CN105420130A - 一种饲用酿酒酵母液固两相发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵领域，具体涉及一种饲用酿酒酵母液固两相发酵方法。所述方法包括步骤：菌种活化及复壮；斜面菌种制备；500mL三角瓶菌种制备配制液体培养基；1000mL三角瓶菌种扩大制备；种子罐菌种制备；固体发酵。根据本法的发酵方法能有效的降低液体发酵在接种过程中的染菌风险，成品杂菌率为0.5％，能够缩短种子制备时间，发挥固体的优势，解决了高耗能、后处理困难等问题，通过发酵培养基的优化，提高了发酵成品有效活菌数，可达100亿/克。

Description

一种饲用酿酒酵母液固两相发酵方法
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体涉及一种饲用酿酒酵母液固两相发酵方法。
背景技术
伴随着我国畜牧业的飞速发展，酿酒酵母作为一种益生菌在畜牧行业中的应用越来越广泛。然而目前酿酒酵母的生产主要才用液体发酵工艺，虽然发酵工艺比较成熟，但是也存在高耗能、易污染等问题，使用传统固体发酵工艺生产酿酒酵母存在有效活菌数较低的问题。
液固两相发酵法主要是通过液体发酵来获取大量的种子液，然后再接种到固体培养基中进行发酵的工艺。这种工艺能有效的降低液体发酵在接种过程中的染菌风险，同时也改进了传统固体发酵的接种方式，能够缩短种子制备时间，同时还能够发挥固体发酵的优势，解决了高耗能、后处理困难等问题。同时通过液固两相发酵所获得的产品生产成本低、产品的耐受性较强。然而，液固两相发酵工艺存在液体菌种不适应固体培养基的问题，液体菌种突然转接到固体培养基后，由于传质、传能等没有液体培养基那么方便，导致液体菌种很难适应固体培养基的环境，导致微生物的延滞期增加，可能导致发酵的失败。
发明内容
本发明针对目前饲用酿酒酵母的液体发酵及固体发酵工艺的不足，优化发酵工艺，提供一种饲用酿酒酵母液固两相发酵方法。该方法制得的饲用酿酒酵母有效活菌数高、杂菌率低、生产成本低。
根据本发明的饲用酿酒酵母液固两相发酵方法包括以下步骤：
(1)菌种活化及复壮；
(2)斜面菌种制备
斜面培养基配方如下：麦芽汁12Bx、琼脂2％、定容至1L，pH自然，
斜面培养基接入步骤(1)所活化菌种，其中酿酒酵母的接种量为试管中混合物总量的0.1％，于30℃条件下培养24h，制得斜面菌种；
(3)500mL三角瓶菌种制备
配制液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然，
将液体培养基分装在500mL三角瓶中，接入步骤(2)所制备的斜面菌种，其中酿酒酵母的接种量为0.1％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(4)1000mL三角瓶菌种扩大制备
配制液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将配制的培养基分装在1000mL三角瓶中，接入步骤(3)所制备的液体种子，其中酿酒酵母的接种量为10％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(5)种子罐菌种制备
发酵罐之加入配方如下的液体培养基，培养基配方：取糖蜜加水稀释至130L，开压缩空气搅匀，浓度为14Bx，加入营养盐(NH4)H2PO4150g、(NH4)2SO4250g、CO(NH2)2150g、MgSO4150g、酵母抽提物450g、消泡剂400mL，
开启发酵罐，当罐内降温至31±2℃，糖浓度为11～13Bx，即可接入步骤(4)制得的液体种子，于30℃通无菌风条件下培养24h，制得液体种子；
(6)固体发酵
配制固体培养基，培养基配方如下：准确计量麸皮、玉米粉和酸化水，麸皮：玉米粉5～6:1，加水量为原料的50％，每50Kg干料加20mL浓硫酸，
固体培养基放入打料机，打碎，灭菌，
准确称取固体发酵之所投加的大料量的2％的硫酸铵、1％的尿素，溶解并煮沸冷却，1％的酶活为10万单位的糖化酶，再将冷却的营养盐和酶液加入步骤(5)制得的液体种子液中，搅拌均匀，待固体培养基冷却至40℃时，接入步骤(5)制得的液体种子液，接种量为10％v/m，将大料及液体菌种混合均匀后装入浅盘，在32℃培养24h结束发酵，出料烘干粉碎制得成品。
根据本发明的具体实施方式，本发明的饲用酿酒酵母液固两相发酵方法包括以下步骤：
(1)菌种活化及复壮
将保存的酿酒酵母(菌种保藏编号ACCC20065)冻干管菌种用无菌水制作成菌悬液，并将菌液稀释到10-8时，在固体平板培养基中进行划线分离进行培养，24小时后挑取单菌落再次进行划线分离培养，得到单菌落。
