CN112501055A - 适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法及其应用，涉及高效农业技术领域，是通过短小芽孢杆菌SGM7、解淀粉芽孢杆菌B1619和解淀粉芽孢杆菌SQR9的混合物作为微生物菌剂，通过提升吲哚乙酸和赤霉素的含量够降低植物体内的氯离子含量，微生物复合菌剂为固体菌剂，在提供相同有效活菌数的同时又有使用和运输方便的特点，且固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件提高了菌体的生长、繁殖能力和发酵产物的生成效率。

Description

适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及高效农业技术领域，尤其涉及一种适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法及其应用。
背景技术
氯是农作物生长发育不可缺少的微量元素。在一定范围内，它能促进作物的生长发育；但是当浓度过高时，它又抑制作物的正常生长。
植物体内氯素大量积累会对植物造成毒害，在氯离子较多时，不利于作物糖转化为淀粉，块根和块茎作物的淀粉含量会降低；氯离子能促进碳水化合物的水解，西瓜、天才、葡萄会降低含糖量；而氯离子多，会影响烟草的燃烧性，卷烟易熄火；氯离子多时，对氯敏感的作物的幼苗造成危害；比如，当土施氯离子浓度高于558.6mg/kg时，会降低黄瓜种子的发芽率以及降低黄瓜叶片的叶绿素含量。若土施氯离子浓度高于1000mg/kg时，甚至会导致黄瓜幼苗死。
现有的土壤除氯技术，是采用曼海姆法在含氯土壤中加入适量的H2SO4,能够有效消除土壤中氯离子对有机质测定结果的部分干扰，但是存在造价高的缺点。
在现有的一种烤烟提钾降氯剂及其制备方法和应用(申请号CN201810895943.3)中，将吲哚乙酸、赤霉素和表油菜素内酯在羊毛脂中混合复配后作为提钾除氯剂在烟草种植中施用，还能够具有使烟草钾离子和氯离子的吸收与分配更平衡，降低烤烟氯离子含量，提高了烟叶产量和品质的效果。但是，存在的弊端如下：
1、生长调节剂造价较高；2、IAA是一种对光敏感，遇光后变成玫瑰色，不易保存的；有机物利用率较低，残留较高；3、降氯效果持续性差。
所以，亟需一种能够稳定的适用于氯敏感植物的微生物菌剂。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法及其应用，提高微生物复合菌剂的稳定性。
为实现上述目的，一种适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法，将短小芽孢杆菌SGM7通过固体发酵方法获得短小芽孢杆菌菌剂；将解淀粉芽孢杆菌B1619和解淀粉芽孢杆菌SQR9通过固体发酵方法获得解淀粉芽孢杆菌菌剂；将短小芽孢杆菌菌剂和解淀粉芽孢杆菌菌剂按照质量比1:2-3混合，获得微生物复合菌剂；其中，所述微生物复合菌剂中解淀粉芽孢杆菌B1619、解淀粉芽孢杆菌SQR9和短小芽孢杆菌SGM7的有效活菌数均大于1.5×1011CFU/g。
进一步，优选的，获得短小芽孢杆菌菌剂的方法包括：将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂；
获得解淀粉芽孢杆菌菌剂的方法包括：将解淀粉芽孢杆菌B1619进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌SQR9进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液和解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液按照1-2:5的比例混合成为解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液；
将所述解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的解淀粉芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于38℃下发酵培养40-48小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得解淀粉芽孢杆菌菌剂。
进一步，优选的，所述短小芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为(110-120):(30-40):(20-12):1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
进一步，优选的，所述解淀粉芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为(30-40):(30-40):(25-29)的玉米粉、米糠、棉粕粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.5％的MgSO4.7H2O以及0.23％的NaCl，料水比为1:1.6，搅拌均匀后121℃蒸汽灭菌60min后备用，调节PH为7.2，接种量为15％。
本发明还保护适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法制备的微生物复合菌剂在氯敏感植物种植过程中的应用，将所述微生物复合菌剂用水稀释300倍后施入土地中，复合菌剂稀释后的添加量为5-10kg/每亩。
本发明具有益效果如下：
本发明所提供的适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂，是通过解淀粉芽孢杆菌菌剂和短小芽孢杆菌菌剂的混合物作为微生物菌剂，不仅提升土壤中吲哚乙酸和赤霉素的含量，还能够降低植物体内的氯离子含量，从而促进氯离子敏感类植物的生长，有效的缓解了现有的氯离子敏感类植物因土壤中氯离子浓度高导致的产量低的问题。
