CN105567740A - 农用芽孢杆菌的高密度固体发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物菌剂发酵技术领域，具体涉及一种农用芽孢杆菌的高密度固体发酵方法。本发明的发酵方法，包括下述的步骤：（1）对发酵物料灭菌处理；（2）对发酵装置灭菌；（3）将步骤（1）中的发酵物料置于步骤（2）的发酵装置中，接种芽孢杆菌至发酵物料中；（4）对发酵物料通气发酵；（5）烘干发酵物料。培养基原料简单，选择余地大，成本低；占地面积小，设备要求低，不需要特殊机具，组装方便，能耗低，因此生产成本远低于液体发酵，只有其30—50%；与渥堆、传统浅盘发酵相比，本发明的发酵考虑到了芽孢杆菌生长过程中对温度、湿度及通气量的要求，有效解决了芽孢杆菌在固体发酵过程中的代谢热移除、质量传递等问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂发酵技术领域，具体涉及一种农用芽孢杆菌的高密度固体发酵方法。
背景技术
芽孢杆菌是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的革兰氏阳性杆状细菌。该菌在自然界中分布广泛，分离培养简单，对人畜无害，对环境友好。芽孢杆菌生长快、营养简单，能产生耐热、抗逆的芽孢，其芽孢抗逆性强、利于保藏，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、高温、紫外线等所造成的伤害，这种生物学特征使其成为一种理想的农用微生物。芽孢杆菌菌剂施用于农田后，可充分分解土壤中难溶的大分子成分，转化为利于植物吸收的小分子水溶成分，并且还可产生多糖与其它胶体结合，能有效改善土壤的团粒结构，增加土壤的生理性能和保护作物根系免受病原微生物的侵入，起到减轻作物病害的作用。很多生物农药就是利用芽孢杆菌做成的，它可通过生物间的竞争作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及诱导植物抗性等来抑制特定农作物病原体的生存和活动，具有显著的抗菌防病作用，可以显著改良土壤，是生态、安全、高效的土壤调理微生物。
目前关于芽孢杆菌工业化的生产方式主要分为液体深层发酵和固体发酵。与液层发酵相比固体发酵原料要求简单，设备要求较低，生产成本远低于液体深层发酵。虽然近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术；但目前为止，对于在细菌发酵过程中出现的代谢热移除、质量传递、参数精确控制等问题，传统的固体发酵方法仍未有成熟的解决方法及产品面市。基于此我们开发了一种芽孢杆菌的高密度固体发酵新方法，该方法针对芽孢杆菌的生长特性，将浅盘发酵技术加以改进，采用常规营养源，或更为低廉的营养源，比如农副加工的副产物、工业生产废弃物等对芽孢杆菌进行固体发酵，并由此建立了一套成熟的芽孢杆菌菌剂制备新工艺，不仅可实现芽孢杆菌菌剂的高密度发酵，还极大降低了其成产成本，具有广阔的应用前景。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种工艺简单、易于控制、能有效节省人工成本且能耗极低的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵新方法，该方法采用自制发酵装置进行固体发酵，占地面积小，发酵工艺简单，制备菌剂的成本低。
本发明是通过下述的技术方案来实现的：
一种农用芽孢杆菌的高密度固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）对发酵物料灭菌处理；
（2）对发酵装置灭菌；
（3）将步骤（1）中的发酵物料置于步骤（2）的发酵装置中，接种芽孢杆菌至发酵物料中；
（4）对发酵物料通气发酵；
（5）烘干发酵物料。
优选的，本发明的农用芽孢杆菌的高密度固体发酵方法，具体步骤如下：
（1）灭菌发酵物料：
灭菌方式为湿热灭菌，灭菌温度为105-130℃，灭菌2-6h；
所述的发酵物料的成分包括下述重量份数的原料：
速效碳源1-5份长效碳源1-10份
氮源1-5份磷酸氢二钾0.2-0.8
磷酸二氢钾0.1-0.5硫酸镁0.05-0.15
硫酸锰0.006-0.012水40-65
以上的“份”是指重量份数；
调节物料的pH至6.8-7.2；
灭菌后，将发酵物料置于杀菌机中降温至30-45℃；
（2）将固体发酵装置紫外杀菌1～2h，预热至30-45℃，湿度控制在30%～50%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）处理后的发酵装置中，铺设时保证物料厚度为1~7cm之间，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为2%~8%；
（4）打开风机，经由空气过滤装置，由发酵盒底部对发酵物料进行通风，通气量为50-300升/小时；发酵条件：培养温度30-45℃，pH值不低于6.5，培养12-48个小时；
（5）发酵完成后将发酵物料40-60℃烘干至含水量低于35%。
更优选的，步骤（1）中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为4h；
速效碳源为豆面、玉米面、淀粉、葡萄糖、氨基酸液、功能性废糖液、豆粕、花生粕中的一种或多种；
长效碳源为各种工业、发酵废弃物：糠醛渣、柠檬酸渣、酒糟、油渣、糖渣、酵母泥、木薯渣、果渣、药渣等；畜禽养殖废弃物：如鸡粪、羊粪、牛粪、猪粪等；农作物废弃物：如秸秆、棉柴、稻壳、麦麸、蘑菇渣、甜菜渣等中的至少一种或多种；
氮源为玉米浆、酵母粉、鱼粉、蛋白胨、花生饼粉、酒糟、尿素、硫酸铵、硝酸钾的一种或多种；
水的重量份数为50-55份。