(2)斜面菌种制备
斜面培养基配方如下：麦芽汁12Bx、琼脂2％、定容至1L，pH自然；
将斜面培养基加热溶解，再进行试管分装并密封；将试管于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，取出冷却备用；
将上述斜面培养基接入步骤(1)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为试管中混合物总量的0.1％，于30℃条件下培养24h，制得斜面菌种。
(3)500mL三角瓶菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将上述培养基分装在500mL三角瓶中，装瓶量为100mL，于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，冷却到30℃时接入步骤(2)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为0.1％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(4)1000mL三角瓶菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将上述培养基分装在1000mL三角瓶中，装瓶量为200mL，于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，冷却到30℃时接入步骤(3)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为10％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(5)种子罐菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：取糖蜜加水稀释至130L左右，开压缩空气搅匀，浓度为14Bx左右即可，加入营养盐(NH4)H2PO4150g、(NH4)2SO4250g、CO(NH2)2150g、MgSO4150g、酵母抽提物450g、消泡剂400mL；
开启发酵罐上部弯管排汽阀与蒸汽进汽阀。关闭其它通往罐内外的阀门，当料液煮沸后，关排汽阀至排微量汽，升压至0.05～0.1MPa，保压30～40min；
当罐内降温至31±2℃，糖浓度为11～13Bx，即可接入步骤(4)制得的液体种子，于30℃通无菌风条件下培养24h，制得液体种子；
(6)固体发酵
按照配方要求配置固体培养基，培养基配方如下：准确计量麸皮、玉米粉和酸化水，麸皮：玉米粉5～6:1，加水量为原料的50％，每50Kg干料加20mL浓硫酸；
固体培养基放入打料机，打碎，匀后装入蒸料锅中，灭菌时装料疏松，常压灭菌2.5小时左右；
准确称取大料投料量2％的硫酸铵、1％的尿素(加约30L水溶解并煮沸冷却待用)，1％的酶活为10万单位的糖化酶，再将冷却的营养盐和酶液加入步骤(5)制得的液体种子液中，开风搅拌均匀，将固体培养基中添加糖化酶和营养盐，帮助液体菌种快速适应固体培养基，为微生物提供碳源及无机盐等；
待固体培养基冷却至40℃时，接入步骤(5)制得的液体种子液，接种量为10％(v/m)，将大料及液体菌种混合均匀后装入浅盘，在32℃培养车间培养24h结束发酵，出料烘干粉碎制得成品；
进一步，所述步骤(6)中糖化酶应先置于40℃无菌水中活化1小时；
进一步，所述步骤(6)中浅盘装样要求厚度为2～3cm，疏松均匀，同时在发酵过程中需要对浅盘中的物料进行翻料2次；
进一步，所述步骤(6)培养过程中控制品温29～34℃，在开始培养前应将室温升至26～32℃，前期保湿培养，夏天可以地面洒水增湿，冬天采取放蒸汽增湿，当品温较高，开启风机，并翻料，旺盛生长期应一小时内至少翻料两次，后期缓慢排朝，以利于干燥。在控制过程中要以室温来控制品温，要以酵母生长的温度趋势做好提前量的控制。
根据本法的发酵方法能有效的降低液体发酵在接种过程中的染菌风险，成品杂菌率为0.5％，同时也改进了传统固体发酵的接种方式，能够缩短种子制备时间，同时还能够发挥固体的优势，解决了高耗能、后处理困难等问题。同时通过液固两相发酵所获得的产品生产成本低、产品的耐受性较强。同时通过发酵培养基的优化，提高了发酵成品有效活菌数，可达100亿/克。
具体实施方式
下面通过实施例作进一步描述。
实施例1
一、发酵试验
采用液固两相工艺发酵酿酒酵母制备饲料添加剂，具体步骤如下：
(1)菌种活化及复壮
将保存的酿酒酵母(菌种保藏编号ACCC20065)冻干管菌种用无菌水制作成菌悬液，并将菌液稀释到10-8时，在固体平板培养基中进行划线分离进行培养，24小时后挑取单菌落再次进行划线分离培养，得到单菌落。
