CN105200102B - 从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：产朊假丝酵母种子培养和发酵；收集发酵培养完毕的发酵液，离心，收集的细胞冷冻；将冷冻后的产朊假丝酵母细胞加入硫酸溶液中，放置15～30分钟后离心分离，收集上清液；此时细胞内的还原型谷胱甘肽从胞内释放出来溶解在硫酸溶液中，完成提取。本发明将收集的细胞冷冻处理以增加细胞壁渗透性；将冷冻处理后的细胞加入强酸溶液中，在强酸溶液中胞内还原型谷胱甘肽完全释放出来，而胞内其他大分子物质如蛋白质、糖类、核酸等则基本留在胞内，简化了后续的纯化操作，降低了纯化成本，实现了高效、清洁化提取；同时在本发明的提取条件下还原型谷胱甘肽未被破坏。
Description
技术领域
本发明涉及一种谷胱甘肽的制备方法，具体涉及一种从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽，即-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物。作为生物体内的非蛋白巯基化合物，谷胱甘肽主要有还原型(G-SH)和氧化型(G-S-S-G)两种形态，在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。还原型谷胱甘肽作为氨基酸类生化药物，可用于治疗肝病、重金属中毒等疾病，最近发现还原型谷胱甘肽还具有抗爱滋病毒功效。
目前生产还原型谷胱甘肽的主要方法是发酵法，即以廉价的糖类等原料为营养物质，利用微生物体内物质和能量代谢途径来进行还原型谷胱甘肽生物合成的方法。一般情况下微生物细胞中还原型谷胱甘肽的含量不高，仅为干重的0.5%～1.0%，因为过高含量的还原型谷胱甘肽容易破坏体内已平衡的氧化还原环境。由于还原型谷胱甘肽是一种胞内产物，发酵结束后需要对还原型谷胱甘肽进行提取纯化。
目前从胞内提取还原型谷胱甘肽主要方法有溶剂萃取法、热水抽提法及超声波破碎抽提法。
其中溶剂萃取法是通过增加细胞壁通透性以完成提取，溶剂的种类、温度和提取时间对抽取率影响较大，用甲酸、液氨、硫酸或三氯乙酸作溶剂萃取时提取率低；用乙醇提取时可以不破坏细胞壁，杂质含量少，能耗低，但是乙醇抽提完毕需要回收处理，增加了提取成本。超声波破碎主要问题是破壁后胞内蛋白质、核酸等杂质全部溶出，离心后容易浑浊，不利于后续处理；超声破碎耗费时间长，需要有效的降温系统，能耗大，不利于工业生产。
热水抽提法是从发酵液中提取谷胱甘肽应用较早的方法，例如中国专利文献CN100455592 C（申请号 200610040606.3）公开了一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法，采用的是沸水煮法，将谷胱甘肽发酵液经离心得到酵母细胞液、用硫酸调节酵母细胞液pH值为1至2、将调节好pH值的酵母细胞液倒进沸水中进行沸水破壁、阳离子交换后收集富含谷胱甘肽的浓缩液、真空浓缩得谷胱甘肽超浓缩液、将谷胱甘肽超浓缩液冷冻干燥得到白色粉末状谷胱甘肽、成品包装而得到成品谷胱甘肽。
中国专利文献CN 104130310 A（申请号 201410231642.2）公开了一种谷胱甘肽的分离纯化方法，将酵母发酵液离心，收集酵母，加入50℃～90℃热水抽取5～30min，调节抽取液的pH值为1.5～3，将提取液进行过滤或离心，收集提取液；提取液采用超滤法去除大分子的蛋白质、多糖等杂质，然后采用纳滤膜过滤的方法去除大部分的小分子氨基酸、单糖类、无机盐等杂质；以纳滤浓缩液为原料，采用强酸性阳离子交换树脂吸附谷胱甘肽，吸附达到穿透点后洗脱；将洗脱液减压浓缩，加入三倍体积的乙醇进行沉淀，沉淀物冷冻烘干，得到谷胱甘肽产品，纯度达95%以上。
热水抽提法方法简单，成本较低，但容易使还原型G-SH转变成G-S-S-G，而且胞内其他物质如蛋白质、糖类及核酸等大分子也会随之释放出来，增加后续纯化难度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种提取完全、成本低的从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法。
实现本发明目的的技术方案是一种从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
①产朊假丝酵母种子培养和发酵。
②收集步骤①发酵培养完毕的产朊假丝酵母发酵液，离心后去除上清液，收集的细胞在-15℃～-25℃下冷冻20～30分钟。
③将步骤②冷冻后的产朊假丝酵母细胞加入硫酸溶液中，硫酸溶液的pH值为1～2， 20℃～35℃下放置15～30分钟后, 产朊假丝酵母细胞内的还原型谷胱甘肽从胞内释放出来溶解在硫酸溶液中，完成从产朊假丝酵母发酵液中对谷胱甘肽的提取，离心分离，收集上清液。
