CN105400858A - 一种北虫草多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种北虫草多肽的制备方法，包括以下步骤：1)以北虫草为培养基的主要成分，接种肠道益生菌进行发酵培养；2)向培养液中加入酶进行酶解得到酶解后的培养液；3)酶解后的培养液进行固液分离，收集上清液过滤后即为北虫草多肽液。利用本方法提取的蛹虫草多肽，提取效率高，产品多肽含量高。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种北虫草多肽的制备方法。
背景技术
北虫草的培育过程是放生野生冬虫夏草的生育条件开展仿生栽培的结果；其富有虫草素、虫草酸、虫草多糖、微量元素、SOD酶、蛋白质，脂肪等多种营养物质，具有很高的营养价值。北虫草的用途广泛，适用于饮料，酒类、保健品等，市场需求量大，前景广阔，产品价值高。目前国内外对北虫草的研究较多，北虫草的开发利用多以提取虫草素，虫草多糖，虫草酸等活性物质为主。关于北虫草制备多肽的研制方法较少。如何更好地开发利用北虫草这一新资源食品，使其丰富的营养得到更充分的利用，同时最大限度地减少对环境的污染，是国内众多专家关注的焦点。
北虫草中含有丰富的蛋白质，而多肽则是蛋白质的初级形式，涉及人体激素调节和神经调节，具有调节身体机能，维持生命活力等功能的活性物质。现有技术中对北虫草多肽的提取主要有水提醇沉法和酶解法，存在提取效率低，提取得到的多肽活性低等问题。
发明内容
本发明提供一种北虫草多肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将北虫草制成北虫草培养基，并向其中接种肠道益生菌进行发酵培养；
2)将所述步骤1)发酵培养得到的培养液与酶混合，进行酶解得到酶解后的培养液；
3)将所述酶解后的培养液进行固液分离，将所述固液分离后的上清液过滤后，得到北虫草多肽液；
将所述北虫草多肽液真空冷冻干燥粉碎，得到北虫草多肽。
优选的，所述的肠道益生菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌中的一种或几种；
优选的，所述的肠道益生菌的发酵培养采用静置培养，发酵培养的培养温度优选的为40～45℃，更优选的为42℃，培养时间优选的为24～48小时，更优选的为36小时。
优选的，所述的北虫草培养基包括以下质量份的组分：
80～100份北虫草；
800～1000份无菌去离子水；
5～10份葡萄糖。
所述的烘干的北虫草优选的通过高温60～80℃烘干至恒重，更优选的温度为70℃，所述的过筛优选的为过80～100目筛，更优选的为过90目筛。
所述的酶优选的为纤维蛋白酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、碱式蛋白酶和风味蛋白酶。
所述的酶解优选的包括以下步骤：
(1)将纤维蛋白酶和果胶酶组成的复合酶与北虫草发酵培养液混合，在41～46℃的温度下酶解2～3小时，得到酶解液A；
(2)将木瓜蛋白酶和碱式蛋白酶组成的复合酶与酶解液A混合，在58～62℃的温度下酶解3～5小时，得到酶解液B；
(3)将风味蛋白酶与B酶解液混合，在52～58℃的温度下酶解5～6小时，得到酶解液C。
优选的，所述步骤3)中的固液分离为离心，所述的离心的转速优选为8000～10000rpm，更优选的为10000rpm，所述离心的时间为5～10min，更优选的为10min；
所述过滤优选的为分子膜过滤，所述的分子膜优选的规格为5000～10000D。
优选的，所述步骤3)中的沉淀为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的温度优选的为-15～-20℃，更优选的为-18℃，真空度优选的为10-12Pa，更优选的为11Pa，时间优选的为3～15小时，更优选的为10小时。
优选的，所述真空冷冻干燥前将沉淀置于-20℃冷冻10～12小时。
本发明的有益效果：本发明所述的方法提取得到的北虫草多肽，由于结合了微生物的发酵作用，在酶解前已经将北虫草部分分解，使得酶解更加完全，从而使北虫草多肽的提取更彻底，提取效率更高，所得的北虫草多肽的活性高。
具体实施方式
本发明提供一种微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
1)将北虫草制成北虫草培养基，并向其中接种肠道益生菌进行发酵培养；
2)将所述步骤1)发酵培养得到的培养液与酶混合，进行酶解得到酶解后的培养液；
3)将所述酶解后的培养液进行固液分离，将所述固液分离后的上清液过滤后，得到北虫草多肽液；将所述北虫草多肽液真空冷冻干燥粉碎，得到北虫草多肽。
本发明微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法步骤1)中所述的北虫草优选的通过烘干后粉碎得到的，所述的烘干和粉碎设备为本领域常规设备，无其他特殊要求，所述烘干具体可采用烘箱，烘干的温度优选为60～80℃，更优选的为70℃，所述的粉碎具体的可采用小型粉碎机；粉碎后的北虫草优选的过80～100目筛，更优选的过90目筛；