(2)斜面菌种制备
斜面培养基配方如下：麦芽汁12Bx、琼脂2％、定容至1L，pH自然；
将斜面培养基加热溶解，再进行试管分装并密封；将试管于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，取出冷却备用；
将上述斜面培养基接入步骤(1)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为试管中混合物总量的0.1％，于30℃条件下培养24h，制得斜面菌种。
(3)500mL三角瓶菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将上述培养基分装在500mL三角瓶中，装瓶量为100mL，于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，冷却到30℃时接入步骤(2)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为0.1％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(4)1000mL三角瓶菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将上述培养基分装在1000mL三角瓶中，装瓶量为200mL，于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，冷却到30℃时接入步骤(3)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为10％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(5)种子罐菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：取糖蜜加水稀释至130L左右，开压缩空气搅匀，浓度为14Bx左右即可，加入营养盐(NH4)H2PO4150g、(NH4)2SO4250g、CO(NH2)2150g、MgSO4150g、酵母抽提物450g、消泡剂400mL；
开启发酵罐上部弯管排汽阀与蒸汽进汽阀。关闭其它通往罐内外的阀门，当料液煮沸后，关排汽阀至排微量汽，升压至0.05～0.1MPa,保压30～40min；
当罐内降温至31±2℃，糖浓度为11～13Bx，即可接入步骤(4)制得的液体种子，于30℃通无菌风条件下培养24h，制得液体种子；
(6)固体发酵
按照配方要求配置固体培养基，培养基配方如下：准确计量麸皮、玉米粉和酸化水，麸皮：玉米粉5～6:1，加水量为原料的50％，每50Kg干料加20mL浓硫酸；
固体培养基放入打料机，打碎，匀后装入蒸料锅中，灭菌时装料疏松，常压灭菌2.5小时左右；
准确称取大料投料量2％的硫酸铵、1％的尿素(加约30L水溶解并煮沸冷却待用)，1％的酶活为10万单位的糖化酶，再将冷却的营养盐和酶液加入步骤(5)制得的液体种子液中，开风搅拌均匀；
待固体培养基冷却至40℃时，接入步骤(5)制得的液体种子液，接种量为10％(v/m)，将大料及液体菌种混合均匀后装入浅盘，在32℃培养车间培养24h结束发酵，出料烘干粉碎制得成品。
通过稀释平板计数法测得成品中有效活菌数能达100亿/克，同时杂菌率为0.3％。
二、对比试验
(1)菌种活化及复壮
将保存的酿酒酵母(菌种保藏编号ACCC20065)冻干管菌种用无菌水制作成菌悬液，并将菌液稀释到10-8时，在固体平板培养基中进行划线分离进行培养，24小时后挑取单菌落再次进行划线分离培养，得到单菌落。
(2)斜面菌种制备
斜面培养基配方如下：麦芽汁12Bx、琼脂2％、定容至1L，pH自然；
将斜面培养基加热溶解，再进行试管分装并密封；将试管于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，取出冷却备用；
将上述斜面培养基接入步骤(1)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为试管中混合物总量的0.1％，于30℃条件下培养24h，制得斜面菌种。
