CN108739805A - 一种小盾壳霉可湿性粉剂及其应用 - Google Patents

一种小盾壳霉可湿性粉剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物农药可湿性粉剂的制备方法及其在油菜、向日葵等作物的菌核病防治中的应用，属于生物农药技术领域。本发明的生物农药可湿性粉剂以固体发酵制备的小盾壳霉孢子粉为有效成分，加入一定量的载体和助剂制备而成。该生物农药可湿性粉剂采用预埋法施入土壤，可有效防治油菜、向日葵等经济作物的菌核病。

Description

一种小盾壳霉可湿性粉剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其是涉及一种小盾壳霉生物农药可湿性粉剂的制备方法及其在油菜、向日葵等作物的菌核病防治中的应用。
背景技术
菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)引起的一种世界性分布的植物病害，对油菜、向日葵、蔬菜等重要经济作物的产量和品质影响严重，给农业生产带来巨大损失。菌核病均在油菜、向日葵等油料作物开花期发病，发病部位位于地表上部10cm植物根茎部，发展速度快，发病面积每周以指数级数增加。以油菜为例，我国每年需防治面积都超过种植面积的50％，达到5000万亩以上。
现阶段我国防治菌核病的主要措施是使用化学杀菌剂，存在的主要问题：(1)长期使用化学农药，将导致核盘菌产生抗药性并使农药用量不断增加，作物体内农药残留不断升高，对人体健康产生危害和引起环境污染等系列问题；(2)使用化学农药杀灭核盘菌的同时也杀死了许多授花的蜜蜂等天敌昆虫，破坏了生态平衡，不利于作物的生长；(3)由于作物菌核病发病期和发病部位的特殊性，以及作物密集种植的特点，喷洒等传统施药方法无法有效到达作物根茎部等主要发病部位，防治效果大幅下降。因此，采用生物农药防治菌核病就成了一种必然趋势，其中，以小盾壳霉对菌核病的防治效果最佳。
小盾壳霉(C.minitans)是核盘菌的天然寄生性真菌(天敌)，与核盘菌共存于土壤之中，由美国学者Campbell于1947年首先发现。自上世纪七十年代开始，国内外学者已经在盾壳霉的生物学特性，对核盘菌的生防作用机制等方面进行了深入的研究。研究表明，小盾壳霉通过重寄生作用侵染菌核，在溶菌和抗生作用下，导致菌核的腐烂和菌体的死亡，达到防治菌核病的目的。长期使用小盾壳霉，可在土壤中可以形成一定的菌群优势，有效降低核盘菌在土壤中数量，产生长期防治的效果。更重要的是小盾壳霉具有对核盘菌专一、无抗性、无毒无残留、对环境友好等特点，是一种绿色生物防治技术。
研究表明，小盾壳霉通过其孢子萌发侵染菌核，因此，将其制备成孢子粉是生物农药的理想剂型。而作为一种好氧性微生物，小盾壳霉产孢子过程需要提供充分的氧气。此外，采用化学杀菌剂防治菌核病一般是在发病期采用叶面喷施的方法进行，由于作物菌核病发病期和发病部位的特殊性，以及作物密集种植的特点，这种传统施药方法无法有效到达作物根茎部等主要发病部位，防治效果大幅下降。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种小盾壳霉可湿性粉剂及其应用。因此，本发明提供了一种固态通风发酵制备其孢子粉原药的发酵工艺。本发明采用农副产品作为主发酵原料，并且对固态发酵产物直接进行干燥和粉碎，具有成本低、无废水废渣等废弃物排放、绿色环保的优点。本发明所提供的小盾壳霉生物农药可湿性粉剂可以采用预埋法与底肥一起施用，不仅降低了劳动强度，也可以明显提高防治效果。
本发明的技术方案如下：
