CN102352334A - 以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，是选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株，在30～35℃利用固体发酵培养48～72小时，然后自然风干35～45小时，再经粉碎过80目筛，制得含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品。本发明方法原料成本低廉，生产工艺简单，不需要大型设备，且产物中枯草芽孢杆菌有效活菌高，为600亿/克发酵干料的产品，能够满足微生物肥料的大量需求。

Description

以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法
技术领域
本发明涉及一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌的方法，属于生物技术领域。 
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，单个细胞，0.7～0.8×2～3微米，无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。 
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有多种功能，是一种可以应用于多个领域的优良菌种，例如可以作为微生物农药、微生物饲料添加剂、生物有机肥接种剂、净水剂等。它的主要功能有抑制有害细菌(大肠杆菌、沙门氏菌)生长，预防腹泻、下痢等疾病；分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，降解动植物性饲料中复杂的有机物，促进消化吸收，提高饲料利用率；安全高效，无药残，无毒副作用，促进动物生长，增强动物免疫力和抗病力；减少粪便中氮、磷、钙的排泄量，减少有害气体排放，降低养殖场所氨气、吲哚等有害气体的浓度，改善养殖环境；分解水体中的残饵、粪便、死藻等，维护水质，减少病害，减小换水量，提高水产动物免疫力、抗病力，提高成活率。 
枯草芽孢杆菌生产主要有液体发酵和固体发酵两种，液体发酵需要全套的发酵罐装置，其优点是发酵过程易于控制，产品纯度高，缺点是发酵后需要吸附干燥，工艺程序多；固体发酵一般在发酵房中进行，其优点是发酵产量高且发酵后不需吸附，直接晾干即可使用，工艺简单，缺点是发酵过程不易控制，杂菌污染不易控制。因此，采用固体发酵生产的枯草芽孢杆菌产品不适用于微生物饲料添加剂，但可适用于微生物肥料。 
目前国内大部分生产枯草芽孢杆菌的企业是采用液体发酵，例如康地恩生物集团、山东宝来利来生物工程股份有限公司等，采用固体发酵生产枯草芽孢杆菌的企业不多且规模不大。 
枯草芽孢杆菌固体发酵的原料主要是麸皮、豆粕、稻壳、玉米粉等，其中麸皮、豆粕、玉米粉为菌体生长提供碳氮源，而稻壳主要是增加固体培养基的透气性。另外培养基中还需要添加一些无机元素供菌体生长所用。枯草芽孢杆菌固体发酵过程最重要的两个因素是培养基配方和温度。由于枯草芽孢杆菌发酵过程中产热，料温升高的很快，如果控制不好，菌体生长易于提前停止。因此，通过合理的培养基配方和温度控制，以建立模式化固体发酵法生产枯草芽孢杆菌活菌的方法具有重要意义。 
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌的方法。 
本发明所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，步骤是： 
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株； 
(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100mL液体种子培养基中，以150～180转/分钟的转速、35～40℃震荡培养24～36小时，得一级种子液；以体积比1～3％的接种量，将一级种子液再次接种于同样配方的液体种子培养基中，以150～180转/分钟的转速、35～40℃震荡培养18～36小时，得二级种子液； 
(3)固体发酵培养：以5～10％质量比的接种量，将二级种子液接种于经121℃、30分钟灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以4～7厘米的厚度平摊于底部带空隙的料筐中，再将料筐置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在30～35℃，并时常翻料使料筐中层料温不高于47℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48～72小时，发酵结束； 
(4)发酵产物晾干：将步骤(3)发酵产物平摊于干净的水泥地面上自然风干35～45小时，其间取样镜检和测定水分，当芽孢率超过70％，含水率低于10％时，风干过程结束，收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品； 
利用系列稀释法对含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，可计算出枯草芽孢杆菌的有效活菌数。 
上述液体种子培养基配方及制备方法为：以重量份计，将玉米粉0.5-2份、豆浆1-4份、葡萄糖0.1-1份、硫酸铵0.1-1份、硫酸锰0.005-0.02份、硫酸镁0.001-0.03份、磷酸氢二钾0.001-0.03份混合，加纯净水1-91份溶解，调节pH值至6-8，蒸汽灭菌后备用； 
