CN101434921B

CN101434921B - 一种培养磁细菌生产磁小体的方法

Info

Publication number: CN101434921B
Application number: CN2007101774527A
Authority: CN
Inventors: 李颖; 孙建波; 姜伟; 田杰生; 王珍芳; 李季伦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2007-11-15
Filing date: 2007-11-15
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2027-11-15
Also published as: CN101434921A

Abstract

本发明提供了一种培养磁细菌生产磁小体的方法，其以空气作为供养方式，通过补料的方式使得磁细菌持续生长，当溶氧达到或低于适合生产磁小体的溶氧时，通过将搅拌转速和/或空气流速与溶氧进行级联来控制溶氧在适宜磁小体生产的溶氧范围。本发明不用配气和纯的惰性气体而以通空气作为供氧方式可以将初始溶氧从100％饱和溶氧降至0％，配合搅拌转速和通气流速的调节可控制溶氧为0～20％饱和溶氧之间的任何值。从而降低了磁小体的生产成本，并对以后研究磁细菌在不同溶氧水平下的生理生化特点提供了技术保障。

Description

一种培养磁细菌生产磁小体的方法

技术领域

本发明涉及细菌培养方法，具体地涉及一种培养磁细菌生产磁小体的方法。

背景技术

趋磁细菌是一类具有趋磁性的革兰氏阴性细菌，在胞内能够合成排列成链的有脂膜包被的纳米磁性颗粒——磁小体。磁小体具备优良载体的主要性质和特点，具有广泛的应用前景。但仅局限于实验室水平，尚未出现商业上的应用。主要是趋磁细菌难以人工培养，磁小体合成条件不易控制，原因在于：1)趋磁细菌对环境中的营养要求苛刻，仅能利用少数几种有机物酸为碳源；2)在自然界中趋磁细菌通常生活在低氧分压的环境中才有利于合成磁小体，但在人工培养的条件下，难以模拟低溶氧条件来满足磁小体合成的需要。由于磁小体的合成受到氧浓度的严格限制，只有在一定的溶氧水平才能合成。因而氧浓度的控制成为趋磁细菌大量培养的关键。趋磁细菌培养过程中的氧浓度控制措施曾出现过很多种。最初是Blakemore等采用自制的大型容器培养MS-1，在培养基中加有氧还状态显色剂，接种前一直通入N2，接种后密闭容器，静置培养。当氧浓度降低使培养基被还原而变色时，通入空气直至培养基再次变色，以此控制气相氧浓度为1～3％。随后出现了精确控制和自动控制溶氧的方法，Matsunaga等在培养ABM-1时通过交替通入氧气或氩气来控制发酵罐内气相氧浓度为2～8％。而在培养MSR-1时，姜伟和付刚等采用含有一定浓度氧气的氮气作为供气气源控制罐内气相氧浓度；D.Schuler等则建立了自动控制较低溶氧的恒氧培养技术：采用高灵敏度溶氧探头测定溶氧，当其超过设定值时，系统自动关闭氧气源开关，打开氮气源开关。

以上报道培养磁细菌都是提供混合气体即含有一定浓度的氧气与惰性气体(或持续通惰性气体并间歇通空气使气相氧浓度为一定值)，或与高灵敏度溶氧电极联用实现对溶氧进行精确控制。但在大规模工业化培养时，发酵罐内溶氧电极的灵敏度一般达不到这个要求，而且如果采用惰性气体供气需要有制备惰性气体的设备，将使成本急剧增加。此外，目前尚无人对以空气作为供气气源培养磁细菌进行深入研究，也还没有在通空气条件下培养磁细菌并控制溶氧为所需要值的研究报道。

磁螺菌在通空气的条件能够生长，理论上来讲，随着细胞密度的增加，细胞耗氧量增大，培养液中溶氧将逐渐降低至适合磁小体合成的水平。但维持这一溶氧水平，必然要求细胞能够持续快速生长，需要在培养过程中适时补料。目前培养磁细菌进行补料的只有日本学者和中国的姜伟等。日本学者在培养磁螺菌AMB-1时建立了恒pH补料及分批补充铁源的方式，但细胞生长速度较慢，培养4天仅可收获0.58g/L的细胞干重。

控制溶氧始终为所需要的值非常有意义，如将溶氧控制在细胞生长最适溶氧将使细胞产量最高；如将溶氧控制在磁小体合成最适溶氧，将使磁小体产量最高；如将溶氧控制在细胞产生某种酶的最适溶氧，将使酶活最高；等等。这些最适溶氧值之间是不一定相同的。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种磁细菌培养溶氧控制方法；

