CN107475091A - 一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，包括固定框架、若干放料板、若干搅拌装置和喷洒水装置，其中，所述固定框架由固定柱，以及若干条支撑杆组成；所述放料板由左侧板和右侧板组成，左侧板、右侧板的外侧边缘设有挡板；左侧板、右侧板上设有多个漏孔；搅拌装置由驱动电机、受驱动电机驱动的搅拌轴和设置在搅拌轴上的若干搅拌抓手组成；喷洒水装置由水管和设置在水管上的若干喷头组成。还公开了利用该发酵装置进行发酵的方法。本发明采用物理方法对原辅料进行搅拌、通气、补水、温控，既降低了生产成本，又提高了产能效率，使原辅料混合更加均匀，增加通气量，能够保证发酵的效果，结构简单，使用方便，节约大量人力物力。

Description

一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置及发酵方法

技术领域

本发明涉及一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置及发酵方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性，需氧菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，同时枯草芽孢杆菌还会释放一些对植物生长有益的活性物质，刺激植物的生长。

目前对于枯草芽孢杆菌的发酵，生产过程中普遍存在活菌数和芽孢率偏低的问题，一般芽孢含量在5.0×10⁹cfu/mL以下，没有芽孢的菌体会在短时间内死亡，大大降低菌剂的活性和质量稳定性；同时，液体发酵后期活菌的提取能耗较大，产生大量废液，对环境造成一定的污染，而固体发酵的研究大多处于实验室阶段，机械化工业生产没有成熟案例，现有技术中的固体发酵设备不能满足枯草芽孢杆菌的发酵需要，无菌化和自动化条件比较低，需要大量的人力物力。

发明内容

针对上述现有技术，为实现发酵过程的无菌化、机械化、自动化，本发明提供了一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，以及发酵方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，包括固定框架、若干放料板、若干搅拌装置和喷洒水装置，其中，

所述固定框架由至少两个固定柱或固定架，以及若干条支撑杆或支撑架组成，固定柱或固定架竖直固定在地面上，支撑杆或支撑架水平放置，支撑杆或支撑架的两端与固定柱或固定架固定连接，若干条支撑杆或支撑架由上到下平行排列，位于最下层的支撑杆或支撑架的下方设有若干出料框；

所述放料板由左侧板和右侧板组成，左侧板、右侧板均与支撑杆或支撑架铰接(通过合页连接)，左侧板、右侧板的外侧边缘设有挡板(应用时，防止发酵物料从左侧板、右侧板的边缘洒落)；左侧板、右侧板上设有相互配合的插销结构(当左侧板、右侧板水平放置时，通过插销结构固定，此时可将发酵物置于板面上；当打开插销时，由于重力作用，左侧板、右侧板均自然垂下，其上的发酵物落下)，或：左侧板、右侧板上设有插销结构，固定柱或固定架上设有与之相配合的插销结构(当左侧板、右侧板水平放置时，通过插销结构与固定柱或固定架连接，此时可将发酵物置于板面上；当打开插销时，由于重力作用，左侧板、右侧板均自然垂下，其上的发酵物落下)；所述左侧板、右侧板上设有多个漏孔(用于发酵过程中通气)，漏孔的直径≤2mm，相邻漏孔之间的距离≥2mm；

所述搅拌装置由驱动电机、受驱动电机驱动的搅拌轴和设置在搅拌轴上的若干搅拌抓手组成，其中，搅拌轴竖直放置并穿过左侧板或右侧板(左侧板、右侧板上设有相应的孔以供穿过)。实际应用时，搅拌装置可固定在室内顶壁上，或者由专门的支撑架固定支撑。工作时，驱动电机与电源接通，带动搅拌轴转动，进而带动搅拌抓手旋转以对物料进行搅拌。