(3)500mL三角瓶菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将上述培养基分装在500mL三角瓶中，装瓶量为100mL，于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，冷却到30℃时接入步骤(2)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为0.1％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(4)1000mL三角瓶菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将上述培养基分装在1000mL三角瓶中，装瓶量为200mL，于121℃、0.15MPa条件下灭菌30min，冷却到30℃时接入步骤(3)所制备的菌种，其中酿酒酵母的接种量为10％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(5)种子罐菌种制备
按照配方要求配置液体培养基，培养基配方如下：取糖蜜加水稀释至130L左右，开压缩空气搅匀，浓度为14Bx左右即可，加入营养盐(NH4)H2PO4150g、(NH4)2SO4250g、CO(NH2)2150g、MgSO4150g、酵母抽提物450g、消泡剂400mL；
开启发酵罐上部弯管排汽阀与蒸汽进汽阀。关闭其它通往罐内外的阀门，当料液煮沸后，关排汽阀至排微量汽，升压至0.05～0.1MPa,保压30～40min；
当罐内降温至31±2℃，糖浓度为11～13Bx，即可接入步骤(4)制得的液体种子，于30℃通无菌风条件下培养24h，制得液体种子；
(6)固体发酵
按照配方要求配置固体培养基，培养基配方如下：准确计量麸皮、玉米粉和酸化水，麸皮：玉米粉5～6:1，加水量为原料的50％，每50Kg干料加20mL浓硫酸；
固体培养基放入打料机，打碎，匀后装入蒸料锅中，灭菌时装料疏松，常压灭菌2.5小时左右；
待固体培养基冷却至40℃时，接入步骤(5)制得的液体种子液，接种量为10％(v/m)，将大料及液体菌种混合均匀后装入浅盘，在32℃培养车间培养24h结束发酵，出料烘干粉碎制得成品。
通过稀释平板计数法测得成品中有效活菌数为16亿/克，同时杂菌率为1.2％。

Claims (3)

1.饲用酿酒酵母液固两相发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)菌种活化及复壮；
(2)斜面菌种制备
斜面培养基配方如下：麦芽汁12Bx、琼脂2％、定容至1L，pH自然，
斜面培养基接入步骤(1)所活化菌种，其中酿酒酵母的接种量为试管中混合物总量的0.1％，于30℃条件下培养24h，制得斜面菌种；
(3)500mL三角瓶菌种制备
配制液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然，
将液体培养基分装在500mL三角瓶中，接入步骤(2)所制备的斜面菌种，其中酿酒酵母的接种量为0.1％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(4)1000mL三角瓶菌种扩大制备
配制液体培养基，培养基配方如下：麦芽汁12Bx，pH自然；
将配制的培养基分装在1000mL三角瓶中，接入步骤(3)所制备的液体种子，其中酿酒酵母的接种量为10％，于30℃、150～180r/min振荡培养24小时制得液体种子；
(5)种子罐菌种制备
发酵罐之加入配方如下的液体培养基，培养基配方：取糖蜜加水稀释至130L，开压缩空气搅匀，浓度为14Bx，加入营养盐(NH4)H2PO4150g、(NH4)2SO4250g、CO(NH2)2150g、MgSO4150g、酵母抽提物450g、消泡剂400mL，
开启发酵罐，当罐内降温至31±2℃，糖浓度为11～13Bx，即可接入步骤(4)制得的液体种子，于30℃通无菌风条件下培养24h，制得液体种子；
(6)固体发酵
配制固体培养基，培养基配方如下：准确计量麸皮、玉米粉和酸化水，麸皮：玉米粉5～6:1，加水量为原料的50％，每50Kg干料加20mL浓硫酸，
固体培养基放入打料机，打碎，灭菌，
准确称取固体发酵之所投加的大料量的2％的硫酸铵、1％的尿素，溶解并煮沸冷却，1％的酶活为10万单位的糖化酶，再将冷却的营养盐和酶液加入步骤(5)制得的液体种子液中，搅拌均匀，待固体培养基冷却至40℃时，接入步骤(5)制得的液体种子液，接种量为10％v/m，将大料及液体菌种混合均匀后装入浅盘，在32℃培养24h结束发酵，出料烘干粉碎制得成品。
2.根据权利要求1所述的饲用酿酒酵母液固两相发酵方法，其特征在于，在所述步骤(6)中，糖化酶先置于40℃无菌水中活化1小时。
3.根据权利要求1所述的饲用酿酒酵母液固两相发酵方法，其特征在于，在所述步骤(6)中，浅盘装样的厚度为2～3cm，疏松均匀，同时在发酵过程中对浅盘中的物料进行翻料2次。
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