一种生物农药可湿性粉剂，每千克可湿性粉剂含有小盾壳霉孢子粉原药10～50克，其中含有小盾壳霉活孢子2.0～3.0×1011个；分散剂2～5克；保护剂1～2克；孢子萌发促进剂2～10克；其余用载体补齐。
所述的小盾壳霉菌孢子粉原药的制备方法为：以小盾壳霉(Coniothyriumminitans)CGMCC No.8325为生产菌株，以麸皮为基质，加入葡萄糖、尿素、无机盐和水，固态通风发酵8～12天；将上述固体发酵产物进行干燥和粉碎，即得到小盾壳霉孢子粉原药，其中干燥后的小盾壳霉孢子数为1～5×1010个/克干基质。
所述制备方法的具体步骤如下：
(1)种子液的制备：将冰箱保藏的小盾壳霉(Coniothyrium minitans)CGMCCNo.8325菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，20℃培养6～8天，用无菌水洗下孢子并打散，血球计数板计数后调整孢子浓度至106/ml；以1.0～2.0％的接种量接种于含0.07％琼脂的马铃薯葡萄糖培养基中，20℃下以150r/min的速度振荡培养6～8天；
(2)固体发酵：将步骤(1)制备得到的种子液以1.0～2.0％的接种量接种于固体发酵培养基中，20-25℃常规固态通风发酵8～12天；固体发酵培养基由每千克麸皮加入1.0～1.5L营养盐溶液配制而成；所述营养盐溶液配方为：葡萄糖：10.0～20.0；尿素：3.0～5.0；KH2PO4：1.0～2.0；CaCl2·2H2O：1.0～2.0；ZnSO4·7H2O：0.2～0.3；FeSO4·7H2O：0.4～0.6；MnCl2·4H2O：0.1～0.2；MgCl2·6H2O：0.1～0.2；单位为g/L；pH 6.0-7.0；
(3)烘干与粉碎：将步骤(2)制备得到的固体发酵物料，在35～40℃下减压干燥后采用刀片式气流粉粹机进行粉碎，即为小盾壳霉孢子粉原药。
优选的，所述的分散剂包括木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、或亚甲基二萘磺酸钠；保护剂包括维生素C或核黄素；孢子萌发促进剂包括硫酸锌或氯化钾；载体为珍珠岩粉。
本申请还提供了所述生物农药可湿性粉剂在植物菌核病生物防治中的应用：采用预埋法施入土壤，使用量为50～150g/亩。
所述应用的具体使用方法如下：
(1)所述生物农药可湿性粉剂的最佳施用时间是在作物栽种之日的2～4周前，最迟也要在作物栽种的当天施用；
(2)稀释，按照以下方法中的任一种进行稀释：
①水稀释：按照使用剂量称取所述生物农药可湿性粉剂，先加少量水调匀成糊状，然后按30～50L/亩加水稀释并混合搅拌均匀；
②细土稀释：按照使用剂量称取所述生物农药可湿性粉剂，然后按20～30Kg/亩加入细土拌匀；
(3)施用：
把用水稀释配制好的生物农药可湿性粉剂的悬浮水剂用喷雾器均匀的喷洒于土壤表面、或把用细土稀释了的生物农药可湿性粉剂用手工或风机均匀的施洒或喷洒到土壤表面；然后用旋耕方法把表面土壤翻入3～10厘米深的土壤中。
优选的，所述小盾壳霉(Coniothyrium minitans)CGMCC No.8325于2013年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8325。
本发明有益的技术效果在于：
1、本发明采用农副产品麸皮作为主要发酵原料进行固体发酵，无需添加可溶性淀粉和酵母粉等其他有机营养物质，成本低且孢子产量高，可以达到5～10×109个孢子/克麸皮。
2、对固态发酵产物直接进行干燥和粉碎，具有成本低、无废水废渣等废弃物排放、绿色环保的优点。
3、本发明所提供的小盾壳霉生物农药可湿性粉剂可以采用预埋法与底肥一起施用，不仅降低了劳动强度，也可以明显提高防治效果。
具体实施方式
