CN112301085A - 一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法 - Google Patents

一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法，属于微生物技术领域。本发明将产朊假丝酵母与微藻共培养，改善体系供氧平衡，从而提高谷胱甘肽的产量。通过对于培养体系溶解氧的补充与调控，从而改善了产朊假丝酵母的生长状况，使得细胞干重由88g/L提升至103.2g/L，提升了细胞的谷胱甘肽生产性能，并使得谷胱甘肽的产量由893mg/L最高可提升至1283mg/L。本发明所涉及的方法，工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产。

Description

一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法
技术领域
本发明涉及一种产朊假丝酵母耦合微藻培养促进谷胱甘肽合成的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团(故谷胱甘肽常简写为G-SH)，易与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属)等结合，而具有整合解毒作用。
目前，本领域中通常选用产朊假丝酵母的微生物方法发酵生产谷胱甘肽，但高密度培养产朊假丝酵母(Candidautilis)合成谷胱甘肽过程时，由于菌体密度高，导致溶解氧供应不足，影响谷胱甘肽(GSH)产率。严重影响了谷胱甘肽的生产及工业化的应用。
发明内容
为了解决目前存在的问题，本方法通过酵母培养合成谷胱甘肽过程中，添加少量Chlorella protothecoides产生氧气，满足酵母合成谷胱甘肽时氧气供应不足的问题，显著提高菌体生长和谷胱甘肽产率。
本发明提供了一种合成谷胱甘肽的方法，所述方法是将产朊假丝酵母和微藻在含葡萄糖的体系中共培养，生成谷胱甘肽。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)将产朊假丝酵母和微藻分别培养，分别获得产朊假丝酵母种子液和微藻种子液；
(2)将产朊假丝酵母种子液加入反应体系中进行培养，培养8-10h；
(3)步骤(2)结束后，指数流加培养11-13h；
(4)指数流加培养结束后，向发酵体系中添加微藻，并进行恒速流加培养20-30h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)是将产朊假丝酵母加入种子培养基中，在150-250r/min，温度28-30℃，培养20-22h得到种子液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)是将微藻加入种子培养基中，培养至种子液中细胞浓度为4-8g/L，
在本发明的一种实施方式中，将产朊假丝酵母的种子液以5-15mL/100mL的量加入反应体系。
在本发明的一种实施方式中，将微藻的种子液以60-120mL/L的添加量加入反应体系。
在本发明的一种实施方式中，指数流加培养时的转速控制在350-450rpm。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述指数流加培养是向反应体系中添加流加培养基，流加培养基为葡萄糖400-600g/L，硫酸铵30-40g/L，磷酸二氢钾3-6g/L，硫酸镁0.2-1g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述恒速流加培养是指在反应体系中以4-6g/L/h的量加入葡萄糖。
本发明的优点：
本发明针对现有的产朊假丝酵母高密度发酵中，溶解氧供应不足、影响谷胱甘肽产量等问题，将产朊假丝酵母与微藻共培养，改善体系供氧平衡，从而提高谷胱甘肽的产量。通过对于培养体系溶解氧的补充与调控，从而改善了产朊假丝酵母的生长状况，使得细胞干重由88g/L提升至103.2g/L，提升了细胞的GSH生产性能，并使得GSH的产量由893mg/L最高可提升至1283mg/L。本发明所涉及的方法，工序简便、操作性强，可实现规模化、工业化生产。
具体实施方式
流加培养基(g/L)：葡萄糖500，硫酸铵36，磷酸二氢钾5，硫酸镁0.5；其中葡萄糖单独灭菌后与其它成分混合。
GSH浓度的测定：将发酵液在3000r/min下离心10min后，上清液用于培养基中营养成分的测定，沉淀的新鲜湿酵母用蒸馏水洗涤3次后，在浓度为40％(v/v)的稀乙醇溶液中振荡处理2h，温度30℃，3000r/min下离心得到的上清液中富含GSH，经稀释后用作GSH的分析检测。GSH的测定采用DTNB[5,5'-二硫双-(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法。在2mL体积的石英比色皿中顺序加入100μL 6mmol/L DTNB，700μL 0.3mmol/L NADPH和200μL稀释至适当浓度的样品，室温下加入100μL 5.0U/mL谷胱甘肽还原酶启动反应，测定412nm处反应体系的起始OD值以及1.5min后的OD值，根据OD值的变化速率与GSH浓度的关系计算出样品中GSH的含量。GSH浓度对细胞干重的百分比即为胞内GSH含量。
细胞干重的测定：取25mL发酵液，经3000r/min下离心后再用蒸馏水洗涤2次，得到的湿酵母细胞在105℃下烘至恒重，计算出细胞干重(dry cell weight，DCW)。
实施例1
(1)菌株：产朊假丝酵母Candidautilis，记载于梁国斌等《分批培养产朊假丝酵母合成谷胱甘肽的前体氨基酸优化策略》(公开于2017年)；
(2)产朊假丝酵母培养基：
斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，琼脂20，pH 6.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH 6.0。
发酵基本培养基(g/L)：葡萄糖15，硫酸铵5，酵母膏2，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.25，pH 5.5。
采用细胞高密度培养合成谷胱甘肽：
三阶段(分批培养、指数速率流加和恒速流加)细胞高密度培养策略：
分批培养时初糖(葡萄糖)浓度为15g/L，发酵9h时葡萄糖消耗完毕，后再经过12h指数速率流加，指数流加结束后进行24h恒数流加(补糖速度为5.5g/L/h)。
产朊假丝酵母种子液培养：将斜面种子在30℃活化3～4h后，取一环酵母菌体接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇床转速200r/min，温度30℃，培养20～22h得到种子液。