本发明提供的微生物复合菌剂为固体菌剂，在提供相同有效活菌数的同时又有使用和运输方便的特点，且固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件提高了菌体的生长、繁殖能力和发酵产物的生成效率。
附图说明
图1是本申请实施例中不同微生物复合菌剂的有效活菌数测定情况图。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商这，均可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
在现有技术中，植物根围促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是典型的植物根系共生微生物，植物根际促生菌(Plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)是在植物根际生活的一类具有刺激植物生长和抑制植物病原菌等综合作用的土壤微生物；PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物都有生防作用，对植物吸收利用矿物质营养有促进作用，并可以产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，具有抑制植物病害的能力，能够产生多种代谢产物，主要包括：吲哚乙酸和赤霉素等。
其中，吲哚乙酸，又称植物生长素，是由具分裂和增大活性的细胞区产生的调控植物生长方向的激素。其化学本质是吲哚乙酸。主要作用是使植物细胞壁松弛，从而使细胞增长，在许多植物中还能增加RNA和蛋白质的合成以及提高吲哚乙酸的用量能够有效降低植物中Cl-。
赤霉素，是广泛存在的一种植物激素，化学结构属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。应用于农业生产，可刺激叶和芽的生长，提高产量。
本发明中提供的适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂，提升土壤中吲哚乙酸和赤霉素的含量，还能够降低植物周围土壤及植物体内的氯离子含量，从而促进氯离子敏感类植物的生长，有效的缓解了现有的氯离子敏感类植物因土壤中氯离子浓度高导致的产量低的问题。
其中，解淀粉芽孢杆菌SQR9，解淀粉芽孢杆菌B1619，短小芽孢杆菌SGM7均为市购。
然而，适用于氯敏感植物的微生物菌剂一般采用菌液浸种、灌根、表面喷洒或者涂抹等施用方式，但是菌液存在保存困难，产品效果不稳定的弊端。而适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂，其固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件不仅会提升复合菌体的生长、繁殖能力和发酵物的生成效率，而且还会提升对其发酵产物(IAA)的产量及质量。
制备例1
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，所述短小芽孢杆菌SGM7的液体种子培养基中蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％和硝酸钾0.05％，PH＝7.2。其中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂；
其中，所述短小芽孢杆菌的固体培养基以质量比为110:30:12:1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
将解淀粉芽孢杆菌B1619进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌SQR9进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液和解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液按照1-2:5的比例混合成为解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液；
将所述解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的解淀粉芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于38℃下发酵培养40-48小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得解淀粉芽孢杆菌菌剂。
所述解淀粉芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为40:30:25的玉米粉、米糠、棉粕粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.5％的MgSO4.7H2O以及0.23％的NaCl，料水比为1:1.6，搅拌均匀后121℃蒸汽灭菌60min后备用，调节PH为7.2，接种量为15％。
将短小芽孢杆菌菌剂和解淀粉芽孢杆菌菌剂按照质量比1：3混合，获得微生物复合菌剂一。
制备例2
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，所述短小芽孢杆菌SGM7的液体种子培养基中蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％和硝酸钾0.05％，PH＝7.2。其中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂；