本发明的另一个目的在于提供一种低成本的培养磁细菌生产磁小体的方法。

(二)技术方案

根据本发明的第一个目的，本发明以空气作为供养方式，通过磁小体的持续生长来降低溶氧，并通过将搅拌转速和/或空气流速与溶氧进行级联来调节溶氧。

磁小体的持续生长会不断消耗氧气，从而可以将溶氧从100％饱和溶氧降低到0％饱和溶氧。通过配合搅拌转速与通气流速可以将溶氧控制在0～20％之内。然而需要说明的是，该范围是一个相对适合磁小体生产的溶氧值，并不意味着本发明的溶氧控制方法仅能控制在0～20％，事实上，通过上述方法可以将溶氧控制在0～100％的任意值，但就本发明的目的而言，控制在0～20％之间特别是0～10％之间特别适合用于磁小体的生产。当溶氧达到或低于适合生产磁小体的溶氧时，可以通过将搅拌转速和/或空气流速与溶氧进行级联来控制溶氧在适宜磁小体生产的溶氧范围。例如，当溶氧接近0％时，可以控制溶氧在0～20％之间的任何值。

磁小体的持续稳定生长会不断消耗养分，因此需要在培养过程中适当进行补料。本发明提供了一种优选的补料方法，其通过检测培养液中乳酸的含量来确定流加补料的速度与时间，能够保证磁细菌快速稳定地生长。

根据本发明的第二个目的，本发明以空气作为供养方式来培养磁小体，具体而言包括如下步骤：将活化后的种子培养液接种到含有灭菌发酵培养基的发酵罐中，接种量为5％-20％(体积比)，所述调灭菌培养基的初始溶氧为100％饱和溶氧，调节pH至6.5～7.5，搅拌转速为发酵罐额定最高转速的0.05-0.15倍，通气量为发酵罐最小通气量的1-10倍，培养温度为25～35℃，通过补料的方式使得磁细菌持续生长，当溶氧达到或低于适合生产磁小体的溶氧时，通过将搅拌转速和/或空气流速与溶氧进行级联来控制溶氧在适宜磁小体生产的溶氧范围。

上述发酵培养基的添加处理方法是：在自动发酵罐内加入无K₂HPO₄的培养基，灭菌后持续通入无菌空气，连续搅拌，当培养基温度降至40℃以下后，加入预先灭菌的K₂HPO₄，K₂HPO₄的在培养基中的终浓度为0.1～3g/L。通过通入无菌空气进行连续搅拌可以用来调节溶氧。

上述发酵培养基含有碳源、氮源和铁源，其碳氮比为3∶1～30∶1，pH值为6.5～7.5；碳源为乳酸或乳酸盐溶液，优选乳酸钠，其浓度范围为0.03～10.4g/L，优选2.6g/L；氮源为氨盐或硝酸盐，优选氯化铵；铁源为可溶性的铁盐，优选柠檬酸铁，铁源与碳源质量浓度比为0～1∶200。

上述补料的方法是根据细胞增长与乳酸消耗的经验关系式ΔOD₅₆₅/Δ[Na-lac]＝0.52±0.20确定补料的速度和时间，进行流加补料，式中Δ[Na-lac]表示乳酸及其盐的消耗量，乳酸及其盐的浓度控制在不少于0.016g/L。其中，补料用培养基为含有碳源、氮源和铁源的液体培养基，其碳氮比为3∶1～30∶1，铁源与碳源质量浓度比为1∶5000～1∶200，pH值为5.5～7.0。

上述种子培养液的制备方法是：在含有碳源、氮源和铁源的培养基中振荡培养趋磁细菌，获得种子培养液，其中所述培养基中碳氮比为3∶1～30∶1，pH值为6.5～7.5；碳源为乳酸或乳酸盐溶液，优选乳酸钠，其浓度范围为0.03～10.4g/L，优选2.6g/L；氮源为氨盐或硝酸盐，优选氯化铵；铁源为可溶性的铁盐，优选柠檬酸铁，铁源与碳源质量浓度比为0～1∶200。

上述用于调节pH用的酸可以是盐酸和硝酸等无机酸，也可以是乳酸和琥珀酸等有机酸。

本发明所用培养基除了特别指出的外，1L培养基均含有：矿质元素混合液(配方见表1)2ml，酵母粉0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.1g。表1中的四种矿质元素储液均用蒸馏水配成500ml，每次使用前取ABCD四种储液等体积混合后，每一升培养基中加入2ml混合液。

表1 矿质元素储液配方

储液	组分	质量(g)
			ABCD	CoCl₂·6H₂ONiCl₂·6H₂OMnSO₄·H₂OCuSO₄·5H₂OZnSO₄·7H₂OKAl(SO₄)₂·12H₂ONitrilotriacetic acidH₃BO₃H₂SeO₃Na₂MoO₄·2H₂O	0.7620.1252.260.050.90.17.50.050.0010.05

