CN112501056A - 固体发酵培养基及利用其生产短小芽孢杆菌菌剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种固体发酵培养基及利用其生产短小芽孢杆菌菌剂的方法，涉及高效农业技术领域，是通过改良短小芽孢杆菌固体发酵培养基并生产短小芽孢杆菌菌剂固体菌剂，通过提升吲哚乙酸和赤霉素的含量够降低植物体内的氯离子含量，在提供相同有效活菌数的同时又有使用和运输方便的特点，且固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件提高了发酵产物的生成效率。

Description

固体发酵培养基及利用其生产短小芽孢杆菌菌剂的方法
技术领域
本发明涉及微生物培养基即培养方法，尤其涉及一种固体发酵培养基及利用其生产短小芽孢杆菌菌剂的方法。
背景技术
吲哚乙酸(IAA)，又称植物生长素，是由具分裂和增大活性的细胞区产生的调控植物生长方向的激素。其化学本质是吲哚乙酸，主要作用是使植物细胞壁松弛，从而使细胞增长，在许多植物中还能增加RNA和蛋白质的合成。
植物体内氯素大量积累会对植物造成毒害，在氯离子较多时，能促进碳水化合物的水解，西瓜、甜菜、葡萄会降低含糖量；甚至会对氯敏感的作物的幼苗造成危害；吲哚乙酸可以提升氯敏感植物的成活率。
在现有技术中，利用液态发酵方法培养产吲哚乙酸的植物根基促生菌，存在发酵菌量偏低，造成发酵产物吲哚乙酸的损失的弊端。
所以，亟需一种利用固体发酵培养基生产高产量IAA的短小芽孢杆菌菌剂的方法。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种固体发酵培养基以及利用其生产高产量IAA的短小芽孢杆菌菌剂的方法，提高植物根际促生菌对氯敏感植物的生长促进效果。
为实现上述目的，本发明提供一种固体发酵培养基，短小芽孢杆菌的固体培养基以质量比为(110-120):(30-40):(20-12):1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
进一步，优选的，所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌SGM7。
利用固体发酵培养基生产高产量IAA的短小芽孢杆菌菌剂的方法，方法包括：
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；
将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂。
进一步，优选的，所述短小芽孢杆菌菌剂中的活菌含量为2*1011CFU/g。
本发明具有益效果如下：
本发明所提供的固体发酵培养基制得的菌剂活菌含量高，操作简单；
无需发酵罐，发酵时间短，发酵成本低，易于产业化；
采用金针菇糠作为固体发酵原料，经微生物发酵后转变成对植物生长有利的营养物质，实现了废物利用；
固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件提高了发酵产物的生成效率以及提高了氯敏感植物的成长效率。
附图说明
图1是本发明实施例中培养时间及培养温度对IAA产量的影响图；
图2是本发明实施例中PH值对IAA产量的影响图；
图3是本发明实施例中料水比对IAA产量的影响图；
图4是本发明实施例中接种量对IAA产量的影响图；
图5是本发明实施例中不同微生物复合菌剂的有效活菌数测定情况图。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商这，均可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
在现有技术中，植物根围促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是典型的植物根系共生微生物，植物根际促生菌(Plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)是在植物根际生活的一类具有刺激植物生长和抑制植物病原菌等综合作用的土壤微生物；PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物都有生防作用，对植物吸收利用矿物质营养有促进作用，并可以产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
其中，吲哚乙酸，又称植物生长素，是由具分裂和增大活性的细胞区产生的调控植物生长方向的激素。其化学本质是吲哚乙酸。主要作用是使植物细胞壁松弛，从而使细胞增长，在许多植物中还能增加RNA和蛋白质的合成以及提高吲哚乙酸的用量能够有效降低植物中Cl-。