所述喷洒水装置由水管和设置在水管上的若干喷头组成，其中，水管设置在左侧板、右侧板的背面(具体应用时，为节约资源，位于最底层的放料板背面可不设置喷洒水装置)；使用时，水管与水龙头实时连接，可直接输入无菌水，也可也在水管内设置无菌过滤器，对自来水进行过滤。

优选的，所述固定框架、搅拌轴、搅拌抓手由不锈钢材料制成，所述左侧板、右侧板、出料框由聚四氟乙烯材料制成。

优选的，所述左侧板、右侧板的宽度为40cm，长度为8m，厚度为5mm，挡板的高度为10cm。

优选的，所述放料板有2～4层，具体应用时，根据室内高度等灵活选择。

优选的，所述放料板，上下相邻的放料板之间的距离为80cm。

优选的，所述搅拌抓手可以是搅拌叶，也可以是机器人抓手，其结构可以为：包括四个部分，每个部分包含5根手指，工作时，搅拌抓手可沿中心轴上下移动(不工作时，搅拌抓手停在每层放料板的上方，不与发酵物料接触)，以达到更好的搅拌物料的效果。

优选的，喷头为8孔的圆形喷头，喷头的喷射直径为17cm，相邻喷头之间的距离≥33cm(靠近搅拌轴处不安装，防止搅拌抓手进水损坏)。

优选的，还包括顶板，顶板设在位于最上层的放料板的上方，顶板两端与固定柱或固定架固定连接，顶板背面(下表面)设有喷洒水装置(对位于最上层的放料板进行喷洒水)；驱动电机可固定在顶板上。或者：为节约资源，位于最上层的放料板上可不设置漏孔、挡板。

一种枯草芽孢杆菌的固体发酵方法：将固体发酵用发酵液与固体发酵培养基混合混匀(接种量10％)，平铺(厚度4cm)，进行发酵，发酵条件为：温度37℃，培养72h，每间隔12h补水并搅拌1次(补水以保持培养物的湿度在60％)；发酵结束后，得发酵产物，移出发酵产物，通风晾干，粉碎，即可使用或进行后续加工。

进一步地，利用上述装置进行固体发酵的方法：将固体发酵用发酵液与固体发酵培养基混合混匀(接种量10％)，平铺在固定好的放料板上(厚度4cm)，进行发酵，发酵条件为：温度37℃，培养72h，每间隔12h补水并搅拌1次(补水以保持培养物的湿度在60％)(采用喷洒水装置补水，采用搅拌抓手搅拌)；发酵结束后，打开左侧板、右侧板，发酵产物落入出料筐，移出出料筐，通风晾干，粉碎，即可使用或进行后续加工。

所述固体发酵培养基，是由固形物和水按料水比1:1.1组成的；所述固形物，是由以下重量百分数的组分组成的：豆粕粉9％，稻壳粉10％，葡萄糖0.5％，硫酸铵0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.05％，余量为麸皮。

进一步地，所述固体发酵用发酵液，是通过以下方法制备得到的：

(1)一级种子液制备：将4℃保存的枯草芽孢杆菌斜面，接种于LB液体培养基(酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％)中，转速200rpm/min，37℃培养17h，得到活化的枯草芽孢杆菌一级种子液；

(2)二级种子液制备：将活化的枯草芽孢杆菌按2％的接种量接种于1000mLLB液体培养基中，摇瓶培养，温度37℃、转速200rpm/min，培养17h，得到二级种子液；

(3)50L发酵罐液体培养：将步骤(2)得到的种子液接种于50L发酵罐(内含LB液体培养基)中，接种量2％，温度37℃，转速200rpm/min，培养17h，得到固体发酵用发酵液。

本发明采用物理方法对原辅料进行搅拌、通气、补水、温控，既降低了生产成本，又提高了产能效率，使原辅料混合更加均匀，增加通气量，能够保证发酵的效果，结构简单，使用方便，节约大量人力物力。本发明的发酵装置，结构巧妙，发酵过程中，发酵物料的通气、补水、搅拌均可方便实现，发酵完成后，可以快速地收集发酵物料，使用非常方便，可推广应用。