其中，所述短小芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为120:40:20:1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。需要说明的是，金针菇菌糠通过培养金针菇获得，其中，培养金针菇的原栽培配方为，棉籽壳38％，麸皮32％，淋水陈积杂木屑25％，玉米粉3％，轻质碳酸钙1.5％，过磷酸钙0.5％。
将解淀粉芽孢杆菌B1619进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌SQR9进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液和解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液按照1-2:5的比例混合成为解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液；
将所述解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的解淀粉芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于38℃下发酵培养40-48小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得解淀粉芽孢杆菌菌剂。
所述解淀粉芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为37:34:27的玉米粉、米糠、棉粕粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.5％的MgSO4.7H2O以及0.23％的NaCl，料水比为1:1.6，搅拌均匀后121℃蒸汽灭菌60min后备用，调节PH为7.2，接种量为15％。
将短小芽孢杆菌菌剂和解淀粉芽孢杆菌菌剂按照质量比2：3混合，获得微生物复合菌剂二。
制备例3
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，所述短小芽孢杆菌SGM7的液体种子培养基中蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％和硝酸钾0.05％，PH＝7.2。其中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂；
其中，所述短小芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为115:37:18:1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
将解淀粉芽孢杆菌B1619进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌SQR9进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液和解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液按照1-2:5的比例混合成为解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液；
将所述解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的解淀粉芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于38℃下发酵培养40-48小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得解淀粉芽孢杆菌菌剂。
所述解淀粉芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为30:40:29的玉米粉、米糠、棉粕粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.5％的MgSO4.7H2O以及0.23％的NaCl，料水比为1:1.6，搅拌均匀后121℃蒸汽灭菌60min后备用，调节PH为7.2，接种量为15％。
将短小芽孢杆菌菌剂和解淀粉芽孢杆菌菌剂按照质量比2：3混合，获得微生物复合菌剂三。
制备例4
将保存在-80℃甘油管的解淀粉芽孢杆菌SQR9在LB固体平板培养基上划线活化；37℃培养箱过夜培养直至长出单菌落。挑取解淀粉芽孢杆菌SQR9的单菌落接种于3ml LB液体培养基，37℃，170r/min震荡培养至对数期，然后，以3％接种量接种于100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养至对数期；将在锥形瓶中培养好的菌种接种于10L种子发酵罐中，37℃培养44h，获得解淀粉芽孢杆菌发酵液，即解淀粉芽孢杆菌SQR9菌剂；本实施例的菌剂含有解淀粉芽孢杆菌SQR9菌体及代谢产物。其中，液体培养基为蛋白胨5g,葡萄糖5g,酵母膏5g,K2HPO44g,蒸馏水1 000ml，pH 7.2±0.1。培养基混匀后121.0℃蒸汽灭菌25min后备用。
将保存在-80℃甘油管的解淀粉芽孢杆菌B1619在LB固体平板培养基上划线活化；37℃培养箱过夜培养直至长出单菌落。挑取解淀粉芽孢杆菌B1619的单菌落接种于3ml LB液体培养基，37℃，170r/min震荡培养至对数期，然后，以3％接种量接种于100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养至对数期；将在锥形瓶中培养好的菌种接种于10L种子发酵罐中，37℃培养44h，获得解淀粉芽孢杆菌发酵液，即解淀粉芽孢杆菌B1619菌剂；本实施例的菌剂含有解淀粉芽孢杆菌B1619菌体及代谢产物。
