CN108004290A

CN108004290A - 用于生产赤霉酸的发酵培养基

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Publication number: CN108004290A
Application number: CN201810048034.6A
Authority: CN
Inventors: 刘健; 杨宝强; 沈颂娣; 熊仁科; 齐昊
Original assignee: LONGMANG FUSHENG SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd SICHUAN PROV
Current assignee: LONGMANG FUSHENG SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd SICHUAN PROV
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2038-01-18
Also published as: CN108004290B

Abstract

本发明提供了一种用于赤霉酸的发酵培养基，包括：玉米蛋白粉10～40g/L；磷酸二氢钾1～10g/L；小分子有机碳源5～30g/L；植物油0.5～5g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸铵0.5～2g/L；微量元素0.1～1g/L。与现有技术相比，本发明以玉米蛋白粉作为有机氮源，其蛋白质含量较高，达50％以上，能够实现赤霉素高密度发酵，且能够避免如花生饼粉产生黄曲霉的隐患，保证菌体的合成与代谢，使其能够快速稳定的发酵；添加植物油不仅能够为发酵提供碳源，还可有效减少发酵气泡逃液等情况的发生；在发酵培养基中添加微量元素能够全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性。

Description

用于生产赤霉酸的发酵培养基

技术领域

本发明属于赤霉酸制备技术领域，尤其涉及一种用于生产赤霉酸的发酵培养基。

背景技术

赤霉酸是通过一种赤霉菌发酵培养代谢得到的一类次级代谢产物，被分离、鉴定和命名的一共有116种，其中在农业中应用最广泛的就是GA₃，在我国农业生产中发挥着巨大的作用。

GA₃具有非常高的植物调节活性，对各种农作物的生长和发育都有很明显的调节作用。在北方，GA₃主要应用于葡萄、红枣、山楂、油桃等经济作物上，在花期喷洒一定浓度赤霉酸溶液可以有效提高果树的坐果率，促进果实生长发育，果树产量提高20％～30％左右。在南方，赤霉酸主要应用于杂交水稻制种上，调节水稻父母本在同一时间开花，使母本授粉率大幅提高，进一步提高了杂交水稻种子的产量，降低了种子的生产成本，为农民减轻了负担。

现有赤霉酸的发酵培养基通常采用液化淀粉、花生饼粉、黄豆饼粉、硫酸镁与磷酸二氢钾为基础组成，其中花生饼粉与黄豆饼粉是赤霉酸发酵的优良有机氮源，但其作为食品工业的副产物，各批次的成分含量稳定性不能保证，对赤霉酸的发规模稳定发酵生产产生不良影响。此外，花生饼粉还易染上黄曲霉素，影响赤霉酸菌种的正常生产及代谢。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于生产赤霉酸的发酵培养基，该发酵培养基用于生产赤霉酸产量较高且稳定。

本发明提供了一种用于生产赤霉酸的发酵培养基，包括：

优选的，包括：

优选的，所述小分子有机碳源选自蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种。

优选的，所述小分子有机碳源为蔗糖与葡萄糖。

优选的，所述蔗糖与葡萄糖的质量比为(1～2)：(2～1)。

优选的，所述微量元素包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴。

优选的，所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)。

优选的，所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比为1：1：1：0.3：0.3：0.3。

优选的，包括：

本发明提供了一种用于赤霉酸的发酵培养基，包括：玉米蛋白粉10～40g/L；磷酸二氢钾1～10g/L；小分子有机碳源5～30g/L；植物油0.5～5g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸铵0.5～2g/L；微量元素0.1～1g/L。与现有技术相比，本发明以玉米蛋白粉作为有机氮源，其蛋白质含量较高，达50％以上，能够实现赤霉素高密度发酵，且能够避免如花生饼粉产生黄曲霉的隐患，保证菌体的合成与代谢，使其能够快速稳定的发酵；同时，添加植物油不仅能够为发酵提供碳源，还可有效减少发酵气泡逃液等情况的发生，避免了物料损失、染菌等潜在风险；另外，在发酵培养基中添加微量元素能够全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种用于生产赤霉酸的发酵培养基，包括：

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

本发明所提供的用于生产赤霉酸的发酵培养基中玉米蛋白粉的含量优选为15～35g/L，更优选为15～30g/L，再优选为20～25g/L，最优选为22g/L。玉米蛋白粉富含丰富的蛋白质，达到50％以上，能够为赤霉素的高密度发酵提供充足的氮源，保证菌体的合成与代谢。

所述磷酸二氢钾的含量优选为3～10g/L，更优选为4～8g/L，再优选为5～7g/L，最优选为6g/L。磷是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递者-三磷酸腺苷(ATP)的成分，在代谢途径的调节方面，磷也起着很重要的作用，磷有利于糖代谢的进行，因此其可促进微生物的生长。磷作为赤霉素合成过程中必不可少的元素，其缺乏会导致赤霉素前体合成受阻，而本发明提高了磷酸二氢钾的浓度，避免了在发酵过程中添加磷酸二氢钾增加人工、操作成本。