上述未详尽描述描述的内容，均为现有技术中已有的技术，比如搅拌装置、喷洒水装置、插销结构，均可市场购买得到，或通过常规方式实现。

附图说明

图1：本发明的用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置的结构示意简图。

图2：放料板的结构示意简图(仰视图)。

其中，1、固定柱；2、支撑杆；3、左侧板；4、右侧板；5、出料框；6、挡板；7、插销结构；8、漏孔；9、驱动电机；10、搅拌轴；11、搅拌抓手；12、水管；13、喷头。

注：上述结构图仅为描述结构、便于本领域技术人员理解所绘制，并不代表实际尺寸、相对距离和比例，实际应用时，所涉及结构的大小、尺寸比例、型号、规格、布局、各结构之间的相对距离等，由生产厂家根据实际情况灵活选择。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，包括固定框架、2层放料板、若干搅拌装置和喷洒水装置，如图1所示，其中，

所述固定框架由两个固定柱1，以及2条支撑杆2组成，固定柱1竖直固定在地面上，支撑杆2水平放置，支撑杆2的两端与固定柱1固定连接，2条支撑杆2由上到下平行排列，位于下层的支撑杆2的下方设有若干出料框5；

所述放料板由左侧板3和右侧板4组成，如图2所示，左侧板3、右侧板4均与支撑杆2铰接(通过合页连接)，左侧板3、右侧板4的外侧边缘设有挡板6(应用时，防止发酵物料从左侧板3、右侧板4的边缘洒落)；左侧板3、右侧板4上设有相互配合的插销结构7(当左侧板3、右侧板4水平放置时，通过插销结构7固定，此时可将发酵物置于板面上；当打开插销时，由于重力作用，左侧板3、右侧板4均自然垂下，其上的发酵物落下)；所述左侧板3、右侧板4上设有多个漏孔8(以成排的方式排列在左侧板3、右侧板4上)(用于发酵过程中通气)，漏孔8的直径≤2mm，相邻漏孔8之间的距离≥2mm；

所述搅拌装置由驱动电机9、受驱动电机9驱动的搅拌轴10和设置在搅拌轴10上的若干搅拌抓手11组成，其中，搅拌轴10竖直放置并穿过左侧板3或右侧板4(左侧板3、右侧板4上设有相应的孔以供穿过)。实际应用时，搅拌装置可固定在室内顶壁上或顶板上，或者由专门的支撑架固定支撑。工作时，驱动电机9与电源接通，带动搅拌轴10转动，进而带动搅拌抓手11旋转以对物料进行搅拌。

所述喷洒水装置由水管12和设置在水管12上的若干喷头13组成，其中，水管12设置在左侧板3、右侧板4的背面(具体应用时，为节约资源，位于最底层的放料板背面可不设置喷洒水装置)；使用时，水管12与水龙头实时连接，可直接输入无菌水，也可也在水管内设置无菌过滤器，对自来水进行过滤。

所述固定框架、搅拌轴10、搅拌抓手11由不锈钢材料制成，所述左侧板3、右侧板4、出料框5由聚四氟乙烯材料制成。

所述左侧板3、右侧板4的宽度为40cm，长度为8m，厚度为5mm，挡板的高度为10cm。

上下相邻的放料板之间的距离为80cm。

所述搅拌抓手11可以是搅拌叶，也可以是机器人抓手。

所述喷头13为8孔的圆形喷头，喷头的喷射直径为17cm，相邻喷头之间的距离≥33cm(靠近搅拌轴处不安装，防止搅拌抓手进水损坏)。

还包括顶板，顶板设在位于最上层的放料板的上方，顶板两端与固定柱或固定架固定连接，顶板背面(下表面)设有喷洒水装置(对位于最上层的放料板进行喷洒水)；驱动电机可固定在顶板上。