适用于氯敏感植物的微生物菌剂一般采用菌液浸种、灌根、表面喷洒或者涂抹等施用方式，但是菌液存在保存困难，产品效果不稳定的弊端。而适用于氯敏感植物的微生物菌剂，其固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件不仅会提升复合菌体的生长、繁殖能力和发酵物的生成效率，而且还会提升对其发酵产物(IAA)的产量及质量。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，革兰氏阳性，椭圆形，中生或次端生；利用固态发酵法培养短小芽孢杆菌提高菌剂中吲哚乙酸的含量，从而提高短小芽孢杆菌菌剂对氯敏感植物的促生作用。
其中，短小芽孢杆菌SGM7均为市购。
发酵培养基的制备
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，所述短小芽孢杆菌SGM7的液体种子培养基中蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％和硝酸钾0.05％，PH＝7.2。其中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液。设置适当的产IAA的固体培养基组合，选择谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉、酵母粉、MgSO4.7H2O和NaCl 6个因素，每个因素选高中低3个浓度进行正交设计(6因子3状态)，应用L18(36)正交表对各组分进行优化试验，考察不同培养基组分对短小芽孢杆菌菌株产IAA的影响。各因素水平，见表1。
表1正交试验水平(％)
Figure BDA0002769732320000041
按照正交设计试验，分别配置不同的培养基，每种培养基取1000g4份(3份接种培养，1份做空白对照)平摊，培养条件37℃，20h；测定IAA含量。
试验数据采用EXCEL及SPASS13.0软件进行统计分析。
根据正交表短小芽孢杆菌SGM7菌株产IAA最佳水平为A2B3C2D3E2F3(配方为：谷壳载体70％、金针菇糠21％、豆粕粉9％、酵母粉0.6％、MgSO4.7H2O1％和NaCl2.5％)。
培养温度和培养时间对短小芽孢杆菌SGM7产生IAA影响固体培养基中接入短小芽孢杆菌发酵种子液1ml，分别置于30℃、35℃、37℃、40℃培养，每5h取样测定IAA含量，确定最适培养温度和产IAA高峰时间，具体结果参照图1，图1示出了培养时间及培养温度对IAA产量的影响。
通过图1可见，固体培养基的最适培养温度为37℃以及产IAA高峰时间为22小时。
培养基初始PH值，对产IAA的影响，在已优化的温度和确定产IAA高峰时间的基础上，设置培养基初始PH值分别为6、7、8、9，测定培养基初始PH值对短小芽孢杆菌菌株产IAA的影响，结果参照图2，图2示出了PH值对IAA产量的影响。
通过图2可见，适宜短小芽孢杆菌生产IAA的固体培养基的最适PH值为7。
在已优化的最适温度，最适初始PH值基础上，研究料水比对产IAA的影响。料水比分别设置为1:0.8；1:1；1:1.2；1:2，测定IAA的产生状况参见图3，图3示出了料水比对IAA产量的影响。
通过图3可见，适宜短小芽孢杆菌生产IAA的固体培养基的料水比为1:1。
接种量对短小芽孢杆菌产生IAA的影响，在已优化的最适温度，最适PH值、最适初始湿度的基础上，采用接种量2.5％、5.0％、10.0％、15％，测定接种量对短小芽孢杆菌产IAA的影响参见图4，图4示出了接种量对IAA产量的影响。
通过图4可见，适宜短小芽孢杆菌生产IAA的固体培养基的接种量为10％。
制备例1
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，所述短小芽孢杆菌SGM7的液体种子培养基中蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％和硝酸钾0.05％，PH＝7.2。其中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂一；
其中，所述短小芽孢杆菌的固体培养基以质量比为110:30:12:1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
制备例2
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，所述短小芽孢杆菌SGM7的液体种子培养基中蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％和硝酸钾0.05％，PH＝7.2。其中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂二；