下面将通过具体实施示例对本发明作进一步的阐述，其目的是为更好理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。
实施例1
(1)种子液的制备：将冰箱保藏的小盾壳霉(Coniothyrium minitans)CGMCCNo.8325菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，20℃培养7天，用无菌水洗下孢子并打散，血球计数板计数后调整孢子浓度至106/ml；以1.0％的接种量接种于含0.07％琼脂的马铃薯葡萄糖培养基中，20℃下以150r/min的速度振荡培养8天；
(2)采用箱式固体发酵：发酵培养基麸皮和营养液＝1:1.0(重量体积比)，拌均匀后装于托盘中，托盘大小为56cm×36cm×5.5cm，每盘可装1.5kg麸皮物料，每箱装4盘，共6kg物料，0.1MPa高压蒸汽灭菌1hr。采用孢子液接种，接种量为1％。控制发酵温度20℃、湿度85％、通气量为1.0vvm、箱体压力0.01MPa，发酵时间为12天。测定其孢子产量为9.6×109cfu/g物料。
其中营养盐溶液配方为：葡萄糖：20.0；尿素：5.0；KH2PO4：2.0；CaCl2.2H2O：2.0；ZnSO4.7H2O：0.3；FeSO4.7H2O：0.6；MnCl2.4H2O：0.2；MgCl2.6H2O：0.2；单位为g/L；pH 6.2。
(3)烘干与粉碎：将步骤(2)制备得到的固体发酵物料用GFG高效沸腾干燥设备进行真空干燥，进料量3kg/批，干燥温度(进风温度)为35℃，干燥时间为25min。干燥后的的物料中小盾壳霉孢子含量为2.0×1010cfu/g，孢子萌发率为99.8％。
采用WFJ-20刀片气流粉粹机进行粉粹，控制送风温度为10℃左右，粉碎细度为150～200目。结果得到的小盾壳霉孢子粉原药，小盾壳霉孢子含量为1.7×1010cfu/g，孢子萌发率为99.2％，对向日葵核盘菌的校正致腐率为95.8％。
称取小盾壳霉孢子粉原药1.3Kg，硫酸锌1.0Kg，木质素磺酸钙500g，维生素C200g，用珍珠岩做载体配制成100Kg的小盾壳霉可湿性粉剂，其中孢子含量为2.0×108cfu/g(实测数据为2.2×108cfu/g)。
实施例2
(1)种子液的制备：将冰箱保藏的小盾壳霉(Coniothyrium minitans)CGMCCNo.8325菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，20℃培养7天，用无菌水洗下孢子并打散，血球计数板计数后调整孢子浓度至106/ml；以1.5％的接种量接种于含0.07％琼脂的马铃薯葡萄糖培养基中，20℃下以150r/min的速度振荡培养7天；
(2)采用箱式固体发酵：发酵培养基麸皮和营养液＝1:1.2(重量体积比)，拌均匀后装于托盘中，托盘大小为56cm×36cm×5.5cm，每盘可装1.5kg麸皮物料，每箱装4盘，共6kg物料，0.1MPa高压蒸汽灭菌1hr。采用孢子液接种，接种量为1.5％。控制发酵温度20℃、湿度85％、通气量为1.0vvm、箱体压力0.01MPa，发酵时间为10天。测定其孢子产量为8.8×109cfu/g物料。
其中营养盐溶液配方为：葡萄糖：15.0；尿素：4.0；KH2PO4：1.5；CaCl2.2H2O：1.5；ZnSO4.7H2O：0.2；FeSO4.7H2O：0.5；MnCl2.4H2O：0.1；MgCl2.6H2O：0.1；单位为g/L；pH 6.5。
(3)烘干与粉碎：将步骤(2)制备得到的固体发酵物料用GFG高效沸腾干燥设备进行真空干燥，进料量3kg/批，干燥温度(进风温度)为40℃，干燥时间为25min。干燥后的的物料中小盾壳霉孢子含量为1.8×1010cfu/g，孢子萌发率为99.8％。
