CN103130906A - 一种高寒地区黄菇菌丝多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种黄菇菌丝多糖的制备方法。本发明提供了一种从黄菇菌丝体提取黄菇菌丝多糖的可行方法。本发明还提供了提取黄菇菌丝多糖的最佳提取条件。具体工艺过程为：接种黄菇菌丝，经发酵培养，对产黄菇多糖的发酵条件进行优化，确定实验最佳条件，在此基础之上，进行多批次的5L小型发酵实验，对发酵液离心收集菌丝体，烘干粉碎，采用超声波辅助热水浸提法提取黄菇中的真菌多糖，得到多糖浸提液。最后，黄菇菌丝多糖经过的浓缩、脱蛋白、脱色、分离精制和干燥，得到多糖干品。与传统的多糖提取方法比较，本发明工艺可操作性强，设备简单，无需试剂和化学反应，成本低，有效地缩短了提取时间，提高了多糖得率。
Description
技术领域本发明涉及一种黄菇菌丝多糖的提取方法。
背景技术真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体及发酵液中分离出的活性物质，是由10个以上的单糖主要以β-1，3和β-1，6糖苷键连接而成的不溶于高浓度乙醇、正丁醇及丙酮等有机溶剂的高分子聚合物。它具有调节免疫力、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、降“三高”、修复损伤组织细胞等多种生理功能。在国际上，被称为“生物反应调节物”(biological responsemodifier，简称BRM)。在生物学、医学、药物学、食品科学等领域受到广泛关注。
中国内陆高寒地区是医药发展的宝地，独特的气候特征使得这里的生物资源丰富，种类繁多。由于地理环境特殊，日照时间长，药物活性成分高，疗效格外显著。黄菇是甘南藏区生长的一种具有极高营养价值的野生真菌，又称黄蘑菇、黄环菌、黄绿蜜环菌，为真菌类担子菌纲伞菌目牛肝菌科黄蘑菇的子实体。由于产于无污染地区，其肉细嫩，色美味香，因此深受当地群众喜爱。黄蘑菇(干样)中蛋白质占36.61-39.1％，脂肪14.58％，粗纤维8.66％，富含多种氨基酸和维生素B、C及铁、钙、硒等多种元素。药理研究表明，黄菇子实体多糖具有降血压、降血脂、抵抗病毒、保护肝脏的作用，此外还具有消炎、预防和治疗癌症的功效。对于国内高寒地区黄菇菌丝多糖的提取方法目前尚未见相关报道。
发明内容鉴于上述，本发明的目的在于提供一种黄菇菌丝多糖的制备方法。具体工艺过程为：黄菇菌丝进行发酵培养，优化黄菇菌丝多糖的发酵条件，确定实验最佳条件，在此基础之上，进行多批次的5L小型发酵实验，对发酵液离心收集菌丝体，烘干粉碎，采用超声波辅助热水浸提法提取黄菇中的真菌多糖，得到多糖浸提液。最后，再经过浓缩、脱蛋白、脱色、分离精制和干燥，得到多糖干品。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种黄菇菌丝多糖的制备方法，其步骤是：
1.真菌的发酵培养
①PDA斜面培养基：将一定量的马铃薯洗净去皮切碎，加水煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入葡萄糖和琼脂，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
②种子培养基：将一定量的马铃薯洗净去皮切碎，加水煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入葡萄糖，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
③发酵培养基：将一定量的马铃薯洗净去皮切碎，加水煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入葡萄糖，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
将黄菇菌丝接种在PDA斜面培养基上，于28℃恒温培养4-10天后，置于4℃冰箱中备用。将菌种经活化培养后的菌丝体接入种子培养基中，在28℃条件下振荡培养4-10天，制得菌种种子液。将菌种种子液接入发酵培养基中，在28℃条件下振荡发酵培养4-10天，初始pH4.0-8.0，装瓶量30-60％，接种量5-20％，转100-300r/min。
2.黄菇菌丝多糖的提取
采用超声波辅助热水浸提法提取黄菇中的菌丝多糖，在浸提温度70-95℃、料液比1∶10-1∶30(g/mL)、超声时间5-20min、浸提次数2-4次、提取时间0.5-3h条件下提取多糖，得到多糖浸提液。
3.黄菇菌丝多糖的浓缩
将多糖浸提液离心，取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4左右，得到多糖浓缩液。
4.黄菇菌丝多糖的脱蛋白