本发明所用磁细菌为微好氧的趋磁细菌。

本发明所通气体为经过滤除菌的空气。

(三)有益效果

本发明所述的培养磁细菌所用的通气方式为通空气，无需配气和制备惰性气体的装置，操作简单，成本低，采用现有的发酵设备即可；本发明所用的补料措施可以保证细胞的生长不受营养底物的限制，在溶氧充足供应的条件下，细胞密度OD₅₆₅可达20以上，并且通过添加乳酸浓度检测仪，根据补料公式可以很容易的实现补料自动化；本发明所用的溶氧控制措施可以使溶氧在通空气条件下从100％降低至0％，通过将转速、通气流速与溶氧级联可以控制溶氧为0～20％饱和溶氧的水平，对以后研究磁细菌在不同溶氧水平下的生理生化特点(如磁小体合成水平、铁还原酶等各种酶的活性等)提供了技术保障。

此外，本发明对培养基还作了筛选和优化，去除了一些不必要的成分，从而进一步降低了成本。

附图说明

图1是细胞生长与乳酸消耗之间的关系曲线；

图2是补料条件下细胞的快速生长曲线；

图3是通空气条件下细胞生长曲线与溶氧变化曲线图。

具体实施方式

以下实施例以磁细菌中磁螺菌属中的模式种M.gryphiswaldense的菌株MSR-1(DSM6361，购自Deutsche Sammlung von Mikro-organismen undZellkulturen)为例，用于说明本发明方法，但不用来限制本发明方法的范围。

实施例1 培养磁细菌生产磁小体的方法

(1)在含有0.03g/L乳酸钠、0.05g/L氯化铵和0g/L柠檬酸铁的培养基中振荡培养磁螺菌MSR-1，获得种子培养液，其中所述培养基初始pH值为6.5；

(2)在42L自动发酵罐内加入无K₂HPO₄的上述培养基，灭菌后持续通入无菌空气(0.3L/min)，100rpm连续搅拌，当培养基温度降至40℃以下后，加入预先灭菌的K₂HPO₄至终浓度为0.1g/L。待培养基温度降至35℃时将步骤(1)活化的种子液接种至罐内，用盐酸调节和控制pH为6.5；

(3)培养过程中每2h取一次样检测细胞密度和乳酸含量并测定培养液铁含量，根据经验公式ΔOD₅₆₅/Δ[Na-lac]＝0.52±0.20，通过流加补料措施控制培养基中乳酸浓度不低于0.016g/L，保证细胞的生长不受营养物缺乏的限制，补料所用培养基pH为7.0，含300g/L乳酸钠、500g/L氯化铵和60mg/L柠檬酸铁；

(4)当溶氧降低至0％时，可以通过保持转速和空气流速不变而使溶氧始终维持在0％。

(5)培养水平：培养30h最终细胞光密度可达OD₅₆₅＝1.8，是现有文献报道水平的1.3倍，生长速度是现有水平的1.2倍。

实施例2 培养磁细菌生产磁小体的方法

(1)在含有10.4g/L乳酸钠、3.2g/L氯化铵和2.08mg/L柠檬酸铁的培养基中振荡培养磁螺菌MSR-1，获得种子培养液，其中所述培养基初始pH值为7.5；

(2)在42L自动发酵罐内加入无K₂HPO₄的上述培养基，灭菌后持续通入无菌空气(3L/min)，100rpm连续搅拌，当培养基温度降至40℃以下后，加入预先灭菌的K₂HPO₄至终浓度为3g/L。待培养基温度降至25℃时将步骤(1)活化的种子液接种至罐内，用乳酸调节和控制pH为7.5；

(3)培养过程中每2h取一次样检测细胞密度和乳酸含量并测定培养液铁含量，根据经验公式ΔOD₅₆₅/Δ[Na-lac]＝0.52±0.20，通过流加补料措施控制培养基中乳酸浓度不低于0.016g/L，保证细胞的生长不受营养物缺乏的限制，补料所用培养基pH为5.5，含208g/L乳酸钠、64g/L氯化铵和1.04g/L柠檬酸铁；

(4)设定与转速级联的溶氧值为20％，可以通过转速的自动增加使溶氧始终维持在20％。

(5)培养水平：细胞增长迅速(图2)，培养96h最终细胞光密度可达OD₅₆₅＝18.6，是现有文献报道水平的13.3倍，生长速度是现有水平的3.7倍。

实施例3 培养磁细菌生产磁小体的方法

(1)在含有2.6g/L乳酸钠、0.61g/L氯化铵和13mg/L柠檬酸铁的培养基中振荡培养磁螺菌MSR-1，获得种子培养液，其中所述培养基初始pH值为7.0；

(2)在42L自动发酵罐内加入无K₂HPO₄的上述培养基，灭菌后持续通入无菌空气(0.3L/min)，100rpm连续搅拌，当培养基温度降至40℃以下后，加入预先灭菌的K₂HPO₄至终浓度为0.5g/L。待培养基温度降至28℃时将步骤(1)活化的种子液接种至罐内，用盐酸调节和控制pH为7.0；