将解淀粉芽孢杆菌SQR9菌剂、解淀粉芽孢杆菌B1619菌剂按照以下体积比混合2:1，制成解淀粉芽孢杆菌菌剂。
将保存在-80℃甘油管的短小芽孢杆菌SGM7在LB固体平板培养基上划线活化；37℃培养箱过夜培养直至长出单菌落。挑取短小芽孢杆菌SGM7的单菌落接种于3ml LB液体培养基，37℃，170r/min震荡培养至对数期，然后，以1％接种量接种于100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养至对数期；将在锥形瓶中培养好的菌种接种于10L种子发酵罐中，37℃培养44h；获得解淀粉芽孢杆菌发酵液，即短小芽孢杆菌SGM7菌剂；本实施例的菌剂含有短小芽孢杆菌SGM7菌体及代谢产物。其中的液体培养基为蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％、硝酸钾0.05％。
其中，需要说明的是菌剂的制备方法不限定本发明菌剂的保护范围。
将解淀粉芽孢杆菌菌剂和短小芽孢杆菌SGM7菌剂按照以下体积比混合5：1；于4℃，10000rpm转速下离心20min，弃上清液，用无菌生理盐水重悬菌体，使菌悬液中短小芽孢杆菌SGM7、解淀粉芽孢杆菌SQR9、解淀粉芽孢杆菌B1619的活菌数分别大于1.0*1011cFu/g，进行充分搅拌获得混合菌液，即为适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂四。
效果例1
称取4种微生物复合菌剂一、微生物复合菌剂二、微生物复合菌剂三和微生物复合菌剂四样品编号1、2、3、4，对4种复合菌剂进行活菌计数。
蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g、琼脂20g，水1000ml，混合后加热溶解，将PH调整为7.2，分装于玻璃容器中，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
按总体积的0.9％称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪吸取9ml生理盐水加入到试管中，并经121℃灭菌20min备用。
利用稀释涂布平板法进行活菌数测定，测定结果如图1。
结果表明，与液体制剂的微生物复合菌剂4相比，固态的微生物菌剂的有效活菌数有显著的增加。
实施例1
供试植物葡萄(京亚)。试验地点在陕西西安，2019年4月移栽，行距1.1m，株距0.5m；2019年4-10月针对葡萄进行微生物复合菌剂降氯试验。其中，供试土壤为黄粘土，肥力中等，土壤中含氯较高。其中，采用优质葡萄生成管理方法，移栽苗来自统一供种、育苗和管理。
供试土壤的基本理化性质如表1所示。
表1供试田块土壤基本养分状况
Figure BDA0002769731720000091
供试的肥料：复合菌剂一、复合菌剂二、复合菌剂三和复合菌剂四；技术指标：有效活菌数(cfu)≥1500亿/g。
试验设计5个处理，在A1-A55个地块中，每个地块小区面积300m2。
A1地块的处理1：常规管理+灌根+叶面喷施高含量微生物复合菌剂一(稀释300倍后10kg/亩)。
A2地块的处理2：常规管理+灌根+叶面喷施灭活高含量微生物复合菌剂二(稀释300倍后，10kg/亩)。
A3地块的处理3：常规管理+灌根+叶面喷施灭活高含量微生物复合菌剂三(稀释300倍后，10kg/亩)。
A4地块的处理4：常规管理+灌根+叶面喷施灭活高含量微生物复合菌剂三(50g对水15kg/亩)。
A5地块的处理5：常规管理。
2019年4月对A1-A3 3个地块中的露地葡萄进行灌根；5月初、5月末各进行叶面喷施一次，2019年8月进行收获。
叶片调查，选择各处理区生长状况一致的葡萄树，选取基部3～4节位成熟叶(代表大多数叶片叶色的叶子)，用SPAD-502型叶绿素计检测叶色值，每地块处理随机测10片叶，3次重复，共测30片叶，取平均值。称取30片叶子重量，计算单叶重。
氯含量调查，叶片选取标准同上，将所选取的叶片，烘箱75℃杀青30min，60℃烘干至恒重，用不锈钢电磨粉碎过0.15mm筛，用于测定叶片氯含量；采用氧化钙灰化-硝酸银滴定法，并流动分析仪测定叶片氯含量。
吲哚乙酸含量调查，叶片选取标准同上，将所选取的叶片，用粉碎机磨成细分(约1mm大小)；称取粉末10g装入烧杯，加入0.1mol/L NaOH溶液40ml，于100℃水浴中煮沸15min(上面加盖防止水分蒸干)，取出烧杯后再向其内加入0.1mol/L NaOH溶液25ml，充分摇匀，用甲醇定容至100ml，静置30min，取上层液离心30min，上清液则为IAA提取液。
采用Salkowski比色法测定IAA合成量
因为在无机酸存在下，IAA与氯化铁作用，生成红色的螯合物。且该物质在530nm有最大吸收峰，因此通过IAA的定量测定法测出μg级的IAA。
PC比色液的配制，将4.5FeCl3溶于300ml蒸馏水，然后缓慢加入587.4ml98％H2SO4，待冷后定容至1L。
配置吲哚乙酸的系列标准溶液，其浓度分别为25、50、75、100、125、150、175μg/ml。取干净的试管9支，每支加入4ml的PC比色液，再分别加入不同浓度的IAA溶液各2ml，摇匀，于30℃(黑暗)条件下保温30min，使反应混合液呈红色。取反应液在530nm处测定OD值，以加了比色液的蒸馏水调0。以IAA浓度(μg/ml)为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线后计算直线回归方程，y＝0.02x-0.04，R2达到0.9979。
