CN102102081B - 一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置，其特征在于，该装置还包括文丘里管；所述的文丘里管的进气端通过气路阀门与所述的空气过滤器相连；所述的文丘里管的出气端连接所述的固体发酵罐，该固体发酵罐上设有泄压的阀门；所述的文丘里管的喉部分别通过液体种子罐、补料罐的出料端阀门连接液体种子罐和补料罐的出口端；所述的气路阀门与文丘里管之间的气路上，还分别通过蒸汽发生器、补料罐、液体种子罐的气路端阀门连接蒸汽发生器、补料罐的进口端和液体种子罐的进口端；高速气流通过文丘里管时喉部气体的流速增加形成负压将液体种子或补料液吸入，并与气体混合，形成气雾后，喷入固体发酵罐的固体培养基中，完成无菌接种和无菌补料。

Description

一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置及其方法

技术领域

本发明属于固态发酵的技术领域，特别涉及一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置及其方法。

背景技术

固态发酵指微生物在没有或者几乎没有游离水的固体培养基上生长、繁殖以及代谢的过程。固态发酵与液体发酵相比有诸多优点，例如：培养基简单且来源广泛；投资少，能耗低；产物的产率高，后提取工艺简单等。

现代意义上的固态发酵技术多为纯种培养过程，需要在无杂菌污染的条件下进行生产。所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌种以外的其他微生物侵入发酵培养基，从而使发酵过程失去了真正意义上的纯种培养。虽然人们采取了多种手段和防范措施，如降低培养基的含水量和pH值来抑制杂菌生长，使用甲醛等杀菌剂，以防止空气中杂菌进入，这些方法都有一定的局限性。加大接种量和使用封闭式反应器被认为是最有效的措施，虽然各种密闭式反应器相继被采用，但所有的操作过程并不都是在严格无菌条件下完成的，所以仍然无法避免杂菌污染。染菌仍是固态发酵中的一个致命弱点，轻者影响目标产物的收率和产品质量，重者导致发酵“倒罐”，造成严重的经济损失。

造成固态发酵染菌的因素是多方面的，其中，接种技术是造成固态发酵染菌的主要因素之一。固态发酵从规模上可分为：摇瓶培养、实验室小试、中试和工业规模。对摇瓶中固体培养基的接种多是在洁净工作台上进行，基本能达到严格意义上的无菌操作，一般不易染菌。而固态发酵反应器，连有灭菌和供无菌空气管路，以及控制系统，在洁净工作台上无菌接种不方便，也不实际。

目前，固体发酵的灭菌多采用在放置反应器的无菌室内对空气进行紫外灭菌，后打开反应器，对实消过的固体培养基接种、拌种，再对反应器密封后进行固态发酵。由于操作空间大、时间长，各种杂菌，尤其是空气中真菌孢子的侵染难以避免，所以固态发酵中染菌现象仍得不到彻底的解决。在应用中，工业规模的固态发酵，主要采用对培养基进行实消，其接种多采用在蒸料罐中对降温后的固体培养基进行接种、拌种操作，再进入主发酵罐进行培养。但由于操作复杂，需要多个设备和管路才能完成，就增加了染菌的机率。

一般固体发酵过程中，由于固体培养基不能象液体发酵中培养基可以完全均匀混合，菌体和培养基间可轻松地实现传质和传热。

而常规的发酵反应器按培养基的运动状态分有两种，即静态和动态反应器。一般的静态反应器，如浅盘式、圆柱式、培养盒式等等，虽然结构简单，但由于温度和湿度难以控制，以及传氧传热困难，很难实现工程放大，而逐渐被动态反应器所取代。动态反应器包括转鼓式、搅动式以及流化床式等。它们采用培养基和发酵罐进行相对运动，有效地提高了传热，传氧，但由于机械部件较多，一方面易染菌，对纯种培养不利，另一方面培养基的相对运动易损伤生长良好的固体菌丝体，使发酵过程产生了障碍。

发明内容

本发明的目的在于，为克服现有技术中固体发酵的染菌，及菌体和培养基间较难实现传质和传热等问题，从而提出一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置及其方法。