发酵罐分批发酵培养：全自动发酵罐KFT-5L(KoBioTechco.，Ltd，韩国)中装发酵培养基2.5L，将种子液以10mL/100mL的接种量接种至发酵培养基中，搅拌转速300r/min，通气量1.2vvm，温度范围29～30℃，pH采用pH电极进行在线检测，通过自动加料泵流加3mol/LH2SO4和3mol/L NaOH溶液进行调节以维持pH变化在5.5±0.1以内。每隔2～3h取样一次进行检测。
流加发酵培养：流加培养包括指数和恒速流加，向发酵罐中按要求流加营养物，并提高搅拌转速至400r/min，通气量1.5vvm，温度、pH和溶氧分别采用相应的电极进行自动监测。
分批培养9h后，进行流加发酵培养，流加发酵培养包括指数和恒速流加培养，将搅拌转速调整到300，350，400，450，500rpm，通气量1.5vvm，菌体量和谷胱甘肽产量如表1所示。
表1不同溶氧对菌体量和谷胱甘肽产量的影响
转速/rpm 300 350 400 450 500
细胞干重(g/L) 88 97 102 98 95
GSH产量(mg/L) 893 962 981 968 943
结果分析：由表1可知，将转速控制在350-450rpm之间，GSH的产量均可达到960mg/L以上，转速控制在400rpm菌体量和GSH产量相对最高。
实施例2
(1)菌种：微藻(Chlorella protothecoides)，即小球藻，记载于梁国斌等《优化鸡粪微生态分解及添加降解液促进微藻过量合成生物油脂》(公开于2017年)。
(2)培养基：
斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉1，甘氨酸1，琼脂40，pH6.0。
种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉1，甘氨酸1，pH6.0。
基本培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉1，甘氨酸1，溶于1升BBM溶液中，pH 6.0。BBM成分(g/L)：NaNO3 0.25，MgSO4`7H2O 0.075，NaCl 0.025，K2HPO4.3H2O 0.075，KH2PO4 0.175,CaCl2.2H2O 0.025，其中微量元素成分(10-3g/L)为：ZnSO4.7H2O 8.82,MnCl2.4H2O 1.44，MoO3 0.71，CuSO4。5H2O 1.57，Co(NO3)2。6H2O 0.49，H3BO3 11.42，EDTA 50.0，KOH 31.0，FeSO4.7H2O 4.98。
微藻种子液培养：将斜面种子在30℃活化3～4h后，取一环菌体接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇床转速200r/min，温度30℃，培养20～22h得到种子液。
参照实施例1，在酵母高密度培养转速控制在400rpm基础上，分批培养9h并指数流加培养12h结束后，向发酵体系中添加分批培养120h的微藻种子液(细胞浓度为5.96g/L)。
将微藻种子液以20mL/L的量加入到酵母高密度培养液中，经过24h恒速流加培养后，测定酵母菌体量和GSH量，分别为103.2g/L和1015mg/L，由此可见，微藻的添加可促进产朊假丝酵母的生长，并促进产软假丝酵母合成GSH的能力，从而使得发酵体系中的GSH产量得到提升。细胞如表2所示。
微藻的添加量对GSH产量的影响：
分别取不同量微藻培养液加入到酵母高密度培养液中，经过24h恒速流加培养后，分别测定菌体量和GSH产率，结果如表2所示，添加微藻对GSH产量的提升均有一定的提升，在微藻添加量为80-120ml/L时，可使得细胞干重达到110g/L以上，GSH产量达到1200mg/L以上。
表2不同微藻添加量对菌体生长和GSH合成的影响
微藻添加量(ml/L) 20 40 60 80 100 120
细胞干重(g/L) 103.2 106.5 109.4 113.6 113.9 112.3
GSH产量(mg/L) 1015 1072 1192 1268 1283 1253
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，将产朊假丝酵母和微藻在含葡萄糖的体系中共培养，生成谷胱甘肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将产朊假丝酵母和微藻分别培养，分别获得产朊假丝酵母种子液和微藻种子液；
(2)将产朊假丝酵母种子液加入反应体系中进行培养，培养8-10h；
(3)步骤(2)结束后，指数流加培养11-13h；
(4)指数流加培养结束后，向发酵体系中添加微藻，并进行恒速流加培养20-30h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)是将产朊假丝酵母加入种子培养基中，在150-250r/min，温度28-30℃，培养20-22h得到种子液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)是将微藻加入种子培养基中，培养至种子液中细胞浓度为4-8g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将产朊假丝酵母的种子液以5-15mL/100mL的量加入反应体系。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将微藻的种子液以60-120mL/L的添加量加入反应体系。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，指数流加培养时的转速控制在350-450rpm。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述指数流加培养是向反应体系中添加流加培养基，流加培养基为葡萄糖400-600g/L，硫酸铵30-40g/L，磷酸二氢钾3-6g/L，硫酸镁0.2-1g/L。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述恒速流加培养是指在反应体系中以4-6g/L/h的量加入葡萄糖。
10.权利要求1-9任一项所述方法在生产谷胱甘肽中的应用。
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Application publication date: 20210202

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