CN103289937B - 一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，它包括以下步骤：菌种选择、斜面种子培养、一级固体种子培养、二级固体种子培养、固体发酵培养、发酵产物烘干和发酵产物闪蒸。本发明的培养基原料都是采用农副产品，成本低，配方合理，能够满足菌种繁殖营养需要，特别是加入碳酸钙缓冲培养过程中培养基的pH值变化，能大大提高了固体发酵的侧孢芽孢杆菌有效活菌含量，实验及生产证明利用本发明方法制备的侧孢芽孢杆菌的有效活菌数可达500亿/克，产品杂菌率低于5%，且芽孢率高达90%以上，能大大降低企业的生产成本，满足微生物菌剂生产的需要。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法。
背景技术
侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）是芽孢杆菌属的一种，菌体杆状，端稍细，单生成对、成堆；芽孢呈椭圆形，大小为（1~1.2）×（2.5~3）微米，附着于芽孢一侧呈独木舟形体，芽孢在纺锤形孢囊中侧生。
侧孢芽孢杆菌可促进植物根部有益菌大量生长，抑制病原菌繁殖，促进植物根系生长，增强根系吸收能力，并能活化土壤养分，从而提高作物产量，改善品质，是一种极为有效的微生物肥料。同时，侧孢芽孢杆菌还能做成微生态饲料添加剂，能减少动物肠道中的有害菌群、调节动物胃肠道微生态平衡，经饲养用户实际使用，发现其具有提高饲料利用率、促进禽畜生长、缩短生长周期和改善肉类品质等功效。
无论利用侧孢芽孢杆菌开发微生物肥料还是微生态制剂产品，有效活菌数都是一个很重要的产品指标，特别考虑到延长产品货架期或耐受饲料加工过程的高温条件，尽量提高产品中侧孢芽孢杆菌的芽孢数就显得非常重要。
侧孢芽孢杆菌生产主要有液体发酵和固体发酵两种，液体发酵需要全套的发酵罐装置，其优点是发酵过程易于控制，产品纯度高，缺点是发酵后需要吸附干燥，工艺程序多，投资大，耗能高，环境污染比较严重，对人员及设备要求较高；固体发酵一般在发酵房中进行，其优点是发酵产量高且发酵后不需吸附，直接烘干粉碎即可使用，工艺简单，投资少，缺点是发酵过程不易控制，杂菌污染不易控制。
中国专利申请号为201110324147.2的发明专利，公布了一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，但是其所使用的菌株、种子培养的具体方法、固体发酵培养的具体操作步骤、发酵产物晾干的方法以及所使用的培养基的配方均不相同，该对比文件的操作方法复杂，生产效率低。其次，该对比文件所使用的培养基配方其pH值为自然值，没有额外调节，但采用农副产品原料做固体培养基，经高温高压灭菌后，培养基pH值一般都会降的比较低，培养一段时间后培养基偏酸，不利于提高固体发酵的有效活菌含量。其次，该对比文件的种子培养采用的是二级液体种子，液体发酵需要全套的发酵罐装置，发酵后需要吸附干燥，工艺程序多，设备成本高，投资大，耗能高，环境污染严重。再次，该对比文件采用的培养基原料淀粉含量比较高，如采用常规的密闭搅拌机搅拌，容易造成培养基结块、板结，灭菌时蒸汽不易穿透，传热性差，影响灭菌效果，而且接种时也不易混合均匀。
侧孢芽孢杆菌固体发酵过程重要的影响因素有培养基配方、水份、温度和pH值。由于发酵过程中产热，料温升高的很快，一般的敞开培养方式水份和温度都不易控制。因此，通过合理的培养基配方和培养条件的控制，建立模式化固体发酵法生产侧孢芽孢杆菌的方法具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于针对现有侧孢芽孢杆菌固体发酵技术存在的问题，提供一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌的方法，生产的侧孢芽孢杆菌有效活菌数高，芽孢的比例高，企业的生产成本低。
本发明的目的通过以下技术方案实现的。
一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，它包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Bacilluslaterosporus）CGMCCNo.1755菌株；该菌种由本申请人自行分离筛选，并已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1755；分类命名为：侧孢芽孢杆菌Bacilluslaterosporu，保藏日期为2006年7月13日，保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为28~45℃，培养时间为36-48小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水清洗收集，调整菌液浓度为10 8 个/mL，然后以体积：质量为5~10%v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，培养温度为28~45℃，培养时间为12~24小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入20~40mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，培养温度为28~45℃，培养时间为12~24小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入50~80L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以体积：质量为1~5% v/m的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为60~70%，随后将接种的固体培养基以10~20厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为28~45℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48~120小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于50~80℃烘房中烘干24~48小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为80~120℃，闪蒸机出口温度为50~70℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品；
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中涉及的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方均为：以重量百分比计，麸皮20~30%，米糠20~30%，豆粕粉20~40%，玉米粉5~20%，花生壳粉5~20%，硫酸镁0.1~0.5%，磷酸氢二钾0.1~0.5%，硫酸锰0.1~0.5%，碳酸钙1~5%，料水质量比1:1.2~1:1.3，用石灰调pH值为9.0~10.0；
