CN108795812A - 一种堆肥用腐熟剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种堆肥用腐熟剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种堆肥用腐熟剂及其制备方法与应用，其制备方法包括：S1.制备芽孢杆菌混菌发酵干燥物；S2.制备哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物；S3.腐熟剂复配，将S1制得的芽孢杆菌混菌发酵干燥物与S2制得的哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物按比例混合均匀后即得。本发明的优点在于腐熟剂起主要作用的芽孢杆菌采用混菌发酵的方法生产，所选用的培养基不需要经过灭菌处理，混菌发酵的芽孢杆菌混合物有效活菌数可达到200亿cfu/g以上。本发明主要应用于畜禽粪便、粕类物质、秸秆等堆肥发酵。

Description

一种堆肥用腐熟剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种堆肥用腐熟剂及其制备方法与应用。
背景技术
我国是农业大国，每年都有大量的农业、畜牧业废弃物产生。我国秸秆资源丰富，在1980年达到年产量3.84亿吨，1990年达到年产量5.35亿吨，2012 年，秸秆资源年产量达到7.07亿吨，每年保持上升趋势据统计。另外，据统计，我国主要畜禽粪便资源实物量超过47亿吨，目前我国大约有24亿吨左右的畜禽粪便尚未得到资源化处理。这些没有被很好的利用的资源，目前已经成为农村生态环境保护的潜在隐患。
秸秆、畜禽粪便资源化利用，主要是通过堆肥腐熟后制作成有机肥还田或者直接还田。传统堆肥法一般利用堆制原料中的土著微生物来降解有机污染物，存在发酵时间长、有异味且肥效低、杂菌率高等问题。人工加入高效腐熟剂可以调节菌群结构、提高微生物活性，从而提高堆肥效率、缩短发酵周期、提高堆肥制品质量。大量的研究发现接种腐熟剂对堆肥腐熟速度、堆肥产品质量、环境影响控制都有一定促进作用。目前，市面上腐熟剂产品种类繁多，质量良莠不齐，质量较好的产品价格又比较昂贵，因此，开发一种腐熟效果好、价格便宜的腐熟剂成为一种比较有意义的事情。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种一种堆肥用腐熟剂及其制备方法与应用，本发明制得的堆肥用腐熟剂含解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、哈茨木霉、乳酸菌、酿酒酵母，其中起主要租用的芽孢杆菌采用混菌发酵方法获得，有效活菌数高，所选用的固体混合发酵培养基不需要灭菌，节省了水电气成本，从而降低了发酵成本，且易推广。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种堆肥用腐熟剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备芽孢杆菌混菌发酵干燥物
S1-1.分别将解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌原菌接种至菌种活化培养基活化；
S1-2活化后的菌株分别接种至液体培养基中进行摇瓶培养得摇瓶种子液；
S1-3.将所述摇瓶种子液接种至液体混合发酵培养基中培养得发酵罐种子液；
S1-4.将所述发酵罐种子液接种至固体混合发酵培养基中培养得解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌固体混合发酵物；
S1-5.将所述固体混合发酵物进行沸腾干燥得芽孢杆菌混菌发酵干燥物；
S2.制备哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物
S2-1.分别将哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌进行发酵制得哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液；
S2-2.将所述哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液按比例混合加保护剂后喷雾干燥得哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物；
S3.腐熟剂复配
将S1制得的芽孢杆菌混菌发酵干燥物与S2制得的哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物按比例混合均匀后即得。
进一步，所述S1-1具体步骤为：分别将解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌原菌接种至菌营养琼脂培养基中活化培养36小时；
进一步，所述S1-2具体步骤为：将活化后的菌株分别接种至LB培养基 (胰蛋白胨10g、酵母浸提物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L,pH7.0-7.5)中，于 160r/min、35℃条件下进行摇瓶培养16-20h，即得摇瓶种子液。
进一步，所述S1-3具体步骤为：将所述摇瓶种子液子液分别按体积比 0.5％-2％的接种量接种至液体混合发酵培养基中培养得发酵罐种子液，液体混合发酵培养基为：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2；培养条件为：罐压0.5Mpa、通气量1∶2-2.5、电机转速160r/min、温度35℃，培养24h即得。
进一步，所述S1-4具体步骤为：将所述发酵罐种子液接种至固体混合发酵培养基中培养，接种量按体积质量比为20％，控制发酵温度35℃，培养3-5 天；所述固体混合发酵培养基为，以重量份计：麸皮90.5-97.8份、葡萄糖1-3 份、豆粕0.5-3.5份、NaH2PO40.5-2份；MnSO4 0.1-0.5份，MgSO40.1-0.5份；优选的，所述固体混合发酵培养基为：麸皮92.2-95.1份、葡萄糖1.5-2.5份、豆粕1-3份、NaH2PO41-1.5份；MnSO4 0.2-0.4份，MgSO4 0.2-0.4份；更优选的，所述固体混合发酵培养基为：麸皮94.4份、葡萄糖2份、豆粕2份、 NaH2PO41.2份；MnSO4 0.2份，MgSO4 0.2份。