采用WFJ-20刀片气流粉粹机进行粉粹，控制送风温度为10℃左右，粉碎细度为150～200目。结果得到的小盾壳霉孢子粉原药，小盾壳霉孢子含量为1.5×1010cfu/g，孢子萌发率为98.6％，对向日葵核盘菌的校正致腐率为93.4％。
称取小盾壳霉孢子粉原药1.35Kg，氯化钾200g，木质素磺酸钠200g，核黄素100g，用珍珠岩做载体配制成100Kg的小盾壳霉可湿性粉剂，其中孢子含量为2.0×108孢子/g(实测数据为2.1×108cfu/g)。
实施例3
(1)种子液的制备：将冰箱保藏的小盾壳霉(Coniothyrium minitans)CGMCCNo.8325菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，20℃培养7天，用无菌水洗下孢子并打散，血球计数板计数后调整孢子浓度至106/ml；以2.0％的接种量接种于含0.07％琼脂的马铃薯葡萄糖培养基中，20℃下以150r/min的速度振荡培养6天；
(2)采用箱式固体发酵：发酵培养基麸皮和营养液＝1:1.5(重量体积比)，拌均匀后装于托盘中，托盘大小为56cm×36cm×5.5cm，每盘可装1.5kg麸皮物料，每箱装4盘，共6kg物料，0.1MPa高压蒸汽灭菌1hr。采用孢子液接种，接种量为2％。控制发酵温度20℃、湿度85％、通气量为1.0vvm、箱体压力0.01MPa，发酵时间为10天。测定其孢子产量为7.4×109cfu/g物料。
其中营养盐溶液配方为：葡萄糖：10.0；尿素：3.0；KH2PO4：1.0；CaCl2.2H2O：1.0；ZnSO4.7H2O：0.2；FeSO4.7H2O：0.4；MnCl2.4H2O：0.1；MgCl2.6H2O：0.1；单位为g/L；pH 7.0。
(3)烘干与粉碎：将步骤(2)制备得到的固体发酵物料用GFG高效沸腾干燥设备进行真空干燥，进料量3kg/批，干燥温度(进风温度)为35℃，干燥时间为30min。干燥后的的物料中小盾壳霉孢子含量为1.9×1010cfu/g，孢子萌发率为99.4％。
采用WFJ-20刀片气流粉粹机进行粉粹，控制送风温度为10℃左右，粉碎细度为150～200目。结果得到的小盾壳霉孢子粉原药，小盾壳霉孢子含量为1.6×1010cfu/g，孢子萌发率为99.6％，对向日葵核盘菌的校正致腐率为92.7％。
称取小盾壳霉孢子粉原药1.3Kg，硫酸锌500g，亚甲基二萘磺酸钠200g，维生素C200g，用珍珠岩做载体配制成100Kg的小盾壳霉可湿性粉剂，其中孢子含量为2.0×108cfu/g(实测数据为2.1×108cfu/g)。
应用例1
将实施例1制备的小盾壳霉可湿性粉剂，在向日葵播种当日按每亩50g、100g和150g的用量，用约24Kg的细土进行稀释后，手工均匀的施洒于土壤表面；然后用旋耕方法把表面土壤翻入约10厘米深的土壤中。向日葵收获前一个月，随机统计菌核病(茎基腐)发病率，结果空白对照组平均为7.01，三个处理组分别为2.65，1.46和1.18，防效分别为62.2％，79.2％和83.2％，均明显优于化学药剂(40％菌核净WP)对照组的防治效果(29.9％)。
应用例2
将实施例2制备的小盾壳霉可湿性粉剂，向日葵播种前按每亩50g、100g和150g的用量，兑水40L进行稀释，喷施于土壤表面，然后翻入3-5cm深的土壤中，空白对照喷洒清水，化学药剂对照采用40％菌核净，用量为125g/亩。每处理重复4次，各小区随机区组排列。向日葵收获前一个月，田间随机取样统计各组发病率、防治效果；收获前一周随机取样统计产量。结果小盾壳霉可湿性粉剂三个处理组对向日葵菌核病的防效分别为58.51％，71.33％和78.55％，优于或与化学药剂对照组的防治效果相当(68.56％)。而小盾壳霉可湿性粉剂(100g/亩)和菌核净(125g/亩)联合施用，防效达到82.76％。小盾壳霉可湿性粉剂三个剂量处理组分别增产4.4％、6.1％和7.2％。