本发明将从培养基灭菌、无菌接种、培养以及补料等发酵过程的各环节入手，设计完整的固态发酵无菌培养的装置和方法，以克服固态发酵过程中染菌问题。

为实现上述目的，本发明提出了一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置，包括：固体发酵罐、液体种子罐、补料罐4、空气压缩机8、缓冲罐7、空气过滤器6和蒸汽发生器5；其中，所述的空气压缩机8、缓冲罐7和空气过滤器6依次连接，用于产生无菌空气，其特征在于，所述的固体发酵装置还包括文丘里管2；

所述的文丘里管2的进气端通过进气阀门10与所述的空气过滤器6相连；所述的文丘里管2的出气端连接所述的固体发酵罐1，该固体发酵罐1上设有泄压阀门9，用于控制出气、泄压；所述的文丘里管2的喉部分别通过液体种子罐3、补料罐4的出料端阀门11、13连接液体种子罐3和补料罐4的出口端；

所述的进气阀门10与所述的文丘里管2之间的气路上，还分别通过蒸汽发生器5、补料罐4、液体种子罐3的气路端阀门15、14、12连接蒸汽发生器5、补料罐4的进口端和液体种子罐3的进口端；

在高速气流通过文丘里管2时，由于喉部气体的流速增加形成负压将液体种子或补料液吸入，并与气体混合，形成气雾后，喷入固体发酵罐1的固体培养基中，完成无菌接种和无菌补料。

所述的固体发酵罐为卧式或者立式压力密闭容器，容器内部安置浅盘式支架或传送带式支架，用于堆放固体培养基。

所述的液体种子罐3为液体深层发酵罐，该罐底部的管路与所述的补料罐4底部的管路分别经消毒阀门16、17连接至蒸汽发生器5，进一步地用产生的蒸汽对种子罐中的液体培养基、或补料罐中的水和营养液进行实消。

为实现上述的另一目的，本发明还提出了一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵方法，该方法利用了文丘里管2，所述的文丘里管2的进气端通过进气阀门10与所述的空气过滤器6相连；所述的文丘里管2的出气端连接所述的固体发酵罐1，该固体发酵罐1上设有泄压阀门9，用于控制出气、泄压；所述的文丘里管2的喉部分别通过种子罐3、补料罐4的出料端阀门11、13连接种子罐3和补料罐4的出口端；

所述的进气阀门10与所述的文丘里管2之间的气路上，还分别通过蒸汽发生器5、补料罐4、液体种子罐3的气路端阀门15、14、12连接蒸汽发生器5、补料罐4、液体种子罐3；

在高速气流通过文丘里管2时，由于喉部气体的流速增加形成负压将液体种子或补液吸入，并与气体混合，形成气雾后，喷入固体发酵罐1的固体培养基中，完成无菌接种或无菌补料；

具体步骤包括：

1）空气依次通过空气压缩机8、缓冲罐7和空气过滤器6，经进气阀门10与所述的文丘里管2进气端相连，用于提供无菌空气；

2）所述的蒸汽发生器5的气路端阀门15打开时，产生的蒸汽用于对固体发酵罐中的固体培养基进行原位灭菌；

3）所述的液体种子罐3的气路端阀门12和出料端阀门11打开时，文丘里管2借助无菌空气吸入液体种子，形成气雾，喷入固体培养基，完成无菌接种；

4）所述的补料罐4的气路端阀门14和出料端阀门13打开时，文丘里管2借助无菌空气吸入水或营养液，形成气雾，喷入固体培养基，完成无菌补料；

5）所述的固体发酵罐1的泄压阀门9打开，控制出气，用于泄压，对固体培养基和菌体施以周期性的充压与泄压以强化固体发酵中的传质、传热和气体交换的特点，降低发酵时间。

所述的方法还包括：通过打开液体种子罐3和补料罐4底部的消毒阀门16、17，分别利用蒸汽发生器5产生的蒸汽对液体种子罐3的液体培养基、或补料罐4中的水和营养液进行实消。