其中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方均匀混合后在121℃，灭菌120分钟备用；
其中，固体发酵培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌8~10小时备用。
本发明中，灭菌之前先用石灰将培养基pH值调到碱性，这样灭菌后培养基pH值就为中性，利于侧孢芽孢杆菌的初始生长。侧孢芽孢杆菌在培养过程中会产酸使培养基pH值降低，不利于长时间维持菌体的增殖，本配方中加入的碳酸钙可缓冲培养基的pH值，使菌体能较长时间保持增殖，因此能得到更多的活菌数。
利用系列稀释法对含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出侧孢芽孢杆菌的有效活菌数，对成品稀释10倍，再进行80℃水浴处理20min，可测出成品中的芽孢数。
微生物生长周期一般分为四个阶段：延滞期、对数生长期、平稳生长期和衰亡期，一般不形成芽孢的菌到了平稳生长期后期就开始衰亡，而能形成芽孢的菌到了平稳生长期时，就开始渐渐形成芽孢，以休眠状态存在。由于形成芽孢后再接到培养基里面，会有一个芽孢再次萌发的过程，从而增加培养时间，而且侧孢芽孢萌发是一个相对比较缓慢的过程，在这个过程中会增加染菌的几率，因此，在侧孢芽孢杆菌形成芽孢之前接种到新的培养基里面，就能马上再次生长繁殖，染菌率低，还没形成芽孢的状态，都可以叫做营养体状态。
其中，所述步骤（3）中，所述斜面种子用无菌水清洗收集于三角瓶中，所述固体培养基为250mL三角瓶装30~40g固体培养基。
其中，所述步骤（4）中，所述固体培养基为15L铝桶装800g~1000g固体培养基。
其中，所述步骤（3）和（4）中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，麸皮22~28%，米糠22~28%，豆粕粉25~35%，玉米粉8~18%，花生壳粉8~18%，硫酸镁0.2~0.4%，磷酸氢二钾0.2~0.4%，硫酸锰0.2~0.4%，碳酸钙2~4%，料水质量比1:1.2~1:1.3，用石灰调pH值为9.0~10.0，将上述配方均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌120分钟备用。
其中，所述步骤（5）中，固体发酵培养用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，麸皮20~25%，米糠20~25%，豆粕粉25~35%，玉米粉10~20%，花生壳粉10~20%，硫酸镁0.2~0.3%，磷酸氢二钾0.2~0.3%，硫酸锰0.2~0.3%，碳酸钙2~3%，料水质量比1:1.2~1:1.3，用石灰调pH值为9.0~10.0，将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌8~10小时备用。
其中，所述步骤（2）中，培养温度为35~40℃，培养时间为40~48小时。
其中，所述步骤（3）和步骤（4）中，培养温度为35~40℃，培养时间为14~22小时。
其中，所述步骤（5）中，环境温度为35~45℃，发酵时间为60~108小时。
其中，所述步骤（5）中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为60~65%。
其中，所述步骤（5）中，无菌风的气流速度是7~10米/分钟。
其中，所述步骤（6）中，烘房温度为50~65℃，烘干时间为24~36小时。
本发明的有益效果为：
（1）本发明的培养基原料都是采用农副产品，成本低，配方合理，能够满足菌种繁殖营养需要。
（2）本发明不需要大型设备，对环境污染低，符合国家产业政策。
（3）本发明先采用一级固体种子培养，然后再采用二级固体种子培养，充分活化菌种，并能大大增加生产接种量。
（4）本发明采用还未形成芽孢状态的营养体接种，能保证菌种接到新鲜培养基里后，迅速地生长繁殖，缩短生长延滞期，使侧孢芽孢杆菌短时间内在培养基里形成优势菌群，大大减小杂菌污染的机会。
（5）侧孢芽孢杆菌发酵培养基含水分比较高，而采用的培养基原料淀粉含量比较高，如采用常规的密闭搅拌机搅拌，容易造成培养基结块、板结，灭菌时蒸汽不易穿透，传热性差，影响灭菌效果，而且接种时也不易混合均匀。本发明采用扬渣机混合培养基原料，能充分混匀各种原料，且疏松度高，不会造成结块，灭菌效果好。
（6）常用固体培养基是采用高温高压灭菌锅来进行灭菌，由于固体培养基装量较大，厚度较大，传热慢，一般都要在121℃灭120min以上才能保证灭菌彻底，这样的条件下，容易发生美拉德反应，致使培养基中的营养成分损失很大，灭菌后的物料变黑比较明显。本发明采用100℃常压长时间灭菌，不需要特种设备如高压灭菌锅，而且对培养基原料的营养成分影响很小，能较大程度的利用各种营养成分为菌体繁殖所用。
（7）本发明的固体发酵培养在接种过程中需要进行补充无菌水，保持接种后水分为60~70%，确保侧孢芽孢杆菌发酵效果好。请补充说明不补水的缺点以及补水后的优点。
（8）采用本发明的工艺能大大提高固体发酵的侧孢芽孢杆菌有效活菌含量，实验及生产证明利用本发明方法制备的侧孢芽孢杆菌的有效活菌数可达500亿/克，杂菌率低于5%，且芽孢率高达90%以上。
（9）本发明具有创新性和实用性，生产的侧孢芽孢杆菌有效活菌数高，能大大降低企业的生产成本，满足微生物菌剂生产的需要。
具体实施方式
下面结合实施例1~6对本发明作进一步的说明。
实施例1。
本实施例的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Bacillus laterosporus）CGMCCNo.1755菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为28℃，培养时间为36小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水洗下，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以体积：质量为5% v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，（250mL三角瓶装30g固体培养基），培养温度为28℃，培养时间为12小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入30mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（15L铝桶装800g固体培养基），培养温度为28℃，培养时间为12小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入50L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以体积：质量为3% v/m的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为68%，随后将接种的固体培养基以10厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为28℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵72小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于60℃烘房中烘干30小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为90℃，闪蒸机出口温度为60℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中涉及的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方为：以重量百分比计，麸皮20%，米糠20%，豆粕粉20%，玉米粉20%，花生壳粉15%，硫酸镁0.1%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸锰0.1%，碳酸钙4.3%，料水质量比1:1.2，用石灰调pH值为9.0；