应用例3
将实施例3制备的小盾壳霉可湿性粉剂，油菜移栽15天前按每亩50g、100g和150g的用量，兑水40L进行稀释，喷施于土壤表面，然后旋耕翻入5-8cm深的土壤中，空白对照喷洒清水，化学药剂对照采用40％菌核净，用量为100g/亩。每处理重复4次，各小区随机区组排列。结果发现，小盾壳霉可湿性粉剂3个剂量实验组的防治效果分别为48.53％，77.29％和81.64％；化学农药对照组的防效为80.85％；联合施用小盾壳霉可湿性粉剂(100g/亩)和化学农药(100g/亩)防效为83.41％。小盾壳霉可湿性粉剂对油菜菌核病的防效与化学杀菌剂相当。
对比例
以CN102408996B《一种生防菌盾壳霉Chy-1C-1的可湿性粉剂及应用为对比例》，对比例在固体发酵时，以秸秆为原料，在添加可溶性淀粉和酵母粉情况下，孢子产量为2×109个孢子/克秸秆。
在油菜菌核病防治中，本发明产品采用预埋法，使用量为100g/亩和150g/亩，经折算为3.0×107个孢子/m2和4.5×107个孢子/m2，防效分别为77.29％和81.64％(见上文应用例3)；而对比例采用喷施法，用量8.0×108个孢子/m2和2.4×109个孢子/m2时，防效分别为71.0％和75.6％。
备注：分析测定方法
(1)小盾壳霉固态发酵物、孢子粉原药以及可湿性粉剂中孢子总数采用血球计数板法进行计数；活孢子数采用马铃薯葡萄糖培养基涂布平板法进行计数。
(2)孢子萌发率的测定：将待测样品制备孢子悬液(约1.0×107cfu/ml)，吸取100μL，涂布于马铃薯葡萄糖培养基平板上，每组实验设置5个平行实验，分别培养24h、36h、48h后将平板置于显微镜下观察孢子萌发情况。每个平板随机检查5个不同视野内的孢子(每个视野内孢子总数≥30个)，芽管长度大于孢子直径记为萌发。据此计算样品中小盾壳霉孢子萌发率。孢子萌发率＝萌发孢子数/所统计孢子总数×100％。
(3)致腐率的测定：称取40目过筛后的江沙20g置于培养皿内，165℃下干热灭菌3h，冷却后每个培养皿内放入20个核盘菌菌核(大小约为7mm×5mm)，然后加入4mL待测样品的分生孢子悬液(约1.0×106cfu/ml)，充分搅拌混匀，置于20℃下避光培养28d后取出，观察盾壳霉对核盘菌菌核的寄生致腐作用。每个样品进行三组平行，并以4mL无菌水代替上述小盾壳霉菌株的孢子悬液作为对照组。以校正致腐率表示小盾壳霉菌株对核盘菌菌核的致腐能力，计算公式如下：
致腐率f＝腐烂菌核数/菌核总数×100％；
校正致腐率F＝(fj-f0)/(1-f0)×100％，其中fj表示样品组的致腐率，f0表示对照组的致腐率。
(4)防治效果测定：在播种前或播种时在试验区块按上述方法施用小盾壳霉生物农药可湿性粉剂，而空白对照区块不施用药物，其他药物对照区块施用化学杀菌剂(待发病时叶面喷施)，每试验组设置4个重复，各组试验区随机排列。待作物生长一定时间后，随机取样，统计各区块发病情况。
病株率＝病株数/调查总株数×100％
防治效果＝(空白对照区病株率-处理区病株率)/空白对照区病株率×100％
作物成熟后各栽种试验区随机选取20脱粒测产量，考核药物的增产效果。

Claims (7)

1.一种生物农药可湿性粉剂，其特征在于：每千克可湿性粉剂含有小盾壳霉孢子粉原药10～50克，其中含有小盾壳霉活孢子2.0～3.0×1011个；分散剂2～5克；保护剂1～2克；孢子萌发促进剂2～10克；其余用载体补齐。