采用Sevag法去除多糖浓缩液中的游离蛋白，按照多糖浓缩液的1/4体积加入Sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，充分混合搅拌，离心除掉变性蛋白质，反复多次直到蛋白质除尽为止，得到多糖提取液。
5.黄菇菌丝多糖的脱色
采用离子交换法对多糖提取液进行脱色，得到多糖流出液。
6.黄菇菌丝多糖的分离精制
将多糖流出液采用半透膜逆向流水透析，之后加入一定体积的乙醇，在4℃下静置24h，离心所得沉淀用无水乙醇多次洗涤，之后将得到的沉淀干燥至恒重，即得多糖干品。
本发明的优点和产生的有益效果：
1.本发明提供了一种来源独特、易于实现生产工艺的连续化和工业化的黄菇菌丝多糖。
2.采用超声波辅助热水浸提法取代以往的单独水提，与原来工艺相比，降低了提取液黏度、有效缩短了提取时间，多糖得率显著提高。超声波辅助提取黄菇菌丝多糖是利用超声波空化产生的极大压力使真菌细胞壁及整个生物体破裂，同时产生的刺激效应也能加速真菌胞内多糖的释放、扩散及溶解，具有提取效率高、时间短、温度低、多糖结构稳定等优点。
3.本工艺无需试剂和化学反应，对多糖活性破坏小、可操作性强，设备简单，成本低。
具体实施方式
本发明采用的菌株为：黄菇Russula lutea(Huds.)Fr.采集在位于海拔在3000米以上的属于青藏高原的甘肃甘南藏区草原，经组织分离获得黄菇菌丝。
本发明所使用的试剂：蛋白胨(OXIDE)，牛肉提取物(BBI)，琼脂(BBI)，马铃薯(市售)，所有试剂均为分析纯；苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂：食品级。
下面，利用实施例对本发明的技术方案再作进一步的说明：
1.黄菇菌丝的发酵培养
①PDA斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，称取100g，加水500ml煮沸30mm，用纱布过滤，向其中加入10g葡萄糖，7.5g琼脂，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
②种子培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，称取100g，加水500ml煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入10g葡萄糖，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
③发酵培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，称取100g，加水500ml煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入10g葡萄糖，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
将黄菇菌丝接种在PDA斜面培养基上，于28℃恒温培养4-10天后，置于4℃冰箱中备用。将菌种经活化培养后的菌丝体接入种子培养基中，在28℃条件下振荡培养4-10天，制得菌种种子液。将菌种种子液接入发酵培养基中，在28℃条件下振荡发酵培养4-10天，初始pH4.0-8.0，装瓶量30-60％，接种量5-20％，转速100-300r/min。
2.黄菇菌丝多糖的提取
黄菇菌丝经液体培养后，取发酵液在高速冷冻离心机于5000r/min离心10-30min，收集菌丝体。菌丝体用蒸馏水洗涤后在真空干燥箱于50℃-80℃下烘干，磨成粉。采用烘干恒重法测定生物量菌体干重。
菌丝体干重(g/mL)＝菌丝体干重(g)/培养液取样体积(mL)
用分析天平称取菌丝体干粉末放入三角瓶中，加入一定量的蒸馏水，放入恒温水浴锅中，在浸提温度70-95℃、料液比1∶10-1∶30(g/mL)、超声时间5-20min、浸提次数2-4次、提取时间0.5-3h条件下提取多糖，得到多糖浸提液。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)＝粗多糖总质量(mg)/黄菇菌粉质量(g)
3.黄菇菌丝多糖的浓缩
取多糖浸提液在高速冷冻离心机于4000r/min离心过滤，取上清液，在温度50℃、0.06-0.08MPa真空度下，用旋转蒸发仪将上清液浓缩至原体积的1/4左右，得到多糖浓缩液。
4.黄菇菌丝多糖的脱蛋白
Sevag法是去除游离蛋白的有效方法。按照多糖水溶液1/4体积加入Sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，充分混合搅拌30-60min，用高速冷冻离心机9000r/min离心10-30min，除掉变性蛋白质，将水相再加入相当于其体积1/4的氯仿-正丁醇溶液，重复操作10-15次，直到多糖提取液与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽。