其中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方均匀混合后在121℃，灭菌120分钟备用；
其中，固体发酵培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌9小时备用。
利用系列稀释法对含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出侧孢芽孢杆菌的有效活菌数，对成品稀释10倍，再进行80℃水浴20min处理，可测出成品中的芽孢数。结果是：有效活菌数为5.2×1010/克发酵干料，芽孢率94%，水分3.3%。
实施例2。
本实施例的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Bacillus laterosporus）CGMCCNo.1755菌株；,
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为31℃，培养时间为38小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水洗下，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以体积：质量为6% v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，（250mL三角瓶装30g固体培养基），培养温度为31℃，培养时间为14小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入20mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（15L铝桶装800g固体培养基），培养温度为31℃，培养时间为14小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入56L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以体积：质量为1% v/m的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为60%，随后将接种的固体培养基以12厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为31℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于50℃烘房中烘干24小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为80℃，闪蒸机出口温度为50℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中涉及的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方为：以重量百分比计，麸皮22%，米糠22%，豆粕粉40%，玉米粉5%，花生壳粉8%，硫酸镁0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸锰0.2%，碳酸钙2.4%，料水质量比1:1.2，用石灰调pH值为9.0；
其中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方均匀混合后在121℃，灭菌120分钟备用；
其中，固体发酵培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌9小时备用。
利用系列稀释法对含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出侧孢芽孢杆菌的有效活菌数，对成品稀释10倍，再进行80℃水浴20min处理，可测出成品中的芽孢数。结果是：有效活菌数为5.1×1010/克发酵干料，芽孢率92%，水分3.0%。
实施例3。
本实施例的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Bacillus laterosporus）CGMCCNo.1755菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为34℃，培养时间为40小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水洗下，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以体积：质量为7% v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，（250mL三角瓶装35g固体培养基），培养温度为34℃，培养时间为16小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入25mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（15L铝桶装900g固体培养基），培养温度为34℃，培养时间为16小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入62L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以体积：质量为2% v/m的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为62%，随后将接种的固体培养基以14厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为34℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵60小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于55℃烘房中烘干34小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为85℃，闪蒸机出口温度为55℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中涉及的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方为：以重量百分比计，麸皮24%，米糠24%，豆粕粉37%，玉米粉5%，花生壳粉5%，硫酸镁0.3%，磷酸氢二钾0.3%，硫酸锰0.3%，碳酸钙4.1%，料水质量比1:1.2，用石灰调pH值为9.5；
