CN107384984A - 一种发酵法提高维生素pqq产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明首先选育出生长状态良好，生命力旺盛，代谢能力强的生丝微菌，然后通过调配培养基，利用添加微量元素液的固体培养基对挑选出来的生丝微菌进行菌种活化，为挑选最佳的菌种做准备；然后通过将其接种于特制的摇瓶种子培养基上，在适宜的条件下培养，扩大优良的生丝微菌的菌群数量，得到摇瓶种子液，然后接种至特制的种子培养基上，在适应的条件下培养至对数期，得到种子菌液，最后将种子菌液接种至特制的发酵培养基上，本发明提供的发酵培养基既能够为生丝微菌提供充足的营养，又能抑制不良的生长因素，促进生丝微菌加快生长代谢速度，提高维生素PQQ的产量，得到含有维生素PQQ的发酵液，生丝微菌的发酵产量为1g/L以上，提取收率为50％以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种发酵法提高维生素PQQ产量的方法。
背景技术
PQQ的学名叫吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone简称PQQ)，分子式：C14H14N2Na2O8，是一种新辅基，是继黄素核苷酸(FMN，FAD)和烟酰胺核苷酸(MAD，NADP)之后，在膜束缚的细菌脱氢酶中发现的第三种辅基，世界医学界称之为第十四种维生素。PQQ作为一种新型水溶性维生素，是一种氧化还原酶辅基，它非常稀少，存在于一些微生物、植物和动物组织中，不仅参与催化生物体内氧化还原反应，而且还具有一些特殊的生物活性和生理功能，如缩短恶臭醋酸杆菌(Acetobacter rancens)和啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的迟缓期，刺激烟草种子提早发芽，预防和治疗某些疾病等生物学功能。微量的PQQ就能提高生物体组织的代谢和生长机能，极其珍贵。
PQQ的合成包括了生物合成和化学合成，而生物合成的方法具有成本低、步骤少、分离更为容易的优点。PQQ广泛存在与革兰氏阴性菌中，但合成量却有所不同，有些菌只能产生痕量PQQ供代谢需要，而有些菌能够产生过量PQQ并分泌到胞外，例如生丝微菌。
虽然生丝微菌能够发酵生产PQQ，但是相对于生产应用来说其仍然存在产量低，效率低的缺陷。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明利用紫外线、常压室温等离子体等法杀死生长状态较弱的生丝微菌，得到生长状态良好的的生丝微菌，利用生长状态良好，繁殖能力强的生丝微菌不同阶段配合不同的培养基，进行菌种活化、制种、发酵培养，提高维生素PQQ的产量。
本发明的目的是提供一种发酵法提高维生素PQQ产量的方法。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选生丝微菌：挑选生长状态良好的生丝微菌；
(2)平皿培养：将步骤(1)得到的生丝微菌接种至灭菌过的平皿培养基上，在30-37℃培养7-8天，得到涂布单菌落，取所述涂布单菌落3-5颗，每颗点种2-3粒，在30-37℃平皿培养基上培养6-8天，得到点种单菌落；
所述平皿培养基的制备过程包括以下步骤：
①称取以下原料，加入水至每1000ml溶液中含有以下重量的原料：
(NH4)2SO4 1-5g，
KH2PO4 1-2g，
Na2HPO4 2-5g，
MgSO4·7H2O 0.5-2g，
微量元素液 0.5-1ml，
琼脂粉 15-25g；
②调节pH至6.3-7.5；
③灭菌，冷却至45-55℃，在无菌环境中加入经过无菌过滤的无水甲醇至每1000ml溶液中含15-30g无水甲醇，倒平皿，得到灭菌过的平皿固体培养基；
每1000ml所述微量元素液包括以下重量的原料：
FeSO4·7H2O 5-10g，
ZnSO4·7H2O 15-25g，
MnSO4·4H2O 3-8g，
CuSO4·5H2O 0.5-1.5g，
NaCl 1-2g，
(NH4)6Mo7O24·4H2O 10-50mg，
CoCl2·6H2O 10-50mg，
H3BO3 10-50mg，
CaCl2·2H2O 10-50mg，
所述微量元素液的pH为6.3-7.5；
(3)斜面培养：取步骤(2)得到的所述点种单菌落，每颗添加1-1.5ml无菌水，分散均匀，取0.2-0.25ml接种至斜面培养基中，在25-37℃培养4-6天，得到成熟斜面菌落，所述斜面培养基与步骤(2)中所述平皿培养基相同；
(4)摇瓶种子培养：将步骤(3)中得到的成熟斜面菌落接种至摇瓶种子培养基中，在30-32℃，在摇瓶培养设备中培养24-30h，得到摇瓶种子菌液；
