率高、时间短、多糖结构稳定等优点。
2、本发明整个过程中无需试剂和化学反应,不但设备简单,可操作性强,而且成本低,易于实现生产工艺的连续化和工业化。
3、本发明发酵菌丝体培养周期短,生长快,利于大规模工业生产,从其发酵液或固体培养物中得到菌丝体提取多糖,对进一步深入开发美味牛肝菌资源具有重要意义。
具体实施方式
实施例1一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在90℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入5g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入5g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养4天后,置于4℃冰箱中,得到活化培养后的菌丝体。
其中:美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌BoletusedulisKX920NG按常规方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝;美味牛肝菌BoletusedulisKX920NG在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:M2012113(保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学;保藏日期:2012年4月13日),其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086386。
⑸接一环活化培养后的菌丝体至装有10mL种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100r/min的速率进行振荡培养4天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按5%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100r/min的速率进行振荡培养4天,即得发酵液;发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体;菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末。
其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为10%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g:5mL的料液比加入去离子水,在功率为100W的条件下超声提取20min后,在温度为70℃的条件下浸提次数2次,每次1h,合并提取液,得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按1mL:1mL的比例,充分混合,在转速150r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质,将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液,反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液。
其中:正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按5mL:1mL混合而成的混合液。
⑼在多糖提取液中按其体积的2倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A。
⑽将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r/min离心10min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得美味牛肝菌多糖。
采用苯酚-硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量,并按下式计算:
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)=粗多糖总质量(mg)/菌丝体干粉末质量(g)。
实施例2一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入10g葡萄糖和10g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养10天后,置于4℃冰箱中,得到活化培养后的菌丝体。
其中:美味牛肝菌菌丝同实施例1。
⑸接一环活化培养后的菌丝体至装有10mL种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以200r/min的速率进行振荡培养10天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按20%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以200r/min的速率进行振荡培养10天,即得发酵液;发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体;菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末。
其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为30%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g:20mL的料液比加入去离子水,在功率为300W的条件下超声提取10min后,在温度为90℃的条件下浸提次数4次,每次3h,合并提取液,得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按1mL:1mL的比例,充分混合,在转速150r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质,将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液,反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液。
其中:正丁醇-三氯乙酸溶液同实施例1。
⑼在多糖提取液中按其体积的4倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A。
⑽将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r/min离心10min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得美味牛肝菌多糖。
采用苯酚-硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量,并按实施例1中的公式计算。
实施例3一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在95℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入8g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在95℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入8g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在95℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养7天后,置于4℃冰箱中,得到活化培养后的菌丝体。
其中:美味牛肝菌菌丝同实施例1。
⑸接一环活化培养后的菌丝体至装有10mL种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以150r/min的速率进行振荡培养7天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按12%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以150r/min的速率进行振荡培养7天,即得发酵液;发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体;菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末。
其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为20%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g:12mL的料液比加入去离子水,在功率为200W的条件下超声提取15min后,在温度为80℃的条件下浸提次数3次,每次2h,合并提取液,得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按1mL:1mL的比例,充分混合,在转速150r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质,将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液,反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液。
其中:正丁醇-三氯乙酸溶液同实施例1。
⑼在多糖提取液中按其体积的3倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A。
⑽将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r/min离心10min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得美味牛肝菌多糖。
采用苯酚-硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量,并按实施例1中的公式计算。
Claims (1)
1.一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法,包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液A,该滤液A补足至1.0L依次加入5~10g葡萄糖和5~10g琼脂,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液B,该滤液B补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎,按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤,得到滤液C,该滤液C补足至1.0L加入5~10g葡萄糖,使其pH值为6.0~8.0,在90~100℃温度下充分加热溶解后分装,在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得;
⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上,于28℃恒温培养4~10天后,置于4℃冰箱中,得到活化培养后的菌丝体;所述美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌BoletusedulisKX920NG按常规方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝;所述美味牛肝菌BoletusedulisKX920NG在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:M2012113,其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086386;
⑸接一环所述活化培养后的菌丝体至装有10mL所述种子培养基的试管中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天,制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液;
⑹将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中,并置于恒温振荡器上,在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天,即得发酵液;所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体;所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于60℃下烘干至恒重后磨成粉,得到菌丝体干粉末;所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30%;
⑺在所述菌丝体干粉末中按1g:5mL~20mL的料液比加入去离子水,在功率为100~300W的条件下超声提取10~20min后,在温度为70~90℃的条件下浸提次数2~4次,每次1~3h,合并提取液,得到多糖浸提液;
⑻将所述多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按1mL:1mL的比例,充分混合,在转速150r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质,将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液,反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止,视为蛋白质除尽,即得多糖提取液;所述正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按5mL:1mL混合而成的混合液;
⑼在所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇,在4℃下静置24h,得到沉淀物A;
⑽将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r/min离心10min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内,经50℃真空干燥至恒重,即得美味牛肝菌多糖。
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