CN103554285B - 一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基；⑵制备种子培养基；⑶制备发酵培养基；⑷鸡油菌菌丝接种至马铃薯葡萄糖斜面培养基，经恒温培养得斜面菌种；⑸1cm2斜面菌种接种至种子培养基，经振荡培养得菌种种子液；⑹菌种种子液接种至发酵培养基，经振荡培养得发酵液；发酵液离心、洗涤、烘干、磨粉后，得到菌丝体干粉末；⑺菌丝体干粉末先超声提取再浸提得到多糖浸提液；⑻多糖浸提液离心、过滤、浓缩后得到多糖浓缩液；⑼多糖浓缩液中加Sevag试剂，离心后得多糖提取液；⑽多糖提取液加乙醇静置，得到沉淀物；⑾沉淀物离心、洗涤、干燥，即得多糖干品。本发明操作简单，成本低，多糖得率高。
Description
技术领域
本发明涉及真菌多糖技术领域，尤其涉及一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法。
背景技术
真菌多糖是一类具有广泛的药理活性和保健作用的高分子聚合物，具有抗肿瘤、抗感染、抗凝血、抗病毒、降血糖、降血脂、修复损伤组织细胞等多种生理功能。常见的真菌多糖有香菇多糖、黑木耳多糖、猴头菌多糖、银耳多糖、灵芝多糖、冬虫夏草多糖、云芝多糖、茯苓多糖、灰树花多糖等。目前，已有多种真菌多糖应用于临床，使得多糖生物资源的研究和开发日益活跃，成为生物学、医学、药物学、食品科学等领域的研究热点。
陇南康县位于甘肃省东南部，陕、甘、川三省交界地带，是珍贵的天然植物宝库。境内气候属典型亚热带向暖温带过渡气候，温和湿润，雨量充沛，自然资源十分丰富。鸡油菌是陇南康县地区生长的一种具有生理活性的野生食用菌，别名黄丝菌、杏菌，属真菌界、担子菌门、同担子菌纲、鸡油菌目、鸡油菌科和鸡油菌属。在我国主要分布于云南、贵州、四川、湖南、甘肃、安徽、陕西、江苏等省。研究表明，鸡油菌富含胡萝卜素、VA、VC、多糖物质、钙、铁、磷等矿质元素和人体必需的8种氨基酸，其性平、味甘具有清肝、明目、利肺、减肥和抗衰老等多种功效。鸡油菌多糖具有多种生理活性，能够促进人体免疫功能，具有抗肿瘤、抗病毒、抗突变、抗辐射、降血压等功能。目前，鸡油菌的开发基本依靠野生资源，存在菌种污染率高、生长周期长、工艺复杂等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低、多糖得率高的鸡油菌菌丝多糖的提取方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~10g葡萄糖和5~10g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑷真菌的发酵培养：接一环鸡油菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养4~10天后，置于4℃冰箱中，得到斜面菌种；
⑸将1cm2所述斜面菌种接种至装有10mL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液；
⑹将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心10~30min，得到菌丝体；所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于50~80℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30%；
⑺在所述菌丝体干粉末中按1g：10mL~30mL的料液比加入去离子水，在功率为100~300W的条件下超声提取20~40min后，在温度为70~90℃的条件下浸提次数2~4次，每次0.5~2h，合并提取液，得到多糖浸提液；
⑻将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10~20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50℃、真空度为0.06~0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3，得到多糖浓缩液；
⑼在所述多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂，充分混合搅拌10~30min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；
⑽所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A；
⑾将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
所述步骤⑷中鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌Cantharellussp.KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝；所述鸡油菌Cantharellussp.KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2012114（保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年4月13日），其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086387。
所述步骤⑼中Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL：1mL混合而成的混合液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用超声波辅助热水浸提法取代以往的单独水提，利用其独特的热作用、机械作用及空化等物理化学效应，可以有效缩短提取时间，显著提高多糖得率，具有提取效率高、时间短、温度低、不易破坏多糖的立体结构等优点。
2、本发明整个过程中无需试剂和化学反应，不但设备简单，可操作性强，而且成本低。
3、本发明发酵菌丝体培养周期短、菌种纯、工艺简单，利于实现规模化、产业化生产，从其发酵液或固体培养物中得到菌丝体提取多糖，为鸡油菌资源的合理开发利用提供参考。
具体实施方式
实施例1一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在90℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养：接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养4天后，置于4℃冰箱中，得到斜面菌种。
其中：鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌Cantharellussp.KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝；鸡油菌Cantharellussp.KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2012114（保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年4月13日），其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086387。
⑸将1cm2斜面菌种接种至装有10mL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100r/min的速率进行振荡培养4天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按5%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100r/min的速率进行振荡培养4天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心10min，得到菌丝体；菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于50℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
其中：发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为10%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g：10mL的料液比加入去离子水，在功率为100W的条件下超声提取40min后，在温度为70℃的条件下浸提次数2次，每次0.5h，合并提取液，得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50℃、真空度为0.06MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5，得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂，充分混合搅拌10min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
其中：Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL：1mL混合而成的混合液。
⑽多糖提取液中按其体积的2倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A。
⑾将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按下式计算：
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)=粗多糖总质量(mg)/菌丝体干粉末质量(g)。