所述摇瓶种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 1-2.5％，
(NH4)2SO4 0.2-0.5％，
KH2PO4 0.1-0.2％，
Na2HPO4 0.2-0.5％，
MgSO4·7H2O 0.05-0.2％，
微量元素液 0.05-0.1％，
余量为水，
所述摇瓶种子培养基的pH值为6.5-7.5；
(5)种子培养：将步骤(4)得到的摇瓶种子菌液接种至种子培养基，培养至对数生长期，得到种子菌液；
所述种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 1-3％，
(NH4)2SO4 0.15-0.45％，
KH2PO4 0.1-0.2％，
Na2HPO4 0.15-0.45％，
MgSO4·7H2O 0.05-0.2％，
微量元素液 0.05-0.15％，
余量为水，
所述种子培养基的pH值为6.5-7.5；
(6)发酵培养：将步骤(5)中培养至对数生长期的种子菌液接种至发酵培养基上，
所述发酵培养基包括以下重量百分比的原料：
(NH4)2SO4 0.2-0.5％，
KH2PO4 0.1-0.2％，
Na2HPO4 0.2-0.5％，
MgSO4·7H2O 0.05-0.2％，
微量元素液 0.05-0.15％，
消泡剂 0.05-0.2％，
余量为水，
所述发酵培养基的pH值为6.0-7.8，
在30-32℃，培养6-10天，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(1)中，所述生丝微菌的挑选方法为，将生丝微菌进行液体培养，取对数生产期的菌液，在30W紫外线灯对菌悬液进行照射，距离为20-30cm，死亡率控制在50-80％，然后稀释，将稀释过的悬浮液放置在培养皿中，将培养皿放置在距离紫外灯30-35cm远的搅拌器上，照射30-180s，然后在无菌环境进行平板涂布，然后在黑暗环境中，温度为35℃下倒置培养72h，得到生长状态良好的生丝微菌。
为了得到生长状态良好，繁殖能力强，生命力旺盛的生丝微菌，本发明人将得到的生丝微菌在紫外灯下照射，在不改变生丝微菌的遗传基因的情况下，通过调整参数，将生丝微菌的死亡率控制在50-80％，将菌液中大部分的抗逆性差的生丝微菌杀死，留下生命力旺盛的生丝微菌，为后续的发酵过程中提供繁殖代谢能力比较强，抗逆性能良好的菌种。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(1)中，所述生丝微菌的挑选方法为，将生丝微菌进行液体培养，取对数生长期的菌液，离心取上清液，加入生理盐水，取菌液涂载片，放入ARTP中，处理距离2-3mm、气量10-15SLM、功率120-125W、处理时间25-30s，将载片置于生理盐水中，振荡、洗脱得到洗脱液，稀释所述洗脱液，进行平板涂布，培养，得到生长状态良好的生丝微菌。
为了得到生长状态良好，繁殖能力强，生命力旺盛的生丝微菌，本发明，通过调整参数，利用常压室温等离子法即ARTP法，不改变生丝微菌的遗传基因，而是筛除生命力弱，抗逆性能差的生丝微菌。
除了以上的方法外，为了得到生长状态良好的生丝微菌，本发明还可以采用其他方法，通过不改变生丝微菌基因和遗传序列，单单杀死或者筛除生命力较弱的生丝微菌，留下生命力，代谢能力旺盛的生丝微菌。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(2)中，③中所述灭菌条件为：温度120-121℃，压力1.2-1.4MPa，时间15-30min。
为了防止杂菌感染，在进行接种前对培养基原料以及器皿进行高温蒸汽灭菌，在温度120-121℃，压力1.2-1.4MPa，灭菌15-30min，杀死杂菌以及杂菌的芽孢。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(3)中，每颗所述点种单菌落直径为3-4mm。
为了得到生命力旺盛，代谢能力强的生丝微菌，挑选点种单菌落的直径为3-4mm。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(4)中，利用NaOH溶液调节摇瓶种子培养基的pH至6.5-7.5。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(5)中，测定种子菌液的OD值为0.6-0.8，确定种子菌液处于对数生长期。
为了确定种子菌液的生长时期，通过测定种子菌液吸收光密度的值来测定其生长时期，得到相对准确的生长曲线。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(6)中，所述消泡剂为PPG2000。