所述的固体发酵采用强制通风或者周期变压方式进行，期间可采用气相运送无菌水和液体营养液进行补料，整个过程均在密闭空间内完成。

本发明对固体和液体培养基采用原位灭菌的方法可大大降低染菌的可能性。由于常规固体培养基在灭菌罐灭菌后进行接种时需机械或人工搅拌，还要通过各种装置转入发酵罐，因此，每增加一个操作环节，经过一个设备或管路就会增加染菌的机会，本发明在配制好固体培养基后放置在发酵罐的培养架上直接原位灭菌将给正常纯种发酵打下良好的基础，确保发酵的顺利进行。

本发明采用的气相接种方式是依靠气流输送完成对固体培养基的接种，即在严格无菌条件下，制备种子液或孢子粉，然后利用无菌空气将菌液或孢子输送到已实消过的固态发酵系统中。而文丘里管是在化工领域应用的一个装置。其原理是理想的流体在管道中流动时，在同一管道的任一截面的动能和压力能的总和是不变的，但是能量的形式可以互相转换。文丘里管是利用流体在其收缩段（喉部）中流速的增加，形成一定程度的真空或负压，从而将另一种流体吸入。本发明利用文氏管的工作原理，使高速气流通过文氏管，由于喉部气体的流速增加，形成负压将液体种子吸入，并与气体混合，形成气雾后，喷入固体培养基中，完成无菌接种的目的。文氏管接种时一般选择菌悬液作为种子液，同时，为防止种子液过于粘稠，不利于抽提，可选择适宜的种子液培养时间，以获得较佳的操作粘度。

首先为保证无菌接种，本发明的思路是采用培养基静止状态，而利用气相作为手段进行接种和补料、以及强化传质和传热。因为在固体发酵中气相无处不在，可以迅速到达培养基，是最有效的调控手段，同时对于菌丝体没有什么伤害。因此在发酵过程中，为保障气流接种后分布在固体培养基表面的菌体迅速生长，本发明可采用周期变压发酵方法来实现。

周期变压固态发酵方法的原理是气相压力脉动在单颗粒水平上可将分子扩散变为对流扩散，在传递界面上产生周期性法向作用力，大大加强传递速率，从而明显强化发酵过程中的传质、传热和气体交换。操作时在密闭反应器中对培养介质和菌体施以周期性的充压与泄压而进行的发酵过程。因而利用周期变压可明显强化固体发酵中的传质、传热和气体交换的特点，可显著降低发酵时间，提高发酵效率。

由于在固体发酵中，好氧菌在对数期生长时需要大量的氧气，所以加大了周期变压的频率，因而培养基中的水分会大量散失，进而引起培养基表面干燥，变得坚硬，从而会影响菌体的继续生长。尤其在一些培养周期较长的发酵过程中，及时在发酵过程中补充水分，有的还有必要补加营养液。这点在常规的发酵中进行这种操作是有一定难度的，常常会带入杂菌。而本发明采用文丘里管可以轻松地将灭菌后的无菌水、液体营养液或者缓冲液，用来补充长时间发酵发生的菌体需要的水分、营养以及调节pH值。

本发明针对固体反应器接种不便和易染菌的问题，由以上各个环节的精密设计，确保了整个固体发酵过程的顺利进行，实现了“严格灭菌、气流接种、变压发酵、无菌补料”的全封闭的固态发酵。

所述的蒸汽发生器，产生的蒸汽对发酵罐内的固体培养基进行实消，也可以对种子罐中的液体培养基和补料罐中的水或者营养液进行实消。

所述的一种新型的培养基灭菌、无菌接种、培养和补料的固态发酵方法是先对发酵所需的固体和液体培养基进行灭菌，液体菌种培养完成后，采用气相通过文丘里管输送到固体培养基上接种，进行固体发酵，期间可采用气相运送水和营养液进行补料。