其中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方均匀混合后在121℃，灭菌120分钟备用；
其中，固体发酵培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌8小时备用。
利用系列稀释法对含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出侧孢芽孢杆菌的有效活菌数，对成品稀释10倍，再进行80℃水浴20min处理，可测出成品中的芽孢数。结果是：有效活菌数为5.0×1010/克发酵干料，芽孢率93%，水分3.2%。
实施例4。
本实施例的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Bacillus laterosporus）CGMCCNo.1755菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为37℃，培养时间为42小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水洗下，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以体积：质量为8% v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，（250mL三角瓶装35g固体培养基），培养温度为37℃，培养时间为18小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入35mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（15L铝桶装900g固体培养基），培养温度为37℃，培养时间为18小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入68L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以4% v/m（体积：质量）的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为65%，随后将接种的固体培养基以16厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为37℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵84小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于67℃烘房中烘干38小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为100℃，闪蒸机出口温度为63℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中涉及的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方为：以重量百分比计，麸皮21%，米糠21%，豆粕粉23%，玉米粉10%，花生壳粉20%，硫酸镁0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸锰0.4%，碳酸钙3.8%，料水质量比1:1.3，用石灰调pH值为9.5；
其中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方均匀混合后在121℃，灭菌120分钟备用；
其中，固体发酵培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌8小时备用。
利用系列稀释法对含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出侧孢芽孢杆菌的有效活菌数，对成品稀释10倍，再进行80℃水浴20min处理，可测出成品中的芽孢数。结果是：有效活菌数为4.9×1010/克发酵干料，芽孢率91%，水分3.0%。
实施例5。
本实施例的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Bacillus laterosporus）CGMCCNo.1755菌株；,
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为41℃，培养时间为44小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水洗下，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以体积：质量为9% v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，（250mL三角瓶装40g固体培养基），培养温度为41℃，培养时间为21小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入37mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（15L铝桶装1000g固体培养基），培养温度为41℃，培养时间为21小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入74L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以4.5% v/m（体积：质量）的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为65%，随后将接种的固体培养基以18厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为41℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵96小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于73℃烘房中烘干42小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为110℃，闪蒸机出口温度为66℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中涉及的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方为：以重量百分比计，麸皮25%，米糠25%，豆粕粉20%，玉米粉12%，花生壳粉12%，硫酸镁0.5%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸锰0.5%，碳酸钙4.5%，料水质量比1:1.3，用石灰调pH值为10.0；