进一步，所述固体混合发酵培养基不需要进行灭菌处理。
进一步，所述S1-5中沸腾干燥条件为：进风温度120-130℃，出风口温度 50-60℃。
进一步，所述S2-2中保护剂为2％海藻酸钠、1％脱脂奶粉、0.5％谷氨酸钠(液体质量的百分比添加)。
进一步：所述哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液按 2:1:1比例混合。
进一步，所述喷雾干燥条件为：进风温度160-180℃，出风口温度60-80 ℃。
进一步，S3中将所述芽孢杆菌混菌发酵干燥物与哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物按质量比2：1-8:1的比例混合均匀，优选5:1比例混合均匀；优选的，采用三维混合机混合均匀。进一步检测各指标含量，腐熟剂有效菌总含量≥100亿cfu/g，计量包装。
上述方法中，S2-1中，所述哈茨木霉制备哈茨木霉孢子悬浮液的发酵方法如下(方法参考公开专利，公开号103819237A)：
a.将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28± 2℃条件下培养48小时；
b.摇床培养：将上述步骤a培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.5-6.8、温度为30℃条件下，160-200r/min摇床培养24小时；
c.发酵罐培养：将上述步骤b培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6.5-6.8、罐压0.5kg、温度为27-28℃、通风量为1:0.6-0.8，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20％时终止发酵，进行固体发酵产孢；
d.固体发酵产孢：将上述步骤c经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养120h,90％产孢；
e.将上述步骤d中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液；
步骤a中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂 20g、水1000mL，pH自然。
上述步骤b中的液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、。淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL。
上述步骤c中的发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、加水至600kg。
上述步骤d中的固体发酵培养基配方如下：
固体料：棉籽壳25％、玉米粉10％、麸皮65％。固体料与水的重量比为 1:0.8。
S2-1中，所述乳酸菌制备乳酸菌发酵液的发酵方法如下(方法参考公开专利，公开号103540541A)：
将乳酸链球菌(Streptococcus lactis)在改良MRS固体培养基上进行传代培养，然后将活化后的乳酸链球菌接种到液体种子培养基中进行静止培养，所得种子液按3％的接种量接种到发酵培养基中，经过扩大培养得到乳酸链球菌发酵液；
其中，所述发酵培养基配方为：豆粕粉15g/L、玉米粉10g/L、蔗糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏3g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氢钾2g/L、结晶硫酸镁 0.5g/L，pH值6.2；发酵培养条件为：35℃，溶解氧0％，间歇式旋转环境中培养45h。
所述所述改良MRS固体培养基的配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5g/L、牛肉膏10和/或，所述哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液按2:1:1比例混合。
g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、乙酸钠2g/L、柠檬酸三胺2g/L、结晶硫酸镁 0.5g/L、琼脂18g/L、水1000mL，pH值6.9；所述传代培养是指将乳酸链球菌菌株接种到改良MRS固体斜面培养基上，于35℃培养3天。
S2-1中，所述酿酒酵母制备酿酒酵母发酵液的发酵方法如下(此方法为本领域熟知的操作方法)：
培养基为豆芽汁培养基，罐压0.05Mpa,通气量1:0.05-0.01，培养温度28 ℃，转速80r/min，培养时间48h。
作为同一个发明构思，本发明还提供了一种上述制备方法制得的堆肥用腐熟剂及其应用，应用于畜禽粪便、粕类物质或秸秆堆肥发酵；所述应用中每吨堆肥干料使用腐熟剂的量是0.5-2.5kg。
本发明中几种微生物均为直接购买得到，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，其中解淀粉芽孢杆菌的编号为ACCC19745、枯草芽孢杆菌的编号为 ACCC19374、哈茨木霉的编号为ACCC30371、乳酸菌的编号为ACCC10295、酿酒酵母菌的编号为ACCC20251。
本发明有如下优点：
1)本发明起主要作用芽孢杆菌采用混菌发酵方法获得，有效活菌数高，混菌发酵的芽孢杆菌混合物有效活菌数可达到200亿cfu/g以上，所采用的培养基不需要灭菌，节省了水电气成本，降低了发酵成本。同时，本发明对固体发酵生产设备要求不高，易于推广。
2)本发明选取的菌剂组合比较全面，产酶种类多，有纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、漆酶，能够应用于不同原料的堆肥。厌氧菌、兼性厌氧菌的添加可以让发酵快速进行。