按照本发明，所述小分子有机碳源的含量优选为5～25g/L，更优选为8～15g/L，再优选为8～12g/L，最优选为10g/L；所述小分子有机碳源为本领域技术人员熟知的有机碳源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种，更优选为蔗糖与葡萄糖；所述蔗糖与葡萄糖的质量比优选为(1～2)：(2～1)，更优选为(1～1.5)：(1.5～1)，再优选为(1～1.2)：(1.2～1)，最优选为1：1。在本发明中以小分子有机碳源作为发酵碳源，能够为发酵代谢提供快速、缓效利用的碳源，为微生物细胞的生长繁殖提供能源和合成菌体所必须的碳成分，为合成目的产物提供所需的碳成分。在本发明中，蔗糖的加入避免葡萄糖过多造成赤霉素发酵的反馈抑制，影响赤霉素的合成，蔗糖作为葡萄糖的替代碳源，能够及时分解供菌体代谢，又减少了反馈抑制的发生。

所述植物油的含量优选为1～4g/L，更优选为2～3g/L，再优选为2g/L；所述植物油为本领域技术人员熟知的植物油即可，并无特殊的限制，本发明中优选为色拉油、葵花籽油、亚麻仁油、乙基棕榈油与橄榄油中的一种或多种，但硬脂酸会抑制赤霉素的发酵，因此本发明中更优选为色拉油。植物油能够减少发酵过程中泡沫的产生，避免逃液等现象，进而避免了物料损失、染菌等潜在风险；同时植物油还可为发酵提供碳源，为赤霉素的合成提供碳骨架，加速赤霉素的合成。

本发明提供的用于生产赤霉酸的发酵培养基中硫酸镁的含量优选为0.5～1.5g/L，更优选为0.8～1.2g/L，再优选为1g/L；所述硫酸镁为本领域人员熟知的硫酸镁即可，并无特殊的限制，本发明中优选为七水合硫酸镁。镁元素是许多酶的活化剂，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成、磷酸盐的转化等。

所述硫酸铵的含量优选为0.5～1.5g/L，更优选为0.8～1.2g/L，再优选为1g/L。

按照本发明，所述微量元素的含量优选为0.2～0.8g/L，更优选为0.2～0.6g/L，再优选为0.3～0.5g/L，最优选为0.39g/L；所述微量元素为本领域技术人员熟知的微量元素即可，并无特殊的限制，本发明优选包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴；所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)，更优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.2～0.4)：(0.2～0.4)：(0.2～0.4)，再优选为1：1：1：0.3：0.3：0.3。添加微量元素的组合物能够满足微生物生长所需的微量元素，全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性，增加某些参与产物合成的酶的活性，使发酵产量明显提高。

在本发明中，所述用于生产赤霉酸的发酵培养基最优选包括：

本发明提供的发酵培养基以玉米蛋白粉作为有机氮源，其蛋白质含量较高，达50％以上，能够实现赤霉素高密度发酵，且能够避免如花生饼粉产生黄曲霉的隐患，保证菌体的合成与代谢，使其能够快速稳定的发酵；同时，添加植物油不仅能够为发酵提供碳源，还可有效减少发酵气泡逃液等情况的发生，避免了物料损失、染菌等潜在风险；另外，在发酵培养基中添加微量元素能够全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种用于生产赤霉酸的发酵培养基进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

1.1将GA3菌种冷冻管直接接入摇瓶，接种量为摇瓶培养基体积的0.8％，摇瓶中培养基配方见表1，发酵温度29±0.2℃，摇瓶培养约68h，得到悬浮液。

表1摇瓶培养基配方

1.2将所述悬浮液接种至一级种子罐中接种量为培养液体积的0.016％，一级种子罐培养基配方见表2。

表2一级种子罐培养基配方

发酵体积：定容1.3t，消后体积按1.5t计(灭菌前加硫酸将pH调整到5.1)。

发酵温度：29±0.2℃。

运行罐压：0.035MPa。

空气流量：65Nm³/h。

转种时间：CO₂升至最高点，下降0.2或2h后转种(48h-72h)。

1.3将一级种子罐培养液接种至二级种子罐中，接种量为培养液体积的8％，二级种子罐培养基配方见表3。

表3二级种子罐培养基配方

发酵体积：定容15t，消后体积16.5t、转后体积18t计(灭菌前加硫酸将pH调整到5.1)。

发酵温度：29±0.2℃。

运行罐压：0.035MPa。

空气流量：760Nm³/h。

转种时间：CO₂升至最高点，下降0.2或2h后(预估20h左右)，得到种子液。

摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表4。

表4摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

31％

4.52

较长

较细

较均匀

少量

++++

一级种子液

16.5％

4.99

较长

较细

较均匀

少量

++++

二级种子液

22.5％

5.53

较长

较细

较均匀

少量

++++

1.4将1.3中得到的种子液按培养液质量的10％～15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表5。