所述的培养基灭菌的固态发酵方法，是采用蒸汽发生器产生的蒸汽对发酵罐内的固体培养基进行实消，而且也可以对种子罐中的液体培养基和补料罐中的水或者营养液进行实消。该固态发酵方法是利用无菌空气快速流经文丘里管时喉部产生的负压，液体菌液随气流输送进入发酵罐，并接种至固体培养基上。而且在发酵过程中采用无菌气流输送无菌水和培养液，对固体基进行补料；全部发酵过程均在密闭空间内完成。

本发明的优点在于：

（1）利用气流经过文丘里管产生的负压可直接将菌种送入发酵罐中，直接随发酵通气进行操作，操作简单，方便快速，而且采用气相为输送相，节省能耗。在发酵过程中还采用该方法可补充无菌水和营养液；

（2）利用文氏管将液体菌种接种到固体培养基上，无需另外添加设备，投资小，效果好；

（3）采用气相进行变压发酵的方法实现了培养基内外的热量和物质的充分的交换，大大强化了发酵中的传质传热，明显提高了发酵效率，缩短了发酵时间；

（4）整个发酵过程的灭菌、接种、补料和发酵的操作完全在密闭的反应器和管路中进行，与外界环境隔绝，杜绝了染菌的可能；

（5）所有固体发酵的环节中没有固体物料的搅拌和翻动，避免对正常生长过程中的菌丝的破坏。

另外，该系统还可以用于对固体和液体培养基进行灭菌，针对固体反应器接种不便和易染菌的问题，尤其在以气相作为主要动力源进行传质和传热，以气相为流动相进行液体菌种的接种，可以不破坏发酵过程形成的良好菌丝。因此，本发明实现了“严格灭菌、气流接种、变压发酵、无菌补料”的全封闭的固态发酵，具有操作简单、不易染菌、能耗低、不破坏菌丝、产率高的特点。

附图说明

图1本发明提供的固态发酵装置图。

具体实施方式

实施例1

固体发酵的菌种为维涅兰德固氮菌（A.vinelandii）。首先配置固氮菌的液体培养基，加入种子罐3中，打开消毒阀门16通入蒸汽，对培养基进行实消。冷却后接入从斜面制得的菌悬液，在30℃培养，搅拌速度为130rpm。培养10h后得到均匀流动性良好的液体菌种。期间准备固体培养基（先配置液体培养基，再按固液比1：3加入草泥炭），放置在固体发酵罐1的浅盘上，料层高度为2cm。打开气路端阀门15用蒸汽对固体培养基在120℃进行灭菌30min，然后冷却至30℃。

待液体菌种培养结束后开启空压机，以及气路端阀门15、12和出料端阀门11，调节空气速度为12m³/hr。当空气经缓冲罐、过滤器快速流经文丘里管时，菌液由种子罐3进入主空气管路，随无菌空气以细小液滴状态携带进入主发酵罐1中。进入反应器1后由于气速迅速降低，菌液沉降到固体培养基上，接种量为10%。控制好接种速度，经过20min完成接种。然后关闭出料端阀门11和气路端阀门12，打开阀门9，控制温度在30℃，调节气量，进行固体发酵。定时开关泄压阀门9和进气阀门10，采用周期变压方法进行培养，压力在0MPa和1.5MPa之间周期变动，继续在30℃培养72hr后即可完成发酵。发酵完成后经过检测没有发现杂菌，固氮菌活菌数达到了750亿/g，纤维素酶（FPA）产量为8.58IU g^-1。

实施例2

固体发酵的菌种为维涅兰德固氮菌（A.vinelandii）。首先配置固氮菌的液体培养基，加入种子罐3中，打开消毒阀门16通入蒸汽，对培养基进行实消。冷却后接入从斜面制得的菌悬液，在30℃培养，搅拌速度为130rpm。培养10h后得到均匀流动性良好的液体菌种。期间准备固体培养基（先配置液体培养基，再按固液比1：3加入草泥炭），放置在固体发酵罐1的浅盘上，料层高度为2cm。打开气路端阀门15用蒸汽对固体培养基在120℃进行灭菌30min，然后冷却至30℃。