附图说明
图1实验例1中实验组与对照组堆肥温度随堆肥时间变化比较图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本申请涉及一种堆肥用腐熟剂，其制备方法如下所示：
其中解淀粉芽孢杆菌的编号为ACCC19745、枯草芽孢杆菌的编号为 ACCC19374、哈茨木霉的编号为ACCC30371、乳酸菌的编号为ACCC10295、酿酒酵母菌的编号为ACCC20251。
1)芽孢杆菌混菌发酵
a.解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株在营养琼脂培养基上活化培养36 小时；
b.解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株分别接种至LB培养基(胰蛋白胨 10g、酵母浸提物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L,pH7.0-7.5)中，于160r/min、35 ℃条件下培养18h，即得摇瓶种子液；将摇瓶种子液按体积比3％的接种量接种至发酵罐培养，发酵罐培养基为：培养条件为：罐压0.5Mpa、通气量1∶2-2.5、电机转速160r/min、温度35℃，培养24h即得发酵罐种子液；
c.将发酵罐种子液接种至固体混合发酵培养基中培养，接种量按体积质量比为20％，控制发酵温度35℃，培养3-5天。所述固体混合发酵培养基为，以重量份计：麸皮94.4份、葡萄糖2份、豆粕2份、NaH2PO4 1.2份；MnSO4 0.2份，MgSO4 0.2份；
d.解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株固体混合发酵5天，发酵结束后进行沸腾干燥，沸腾干燥条件为：进风温度120-130℃，出风口温度50-60℃。
2)哈茨木霉发酵(方法参考本公司专利：公开号103819237A)
a.将哈茨木霉原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28± 2℃条件下培养48小时；
b.摇床培养：将上述步骤a培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，在pH6.5-6.8、温度为30℃条件下，160-200r/min摇床培养24小时；
c.发酵罐培养：将上述步骤b培养的菌种在无菌条件下分别接种于发酵罐培养基，在pH6.5-6.8、罐压0.5kg、温度为27-28℃、通风量为1:0.6-0.8，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20％时终止发酵，进行固体发酵产孢；
d.固体发酵产孢：将上述步骤c经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养120h,90％产孢；
e.将上述步骤d中完全产孢的培养基分别浸在清水中制成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液；
步骤a中选用的斜面培养基的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂 20g、水1000mL，pH自然。
上述步骤b中的液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、。淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL。
上述步骤c中的发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、加水至600kg。
上述步骤d中的固体发酵培养基配方如下：
固体料：棉籽壳25％、玉米粉10％、麸皮65％。固体料与水的重量比为 1:0.8。
3)乳酸菌发酵(参考本公司专利号：103540541A)
培养基：豆粕粉15g/L、玉米粉10g/L、蔗糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏 3g/L、番茄汁50mL/L、磷酸二氢钾2g/L、结晶硫酸镁0.5g/L，pH值6.2；发酵培养条件为：35℃，溶解氧0％，间歇式旋转环境中培养45h；
4)酿酒酵母发酵
培养基为豆芽汁培养基，罐压0.05Mpa,通气量1:0.05-0.01，培养温度28 ℃，转速80r/min，培养时间48h。
5)腐熟剂复配
a.将哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液混合均匀后加入保护剂，保护剂为2％海藻酸钠、1％脱脂奶粉、0.5％谷氨酸钠。混合均匀后进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风温度160-180℃，出风口温度60-80℃；
将解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌沸腾干燥后的混合物与哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌喷雾干燥的混合物按质量比5:1混合均匀；
b.检测各指标含量，腐熟剂有效菌总含量≥100亿cfu/g，计量包装。实施例2
本申请涉及堆肥用腐熟剂，其中芽孢杆菌混菌发酵培养基为：
麸皮97.8份、葡萄糖1份、豆粕0.5份、NaH2PO40.5份；MnSO4 0.1份， MgSO40.1份；
其制备方法同实施例1，芽孢杆菌混菌发酵时间为5天。
实施例3
本申请涉及一种堆肥用腐熟剂，其中芽孢杆菌混菌发酵培养基为：
麸皮90.5份、葡萄糖3份、豆粕3.5份、NaH2PO42份；MnSO4 0.5份， MgSO40.5份；
其制备方法同实施例1，芽孢杆菌混菌发酵时间为4天。
实验例1堆肥效果实验
以干湿分离的猪粪为堆肥对象，以实施例1方法生产的发酵菌剂为实验组，以不添加菌种为对照组。发酵堆堆肥配比如下所示：猪粪70％、统糠30％。发酵菌剂添加量为发酵堆质量的0.2％，单个实验堆质量为300kg，加入发酵菌剂后调节发酵堆水分至60％左右。当发酵堆温度超过65℃时候进行翻堆，当发酵堆有氨气味出现时候也需要加强翻堆。