其中，所述短小芽孢杆菌的固体培养基以质量比为120:40:20:1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。金针菇菌糠通过培养金针菇获得，其中，培养金针菇的原栽培配方为，棉籽壳38％，麸皮32％，淋水陈积杂木屑25％，玉米粉3％，轻质碳酸钙1.5％，过磷酸钙0.5％。制备例3
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，所述短小芽孢杆菌SGM7的液体种子培养基中蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％和硝酸钾0.05％，PH＝7.2。其中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂三；
其中，所述短小芽孢杆菌的固体培养基以质量比为115:37:18:1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4.7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
制备例4
将保存在-80℃甘油管的短小芽孢杆菌SGM7在LB固体平板培养基上划线活化；37℃培养箱过夜培养直至长出单菌落。挑取短小芽孢杆菌SGM7的单菌落接种于3ml LB液体培养基，37℃，170r/min震荡培养至对数期，然后，以1％接种量接种于100ml LB液体培养基的锥形瓶中，培养至对数期；将在锥形瓶中培养好的菌种接种于10L种子发酵罐中，37℃培养44h；获得解淀粉芽孢杆菌发酵液，即短小芽孢杆菌菌剂四；本实施例的菌剂含有短小芽孢杆菌SGM7菌体及代谢产物。其中的液体培养基为蛋白胨1％、玉米粉2％、麸皮0.25％、硫酸铵0.05％、硝酸钾0.05％。
使菌悬液中短小芽孢杆菌SGM7的活菌数分别大于1.0*10 11CFU/g。
效果例1
称取4种短小芽孢杆菌菌剂一、短小芽孢杆菌菌剂二、短小芽孢杆菌菌剂三和短小芽孢杆菌菌剂四样品编号1、2、3、4，对4种复合菌剂进行活菌计数。蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g、琼脂20g，水1000ml，混合后加热溶解，将PH调整为7.2，分装于玻璃容器中，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
按总体积的0.9％称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪吸取9ml生理盐水加入到试管中，并经121℃灭菌20min备用。
利用稀释涂布平板法进行活菌数测定，测定结果如图5，图5示出了不同微生物复合菌剂的有效活菌数测定情况，与液体制剂的短小芽孢杆菌菌剂四相比，固态的微生物菌剂的有效活菌数有显著的增加。
实施例1
供试植物葡萄(京亚)。试验地点在陕西西安，2019年4月移栽，行距1.1m，株距0.5m；2019年4-10月针对葡萄进行微生物复合菌剂降氯试验。其中，供试土壤为黄粘土，肥力中等，土壤中含氯较高。其中，采用优质葡萄生成管理方法，移栽苗来自统一供种、育苗和管理。
供试土壤的基本理化性质如表2所示。
表2供试田块土壤基本养分状况
Figure BDA0002769732320000071
供试的肥料：短小芽孢杆菌菌剂一、短小芽孢杆菌菌剂二、短小芽孢杆菌菌剂三和短小芽孢杆菌菌剂四；技术指标：有效活菌数(CFU)≥1500亿/g。
试验设计5个处理，在A1-A55个地块中，每个地块小区面积300m2。
A1地块的处理1：常规管理+灌根+叶面喷施高含量微生物复合菌剂一(稀释300倍后10kg/亩)。
A2地块的处理2：常规管理+灌根+叶面喷施灭活高含量微生物复合菌剂二(稀释300倍后，10kg/亩)。
A3地块的处理3：常规管理+灌根+叶面喷施灭活高含量微生物复合菌剂三(稀释300倍后，10kg/亩)。
A4地块的处理4：常规管理+灌根+叶面喷施灭活高含量微生物复合菌剂三(50g对水15kg/亩)。
A5地块的处理5：常规管理。
2019年4月对A1-A33个地块中的露地葡萄进行灌根；5月初、5月末各进行叶面喷施一次，2019年8月进行收获。
叶片调查，选择各处理区生长状况一致的葡萄树，选取基部3～4节位成熟叶(代表大多数叶片叶色的叶子)，用SPAD-502型叶绿素计检测叶色值，每地块处理随机测10片叶，3次重复，共测30片叶，取平均值。称取30片叶子重量，计算单叶重。