上述步骤③中，硫酸溶液中产朊假丝酵母细胞的浓度为0.08g/mL～0.12g/mL。
上述步骤①产朊假丝酵母种子培养时，将产朊假丝酵母菌株接种于种子培养基中，28℃～32℃下培养18～28小时，摇床转速200～250rpm，培养至对数期时停止培养，得到的种子液待发酵培养。
步骤①产朊假丝酵母发酵时，先将种子液按8%～10%的接种量接种在发酵基本培养基中分批培养8～10h，再按照细胞比生长速率0.15h-1～0.25h-1指数流加培养11～13h，接着以5.0～6.0 g（h﹒L）-1恒数流加培养23～25h后；向罐内加入三种氨基酸，加入后罐内谷氨酸 5.5～6.5 mmol/L、甘氨酸 5.0～6.0mmol/L、半胱氨酸6.0～7.0 mmol/L，继续培养25～35h完成产朊假丝酵母的发酵培养。
上述分批培养时所述发酵基本培养基组成为：葡萄糖15 g/L，硫酸铵5 g/L，酵母膏2 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁0.25 g/L，发酵基本培养基的pH 值为5.5；
上述指数流加培养和恒数流加培养所用的均为流加培养基，流加培养基组成如下：葡萄糖500 g/L，硫酸铵36 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，其中葡萄糖单独灭菌后与其它成分混合。
本发明具有积极的效果：（1）本发明的提取方法首先将产朊假丝酵母（Candidautilis，简写为C.utilis）培养并发酵，得到的发酵液离心分离，去除上清液，收集的细胞在-20℃～-30℃下冷冻处理, 以增加C.utilis细胞壁渗透性；将冷冻处理后的C.utilis细胞加入低pH值的强酸溶液中，在低pH值的强酸溶液中胞内还原型谷胱甘肽完全释放出来，而胞内其他大分子物质如蛋白质、糖类、核酸等则基本留在胞内，简化了后续的纯化操作，降低了纯化成本，实现了高效、清洁化提取C.utilis细胞中G-SH；同时在本发明的提取条件下还原型谷胱甘肽未被破坏。
（2）用低pH值的强酸溶液提取GSH时，只需使用少量的强酸溶液，G-SH提取结束后，强酸溶液还可进一步循环利用，具有环境友好性。
（3）本发明的提取方法提取时间短，20分钟左右细胞内的谷胱甘肽就能完全释放至强酸溶液中，因此本方法提取效率高。
（4）本发明的提取方法工艺简单、经济、环保，符合循环经济发展的需要，具有良好的工业应用前景。
具体实施方式
（实施例1）
本实施例的从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法包括以下步骤：
①产朊假丝酵母种子培养和发酵。以产朊假丝酵母(Candida utilis WSH 02-08)作为生产菌株，首先进行种子培养，培养至对数后期时停止培养，得到的种子液待发酵培养。
种子培养基组成如下（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10， 溶剂为水，pH值5.5～6.5。
具体的种子培养时，将产朊假丝酵母(Candida utilis WSH 02-08)菌株接种于种子培养基中，28℃～32℃下培养18～28小时，摇床转速200～250rpm，当培养到对数后期时停止培养，得到的种子液待发酵培养。
在5L发酵罐中装入3L发酵基本培养基，将上述种子液按8%～10%（v/v）接种量接种在发酵基本培养基中分批培养8～10h（本实施例中为9h），再按照细胞比生长速率0.15h-1～0.25h-1指数流加培养11～13h（本实施例中为12h），接着以5.0～6.0 g（h﹒L）-1恒数流加培养23～25h（本实施例中为24h）后，发酵罐内细胞浓度达102 g/L，此时向罐内加入三种氨基酸，加入后罐内谷氨酸 6 mmol/L、甘氨酸 5.5 mmol/L、半胱氨酸 6.5 mmol/L；继续培养25～35h（本实施例中为30 h），完成产朊假丝酵母的发酵培养。
上述发酵基本培养基组成如下（g/L）：葡萄糖15，硫酸铵5，酵母膏2，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.25，溶剂为水，pH值为5.5。
指数流加培养和恒数流加培养所用的均为流加培养基，流加培养基组成如下（g/L）：葡萄糖500，硫酸铵36，磷酸二氢钾5，硫酸镁0.5，溶剂为水，；其中葡萄糖单独灭菌后与其它成分混合。