由发酵过程产生的气体聚结生成的发酵泡沫，发酵液中糖、蛋白质和代谢物等的存在起到稳定泡沫的作用，而泡沫的存在使发酵罐的装填系数减少；造成大量逃液，导致产物损失；加了染菌的机会；增加了菌群的非均一性；泡沫影响氧传递，影响通气搅拌效果。为了消除发酵过程中产生的泡沫，消除泡沫产生的不良影响，本发明采用PPG2000为消泡剂，降低液膜的机械强度和表面粘度这两种性能，具有良好的消泡性能。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(6)中，在发酵过程中，取浓度为35-65％的无菌甲醇溶液作为补料，控制发酵培养基中甲醇的浓度为300-1000ppm。
发酵过程中由于营养成分充足，生丝微菌生命力旺盛，代谢速度快，会导致供氧不足。为了解决这个问题本发明在发酵过程中时时补充甲醇溶液，及时供给生丝微菌合成PQQ的需要，同时能够通过补料控制生丝微菌的的呼吸，避免发酵过程中受氧的限制。
根据本发明具体实施方式的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，优选地，步骤(6)中，对数生长期的种子菌液在发酵培养基上，在30-32℃，培养6-10天，发酵产量为1g/L以上，提取收率为50％以上。
利用本发明提供的培养基以及方法，得到的生丝微菌发酵，通过代谢产生的维生素PQQ，产量高，提取收率高。
本发明的有益效果为：
本发明首先选育出生长状态良好，生命力旺盛，代谢能力强的生丝微菌，然后通过调配培养基，利用添加微量元素液的固体培养基对挑选出来的生丝微菌进行菌种活化，进一步得到代谢能力强的生丝微菌，本发明提供的固体培养基包括了平皿培养基和斜面培养基，它们为菌种提供足够的营养，促进生丝微菌的生长，为挑选最佳的菌种做准备；然后通过将其接种于特制的摇瓶种子培养基上，在适宜的条件下培养，得到摇瓶种子液，即种母，本发明通过调整培养基，扩大优良的生丝微菌的菌群数量，得到种母，为后续培养做准备；利用种母接种至特制的种子培养基上，在适应的条件下培养至对数期，得到种子菌液，最后将种子菌液接种至特制的发酵培养基上，本发明提供的发酵培养基既能够为生丝微菌提供充足的营养，又能抑制不良的生长因素，促进生丝微菌加快生长代谢速度，提高维生素PQQ的产量，在30-32℃，培养6-10天，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液，生丝微菌的发酵产量为1g/L以上，提取收率为50％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供发酵法提高维生素PQQ产量的方法的工艺流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
发酵法提高维生素PQQ产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选生丝微菌：将生丝微菌进行液体培养，取对数生产期的菌液，在30W紫外线灯对菌悬液进行照射，距离为20cm，死亡率控制在50％，然后稀释，将稀释过的悬浮液放置在培养皿中，将培养皿放置在距离紫外灯30cm远的搅拌器上，照射30s，然后在无菌环境进行平板涂布，然后在黑暗环境中，温度为35℃下倒置培养72h，挑选得到生长状态良好的生丝微菌；
(2)平皿培养：将步骤(1)得到的生丝微菌接种至灭菌过的平皿培养基上，在30℃培养7天，得到涂布单菌落，取所述涂布单菌落3颗，每颗点种2粒，在30℃平皿培养基上培养6天，得到点种单菌落；
所述平皿培养基的制备过程包括以下步骤：
①称取以下原料，加入水至每1000ml溶液中含有以下重量的原料：
(NH4)2SO4 1g，
KH2PO4 1g，
Na2HPO4 2g，
MgSO4·7H2O 0.5g，
微量元素液 0.5ml，
琼脂粉 15g；
②调节pH至6.3；
③灭菌，冷却至45℃，在无菌环境中加入经过无菌过滤的无水甲醇至每1000ml溶液中含15g无水甲醇，倒平皿，得到灭菌过的平皿固体培养基；
每1000ml所述微量元素液包括以下重量的原料：
FeSO4·7H2O 5g，
ZnSO4·7H2O 15g，
MnSO4·4H2O 3g，
CuSO4·5H2O 0.5g，
NaCl 1g，
(NH4)6Mo7O24·4H2O 10mg，
CoCl2·6H2O 10mg，
H3BO3 10mg，
CaCl2·2H2O 10mg，
所述微量元素液的pH为6.3；
(3)斜面培养：取步骤(2)得到的所述点种单菌落，每颗添加1ml无菌水，分散均匀，取0.2ml接种至斜面培养基中，在25℃培养4天，得到成熟斜面菌落，所述斜面培养基与步骤(2)中所述平皿培养基相同；