其中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方均匀混合后在121℃，灭菌120分钟备用；
其中，固体发酵培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌10小时备用。
利用系列稀释法对含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出侧孢芽孢杆菌的有效活菌数，对成品稀释10倍，再进行80℃水浴20min处理，可测出成品中的芽孢数。结果是：有效活菌数为4.9×1010/克发酵干料，芽孢率91%，水分3.0%。
实施例6。
本实施例的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Bacillus laterosporus）CGMCCNo.1755菌株；,
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为45℃，培养时间为48小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水洗下，收集于三角瓶中，调整菌液浓度为108个/mL，然后以体积：质量为10% v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，（250mL三角瓶装40g固体培养基），培养温度为45℃，培养时间为24小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入40mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中（15L铝桶装1000g固体培养基），培养温度为45℃，培养时间为24小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入80L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以体积：质量为5% v/m的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为70%，随后将接种的固体培养基以20厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为45℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵120小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于80℃烘房中烘干48小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为120℃，闪蒸机出口温度为70℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品。
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中涉及的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方为：以重量百分比计，麸皮30%，米糠30%，豆粕粉20%，玉米粉8%，花生壳粉8%，硫酸镁0.5%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸锰0.5%，碳酸钙2.5%，料水质量比1:1.3，用石灰调pH值为10.0；
其中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方均匀混合后在121℃，灭菌120分钟备用；
其中，固体发酵培养用固体培养基的制备方法为：将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌10小时备用。
利用系列稀释法对含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出侧孢芽孢杆菌的有效活菌数，对成品稀释10倍，再进行80℃水浴20min处理，可测出成品中的芽孢数。结果是：有效活菌数为4.8×1010/克发酵干料，芽孢率90%，水分3.0%。
本发明的实施例1~6的各项数据列表如下：
表1：实施例1~6的各步骤参数表
| 实施例1 | 实施例 2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例 5 | 实施例 6 | |
| 斜面种子培养温度（℃） | 28 | 31 | 34 | 37 | 41 | 45 |
| 斜面种子培养时间（h） | 36 | 38 | 40 | 42 | 44 | 48 |
| 一级固体种子培养接种量（v/w） | 5% | 6% | 7% | 8% | 9% | 10% |
| 一级固体种子培养固体培养基料量（g） | 30 | 30 | 35 | 35 | 40 | 40 |
| 一级固体种子培养温度（℃） | 28 | 31 | 34 | 37 | 41 | 45 |
| 一级固体种子培养时间（h） | 12 | 14 | 16 | 18 | 21 | 24 |
| 二级固体种子培养无菌水（mL） | 30 | 20 | 25 | 35 | 37 | 40 |
| 二级固体种子培养固体培养基料量（g） | 800 | 800 | 900 | 900 | 1000 | 1000 |
| 二级固体种子培养温度（℃） | 28 | 31 | 34 | 37 | 41 | 45 |
| 二级固体种子培养时间（h） | 12 | 14 | 16 | 18 | 21 | 24 |
| 固体发酵培养无菌水（L） | 50 | 56 | 62 | 68 | 74 | 80 |
| 菌液接种量（v/w） | 3% | 1% | 2% | 4% | 4.5% | 5% |
| 接种后最终水分（%） | 68 | 60 | 62 | 65 | 65 | 70 |
| 固体培养基厚度（cm） | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 |
| 环境温度（℃） | 28 | 31 | 34 | 37 | 41 | 45 |
| 发酵时间（h） | 72 | 48 | 60 | 84 | 96 | 120 |
| 烘房温度（℃） | 60 | 50 | 55 | 67 | 73 | 80 |
| 烘干时间（h） | 30 | 24 | 34 | 38 | 42 | 48 |
| 闪蒸机进口温度（℃） | 90 | 80 | 85 | 100 | 110 | 120 |
| 闪蒸机出口温度（℃） | 60 | 50 | 55 | 63 | 66 | 70 |
| 常压灭菌时间（h） | 9 | 9 | 8 | 8 | 10 | 10 |
表2：实施例1~6的一级固体种子培养、二级固体种子培养和固体发酵培养用固体培养基配方表（以重量百分比计）
| 固体培养基配方 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 |