优选的，上述的速效碳源为1.5-3.5份、长效碳源为2.5-6.5份、1.5-3.5份。
上的步骤（2）中预热温度为32-37℃，湿度控制在35-45%。
上述的步骤（3）中，物料厚度为2.5-5cm，接种量为3-5%。
通气量为75-250升/小时，发酵条件：培养温度32-37℃，pH值不低于6.5，培养18-40个小时。
优选的，上述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌的一种或多种。
更优选的，上述的芽孢杆菌具体为：
枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的至少两种；
当芽孢杆菌菌种为巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌时，巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
当芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌时，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：1：1：4：3；
当芽孢杆菌菌种为巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌时，巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的种子液的体积比为1：2：5。
本发明的有益效果在于，采用了本发明的方法发酵，相对于液体发酵，本发明的培养基原料简单，选择余地大，成本低；占地面积小，设备要求低，不需要特殊机具，组装方便，能耗低，因此生产成本远低于液体发酵，只有其30—50%；与渥堆、传统浅盘发酵相比，本发明的发酵考虑到了芽孢杆菌生长过程中对温度、湿度及通气量的要求，有效解决了芽孢杆菌在固体发酵过程中的代谢热移除、质量传递等问题；并且，本方法所采用的发酵装置可进行整体杀菌，并采用了无菌湿热风通气，有效避免了上述的两种发酵方式中易发生的杂菌污染问题，通过本方法得到的菌剂活菌含量高，芽孢生成率高；发酵工艺简单，整个过程可实现全自动化，有效节省了人工成本。
本发明固体发酵完成后，所有的菌体及物料全部作为产品进行后续肥料的复配，固体发酵物料中菌体丰富的次级代谢产物得以保留，并且采用的发酵物料本身也是肥料中常用的碳、氮源来源，因此产品活性优于液体发酵工艺生产的菌剂；实现了对农副加工副产物及工业生产废弃物的高值化利用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
一种农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌4h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源4份：具体为玉米面3、花生粕1；
长效碳源8份：具体为蘑菇渣3、糠醛渣2、鸡粪2、稻壳1；
氮源3份：具体为玉米浆1、酵母粉1；
磷酸氢二钾0.25%
磷酸二氢钾0.25%硫酸镁0.1％
硫酸锰0.008%水50%
调节物料的pH7.0；
灭菌完成后取出物料，降温至40℃左右。
（2）将自制固体发酵装置进行紫外杀菌1.5h，预热至40℃，湿度控制在30%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）后发酵装置中的浅盘上，物料厚度为3cm，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为2%；
芽孢杆菌菌种为巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌时，巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
（4）打开风机，经由空气过滤网，由浅盘底部对发酵物料进行通风，通气量100升/小时。发酵条件：培养温度37℃，pH值不低于6.5，培养24个小时；
（5）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
菌剂中活菌含量达到152cfu/g，芽孢生成率≥85%；
结算上述的发酵方法，相对于液体发酵，其成本只有液体发酵的36.8%。采用本方法所制备菌剂，含有发酵过程中菌体繁殖所产生的活性次级代谢产物，其肥效远优于液体发酵菌剂。
实施例2
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌3.5h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源为3.5份豆粕
长效碳源为8份，具体为重量比是2：1的糠醛渣和棉柴；
氮源4份，具体为重量比为3：1的玉米浆：硝酸钾；
磷酸氢二钾0.5%
磷酸二氢钾0.5%硫酸镁0.08％
硫酸锰0.009%水55%
调节物料的pH6.8-7.2；
灭菌完成后取出物料，降温至37℃。
（2）将自制固体发酵装置进行紫外杀菌2h，预热至37℃，湿度控制在50%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）后发酵装置中的浅盘上，物料厚度为5cm，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为5%；
上述的芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌时，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：1：1：4：3；