(4)摇瓶种子培养：将步骤(3)中得到的成熟斜面菌落接种至摇瓶种子培养基中，在30℃，在旋转摇瓶机中培养24h，得到摇瓶种子菌液；
所述摇瓶种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 1％，
(NH4)2SO4 0.2％，
KH2PO4 0.1％，
Na2HPO4 0.2％，
MgSO4·7H2O 0.05％，
微量元素液 0.05％，
余量为水，
所述摇瓶种子培养基的pH值为6.5；
(5)种子培养：将步骤(4)得到的摇瓶种子菌液接种至种子培养基，培养至对数生长期，得到种子菌液；
所述种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 1％，
(NH4)2SO4 0.15％，
KH2PO4 0.1％，
Na2HPO4 0.15％，
MgSO4·7H2O 0.05％，
微量元素液 0.05％，
余量为水，
所述种子培养基的pH值为6.5；
(6)发酵培养：将步骤(5)中培养至对数生长期的种子菌液接种至发酵培养基上，
所述发酵培养基包括以下重量百分比的原料：
(NH4)2SO4 0.2％，
KH2PO4 0.1％，
Na2HPO4 0.2％，
MgSO4·7H2O 0.05％，
微量元素液 0.05％，
消泡剂 0.05％，
余量为水，
所述发酵培养基的pH值为6.0，
在30℃，培养6天，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液，发酵得到含有维生素PQQ的发酵液的产量为1g/L，提取收率为50％。
实施例2
发酵法提高维生素PQQ产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选生丝微菌：将生丝微菌进行液体培养，取对数生产期的菌液，在30W紫外线灯对菌悬液进行照射，距离为30cm，死亡率控制在80％，然后稀释，将稀释过的悬浮液放置在培养皿中，将培养皿放置在距离紫外灯35cm远的搅拌器上，照射180s，然后在无菌环境进行平板涂布，然后在黑暗环境中，温度为35℃下倒置培养72h，挑选得到生长状态良好的生丝微菌；
(2)平皿培养：将步骤(1)得到的生丝微菌接种至灭菌过的平皿培养基上，在37℃培养8天，得到涂布单菌落，取所述涂布单菌落5颗，每颗点种3粒，在37℃平皿培养基上培养8天，得到点种单菌落；
所述平皿培养基的制备过程包括以下步骤：
①称取以下原料，加入水至每1000ml溶液中含有以下重量的原料：
(NH4)2SO4 5g，
KH2PO4 2g，
Na2HPO4 5g，
MgSO4·7H2O 2g，
微量元素液 1ml，
琼脂粉 25g；
②调节pH至7.5；
③在温度120℃，压力1.2MPa，时间30min灭菌，冷却至55℃，在无菌环境中加入经过无菌过滤的无水甲醇至每1000ml溶液中含30g无水甲醇，倒平皿，得到灭菌过的平皿固体培养基；
每1000ml所述微量元素液包括以下重量的原料：
FeSO4·7H2O 10g，
ZnSO4·7H2O 25g，
MnSO4·4H2O 8g，
CuSO4·5H2O 1.5g，
NaCl 2g，
(NH4)6Mo7O24·4H2O 50mg，
CoCl2·6H2O 50mg，
H3BO3 50mg，
CaCl2·2H2O 50mg，
所述微量元素液的pH为7.5；
(3)斜面培养：取步骤(2)得到的所述点种单菌落，每颗添加1.5ml无菌水，分散均匀，取0.25ml接种至斜面培养基中，在37℃培养6天，得到成熟斜面菌落，所述斜面培养基与步骤(2)中所述平皿培养基相同；
(4)摇瓶种子培养：将步骤(3)中得到的成熟斜面菌落接种至摇瓶种子培养基中，在32℃，在旋转摇瓶机中培养30h，得到摇瓶种子菌液；
所述摇瓶种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 2.5％，
(NH4)2SO4 0.5％，
KH2PO4 0.2％，
Na2HPO4 0.5％，
MgSO4·7H2O 0.2％，
微量元素液 0.1％，
余量为水，
所述摇瓶种子培养基的pH值为7.5；
(5)种子培养：将步骤(4)得到的摇瓶种子菌液接种至种子培养基，培养至对数生长期，得到种子菌液；
所述种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 3％，
(NH4)2SO4 0.45％，
KH2PO4 0.2％，
Na2HPO4 0.45％，
MgSO4·7H2O 0.2％，
微量元素液 0.15％，
余量为水，
所述种子培养基的pH值为7.5；
(6)发酵培养：将步骤(5)中培养至对数生长期的种子菌液接种至发酵培养基上，
所述发酵培养基包括以下重量百分比的原料：
(NH4)2SO4 0.5％，