实施例1枯草芽孢杆菌的固体发酵

利用上述发酵装置进行发酵，步骤如下：

(1)将4℃保存的枯草芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基(酵母粉0.25g、胰蛋白胨0.5g、氯化钠0.5g、水50mL，121℃、灭菌20min)中，37℃、200rpm/min，培养17h，得到枯草芽孢杆菌活化菌液。

(2)用移液枪吸取16mL活化的菌液，接种于4个1000mL摇瓶中，每个摇瓶培养基装液量为200ml，摇床培养条件为：37℃、200rpm/min，培养17h。

(3)将上一步得到的种子液接种于50L发酵罐中，培养基装液量为35L，接菌量700mL，发酵条件为：37℃、通气量1:1、转速200rpm/min，发酵培养17h，得到固体发酵所用菌液；

(4)取15L发酵液，加入150L灭菌水，接种于150kg灭菌的固体培养基中，混匀后平铺在左侧板、右侧板上。固体发酵培养基配比：麸皮119.775kg、豆粕粉13.5kg、稻壳粉15kg、葡萄糖0.75kg、硫酸铵0.75kg、硫酸镁0.15kg、硫酸锰0.075kg；培养基的灭菌条件为：121℃、25min，发酵条件为：物料厚度4cm、37℃、72h、搅拌1次/12h(采用搅拌抓手搅拌)、补水1次/12h(采用喷洒水装置补水)。营养琼脂平板计数活菌数3.2×10¹⁰cfu/g，孔雀石绿芽孢染色，油镜观察芽孢率93.2％。

(5)打开左侧板、右侧板，使其自然垂下，固体发酵产物进入出料筐，移出出料筐通风晾干，粉碎，得到枯草芽孢杆菌产品。

实施例2枯草芽孢杆菌的固体发酵

利用上述发酵装置进行发酵，步骤如下：

(1)将4℃保存的枯草芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基(酵母粉0.25g、胰蛋白胨0.5g、氯化钠0.5g、水50mL，121℃、灭菌20min)中，37℃、200rpm/min，培养17h，得到枯草芽孢杆菌活化菌液。

(2)用移液枪吸取16mL活化的菌液，接种于4个1000mL摇瓶中，每个摇瓶培养基装液量为200ml，摇床培养条件为：37℃、200rpm/min，培养17h。

(3)将上一步得到的种子液接种于50L发酵罐中，培养基装液量为35L，接菌量700mL，发酵条件为：37℃、通气量1:1、转速200rpm/min，发酵培养17h，得到固体发酵所用菌液；

(4)取30L发酵液，加入300L灭菌水，接种于300kg灭菌的固体培养基中，混匀后平铺在左侧板、右侧板上。固体发酵培养基配比：麸皮239.55kg、豆粕粉27kg、稻壳粉30kg、葡萄糖1.5kg、硫酸铵1.5kg、硫酸镁0.3kg、硫酸锰0.15kg；培养基的灭菌条件为：121℃、25min，发酵条件为：物料厚度4cm、37℃、72h、搅拌1次/12h、补水1次/12h。营养琼脂平板计数活菌数3.5×10¹⁰cfu/g，孔雀石绿芽孢染色，油镜观察芽孢率93.6％。

(5)打开左侧板、右侧板，使其自然垂下，固体发酵产物进入出料筐，移出出料筐通风晾干，粉碎，得到枯草芽孢杆菌产品。

Claims (10)

1.一种用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，其特征在于：包括固定框架、若干放料板、若干搅拌装置和喷洒水装置，其中，

所述固定框架由至少两个固定柱或固定架，以及若干条支撑杆或支撑架组成，固定柱或固定架竖直固定在地面上，支撑杆或支撑架水平放置，支撑杆或支撑架的两端与固定柱或固定架固定连接，若干条支撑杆或支撑架由上到下平行排列，位于最下层的支撑杆或支撑架的下方设有若干出料框；