（4）打开风机，经由空气过滤网，由浅盘底部对发酵物料进行通风，通气量300升/小时。发酵条件：培养温度37℃，pH值不低于6.5，培养48个小时；
（5）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
实施例3
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌2h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源2份，具体为葡萄糖1.5份，葡萄糖0.5份；
长效碳源1.5份，具体为蘑菇渣0.5份，棉壳1份；
氮源1份，具体为蛋白胨0.5份，花生饼粉0.5份；
磷酸氢二钾0.1%
磷酸二氢钾0.1%硫酸镁0.05％
硫酸锰0.006%水40%
调节物料的pH值为6.8；
灭菌完成后取出物料，降温至30℃。
（2）将自制固体发酵装置进行紫外杀菌2h，预热至30℃，湿度控制在40%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）后发酵装置中的浅盘上，物料厚度为3.5cm，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为4%；
芽孢杆菌菌种为巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
（4）打开风机，经由空气过滤网，由浅盘底部对发酵物料进行通风，通气量150升/小时。发酵条件：培养温度30℃，pH值不低于6.5，培养48个小时；
（5）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
实施例4
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌4h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源5份，具体为葡萄糖2份，豆粕2份，花生粕1份；
长效碳源10份，具体为蘑菇渣3份，鸡粪2份，棉柴4份，稻壳1份；
氮源5份，具体为酵母粉2份，玉米浆3份；
磷酸氢二钾0.8%
磷酸二氢钾0.5%硫酸镁0.15％
硫酸锰0.012%水65%
调节物料的pH值为7.2；
灭菌完成后取出物料，降温至45℃。
（2）将自制固体发酵装置进行紫外杀菌2h，预热至45℃，湿度控制在30%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）后发酵装置中的浅盘上，物料厚度为5cm，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为2.5%；
芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌时，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：1：1：4：3；
（4）打开风机，经由空气过滤网，由浅盘底部对发酵物料进行通风，通气量300升/小时。发酵条件：培养温度45℃，pH值不低于6.5，培养12个小时；
（5）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
实施例5
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌5h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源4份，具体为豆面1份、玉米面2份，花生粕1份；
长效碳源9份，具体为糠醛渣2份、鸡粪2份、棉柴2份、稻壳3份；
氮源4份，具体为酒糟2、尿素1、硫酸铵1份；
磷酸氢二钾0.5%
磷酸二氢钾0.3%硫酸镁0.12％
硫酸锰0.009%水55%
调节物料的pH值为7.0；
灭菌完成后取出物料，降温至37℃；
（2）将自制固体发酵装置进行紫外杀菌2h，预热至37℃，湿度控制在50%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）后发酵装置中的浅盘上，物料厚度为2.5cm，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为2.5%；
芽孢杆菌菌种为巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌时，巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的种子液的体积比为1：2：5。
（4）打开风机，经由空气过滤网，由浅盘底部对发酵物料进行通风，通气量230升/小时。发酵条件：培养温度37℃，pH值不低于6.5，培养24个小时；
（5）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
实施例6
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌5h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源4份，具体为葡萄糖2份，氨其酸液1份，花生粕1份；
长效碳源6份，具体为羊粪2份，秸秆1份、棉柴1份、稻壳2份；
氮源4份，具体为酵母粉1份、鱼粉1份、蛋白胨1份，酒糟1份；
磷酸氢二钾0.5%
磷酸二氢钾0.3%硫酸镁0.09％
硫酸锰0.008%水55%
调节物料的pH值为7.0；
灭菌完成后取出物料，降温至37℃。