取上述反应罐内发酵培养完毕的发酵液25mL，在转速3000rpm下离心10min，去除离心管内上清液，收集产朊假丝酵母细胞。将收集的产朊假丝酵母细胞加入乙醇中，产朊假丝酵母细胞与乙醇的体积比为0.4:1，在乙醇中抽提30分钟后，离心分离，上清液注入高效液相色谱中测定G-SH含量，经计算步骤①发酵培养的产朊假丝酵母细胞中G-SH含量为1.81%，进一步的，反应罐内发酵培养完毕的发酵液中，还原型谷胱甘肽的产量为1847mg/L。
另外，按照中国专利文献CN 104130310 A（申请号 201410231642.2）的方法提取胞内的谷胱甘肽，取纳滤浓缩液注入高效液相色谱中测定GSH含量，计算步骤①发酵培养的产朊假丝酵母细胞中GSH含量为1.81%。
②收集步骤①的发酵罐中发酵培养完毕的产朊假丝酵母发酵液，本实施例中收集到发酵液5000g，将发酵液在3000rpm转速下离心10min，离心去除上清液，收集的细胞在-15℃～-25℃（本实施例中为-20℃）下冷冻20～30分钟（本实施例中为30分钟）。
③将步骤②冷冻后的产朊假丝酵母细胞2.5g加入25mL硫酸溶液中，其中硫酸溶液的pH值为1～2（本实施例中为1.2），硫酸溶液中产朊假丝酵母细胞的浓度为0.1g/mL。
室温20℃～35℃下放置15～30分钟（本实施例中为20分钟），此时产朊假丝酵母细胞内的还原型谷胱甘肽从胞内释放出来溶解在硫酸溶液中，完成本实施例从产朊假丝酵母发酵液中对谷胱甘肽的提取；然后3000rpm转速下离心分离10min，收集上清液。
取步骤③含有还原型谷胱甘肽的上清液0.2µL注入高效液相色谱中测定GSH含量，测得上清液中还原型谷胱甘肽的浓度为0.16wt%，继而计算得到步骤①发酵培养的产朊假丝酵母细胞中GSH含量为1.80wt%，进一步的，反应罐内发酵培养完毕的发酵液中，还原型谷胱甘肽的产量为1843mg/L。
由上述数据可知，本发明从产朊假丝酵母细胞中提取谷胱甘肽的方法的效果与溶剂萃取法和热水抽提法相当。
上清液中谷胱甘肽的纯化按照现有技术进行，例如可以使用阳离子交换树脂。
Claims (5)
1.一种从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
①产朊假丝酵母种子培养和发酵；
②收集步骤①发酵培养完毕的产朊假丝酵母发酵液，离心后去除上清液，收集的细胞在-15℃～-25℃下冷冻20～30分钟；
③将步骤②冷冻后的产朊假丝酵母细胞加入硫酸溶液中，硫酸溶液的pH值为1～2， 20℃～35℃下放置15～30分钟后, 产朊假丝酵母细胞内的还原型谷胱甘肽从胞内释放出来溶解在硫酸溶液中，完成从产朊假丝酵母发酵液中对谷胱甘肽的提取，离心分离，收集上清液。
2.根据权利要求1所述的从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤③中，硫酸溶液中产朊假丝酵母细胞的浓度为0.08g/mL～0.12g/mL。
3.根据权利要求1所述的从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤①产朊假丝酵母种子培养时，将产朊假丝酵母菌株接种于种子培养基中，28℃～32℃下培养18～28小时，摇床转速200～250rpm，培养至对数期时停止培养，得到的种子液待发酵培养。
4.根据权利要求3所述的从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于：步骤①产朊假丝酵母发酵时，先将种子液按8%～10%的接种量接种在发酵基本培养基中分批培养8～10h，再按照细胞比生长速率0.15h-1～0.25h-1指数流加培养11～13h，接着以5.0～6.0g（h﹒L）-1恒数流加培养23～25h后；向罐内加入三种氨基酸，加入后罐内谷氨酸 5.5～6.5 mmol/L、甘氨酸 5.0～6.0mmol/L、半胱氨酸6.0～7.0 mmol/L，继续培养25～35h完成产朊假丝酵母的发酵培养。
5.根据权利要求4所述的从产朊假丝酵母发酵液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于：分批培养时所述发酵基本培养基组成为：葡萄糖15 g/L，硫酸铵5 g/L，酵母膏2 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁0.25 g/L，发酵基本培养基的pH 值为5.5；
指数流加培养和恒数流加培养所用的均为流加培养基，流加培养基组成如下：葡萄糖500 g/L，硫酸铵36 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，其中葡萄糖单独灭菌后与其它成分混合。
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