所述的北虫草培养基是将粉碎过筛后的北虫草80～100份，无菌去离子水800～1000份，葡萄糖5～10份混合后制备而成；其中所述的葡萄糖为市售分析纯，所述的无菌去离子水为实验室常用的无菌去离子水，无其他特殊要求；
所述的向北虫草培养基中接种肠道益生菌进行发酵培养；其中所述的肠道益生菌具体的可以是保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌中的一种或几种；所述的接种是在无菌条件下进行的，所述的无菌条件即为厌氧操作箱或其他普通实验室可以实现的无菌厌氧条件；所述的发酵培养采用静置培养，具体的发酵培养优选的培养温度为40～45℃，更优选的为42℃，优选的培养时间为24～48小时，更优选的为36小时。
本发明微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法步骤2)中所述的将发酵培养得到的培养液与酶混合，进行酶解得到酶解后的培养液；其中所述的酶优选的为纤维蛋白酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、碱式蛋白酶和风味蛋白酶；所述的酶解具体的包括以下步骤：
(1)优选的将纤维蛋白酶和果胶酶以1∶1的重量比例混合组成的复合酶与北虫草发酵培养液混合酶解，所述的酶解温度优选为41～46℃，更优选的为44℃，酶解时间优选为2～3小时，更优选为2.5小时，酶解后得到酶解液A；
(2)将木瓜蛋白酶和碱式蛋白酶以1∶1的重量比例混合组成的复合酶与酶解液A混合继续酶解，酶解温度优选为58～62℃，更优选的为60℃，酶解时间优选为3～5小时，更优选为4小时，酶解后得到酶解液B；
(3)将风味蛋白酶与酶解液B混合酶解，酶解温度优选为52～58℃，更优选的为55℃，酶解时间优选为5～6小时，更优选为5.5小时，酶解后得到酶解液C；
本发明微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法步骤2)中所述的酶解具体的采用恒温震荡的方式，优选的震荡频率为30～80rpm，更优选的为50rpm。
本发明微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法步骤3)中所述的固液分离具体的选择离心的方式，离心的转速优选为8000～10000rpm，更优选的为10000rpm，离心的时间优选为5～10min，更优选的为8min；
本发明微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法步骤3)中所述的上清液的过滤优选的为分子膜过滤，过滤用的分子膜优选的规格为5000～10000D；
本发明微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法步骤3)中的所述的上清液的干燥，具体的为真空冷冻干燥，在真空冷冻干燥前将上清液置于-20℃冷冻10～12小时，然后在真空冷冻干燥的温度优选的为-15～-20℃，更优选的为-18℃，真空度优选的为10-12Pa，更优选的为11Pa，时间优选的为3～15小时，更优选的为10小时。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的微生物发酵酶解北虫草多肽的制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1北虫草培养基的制备
北虫草70℃烘干至恒重，粉碎机粉碎，过100目筛，粉碎过筛后的北虫草90份，无菌去离子水902份，葡萄糖8份，混合后充氮气除氧，加入除氧剂，制备成北虫草培养基。
实施例2肠道益生菌在北虫草培养基中的发酵培养
北虫草70℃烘干至恒重，粉碎机粉碎，过100目筛，粉碎过筛后的北虫草90份，无菌去离子水902份，葡萄糖8份，混合后充氮气除氧，加入除氧剂，制备成北虫草培养基。在厌氧工作台内，接种保加利亚乳杆菌至上述的北虫草培养基，接种量为10％，置于厌氧培养箱内42℃静置培养36个小时。
实施例3肠道益生菌在北虫草培养基中的发酵培养
北虫草80℃烘干至恒重，粉碎机粉碎，过90目筛，粉碎过筛后的北虫草90份，无菌去离子水902份，葡萄糖8份，混合后充氮气除氧，加入除氧剂，制备成北虫草培养基。在厌氧工作台内，接种嗜酸乳杆菌，嗜热链球菌至实上述的北虫草培养基，接种量为5％，置于厌氧培养箱内45℃静置培养40个小时。
实施例4微生物发酵北虫草培养液的酶解
将纤维蛋白酶和果胶酶组成的复合酶与实施例3得到的北虫草发酵培养液混合，在42℃的温度下酶解3小时，得到酶解液A1；
(2)将木瓜蛋白酶和碱式蛋白酶组成的复合酶与酶解液A1混合，在60℃的温度下酶解5小时，得到酶解液B1；
(3)将风味蛋白酶与酶解液B1混合，在55℃的温度下酶解5.5小时，得到酶解液C1。
实施例5微生物发酵北虫草多肽的提取
将纤维蛋白酶和果胶酶组成的复合酶与实施例2得到的北虫草发酵培养液混合，在45℃的温度下酶解2.5小时，得到酶解液A2；