（2）将自制固体发酵装置进行紫外杀菌1.5h，预热至37℃，湿度控制在45%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）后发酵装置中的浅盘上，物料厚度为3cm，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为4%；
芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌时，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：1：1：4：3；
（4）打开风机，经由空气过滤网，由浅盘底部对发酵物料进行通风，通气量150升/小时。发酵条件：培养温度37℃，pH值不低于6.5，培养18个小时；
（5）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
Claims (9)
1.农用芽孢杆菌的高密度固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）对发酵物料灭菌处理；
（2）对发酵装置灭菌；
（3）将步骤（1）中的发酵物料置于步骤（2）的发酵装置中，接种芽孢杆菌至发酵物料中；
（4）对发酵物料通气发酵；
（5）烘干发酵物料。
2.如权利要求1所述的一种农用芽孢杆菌的高密度固体发酵方法，其特征在于，所述的
（1）灭菌发酵物料：
灭菌方式为湿热灭菌，灭菌温度为105-130℃，灭菌2-6h；
所述的发酵物料的成分包括下述重量份数的原料：
速效碳源1-5份长效碳源1-10份
氮源1-5份磷酸氢二钾0.2-0.8
磷酸二氢钾0.1-0.5硫酸镁0.05-0.15
硫酸锰0.006-0.012水40-65
所述的份是指重量份数；
调节物料的pH至6.8-7.2；
灭菌后，将发酵物料置于杀菌机中降温至30-45℃；
（2）将固体发酵装置紫外杀菌1～2h，预热至30-45℃，湿度控制在30%～50%；
（3）将步骤（1）得到的发酵物料平铺于经步骤（2）处理后的发酵装置中，铺设时保证物料厚度为1~7cm之间，而后将芽孢杆菌液体培养液均匀接种至物料中，接种量为2%~8%；
（4）打开风机，经由空气过滤装置，由发酵盒底部对发酵物料进行通风，通气量为50-300升/小时；发酵条件：培养温度30-45℃，pH值不低于6.5，培养12-48个小时；
（5）发酵完成后将发酵物料40-60℃烘干至含水量低于35%。
3.如权利要求2所述的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，其特征在于，
所述步骤（1）中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为4h；
所述的速效碳源为豆面、玉米面、淀粉、葡萄糖、氨基酸液、功能性废糖液、豆粕、花生粕中的一种或多种；
所述的长效碳源为各种工业、发酵废弃物：糠醛渣、柠檬酸渣、酒糟、油渣、糖渣、酵母泥、木薯渣、果渣、药渣等；畜禽养殖废弃物：如鸡粪、羊粪、牛粪、猪粪等；农作物废弃物：如秸秆、棉柴、稻壳、麦麸、蘑菇渣、甜菜渣等中的至少一种或多种；
所述的氮源为玉米浆、酵母粉、鱼粉、蛋白胨、花生饼粉、酒糟、尿素、硫酸铵、硝酸钾的一种或多种；
所述的水的重量份数为50-55份。
4.如权利要求2所述的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，其特征在于，所述的速效碳源为1.5-3.5份、长效碳源为2.5-6.5份、1.5-3.5份。
5.如权利要求2所述的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，其特征在于，所述的步骤（2）中预热温度为32-37℃，湿度控制在35-45%。
6.如权利要求2所述的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，物料厚度为2.5-5cm，接种量为3-5%。
7.如权利要求2所述的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，其特征在于，所述的通气量为75-250升/小时，发酵条件：培养温度32-37℃，pH值不低于6.5，培养18-40个小时。
8.如权利要求1所述的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，其特征在于，
所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌的一种或多种。
9.如权利要求1所述的农用芽孢杆菌菌剂的高密度固体发酵方法，其特征在于，
所述的芽孢杆菌具体为：
枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的至少两种；
当芽孢杆菌菌种为巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌时，巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
当芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌时，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：1：1：4：3；
当芽孢杆菌菌种为巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌时，巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的种子液的体积比为1：2：5。
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