KH2PO4 0.2％，
Na2HPO4 0.5％，
MgSO4·7H2O 0.2％，
微量元素液 0.15％，
消泡剂 0.2％，
余量为水，
所述发酵培养基的pH值为7.8，
在32℃，培养10天，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液，发酵得到含有维生素PQQ的发酵液的产量为1.2g/L，提取收率为53％。
实施例3
发酵法提高维生素PQQ产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选生丝微菌：将生丝微菌进行液体培养，取对数生长期的菌液，离心取上清液，加入生理盐水，取菌液涂载片，放入ARTP中，处理距离2mm、气量10SLM、功率120W、处理时间25s，将载片置于生理盐水中，振荡、洗脱得到洗脱液，稀释所述洗脱液，进行平板涂布，培养，挑选得到生长状态良好的生丝微菌；
(2)平皿培养：将步骤(1)得到的生丝微菌接种至灭菌过的平皿培养基上，在30℃培养8天，得到涂布单菌落，取所述涂布单菌落4颗，每颗点种3粒，在30℃平皿培养基上培养8天，得到点种单菌落；
所述平皿培养基的制备过程包括以下步骤：
①称取以下原料，加入水至每1000ml溶液中含有以下重量的原料：
(NH4)2SO4 3g，
KH2PO4 1.4g，
Na2HPO4 3g，
MgSO4·7H2O 1g，
微量元素液 0.7ml，
琼脂粉 20g；
②调节pH至6.8；
③在温度121℃，压力1.4MPa，灭菌15min，冷却至50℃，在无菌环境中加入经过无菌过滤的无水甲醇至每1000ml溶液中含20g无水甲醇，倒平皿，得到灭菌过的平皿固体培养基；
每1000ml所述微量元素液包括以下重量的原料：
FeSO4·7H2O 7.5g，
ZnSO4·7H2O 22.5g，
MnSO4·4H2O 4.5g，
CuSO4·5H2O 0.75g，
NaCl 1.5g，
(NH4)6Mo7O24·4H2O 30mg，
CoCl2·6H2O 30mg，
H3BO3 30mg，
CaCl2·2H2O 30mg，
所述微量元素液的pH为6.8；
(3)斜面培养：取步骤(2)得到的所述点种单菌落，所述点种单菌落直径为3mm，每颗添加1.2ml无菌水，分散均匀，取0.2ml接种至斜面培养基中，在30℃培养5天，得到成熟斜面菌落，所述斜面培养基与步骤(2)中所述平皿培养基相同；
(4)摇瓶种子培养：将步骤(3)中得到的成熟斜面菌落接种至摇瓶种子培养基中，在30℃，在旋转摇瓶机中培养24h，得到摇瓶种子菌液；
所述摇瓶种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 2％，
(NH4)2SO4 0.3％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.4％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
余量为水，
用NaOH溶液调节摇瓶种子培养基的pH至6.5；
(5)种子培养：将步骤(4)得到的摇瓶种子菌液接种至种子培养基，培养至对数生长期，得到种子菌液，测定种子菌液的OD值为0.6；
所述种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 2％，
(NH4)2SO4 0.3％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.13％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
余量为水，
所述种子培养基的pH值为6.8；
(6)发酵培养：将步骤(5)中培养至对数生长期的种子菌液接种至发酵培养基上，
所述发酵培养基包括以下重量百分比的原料：
(NH4)2SO4 0.24％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.4％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
PPG2000消泡剂 0.1％，
余量为水，
所述发酵培养基的pH值为7.0，
在30℃，培养8天，培养过程中，取浓度为35％的无菌甲醇溶液作为补料，控制发酵培养基中甲醇的浓度为300ppm，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液，发酵得到含有维生素PQQ的发酵液的产量为1.1g/L，提取收率为51％。
实施例4