将处理1-处理4的IAA提取液，于530nm处测定OD值，然后根据OD值对应的标准曲线(或直线回归方程)测定各复合菌剂产生的IAA的量。
产量调查，采收时每个处理随机抽取3株葡萄，调查单穗粒数、单粒重，计算亩产量。
其中，各处理的土壤施肥均按农户常规施肥进行，田间管理措施按常规要求进行。
不同处理对葡萄生物性状的影响见表2
表2葡萄叶片性状调查
Figure BDA0002769731720000111
注：叶片按照相同位置见光程度一致的条件进行选取。不同字母代表同一时期不同处理间差异达5％显著水平，下同。
通过观察表2发现，处理1-处理3中施用了固态微生物复合菌剂的葡萄叶片中的单叶片重量、IAA、叶绿素含量高于液态微生物复合菌剂的处理4，并且处理1-处理3的叶绿素和IAA含量显著高于处理5对照组；而氯含量远远低于处理5的对照组。
不同的处理对葡萄产量影响见表3。
表3不同处理对葡萄产量的影响
Figure BDA0002769731720000112
通过观察表3发现，常规处理方式的处理5对照组的葡萄亩产量远远低于氯含量正常地块的平均产量300kg/亩；而处理1-处理4中施用了微生物复合菌剂后的葡萄亩产量显著高于氯含量正常地块的平均产量。相对于处理4的对照组而言，处理1-处理3的每亩葡萄增产均高于200％。其中，处理1-3的固态微生物复合菌剂的亩产量相对于处理4中的液态微生物复合菌剂而言，也有提升。
综上，本发明所提供的适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂，是通过解淀粉芽孢杆菌菌剂和短小芽孢杆菌菌剂的混合物作为微生物菌剂，不仅提升土壤中吲哚乙酸和赤霉素的含量，还能够降低植物体内的氯离子含量，从而促进氯离子敏感类植物的生长，有效的缓解了现有的氯离子敏感类植物因土壤中氯离子浓度高导致的产量低的问题。在提供相同有效活菌数的同时又有使用和运输方便的特点，且固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件提高了菌体的生长、繁殖能力和发酵产物的生成效率。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式以及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，
将短小芽孢杆菌SGM7通过固体发酵方法获得短小芽孢杆菌菌剂；
将解淀粉芽孢杆菌B1619和解淀粉芽孢杆菌SQR9通过固体发酵方法获得解淀粉芽孢杆菌菌剂；
将短小芽孢杆菌菌剂和解淀粉芽孢杆菌菌剂按照质量比1:2-3混合，获得微生物复合菌剂；
其中，所述微生物复合菌剂中解淀粉芽孢杆菌B1619、解淀粉芽孢杆菌SQR9和短小芽孢杆菌SGM7的有效活菌数均大于1.5×1011CFU/g。
2.根据权利要求1所述的适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，获得短小芽孢杆菌菌剂的方法包括：
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂；
获得解淀粉芽孢杆菌菌剂的方法包括：
将解淀粉芽孢杆菌B1619进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌SQR9进行活化；取活化的菌种于100ml解淀粉芽孢杆菌液体种子培养基中，接种量为体积比3％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液；将解淀粉芽孢杆菌B1619固体发酵种子液和解淀粉芽孢杆菌SQR9固体发酵种子液按照1-2:5的比例混合成为解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液；
将所述解淀粉芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的解淀粉芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于38℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得解淀粉芽孢杆菌菌剂。
3.根据权利要求2所述的适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为(110-120):(30-40):(20-12):1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4 .7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
4.根据权利要求2所述的适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，
所述解淀粉芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为(30-40):(30-40):(25-29)的玉米粉、米糠、棉粕粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.5％的MgSO4 .7H2O以及0.23％的NaCl，料水比为1:1.6，搅拌均匀后121℃蒸汽灭菌60min后备用，调节PH为7.2，接种量为15％。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的适用于氯敏感植物的微生物复合菌剂的制备方法制备的微生物复合菌剂在氯敏感植物种植过程中的应用，其特征在于，将所述微生物复合菌剂用水稀释300倍后施入土地中，复合菌剂稀释后的添加量为5-10kg/每亩。
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