实施例2一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入10g葡萄糖和10g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养：接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养10天后，置于4℃冰箱中，得到斜面菌种。
其中：鸡油菌菌丝同实施例1。
⑸将1cm2斜面菌种接种至装有10mL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以200r/min的速率进行振荡培养10天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按20%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以200r/min的速率进行振荡培养10天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心30min，得到菌丝体；菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于80℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
其中：发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为30%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g：30mL的料液比加入去离子水，在功率为300W的条件下超声提取20min后，在温度为90℃的条件下浸提次数4次，每次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50℃、真空度为0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/3，得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂，充分混合搅拌30min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
其中：Sevag试剂同实施例1。
⑽多糖提取液中按其体积的4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A。
⑾将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
实施例3一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在95℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在95℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在95℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得。
⑷真菌的发酵培养：接一环鸡油菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养7天后，置于4℃冰箱中，得到斜面菌种。
其中：鸡油菌菌丝同实施例1。
⑸将1cm2斜面菌种接种至装有10mL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以150r/min的速率进行振荡培养7天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液。
⑹将菌种种子液按12%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以150r/min的速率进行振荡培养7天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min，得到菌丝体；菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于65℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
其中：发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为20%。
⑺在菌丝体干粉末中按1g：20mL的料液比加入去离子水，在功率为200W的条件下超声提取30min后，在温度为80℃的条件下浸提次数3次，每次1h，合并提取液，得到多糖浸提液。
⑻将多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心15min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50℃、真空度为0.07MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/4，得到多糖浓缩液。
⑼在多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂，充分混合搅拌20min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
其中：Sevag试剂同实施例1。
⑽多糖提取液中按其体积的3倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A。
⑾将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
Claims (1)
1.一种鸡油菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~10g葡萄糖和5~10g琼脂，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑵制备种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑶制备发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4~6倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~10g葡萄糖，使其pH值为6.0~8.0，在90~100℃温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min即得；
⑷真菌的发酵培养：接一环鸡油菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28℃恒温培养4~10天后，置于4℃冰箱中，得到斜面菌种；所述鸡油菌菌丝是指采集于陇南康县的鸡油菌Cantharellussp.KX560JY按常规方法经组织分离获得的鸡油菌菌丝；所述鸡油菌Cantharellussp.KX560JY在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2012114，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086387；
⑸将1cm2所述斜面菌种接种至装有10mL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为5.0~7.0的菌种种子液；
⑹将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃条件下以100~200r/min的速率进行振荡培养4~10天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心10~30min，得到菌丝体；所述菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于50~80℃下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10~30%；
⑺在所述菌丝体干粉末中按1g：10mL~30mL的料液比加入去离子水，在功率为100~300W的条件下超声提取20~40min后，在温度为70~90℃的条件下浸提次数2~4次，每次0.5~2h，合并提取液，得到多糖浸提液；
⑻将所述多糖浸提液在高速冷冻离心机中于4000r/min离心10~20min过滤后，得到上清液A，该上清液A在温度为50℃、真空度为0.06~0.08MPa的条件下浓缩至原上清液A体积的1/5~1/3，得到多糖浓缩液；
⑼在所述多糖浓缩液中按其体积的1/5加入Sevag试剂，充分混合搅拌10~30min，再用高速冷冻离心机以5000r/min离心20min除掉变性蛋白质，弃去水与有机相间的蛋白变性层，收集上清液B，反复多次直到所述上清液B与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；所述Sevag试剂是指氯仿与正丁醇按4mL：1mL混合而成的混合液；
⑽所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4℃下静置24h，得到沉淀物A；
⑾将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000r／min离心20min后，得到沉淀物B，该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50℃真空干燥至恒重，即得多糖干品。
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