发酵法提高维生素PQQ产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选生丝微菌：将生丝微菌进行液体培养，取对数生长期的菌液，离心取上清液，加入生理盐水，取菌液涂载片，放入ARTP中，处理距离3mm、气量15SLM、功率125W、处理时间30s，将载片置于生理盐水中，振荡、洗脱得到洗脱液，稀释所述洗脱液，进行平板涂布，培养，挑选得到生长状态良好的生丝微菌；
(2)平皿培养：将步骤(1)得到的生丝微菌接种至灭菌过的平皿培养基上，在30℃培养8天，得到涂布单菌落，取所述涂布单菌落4颗，每颗点种3粒，在30℃平皿培养基上培养8天，得到点种单菌落；
所述平皿培养基的制备过程包括以下步骤：
①称取以下原料，加入水至每1000ml溶液中含有以下重量的原料：
(NH4)2SO4 3g，
KH2PO4 1.4g，
Na2HPO4 3g，
MgSO4·7H2O 1g，
微量元素液 0.7ml，
琼脂粉 20g；
②调节pH至6.8；
③在温度121℃，压力1.4MPa，灭菌15min，冷却至50℃，在无菌环境中加入经过无菌过滤的无水甲醇至每1000ml溶液中含20g无水甲醇，倒平皿，得到灭菌过的平皿固体培养基；
每1000ml所述微量元素液包括以下重量的原料：
FeSO4·7H2O 7.5g，
ZnSO4·7H2O 22.5g，
MnSO4·4H2O 4.5g，
CuSO4·5H2O 0.75g，
NaCl 1.5g，
(NH4)6Mo7O24·4H2O 30mg，
CoCl2·6H2O 30mg，
H3BO3 30mg，
CaCl2·2H2O 30mg，
所述微量元素液的pH为6.8；
(3)斜面培养：取步骤(2)得到的所述点种单菌落，所述点种单菌落直径为4mm，每颗添加1.2ml无菌水，分散均匀，取0.2ml接种至斜面培养基中，在30℃培养5天，得到成熟斜面菌落，所述斜面培养基与步骤(2)中所述平皿培养基相同；
(4)摇瓶种子培养：将步骤(3)中得到的成熟斜面菌落接种至摇瓶种子培养基中，在30℃，在旋转摇瓶机中培养24h，得到摇瓶种子菌液；
所述摇瓶种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 2％，
(NH4)2SO4 0.3％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.4％，
MgSO4·7H2O 0.1％
微量元素液 0.1％，
余量为水，
用NaOH溶液调节摇瓶种子培养基的pH至7.5；
(5)种子培养：将步骤(4)得到的摇瓶种子菌液接种至种子培养基，培养至对数生长期，得到种子菌液，测定种子菌液的OD值为0.8；
所述种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 2％，
(NH4)2SO4 0.3％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.13％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
余量为水，
所述种子培养基的pH值为6.8；
(6)发酵培养：将步骤(5)中培养至对数生长期的种子菌液接种至发酵培养基上，
所述发酵培养基包括以下重量百分比的原料：
(NH4)2SO4 0.24％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.4％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
PPG2000消泡剂 0.1％，
余量为水，
所述发酵培养基的pH值为7.0，
在30℃，培养8天，培养过程中，取浓度为35％的无菌甲醇溶液作为补料，控制发酵培养基中甲醇的浓度为1000ppm，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液，发酵得到含有维生素PQQ的发酵液的产量为1.3g/L，提取收率为56％。
实施例5
发酵法提高维生素PQQ产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选生丝微菌：在恶劣环境中培养生丝微菌，挑选生长状态良好的生丝微菌；
(2)平皿培养：将步骤(1)得到的生丝微菌接种至灭菌过的平皿培养基上，在30℃培养8天，得到涂布单菌落，取所述涂布单菌落4颗，每颗点种3粒，在30℃平皿培养基上培养8天，得到点种单菌落；
所述平皿培养基的制备过程包括以下步骤：
①称取以下原料，加入水至每1000ml溶液中含有以下重量的原料：
(NH4)2SO4 3g，
KH2PO4 1.4g，
Na2HPO4 3g，
MgSO4·7H2O 1g，
微量元素液 0.7ml，
琼脂粉 20g；
②调节pH至6.8；