待液体菌种培养结束后开启空压机，以及气路端阀门15、气路端阀门12和出料端阀门11，调节空气速度为12m³/hr。当空气经缓冲罐、过滤器快速流经文丘里管时，菌液由种子罐3进入主空气管路，随无菌空气以细小液滴状态携带进入主发酵罐1中。进入反应器1后由于气速迅速降低，菌液沉降到固体培养基上，接种量为10%。控制好接种速度，经过20min完成接种。然后关闭出料端阀门11和气路端阀门12，打开泄气阀门9，控制温度在30℃，调节气量，进行固体发酵。定时开关泄压阀门9和进气阀门10，采用周期变压方法进行培养，压力在0MPa和1.5MPa之间周期变动，继续在30℃培养72hr后即可完成发酵。发酵完成后经过检测没有发现杂菌，固氮菌活菌数达到了750亿/g，纤维素酶（FPA）产量为8.58IU g^-1。

再进行种子液的培养，在30℃下培养12hr后，调节空气流速为15m³/hr,接种至固体培养基上，固体培养基的料层厚度为4cm，接种量为10%。继续发酵。

在固体发酵过程中打开消毒阀门17对补料罐中的水进行实消，并冷却待用。当固体培养基水含量低于50%时，打开出料端阀门13和气路端阀门14，无菌水会以水雾状吹入发酵罐中，给固体培养基补充水分。采用周期变压方法进行培养，压力在0MPa和2.0MPa之间周期变动，高低压维持时间分别为2分钟和5分钟。整个发酵周期为80hr，纤维素酶（FPA）产量为9.05IU g^-1。

实施例3

发酵菌种为斜卧青霉(Penicillium decumbens)。

先进行种子液的培养，在30℃下培养20hr后，调节空气流速为2.0m³/hr,接种至固体培养基上（以粒径2mm左右的麦秸为固体基质），固体培养基的料层厚度为3cm，接种量为10%。采用周期变压方法进行培养，压力在0.5MPa和1.8MPa之间周期变动，高低压维持时间分别为3分钟和3分钟。继续发酵期间保持反应器的湿度在50～80%，如湿度低于设定值，则将灭菌后的无菌水通过气流以雾状送入反应器中。整个发酵周期为114hr，β-Gase达到38.85IU g^-1。

实施例4

发酵菌种为斜卧青霉(Penicillium decumbens)。

先进行种子液的培养，在30℃下培养20hr后，调节空气流速为2.0m³/hr,接种至固体培养基上（以粒径2mm左右的麦秸为固体基质），固体培养基的料层厚度为3cm，接种量为10%。采用周期变压方法进行培养，压力在0.5MPa和1.8MPa之间周期变动，高低压维持时间分别为3分钟和3分钟。继续发酵期间保持反应器的湿度在50～80%，如湿度低于设定值，则将灭菌后的无菌水通过气流以雾状送入反应器中。整个发酵周期为114hr，β-Gase达到38.85IU g^-1。

先进行种子液的培养，在30℃下培养18hr后，调节空气流速为2.2m³/hr,接种至固体培养基上，固体培养基的料层厚度为3cm，接种量为10%。采用周期变压方法进行培养，压力在0MPa和1.5MPa之间周期变动。发酵期间将灭菌后的液体培养基以水雾状送入反应器中，补充到固体培养基上，以满足发酵中菌体生长的需要。整个发酵周期为120hr，β-Gase高达40.14IU g^-1。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置，包括：固体发酵罐（1）、液体种子罐（3）、补料罐（4）、空气压缩机（8）、缓冲罐（7）、空气过滤器（6）和蒸汽发生器（5）；其中，所述的空气压缩机（8）、缓冲罐（7）和空气过滤器（6）依次连接，用于产生无菌空气；其特征在于，所述的固体发酵装置还包括文丘里管（2）；

所述的文丘里管（2）的进气端通过进气阀门（10）与所述的空气过滤器（6）相连；所述的文丘里管（2）的出气端连接所述的固体发酵罐（1），该固体发酵罐（1）上设有泄压阀门（9），用于控制出气以泄压；所述的文丘里管（2）的喉部分别通过液体种子罐（3）、补料罐（4）的出料端阀门（11、13）连接液体种子罐（3）和补料罐（4）的出口端；