表5发酵培养基的配方

发酵体积：定容82t，消后体积90t、转后体积100t计。

发酵温度：29±0.2℃。

运行罐压：0.035MPa。

空气流量：2200Nm³/h。

pH控制：开始运行后，pH逐步增加，每次增加0.1/半小时，流加氨水控制pH 5.0～5.2。

补料控制：溶氧反弹20％，开启自动流加葡萄糖、色拉油，葡萄糖(45％)：油(3.2L:1L)，溶氧控制点20％～30％。

发酵周期：9天。

对实施例1中得到的发酵液进行检测，得到结果见表6与表7。

表6发酵液检测数据

表7发酵液湿重

实施例2

2.1将1.3中得到的种子液按培养液质量的10％～15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表8。

表8发酵培养基的配方

发酵条件同实例1

对实施例2中得到的发酵液进行检测，得到结果见表9与表10。

表9发酵液检测数据

表10发酵液湿重

实施例3

3.1将1.3中得到的种子液按培养液质量的10％～15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表11。

表11发酵培养基的配方

发酵条件同实施例1。

对实施例3中得到的发酵液进行检测，得到结果见表12与表13。

表12发酵液检测数据

表13发酵液湿重

实施例4

4.1将1.3中得到的种子液按培养液质量的10～15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表14。

表14发酵培养基的配方

培养条件同实施例1。

对实施例4中得到的发酵液进行检测，得到结果见表15与表16。

表15发酵液检测数据

表16发酵液湿重

通过实施例2、3可以看出调节玉米蛋白粉及磷酸二氢钾的量直接影响最终目标产物GA₃的量，即实施例1培养基优于实例2、3；再通过实施例4可以看出用花生饼粉代替玉米蛋白粉最终目标产物远低于实施例1。所以实施例1配方为最佳培养基组合，利用实施例1培养基通过批次发酵生产，得到结果见表17。由表17可看出其能得出稳定的高产的GA₃。

表17 GA₃批次生产检测数据

实施例5

5.1将GA₃菌种冷冻管直接接入摇瓶，接种量为摇瓶培养基体积的1.2％，摇瓶中培养基配方见表1，发酵温度29±0.2℃，摇瓶培养约68h，得到悬浮液。

5.2一级二级种子罐同实施例1。

5.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表18。

表18摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

22％

4.0

长

细

均匀

大量

++

一级种子液

19％

3.99

长

较细

均匀

少量

++

二级种子液

20％

4.58

长

细

较均匀

少量

+++

实施例6

6.1将GA₃菌种冷冻管直接接入摇瓶，接种量为摇瓶培养基体积的0.4％，摇瓶中培养基配方见表1，发酵温度29±0.2℃，摇瓶培养约68h，得到悬浮液。

6.2一级二级种子罐同实施例1。

6.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表19。

表19摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

18.5％

4.2

长

较细

较均匀

大量

+++

一级种子液

17.7％

4.33

较长

较细

均匀

大量

+++

二级种子液

18.6％

4.12

长

细

较均匀

大量

+++

比较例1

1.1通过多次活化GA₃保藏菌种斜面取1～2环菌种接至种子摇瓶中，震荡培养；然后将GA₃菌种接种到种子罐中进行培养，得到悬浮液；再将得到的悬浮液继续在种子罐内培养，最后接种到发酵罐内进行发酵，得到发酵液。

1.2摇瓶、一级及二级种子罐培养基和发酵条件同实例1。

1.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表20。

表20摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

比较例2

2.1通过多次活化GA₃保藏菌种斜面取1～2环菌种接至种子摇瓶中，震荡培养；然后将GA₃菌种接种到种子罐中进行培养，得到悬浮液；再将得到的悬浮液继续在种子罐内培养，最后接种到发酵罐内进行发酵，得到发酵液。

2.2摇瓶、一级及二级种子罐培养基和发酵条件同实例1。

2.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表21。

表21摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

22.6％

4.71

长

较细

均匀

少量

++++

一级种子液

16.5％

4.99

较长

细

均匀

大量

+++

二级种子液

22.5％

5.53

较长

较细

较均匀

少量

++++

通过实施例5～6与实施例1对比，GA₃菌种冷冻管直接接入摇瓶的量对种子的质量有一定影响，但都能为发酵罐正常供种，最终确定实施例1的摇瓶接种量为最优；通过比较例1～2与实施例1对比，摇瓶、一级及二级种子罐培养液都在正常范围，但减少了多次活化GA₃保存菌种斜面的步骤，缩短了种子液制备时间，简化了种子制备工艺流程，通过实施例1批次生产得到摇瓶数据见表22。

表22摇瓶批次生产数据

批次

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

1751

31％

4.54

较长

较细

较均匀

少量

++++

1752

27％

4.26

较长

较细

较均匀

少量

++++

1753

26％

4.46

较长

较细

较均匀

少量

++++

1754

23％

4.73

较长

较细

较均匀

少量

++++

Claims

1.一种用于生产赤霉酸的发酵培养基，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，包括：

3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，包括：

4.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述小分子有机碳源选自蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述小分子有机碳源为蔗糖与葡萄糖。

6.根据权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述蔗糖与葡萄糖的质量比为(1～2)：(2～1)。

7.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述微量元素包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴。

8.根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)。

9.根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比为1：1：1：0.3：0.3：0.3。

10.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，包括：