(3)培养过程中每2h取一次样检测细胞密度和乳酸含量(图1)并测定培养液铁含量，根据经验公式ΔOD₅₆₅/Δ[Na-lac]＝0.52±0.20，通过流加补料措施控制培养基中乳酸浓度不低于0.016g/L，保证细胞的生长不受营养物缺乏的限制，补料所用培养基pH为7.0，含260g/L乳酸钠、60g/L氯化铵和0.26g/L柠檬酸铁；

(4)当细胞生长速度变慢时，设定与空气流速速级联的溶氧值为0.2％，溶氧始终维持在0.2％(见图3)。

(5)培养水平：培养40h最终细胞光密度可达OD₅₆₅＝6.67，是现有文献报道水平的4.8倍，生长速度是现有水平的3.3倍。

实施例4 培养磁细菌生产磁小体的工艺

(1)在含有10.4g/L乳酸钠、3.2g/L氯化铵和10.4mg/L柠檬酸铁的培养基中振荡培养磁螺菌MSR-1，获得种子培养液，其中所述培养基初始pH值为7.5；

(2)在42L自动发酵罐内加入无K₂HPO₄的上述培养基，灭菌后持续通入无菌空气(0.3L/min)，300rpm连续搅拌，当培养基温度降至40℃以下后，加入预先灭菌的K₂HPO₄至终浓度为3g/L。待培养基温度降至25℃时将步骤(1)活化的种子液接种至罐内，用乳酸调节和控制pH为7.5；

(3)培养过程中每2h取一次样检测细胞密度和乳酸含量并测定培养液铁含量，根据经验公式ΔOD₅₆₅/Δ[Na-lac]＝0.52±0.20，通过流加补料措施控制培养基中乳酸浓度不低于0.016g/L，保证细胞的生长不受营养物缺乏的限制，补料所用培养基pH为5.5，含208g/L乳酸钠、64g/L氯化铵和0.104g/L柠檬酸铁；

(4)当溶氧降低至0％时，设定与通气流速级联的溶氧值为0.5％，可以通过通气流速的自动增加使溶氧始终维持在0.5％。

(5)培养水平：培养48h最终细胞光密度可达OD₅₆₅＝5.6，是现有文献报道水平的4倍，生长速度是现有水平的2.3倍。

Claims

1.一种培养磁细菌生产磁小体的方法，包括步骤：将活化后的种子培养液接种到含有灭菌发酵培养基的发酵罐中，所述灭菌培养基的初始溶氧为100％饱和溶氧，调节pH至6.5～7.5，搅拌转速为发酵罐额定最高转速的0.05-0.15倍，通气量为发酵罐最小通气量的1-10倍，培养温度为25～35℃，通过补料的方式保证细胞生长不受营养的限制，当溶氧达到或低于适合生产磁小体的溶氧时，通过将搅拌转速和/或空气流速与溶氧进行级联来控制溶氧在适宜磁小体生产的溶氧范围；其中，所述磁细菌为Magnetospirillum gryphiswaldense的菌株MSR-1；所述补料的方法是根据公式ΔOD₅₆₅/Δ[Na-lac]＝0.52±0.20，进行流加补料，乳酸或乳酸盐浓度控制在不少于0.016g/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有碳源、氮源和铁源，其碳氮比为3∶1～30∶1，pH值为6.5～7.5；碳源为乳酸或乳酸盐溶液，其浓度范围为0.03～10.4g/L；氮源为氨盐或硝酸盐；铁源为可溶性的铁盐，铁源与碳源质量浓度比为0～1∶200。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碳源为乳酸钠，所述浓度为2.6g/L；所述氮源为氯化铵；所述铁源为柠檬酸铁。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，补料用培养基为含有碳源、氮源和铁源的液体培养基，其碳氮比为3∶1～30∶1，铁源与碳源质量浓度比为1∶5000～1∶200，pH值为5.5～7.0。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当溶氧接近0％时，控制溶氧在0～20％之间。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，种子培养液的制备方法是：在含有碳源、氮源和铁源的培养基中振荡培养趋磁细菌，获得种子培养液，其中所述培养基中碳氮比为3∶1～30∶1，pH值为6.5～7.5；碳源为乳酸或乳酸盐溶液，其浓度范围为0.03～10.4g/L；氮源为氨盐或硝酸盐；铁源为可溶性的铁盐，铁源与碳源质量浓度比为0～1∶200。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碳源为乳酸钠，所述浓度为2.6g/L；所述氮源为氯化铵；所述铁源为柠檬酸铁。

8.如权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于所通气体为经过滤除菌的空气。