所述放料板由左侧板和右侧板组成，左侧板、右侧板均与支撑杆或支撑架铰接，左侧板、右侧板的外侧边缘设有挡板；左侧板、右侧板上设有相互配合的插销结构(当左侧板、右侧板水平放置时，通过插销结构固定，此时可将发酵物置于板面上；当打开插销时，由于重力作用，左侧板、右侧板均自然垂下，其上的发酵物落下)，或：左侧板、右侧板上设有插销结构，固定柱或固定架上设有与之相配合的插销结构；所述左侧板、右侧板上设有多个漏孔，漏孔的直径≤2mm，相邻漏孔之间的距离≥2mm；

所述搅拌装置由驱动电机、受驱动电机驱动的搅拌轴和设置在搅拌轴上的若干搅拌抓手组成，其中，搅拌轴竖直放置并穿过左侧板或右侧板；

所述喷洒水装置由水管和设置在水管上的若干喷头组成，其中，水管设置在左侧板、右侧板的背面。

2.根据权利要求1所述的用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，其特征在于：所述左侧板、右侧板的宽度为40cm，长度为8m，厚度为5mm，挡板的高度为10cm。

3.根据权利要求1所述的用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，其特征在于：所述放料板有2～4层，上下相邻的放料板之间的距离为80cm。

4.根据权利要求1所述的用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，其特征在于：所述搅拌抓手是搅拌叶或机器人抓手。

5.根据权利要求1所述的用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，其特征在于：所述喷头为8孔的圆形喷头，喷头的喷射直径为17cm，相邻喷头之间的距离≥33cm。

6.根据权利要求1所述的用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，其特征在于：所述固定框架、搅拌轴、搅拌抓手由不锈钢材料制成，所述左侧板、右侧板、出料框由聚四氟乙烯材料制成。

7.根据权利要求1所述的用于固体发酵枯草芽孢杆菌的发酵装置，其特征在于：还包括顶板，顶板设在位于最上层的放料板的上方，顶板两端与固定柱或固定架固定连接，顶板背面设有喷洒水装置；驱动电机固定在顶板上。

8.利用权利要求1～6中任一项所述的发酵装置进行枯草芽孢杆菌的固体发酵方法，其特征在于：将固体发酵用发酵液与固体发酵培养基混合混匀，接种量10％，平铺在固定好的放料板上，厚度4cm，进行发酵，发酵条件为：温度37℃，培养72h，每间隔12h补水并搅拌1次，补水以保持培养物的湿度在60％，采用喷洒水装置补水，采用搅拌抓手搅拌；发酵结束后，打开左侧板、右侧板，发酵产物落入出料筐，移出出料筐，通风晾干。

9.根据权利要求8所述的固体发酵方法，其特征在于：所述固体发酵培养基，是由固形物和水按料水比1:1.1组成的；所述固形物，是由以下重量百分数的组分组成的：豆粕粉9％，稻壳粉10％，葡萄糖0.5％，硫酸铵0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.05％，余量为麸皮。

10.根据权利要求8所述的固体发酵方法，其特征在于：所述固体发酵用发酵液，是通过以下方法制备得到的：

(1)一级种子液制备：将4℃保存的枯草芽孢杆菌斜面，接种于LB液体培养基(酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％)中，转速200rpm/min，37℃培养17h，得到活化的枯草芽孢杆菌一级种子液；

(2)二级种子液制备：将活化的枯草芽孢杆菌按2％的接种量接种于1000mLLB液体培养基中，摇瓶培养，温度37℃、转速200rpm/min，培养17h，得到二级种子液；

(3)50L发酵罐液体培养：将步骤(2)得到的种子液接种于50L发酵罐(内含LB液体培养基)中，接种量2％，温度37℃，转速200rpm/min，培养17h，得到固体发酵用发酵液。