上述固体发酵培养基配方及制备方法为：以重量份计，将麸皮20-40份、玉米粉2-8份、豆粕2-8份、红糖0.1-5份、糖蜜0.1-5份、稻壳1-10份、硫酸铵0.1-1份、硫酸镁0.01-1份、硫酸锰0.01-1份、酵母粉0.001-0.1份、自来水20-75份均匀混合，然后蒸汽灭菌备用，自然pH，不需额外调节。 
上述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法中，步骤(1)所述菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；步骤(2)所述培养温度优选37℃；步骤(2)所述培养时间优选28小时；步骤(3)所述环境温度优选30℃；步骤(3)所述培养时间优选56小时；步骤(3)所述无菌风的气流速度为2-6米/秒；步骤(4)所述风干时间优选40小时。 
本发明将麸皮、玉米粉、豆粕、红糖、糖蜜、稻壳放在一起进行枯草芽孢杆菌的固体发酵，通过合理的培养基配方和温度控制，大大提高了固体发酵的枯草芽孢杆菌有效活菌含量，实验证实利用本发明方法制备的枯草芽孢杆菌的有效活菌数可达600亿/克固体发酵干料，具有创新性和实用性。经检索，国内外还没有这种固体发酵方法。 
应用本发明方法生产含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品成本低，不需要大型设备，对环境污染也低，符合国家产业政策。并且本发明方法生产的枯草芽孢杆菌有效活菌数高，能够满足微生物肥料的需要。 
具体实施方式
实施例1： 
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株；所述菌 种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，具有固氮和作物根际促生能力； 
(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接1环于100mL液体种子培养基中，37℃震荡培养28小时，得一级种子液； 
(3)摇瓶发酵培养： 
以5％的体积比的接种量，将一级种子液接种于装有1000mL液体种子培养基的摇瓶中，37℃，以180转/分钟的转速摇瓶发酵28小时，发酵结束，得二级种子液； 
(4)菌落计数：以系列稀释法进行平板计数，二级种子液活菌含量为1.5×109/mL发酵液。 
上述液体发酵种子培养基及制备方法为：按重量份(单位：克)称取玉米粉2份、豆浆4份、葡萄糖0.5份、硫酸铵0.2份、硫酸锰0.005份、硫酸镁0.02份、磷酸氢二钾0.005份，然后将其充分混合，加自来水93.3份溶解，调节pH值至7，121℃、30分钟蒸汽灭菌后备用。 
实施例2： 
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120，所述菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心； 
(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于60mL液体发酵种子培养基中，37℃震荡培养30小时，得一级种子液； 
(3)摇瓶发酵培养： 
以3％的体积比的接种量，将一级种子液接种于装有1000mL液体种子培养基的摇瓶中，37℃，以180转/分钟的转速摇瓶发酵28小时，发酵结束，得二级种子液； 
(4)固体发酵培养： 
以10％的质量比的接种量，将二级种子液接种于0.2吨提前配好混匀并灭菌的固体培养基中，将接种好的固体培养基以5厘米的厚度平摊于底部带空隙的塑料筐中，再将塑料筐置于无菌的固体发酵房铁架上发酵，利用冷暖空调控制环境温度在32℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风(气流速度为3-4米/秒)，在发酵过程中控制料温，时常翻料使料筐中层料温不高于47℃，发酵50小时后结束； 
(5)发酵产物分离晾干： 
将步骤(4)所述发酵结束后的产物平摊于干净的水泥地面上自然风干35～45小时，在风干过程中大量菌体转变为芽孢。在风干中，取样镜检和水分测定，当芽孢率超过70％，含水率低于8％时，风干过程即结束，收集发酵产物粉碎过80目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品； 
(6)菌落计数：利用系列稀释法对含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，结果是：有效活菌数为6×1010/克发酵干料，芽孢率79％，水分5％。 
上述液体种子培养基及制备方法为：按重量份(单位：克)称取玉米粉1.5份、豆浆3.5份、葡萄糖1份、硫酸铵0.1份、硫酸锰0.006份、硫酸镁0.02份、磷酸氢二钾0.005份，混合，加自来水93.9份溶解，调节pH值至7，121℃、30分钟蒸汽灭菌后备用。 
上述固体发酵培养基及制备方法为：按重量份(单位：克)称取麸皮30份、玉米粉3 份、豆粕3份、红糖2份、糖蜜2份、稻壳5份、硫酸铵0.5份、硫酸镁0.01份、硫酸锰0.01份、酵母粉0.005份、自来水54.5份，均匀混合后121℃、30分钟蒸汽灭菌备用，自然pH，不需额外调节。 
实施例3： 
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120； 