③在温度121℃，压力1.4MPa，灭菌15min，冷却至50℃，在无菌环境中加入经过无菌过滤的无水甲醇至每1000ml溶液中含20g无水甲醇，倒平皿，得到灭菌过的平皿固体培养基；
每1000ml所述微量元素液包括以下重量的原料：
FeSO4·7H2O 7.5g，
ZnSO4·7H2O 22.5g，
MnSO4·4H2O 4.5g，
CuSO4·5H2O 0.75g，
NaCl 1.5g，
(NH4)6Mo7O24·4H2O 30mg，
CoCl2·6H2O 30mg，
H3BO3 30mg，
CaCl2·2H2O 30mg，
所述微量元素液的pH为6.8；
(3)斜面培养：取步骤(2)得到的所述点种单菌落，所述点种单菌落直径为4mm，每颗添加1.2ml无菌水，分散均匀，取0.2ml接种至斜面培养基中，在30℃培养5天，得到成熟斜面菌落，所述斜面培养基与步骤(2)中所述平皿培养基相同；
(4)摇瓶种子培养：将步骤(3)中得到的成熟斜面菌落接种至摇瓶种子培养基中，在30℃，在旋转摇瓶机中培养24h，得到摇瓶种子菌液；
所述摇瓶种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 2％，
(NH4)2SO4 0.3％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.4％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
余量为水，
用NaOH溶液调节摇瓶种子培养基的pH至7.5；
(5)种子培养：将步骤(4)得到的摇瓶种子菌液接种至种子培养基，培养至对数生长期，得到种子菌液，测定种子菌液的OD值为0.8；
所述种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇 2％，
(NH4)2SO4 0.3％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.13％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
余量为水，
所述种子培养基的pH值为6.8；
(6)发酵培养：将步骤(5)中培养至对数生长期的种子菌液接种至发酵培养基上，
所述发酵培养基包括以下重量百分比的原料：
(NH4)2SO4 0.24％，
KH2PO4 0.15％，
Na2HPO4 0.4％，
MgSO4·7H2O 0.1％，
微量元素液 0.1％，
PPG2000消泡剂 0.1％，
余量为水，
所述发酵培养基的pH值为7.0，
在30℃，培养8天，培养过程中，取浓度为35％的无菌甲醇溶液作为补料，控制发酵培养基中甲醇的浓度为1000ppm，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液，发酵得到含有维生素PQQ的发酵液的产量为1.25g/L，提取收率为54％。
对比例
对比例1
取生丝微菌菌种，不经过实施例步骤(1)的筛选菌种，其他实验条件与实施例4相同，发酵得到含有维生素PQQ的发酵液的产量为0.46g/L，提取收率为41％。
对比例2
取生丝微菌菌种，经过实施例步骤(1)的筛选菌种，接种至普通的培养基上进行培养，其他实验条件与实施例4相同，发酵得到含有维生素PQQ的发酵液的产量为0.57/L，提取收率为45％。
结果说明，利用本发明提供的方法能够有效提高维生素PQQ的产量和提取收率。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)筛选生丝微菌：挑选生长状态良好的生丝微菌；
(2)平皿培养：将步骤(1)得到的生丝微菌接种至灭菌过的平皿培养基上，在30-37℃培养7-8天，得到涂布单菌落，取所述涂布单菌落3-5颗，每颗点种2-3粒，在30-37℃平皿培养基上培养6-8天，得到点种单菌落；
所述平皿培养基的制备过程包括以下步骤：
①称取以下原料，加入水至每1000ml溶液中含有以下重量的原料：
(NH4)2SO4 1-5g，
KH2PO4 1-2g，
Na2HPO4 2-5g，
MgSO4·7H2O 0.5-2g，
微量元素液0.5-1ml，
琼脂粉15-25g；
②调节pH至6.3-7.5；
③灭菌，冷却至45-55℃，在无菌环境中加入经过无菌过滤的无水甲醇至每1000ml溶液中含15-30g无水甲醇，倒平皿，得到灭菌过的平皿固体培养基；
每1000ml所述微量元素液包括以下重量的原料：
FeSO4·7H2O 5-10g，
ZnSO4·7H2O 15-25g，
MnSO4·4H2O 3-8g，
CuSO4·5H2O 0.5-1.5g，
NaCl 1-2g，
(NH4)6Mo7O24·4H2O 10-50mg，
CoCl2·6H2O 10-50mg，