(2)将木瓜蛋白酶和碱式蛋白酶组成的复合酶与酶解液A2混合，在58℃的温度下酶解4小时，得到酶解液B2；
(3)将风味蛋白酶与酶解液B2混合，在56℃的温度下酶解5小时，得到酶解液C2。
将所述酶解后的培养液C2，离心10000rpm，10min，进行固液分离，将所述固液分离后得到的上清液用5000D分子膜过滤后，得到北虫草多肽液；将所述固液分离后的沉淀或北虫草多肽液，置于-20℃冷冻12小时后，置于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，条件为：温度-20℃，真空度为11Pa，时间为10小时，得到北虫草多肽。
实施例6北虫草多肽中多糖、腺苷含量和多肽提取率的测定
检测本发明所述的北虫草多肽液中多糖、腺苷的含量，多糖的检测按QB/T2489中规定的方法检验，腺苷的检测按《保健食品检验与评价技术规范》中腺苷的检验的方法测定。本发明所述的北虫草多肽液中多糖的平均含量为2.3％，腺苷的平均含量为11mg/100ml。
蛋白含量的测定采用双缩脲检测法，多肽含量的测定程序：取2.5ml北虫草多肽液，加入2.5ml10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5％的TCA定容至刻度，摇匀。然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml(样液∶双缩脲试剂＝3∶2，V/V)，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml)，计算北虫草多肽的平均提取率为82.3％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种北虫草多肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将北虫草制成北虫草培养基，向所述北虫草培养基中接种肠道益生菌进行发酵培养；
2)将所述步骤1)发酵培养得到的培养液与酶混合，进行酶解得到酶解后的培养液；
3)将所述酶解后的培养液进行固液分离，将所述固液分离后的上清液过滤后，得到北虫草多肽液；将所述北虫草多肽液干燥和粉碎，得到北虫草多肽。
2.根据权利要求1所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述的肠道益生菌为保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述的肠道益生菌的发酵培养为静置培养，所述发酵培养的培养温度为40～45℃，所述发酵培养的时间为24～48小时。
4.根据权利要求1所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述的北虫草培养基包括以下质量份的组分：
80～100份北虫草；
800～1000份无菌去离子水；
5～10份葡萄糖。
5.根据权利要求1所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述的北虫草由60～80℃温度条件下烘干至恒重、粉碎后过80～100目筛得到。
6.根据权利要求1所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述酶为纤维蛋白酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、碱式蛋白酶和风味蛋白酶。
7.根据权利要求6所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述的酶解具体包括以下步骤：
(1)将纤维蛋白酶和果胶酶组成的复合酶与北虫草发酵培养液混合，在41～46℃的温度下酶解2～3小时，得到酶解液A；
(2)将木瓜蛋白酶和碱式蛋白酶组成的复合酶与酶解液A混合，在58～62℃的温度下酶解3～5小时，得到酶解液B；
(3)将风味蛋白酶与B酶解液混合，在52～58℃的温度下酶解5～6小时，得到酶解后的培养液。
8.根据权利要求1所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的固液分离为离心，所述的离心的转速为8000～10000rpm，所述离心的时间为5～10min；
所述过滤为分子膜过滤，所述的分子膜的规格为5000～10000D。
9.根据权利要求1所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的干燥为真空冷冻干燥；
所述真空冷冻干燥的温度为-15～-20℃，真空度为10-12Pa，时间为3～15小时。
10.根据权利要求9所述的北虫草多肽的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥前将沉淀置于-20℃冷冻10～12小时。
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