(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100mL液体种子培养基中，37℃震荡培养30小时，得一级种子液； 
(3)摇瓶发酵培养： 
以2％的体积比的接种量，将一级种子液接种于装有1000mL液体种子培养基的摇瓶中，37℃，以180转/分钟的转速摇瓶发酵28小时，发酵结束，得二级种子液； 
(4)固体发酵培养： 
以7％的质量比的接种量，将二级种子液接种于0.8吨提前配好混匀并灭菌的固体培养基中，将接种好的固体培养基以7厘米的厚度平摊于底部带空隙的塑料筐中，再将塑料筐置于无菌的固体发酵房铁架上发酵，利用冷暖空调控制环境温度在30℃，同时往固体发酵房中通无菌风(气流速度为4-6米/秒)，56小时后发酵结束；在发酵过程中控制料温，当料的中层温度超过47℃时，人工翻料。 
(5)发酵产物分离晾干： 
将步骤(4)所述发酵结束后的产物平摊于干净的水泥地面上自然风干35～45小时，在风干过程中大量菌体转变为芽孢。在风干中，取样镜检和水分测定，当芽孢率超过70％，含水率低于8％时，风干过程即结束，收集发酵产物粉碎过80目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品； 
(6)菌落计数：以系列稀释法对含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品进行菌落计数，结果是：有效活菌数为6.5×1010/克发酵干料，芽孢率81.9％，水分6.5％。 
上述液体种子培养基及制备方法为：按重量份(单位：克)称取玉米粉2份、豆浆4份、葡萄糖0.5份、硫酸铵0.1份、硫酸锰0.007份、硫酸镁0.02份、磷酸氢二钾0.005份，混合，加自来水93.4份溶解，调节pH值至7，蒸汽灭菌后备用。 
上述固体发酵培养基及制备方法为：按重量份(单位：克)称取麸皮35份、玉米粉2.5份、豆粕3份、红糖1份、糖蜜1份、稻壳5份、硫酸铵0.5份、硫酸镁0.01份、硫酸锰0.01份、酵母粉0.005份、自来水52份，均匀混合后蒸汽灭菌备用，自然pH，不需额外调节。 

Claims (7)

1.一种以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，步骤是：
(1)菌种选择：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC03120菌株；
(2)种子培养：将步骤(1)所述菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于90～100mL液体种子培养基中，以150～180转/分钟的转速、35～40℃震荡培养24～36小时，得一级种子液；以体积比1～3％的接种量，将一级种子液再次接种于同样配方的液体种子培养基中，以150～180转/分钟的转速、35～40℃震荡培养18～36小时，得二级种子液；
(3)固体发酵培养：以5～10％质量比的接种量，将二级种子液接种于经121℃、30分钟灭菌的固体培养基中，随后将接种的固体培养基以4～7厘米的厚度平摊于底部带空隙的料筐中，再将料筐置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在30～35℃，并时常翻料使料筐中层料温不高于47℃，同时利用空压机往固体发酵房中通无菌风，发酵48～72小时，发酵结束；
(4)发酵产物晾干：将步骤(3)发酵产物平摊于干净的水泥地面上自然风干35～45小时，其间取样镜检和测定水分，当芽孢率超过70％，含水率低于10％时，风干过程结束，收集产物并粉碎，过80目筛，所得粉末即为含枯草芽孢杆菌活菌的固体发酵成品；
上述液体种子培养基配方及制备方法为：以重量份计，将玉米粉0.5-2份、豆浆1-4份、葡萄糖0.1-1份、硫酸铵0.1-1份、硫酸锰0.005-0.02份、硫酸镁0.001-0.03份、磷酸氢二钾0.001-0.03份混合，加纯净水1-91份溶解，调节pH值至6-8，蒸汽灭菌后备用；
上述固体发酵培养基配方及制备方法为：以重量份计，将麸皮20-40份、玉米粉2-8份、豆粕2-8份、红糖0.1-5份、糖蜜0.1-5份、稻壳1-10份、硫酸铵0.1-1份、硫酸镁0.01-1份、硫酸锰0.01-1份、酵母粉0.001-0.1份、自来水20-75份均匀混合，然后蒸汽灭菌备用，自然pH，不需额外调节。
2.如权利要求1所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养温度为37℃。
3.如权利要求1所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，步骤(2)所述培养时间为28小时。
4.如权利要求1所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，步骤(3)所述环境温度为30℃。
5.如权利要求1所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养时间为56小时。
6.如权利要求1所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，步骤(3)所述无菌风的气流速度为2-6米/秒。
7.如权利要求1所述以固体发酵生产枯草芽孢杆菌活菌的方法，其特征在于，步骤(4)所述风干时间为40小时。 
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