H3BO3 10-50mg，
CaCl2·2H2O 10-50mg，
所述微量元素液的pH为6.3-7.5；
(3)斜面培养：取步骤(2)得到的所述点种单菌落，每颗添加1-1.5ml无菌水，分散均匀，取0.2-0.25ml接种至斜面培养基中，在25-37℃培养4-6天，得到成熟斜面菌落，所述斜面培养基与步骤(2)中所述平皿培养基相同；
(4)摇瓶种子培养：将步骤(3)中得到的成熟斜面菌落接种至摇瓶种子培养基中，在30-32℃，在摇瓶培养设备中培养24-30h，得到摇瓶种子菌液；
所述摇瓶种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇1-2.5％，
(NH4)2SO4 0.2-0.5％，
KH2PO4 0.1-0.2％，
Na2HPO4 0.2-0.5％，
MgSO4·7H2O 0.05-0.2％，
微量元素液0.05-0.1％，
余量为水，
所述摇瓶种子培养基的pH值为6.5-7.5；
(5)种子培养：将步骤(4)得到的摇瓶种子菌液接种至种子培养基，培养至对数生长期，得到种子菌液；
所述种子培养基包括以下重量百分比的原料：
无水甲醇1-3％，
(NH4)2SO4 0.15-0.45％，
KH2PO4 0.1-0.2％，
Na2HPO4 0.15-0.45％，
MgSO4·7H2O 0.05-0.2％，
微量元素液0.05-0.15％，
余量为水，
所述种子培养基的pH值为6.5-7.5；
(6)发酵培养：将步骤(5)中培养至对数生长期的种子菌液接种至发酵培养基上，
所述发酵培养基包括以下重量百分比的原料：
(NH4)2SO4 0.2-0.5％，
KH2PO4 0.1-0.2％，
Na2HPO4 0.2-0.5％，
MgSO4·7H2O 0.05-0.2％，
微量元素液0.05-0.15％，
消泡剂0.05-0.2％，
余量为水，
所述发酵培养基的pH值为6.0-7.8，
在30-32℃，培养6-10天，收集产物，得到含有维生素PQQ的发酵液。
2.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生丝微菌的挑选方法为，将生丝微菌进行液体培养，取对数生产期的菌液，在30W紫外线灯对菌悬液进行照射，距离为20-30cm，死亡率控制在50-80％，然后稀释，将稀释过的悬浮液放置在培养皿中，将培养皿放置在距离紫外灯30-35cm远的搅拌器上，照射30-180s，然后在无菌环境进行平板涂布，然后在黑暗环境中，温度为35℃下倒置培养72h，得到生长状态良好的生丝微菌。
3.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生丝微菌的挑选方法为，将生丝微菌进行液体培养，取对数生长期的菌液，离心取上清液，加入生理盐水，取菌液涂载片，放入ARTP中，处理距离2-3mm、气量10-15SLM、功率120-125W、处理时间25-30s，将载片置于生理盐水中，振荡、洗脱得到洗脱液，稀释所述洗脱液，进行平板涂布，培养，得到生长状态良好的生丝微菌。
4.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(2)中，③中所述灭菌条件为：温度120-121℃，压力1.2-1.4MPa，时间15-30min。
5.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(3)中，每颗所述点种单菌落直径为3-4mm。
6.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(4)中，利用NaOH溶液调节摇瓶种子培养基的pH至6.5-7.5。
7.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(5)中，测定种子菌液的OD值为0.6-0.8，确定种子菌液处于对数生长期。
8.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述消泡剂为PPG2000。
9.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(6)中，在发酵过程中，取浓度为35-65％的无菌甲醇溶液作为补料，控制发酵培养基中甲醇的浓度为300-1000ppm。
10.根据权利要求1所述的发酵法提高维生素PQQ产量的方法，其特征在于，步骤(6)中，对数生长期的种子菌液在发酵培养基上，在30-32℃，培养6-10天，发酵产量为1g/L以上，提取收率为50％以上。
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