| 麸皮 | 20% | 22% | 24% | 21% | 25% | 30% |
| 米糠 | 20% | 22% | 24% | 21% | 25% | 30% |
| 豆粕粉 | 20% | 40% | 37% | 23% | 20% | 20% |
| 玉米粉 | 20% | 5% | 5% | 10% | 12% | 8% |
| 花生壳粉 | 15% | 8% | 5% | 20% | 12% | 8% |
| 硫酸镁 | 0.1% | 0.2% | 0.3% | 0.4% | 0.5% | 0.5% |
| 磷酸氢二钾 | 0.1% | 0.2% | 0.3% | 0.4% | 0.5% | 0.5% |
| 硫酸锰 | 0.1% | 0.2% | 0.3% | 0.4% | 0.5% | 0.5% |
| 碳酸钙 | 4.7% | 2.4% | 4.1% | 3.8% | 4.5% | 2.5% |
| 料水质量比 | 1:1.2 | 1:1.2 | 1:1.2 | 1:1.3 | 1:1.3 | 1:1.3 |
| 用石灰调pH为 | 9.0 | 9.0 | 9.5 | 9.5 | 10.0 | 10.0 |
表3：实施例1~6的结果表
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | |
| 有效活菌数（每克发酵干料） | 5.2×1010 | 5.1×1010 | 5.0×1010 | 4.9×1010 | 4.9×1010 | 4.8×1010 |
| 芽孢率（%） | 94 | 92 | 93 | 91 | 91 | 90 |
| 水分（%） | 3.3 | 3.0 | 3.2 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
（1）菌种选择：选用侧孢芽孢杆菌WY9701（Baclicus laterosporus）CGMCCNo.1755菌株；
（2）斜面种子培养：将步骤（1）所述菌株，在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，培养温度为28~45℃，培养时间为36-48小时，得斜面种子；
（3）一级固体种子培养：将步骤（2）得到的斜面种子用无菌水清洗收集，调整菌液浓度为10 8 个/mL，然后以体积：质量为5~10%v/m的接种量，将该菌液接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，培养温度为28~45℃，培养时间为12~24小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得一级固体种子；
（4）二级固体种子培养：在步骤（3）得到的一级固体种子瓶中加入20~40mL无菌水，搅拌混匀，然后将该固体种子全部接种于经121℃、120min灭菌的固体培养基中，培养温度为28~45℃，培养时间为12~24小时，培养至侧孢芽孢杆菌还未形成芽孢的状态，得二级固体种子；
（5）固体发酵培养：将步骤（4）得到的二级固体种子倒入50~80L无菌水中，搅拌混匀，将该菌液以体积：质量为1~5% v/m的接种量，接种于经121℃、120min灭菌的固体发酵培养基中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为60~70%，随后将接种的固体培养基以10~20厘米的厚度平摊于浅盘中，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为28~45℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48~120小时，发酵结束；
（6）发酵产物烘干：将步骤（5）的发酵产物置于50~80℃烘房中烘干24~48小时，期间取样测定水分，当含水率低于20%时，烘干过程结束；
（7）发酵产物闪蒸：将步骤（6）所得发酵产物输入闪蒸机闪蒸干燥，闪蒸机进口温度为80~120℃，闪蒸机出口温度为50~70℃，干燥结束收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含侧孢芽孢杆菌活菌的固体发酵产品，侧孢芽孢杆菌的有效活菌数可达500亿/克，杂菌率低于5%，且芽孢率高达90%以上；
其中，所述步骤（2）涉及的营养琼脂培养基配方及制备方法为：牛肉膏3g/L ，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH7.0~7.2，配制斜面培养基时加入15 g/L的琼脂，121℃灭菌15分钟；
其中，所述步骤（3）和（4）中，一级固体种子培养、二级固体种子培养用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，麸皮22~28%，米糠22~28%，豆粕粉25~35%，玉米粉8~18%，花生壳粉8~18%，硫酸镁0.2~0.4%，磷酸氢二钾0.2~0.4%，硫酸锰0.2~0.4%，碳酸钙2~4%，料水质量比1:1.2~1:1.3，用石灰调pH值为9.0~10.0，将上述配方均匀混合后在121℃，蒸汽灭菌120分钟备用；
其中，所述步骤（5）中，固体发酵培养用固体培养基配方及制备方法为以重量百分比计，麸皮20~25%，米糠20~25%，豆粕粉25~35%，玉米粉10~20%，花生壳粉10~20%，硫酸镁0.2~0.3%，磷酸氢二钾0.2~0.3%，硫酸锰0.2~0.3%，碳酸钙2~3%，料水质量比1:1.2~1:1.3，用石灰调pH值为9.0~10.0，将上述配方用扬渣机混合均匀后在100℃，常压灭菌8~10小时备用。
2.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述斜面种子用无菌水清洗收集于三角瓶中，所述固体培养基为250mL三角瓶装30~40g固体培养基。
3.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述固体培养基为15L铝桶装800g~1000g固体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，培养温度为35~40℃，培养时间为40~48小时。
5.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（3）和步骤（4）中，培养温度为35~40℃，培养时间为14~22小时。
6.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（5）中，环境温度为35~45℃，发酵时间为60~108小时。
7.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（5）中，接种过程中补水，保持接种后最终水分为60~65%。
8.根据权利要求1所述的一种高密度固体发酵生产侧孢芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于：所述步骤（6）中，烘房温度为50~65℃，烘干时间为24~36小时。
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