实验结果：
实验堆温度的变化见图1。
根据图1可以看出，添加本方案生产的菌剂在堆肥方案有明显的优势，实 验组发酵升温快，堆肥2天就可以达到50℃以上；维持高温时间长，在60℃ 以上温度可以维持11天，随着发酵堆水分散失及营养成分被利用，发酵堆才 开始降温，在18天的样子完成彻底腐熟。对照组没有添加菌种，发酵速度较 慢，在第7天温度才上升至50℃，整个发酵过程最高温度才55℃，50℃以上 温度维持天数才9天。由此可见，本方案提出的腐熟剂有较好的堆肥效果。
堆肥结束后各指标的对比：
由以上数据可以看出，添加发酵菌剂后总养分、有效活菌数、蛔虫卵死亡率等都比对照组要好，生产出来的有机肥性能也更加优秀。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1. 一种堆肥用腐熟剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备芽孢杆菌混菌发酵干燥物
S1-1.分别将解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌原菌接种至菌种活化培养基活化；
S1-2活化后的菌株分别接种至液体培养基中进行摇瓶培养得摇瓶种子液；
S1-3.将所述摇瓶种子液分别接种至液体混合发酵培养基中培养得发酵罐种子液；
S1-4.将所述发酵罐种子液接种至固体混合发酵培养基中培养得解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌固体混合发酵物；
S1-5. 将所述固体混合发酵物进行沸腾干燥得芽孢杆菌混菌发酵干燥物；
S2.制备哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物
S2-1.分别将哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌进行发酵制得哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液；
S2-2.将所述哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液按比例混合加保护剂后喷雾干燥得哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物；
S3.腐熟剂复配
将S1制得的芽孢杆菌混菌发酵干燥物与S2制得的哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物按比例混合均匀后即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1-1具体步骤为：分别将解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌原菌接种至菌营养琼脂培养基中活化培养36小时；
和/或，所述S1-2具体步骤为：将活化后的菌株分别接种至LB培养基中，于160r/min、35℃条件下进行摇瓶培养16-20h，即得摇瓶种子液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1-3具体步骤为：将所述摇瓶种子液分别按体积比0.5%-2%的接种量接种至液体混合发酵培养基中培养得发酵罐种子液，液体混合发酵培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠NaCl 5g /L，pH7.0-7.2；培养条件为：罐压0.5Mpa、通气量1：2-2.5、电机转速160 r/min、温度35℃，培养24h即得。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1-4具体步骤为：将所述发酵罐种子液接种至固体混合发酵培养基中培养，接种量按体积质量比为20%，控制发酵温度35℃，培养3-5天；所述固体混合发酵培养基为，以重量份计：麸皮90.5-97.8份、葡萄糖1-3份、豆粕0.5-3.5份、NaH2PO40.5-2份；MnSO4 0.1-0.5份，MgSO40.1 -0.5份；优选的，所述固体混合发酵培养基为：麸皮92.2-95.1份、葡萄糖1.5-2.5份、豆粕1-3份、NaH2PO41-1.5份；MnSO4 0.2-0.4份，MgSO4 0.2 -0.4份；更优选的，所述固体混合发酵培养基为：麸皮94.4份、葡萄糖2份、豆粕2份、NaH2PO4 1.2份；MnSO4 0.2份，MgSO4 0.2份。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固体混合发酵培养基不需要进行灭菌处理。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1-5中沸腾干燥条件为：进风温度120-130℃，出风口温度50-60℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2-2中保护剂为2%海藻酸钠、1%脱脂奶粉、0.5%谷氨酸钠；
和/或，所述哈茨木霉孢子悬浮液、酿酒酵母发酵液、乳酸菌发酵液按2:1:1比例混合；
和/或，所述喷雾干燥条件为：进风温度160-180℃，出风口温度60-80℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：S3中将所述芽孢杆菌混菌发酵干燥物与哈茨木霉、酿酒酵母、乳酸菌混合干燥物按质量比2：1-8:1的比例混合均匀，优选5:1比例混合均匀；优选的，采用三维混合机混合均匀。
9.一种根据权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的堆肥用腐熟剂。
10.一种权利要求1-8任一项所述制备方法制得的堆肥腐熟剂或权利要求9所述的堆肥腐熟剂的应用，其特征在于，应用于畜禽粪便、粕类物质或秸秆堆肥发酵；优选的，每吨堆肥干料使用腐熟剂的量是0.5-2.5kg。
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