5.黄菇菌丝多糖的脱色
用量筒量取多糖提取液20-100mL，以2-5mL/min的流速通过苯乙烯系大孔弱碱性阴树脂离子交换树脂床，收集后用紫外分光光度计在460nm波长测量多糖流出液的比色值。
脱色率＝[(脱色后的透色比-脱色前的透色比)/脱色后的透色比]*100％
6.黄菇菌丝多糖的分离精制
将脱色后的上清液采用半透膜逆向流水透析1-3d，透析液浓缩至小体积，加入2-4倍体积的95％乙醇，在4℃下静置24h，之后用高速冷冻离心机9000r/min离心10-30min，所得沉淀用无水乙醇多次洗涤，之后将得到的沉淀在50℃下干燥至恒重，即得多糖干品。
试验例1
发酵条件
其他参数保持不变，在不同pH值4.0-8.0条件下发酵多糖，确定最适pH。
其他参数保持不变，在不同培养时间4-10d条件下发酵多糖，确定最佳的培养时间。
其他参数保持不变，在不同装液量75-150mL/250mL条件下发酵多糖，确定最适装液量。
试验例2
α-葡萄糖苷酶5L小型发酵实验
在试管和摇瓶培养的基础上采用5L发酵罐完成小型发酵实验。培养基选用经优化的小型发酵用液体培养基，发酵条件：接种量为5-20％，pH4.0-8.0，培养温度20-40℃，培养时间4-10d。将试管培养的菌株接入到三角瓶中，放置在摇床上，搅拌速度100-250r/min，温度20-40℃培养4-10d后多糖含量。把培养4-10d后的三角瓶中的菌株，接入到发酵罐中，搅拌速度100-250r/min，通气量1.0-2.0，温度20-40℃培养4-10d后测定多糖含量。
试验例3
提取条件
其他参数保持不变，在不同液料比1∶10-1∶30时进行提取，确定最佳液料比。
其他参数保持不变，在不同温度70-95℃条件下进行提取，确定最佳提取温度。
其他参数保持不变，在不同浸提次数2-4次条件下进行提取，确定最佳浸提次数。
其他参数保持不变，在不同超声时间5-20min时进行提取，确定最佳超声时间
其他参数保持不变，在不同提取时间0.5-3h时进行提取，确定最佳提取时间。
Claims (1)
1.一种高寒地区黄菇菌丝多糖的制备方法，其步骤是：
1.真菌的发酵培养
①PDA斜面培养基：将一定量的马铃薯洗净去皮切碎，加水煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入葡萄糖和琼脂，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
②种子培养基：将一定量的马铃薯洗净去皮切碎，加水煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入葡萄糖，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
③发酵培养基：将一定量的马铃薯洗净去皮切碎，加水煮沸30min，用纱布过滤，向其中加入葡萄糖，自然pH，1.05Kg/cm2灭菌20min。
将黄菇菌丝接种在PDA斜面培养基上，于28℃恒温培养4-10天后，置于4℃冰箱中备用。将菌种经活化培养后的菌丝体接入种子培养基中，在28℃条件下振荡培养4-10天，制得菌种种子液，将菌种种子液接入发酵培养基中，在28℃条件下振荡发酵培养4-10天，初始pH4.0-8.0，装瓶量30-60％，接种量5-20％，转速100-300r/min。
2.黄菇菌丝多糖的提取
采用超声波辅助热水浸提法提取黄菇中的黄菇菌丝多糖，在浸提温度70-95℃、料液比1∶10-1∶30(g/mL)、超声时间5-20min、浸提次数2-4次、提取时间0.5-3h条件下提取多糖，得到多糖浸提液。
3.黄菇菌丝多糖的浓缩
取多糖浸提液离心取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4左右，得到多糖浓缩液。
4.黄菇菌丝多糖的脱蛋白
采用Sevag法去除多糖浓缩液中的游离蛋白，按照多糖浓缩液的1/4体积加入Sevag试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，充分混合搅拌，离心除掉变性蛋白质，反复多次直到蛋白质除尽为止，得到多糖提取液。
5.黄菇菌丝多糖的脱色
采用离子交换法对多糖提取液进行脱色，得到多糖流出液。
6.黄菇菌丝多糖的分离精制
将脱色后的多糖流出液采用半透膜逆向流水透析，之后加入一定体积的乙醇，在4℃下静置24h，离心所得沉淀用无水乙醇多次洗涤，之后将得到的沉淀在50℃下干燥至恒重，即得多糖干品。
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