所述的进气阀门（10）与所述的文丘里管（2）之间的气路上，还分别通过蒸汽发生器（5）、补料罐（4）、液体种子罐（3）的气路端阀门（15、14、12）连接蒸汽发生器（5）、补料罐（4）的进口端和液体种子罐（3）的进口端；

在高速气流通过文丘里管（2）时，由于喉部气体的流速增加形成负压将液体种子或补料液吸入，并与气体混合，形成气雾后，喷入固体发酵罐（1）的固体培养基中，完成无菌接种或无菌补料。

2.根据权利要求1所述的气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置，其特征在于，所述的固体发酵罐为卧式或者立式压力密闭容器，容器内部安置浅盘式支架或传送带式支架，用于堆放固体培养基。

3.根据权利要求1所述的气相接种和补料的纯种培养的固体发酵装置，其特征在于，所述的液体种子罐（3）为液体深层发酵罐，该罐底部的管路与所述的补料罐（4）底部的管路分别经消毒阀门（16、17）连接至蒸汽发生器（5），进一步地用产生的蒸汽对液体种子罐中的液体培养基或补料罐中的水和营养液进行实消。

4.一种气相接种和补料的纯种培养的固体发酵方法，该方法利用了文丘里管（2），所述的文丘里管（2）的进气端通过固体发酵罐（1）的进气阀门（10）与空气过滤器（6）相连；所述的文丘里管（2）的出气端连接固体发酵罐（1），该固体发酵罐（1）上设有泄压阀门（9），用于控制出气、泄压；所述的文丘里管（2）的喉部分别通过液体种子罐（3）、补料罐（4）的出料端阀门（11、13）连接液体种子罐（3）和补料罐（4）的出口端；

所述的进气阀门（10）与所述的文丘里管（2）之间的气路上，还分别通过蒸汽发生器（5）、补料罐（4）、液体种子罐（3）的气路端阀门（15、14、12）连接蒸汽发生器（5）、补料罐（4）、液体种子罐（3）；

在高速气流通过文丘里管（2）时，由于喉部气体的流速增加形成负压将液体种子或补液吸入，并与气体混合，形成气雾后，喷入固体发酵罐（1）的固体培养基中，完成无菌接种和无菌补料；

具体步骤包括：

1）空气依次通过空气压缩机（8）、缓冲罐（7）和空气过滤器（6），经进气阀门（10）与所述的文丘里管（2）进气端相连，用于提供无菌空气；

2）所述的蒸汽发生器（5）的气路端阀门（15）打开时，产生的蒸汽用于对固体发酵罐中的固体培养基进行原位灭菌；

3）所述的液体种子罐（3）的气路端阀门（12）和出料端阀门（11）打开时，文丘里管（2）借助无菌空气吸入液体种子，形成气雾，喷入固体培养基，完成无菌接种；

4）所述的补料罐（4）的气路端阀门（14）和出料端阀门（13）打开时，文丘里管（2）借助无菌空气吸入水或营养液，形成气雾，喷入固体培养基，完成无菌补料；

5）所述的固体发酵罐（1）的进气阀门（10）和泄压阀门（9）打开或关闭，以控制进气和出气，对固体培养基和菌体施以周期性的充压与泄压以强化固体发酵中的传质、传热和气体交换，减少发酵时间，提高发酵效率。

5.根据权利要求4所述的气相接种和补料的纯种培养的固体发酵方法，其特征在于，所述的方法还包括：通过打开液体种子罐（3）和补料罐（4）底部的消毒阀门（16、17），分别利用蒸汽发生器（5）产生的蒸汽对液体种子罐（3）的液体培养基或补料罐（4）中的水和营养液进行实消。

6.根据权利要求4所述的气相接种和补料的纯种培养的固体发酵方法，其特征在于，所述的固体发酵采用强制通风或者周期变压方式进行，期间采用气相运送无菌水和液体营养液进行补料，整个过程均在密闭空间内完成。

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