2.权利要求1中所述的小盾壳霉菌孢子粉原药的制备方法，其特征在于：以小盾壳霉(Coniothyrium minitans)CGMCC No.8325为生产菌株，以麸皮为基质，加入葡萄糖、尿素、无机盐和水，固态通风发酵8～12天；将上述固体发酵产物进行干燥和粉碎，即得到小盾壳霉孢子粉原药，其中干燥后的小盾壳霉孢子数为1～5×1010个/克干基质。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)种子液的制备：将冰箱保藏的小盾壳霉(Coniothyrium minitans)CGMCC No.8325菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面上，20℃培养6～8天，用无菌水洗下孢子并打散，血球计数板计数后调整孢子浓度至106/ml；以1.0～2.0％的接种量接种于含0.07％琼脂的马铃薯葡萄糖培养基中，20℃下以150r/min的速度振荡培养6～8天；
(2)固体发酵：将步骤(1)制备得到的种子液以1.0～2.0％的接种量接种于固体发酵培养基中，20-25℃常规固态通风发酵8～12天；固体发酵培养基由每千克麸皮加入1.0～1.5L营养盐溶液配制而成；所述营养盐溶液配方为：葡萄糖：10.0～20.0；尿素：3.0～5.0；KH2PO4：1.0～2.0；CaCl2·2H2O：1.0～2.0；ZnSO4·7H2O：0.2～0.3；FeSO4·7H2O：0.4～0.6；MnCl2·4H2O：0.1～0.2；MgCl2·6H2O：0.1～0.2；单位为g/L；pH 6.0-7.0；
(3)烘干与粉碎：将步骤(2)制备得到的固体发酵物料，在35～40℃下减压干燥后采用刀片式气流粉粹机进行粉碎，即为小盾壳霉孢子粉原药。
4.根据权利要求1所述的生物农药可湿性粉剂，其特征在于：所述的分散剂包括木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、或亚甲基二萘磺酸钠；保护剂包括维生素C或核黄素；孢子萌发促进剂包括硫酸锌或氯化钾；载体为珍珠岩粉。
5.权利要求1中所述的生物农药可湿性粉剂在植物菌核病生物防治中的应用，其特征在于：采用预埋法施入土壤，使用量为50～150g/亩。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具体使用方法如下：
(1)所述生物农药可湿性粉剂的最佳施用时间是在作物栽种之日的2～4周前，最迟也要在作物栽种的当天施用；
(2)稀释，按照以下方法中的任一种进行稀释：
①水稀释：按照使用剂量称取所述生物农药可湿性粉剂，先加少量水调匀成糊状，然后按30～50L/亩加水稀释并混合搅拌均匀；
②细土稀释：按照使用剂量称取所述生物农药可湿性粉剂，然后按20～30Kg/亩加入细土拌匀；
(3)施用：
把用水稀释配制好的生物农药可湿性粉剂的悬浮水剂用喷雾器均匀的喷洒于土壤表面、或把用细土稀释了的生物农药可湿性粉剂用手工或风机均匀的施洒或喷洒到土壤表面；然后用旋耕方法把表面土壤翻入3～10厘米深的土壤中。
7.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述小盾壳霉(Coniothyriumminitans)CGMCC No.8325于2013年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8325。
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