氯含量调查，叶片选取标准同上，将所选取的叶片，烘箱75℃杀青30min，60℃烘干至恒重，用不锈钢电磨粉碎过0.15mm筛，用于测定叶片氯含量；采用氧化钙灰化-硝酸银滴定法，并流动分析仪测定叶片氯含量。
吲哚乙酸含量调查，叶片选取标准同上，将所选取的叶片，用粉碎机磨成细分(约1mm大小)；称取粉末10g装入烧杯，加入0.1mol/L NaOH溶液40ml，于100℃水浴中煮沸15min(上面加盖防止水分蒸干)，取出烧杯后再向其内加入0.1mol/LNaOH溶液25ml，充分摇匀，用甲醇定容至100ml，静置30min，取上层液离心30min，上清液则为IAA提取液。
采用Salkowski比色法测定IAA合成量
因为在无机酸存在下，IAA与氯化铁作用，生成红色的螯合物。且该物质在530nm有最大吸收峰，因此通过IAA的定量测定法测出μg级的IAA。
PC比色液的配制，将4.5FeCl3溶于300ml蒸馏水，然后缓慢加入587.4ml98％H2SO4，待冷后定容至1L。
配置吲哚乙酸的系列标准溶液，其浓度分别为25、50、75、100、125、150、175μg/ml。取干净的试管9支，每支加入4ml的PC比色液，再分别加入不同浓度的IAA溶液各2ml，摇匀，于30℃(黑暗)条件下保温30min，使反应混合液呈红色。取反应液在530nm处测定OD值，以加了比色液的蒸馏水调0。以IAA浓度(μg/ml)为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线后计算直线回归方程，y＝0.02x-0.04，R2达到0.9979。
将处理1-处理3的IAA提取液，于530nm处测定OD值，然后根据OD值对应的标准曲线(或直线回归方程)测定各复合菌剂产生的IAA的量。
产量调查，采收时每个处理随机抽取3株葡萄，调查单穗粒数、单粒重，计算亩产量。
其中，各处理的土壤施肥均按农户常规施肥进行，田间管理措施按常规要求进行。
不同处理对葡萄生物性状的影响见表3
表3葡萄叶片性状调查
Figure BDA0002769732320000091
注：叶片按照相同位置见光程度一致的条件进行选取。不同字母代表同一时期不同处理间差异达5％显著水平，下同。
通过观察表3发现，处理1-处理3中施用了固态短小芽孢杆菌菌剂的葡萄叶片中的单叶片重量、IAA、叶绿素含量高于液态短小芽孢杆菌菌剂的处理4，并且处理1-处理3的叶绿素和IAA含量显著高于处理5对照组；而氯含量远远低于处理5的对照组。
不同的处理对葡萄产量影响见表4
表4不同处理对葡萄产量的影响
Figure BDA0002769732320000092
通过观察表4发现，常规处理方式的处理5对照组的葡萄亩产量远远低于氯含量正常地块的平均产量300kg/亩；而处理1-处理4中施用了短小芽孢杆菌菌剂后的葡萄亩产量显著高于氯含量正常地块的平均产量。相对于处理4的对照组而言，处理1-处理3的每亩葡萄增产均高于处理4。其中，处理1-3的固态短小芽孢杆菌菌剂的亩产量相对于处理4中的液态短小芽孢杆菌菌剂而言，也有提升。
综上，本发明所提供的一种固体发酵培养基以及利用其生产高产量IAA的短小芽孢杆菌菌剂的方法，通过使用固态的短小芽孢杆菌菌剂，提升吲哚乙酸的产量，还能够降低植物体内的氯离子含量，从而促进氯离子敏感类植物的生长，有效的缓解了现有的氯离子敏感类植物因土壤中氯离子浓度高导致的产量低的问题。在提供相同有效活菌数的同时又有使用和运输方便的特点，且固体发酵中培养基成分的组成与发酵条件提高了发酵产物的生成效率。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式以及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种固体发酵培养基，其特征在于，短小芽孢杆菌的固体发酵培养基以质量比为(110-120):(30-40):(20-12):1的谷壳载体、金针菇糠、豆粕粉和酵母粉作为基础料，并添加总固体培养基的重量比为1.1％的MgSO4 .7H2O以及2.7％的NaCl，料水比为1:1，搅拌均匀，调节PH为6.5，接种量为10％。
2.根据权利要求1所述的固体发酵培养基，其特征在于，所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌SGM7。
3.利用如权利要求1所述的固体发酵培养基生产高产量IAA的短小芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于，方法包括：
将短小芽孢杆菌SGM7进行活化；取活化的菌种于100ml液体种子培养基中，接种量为体积比1％，37℃，170rpm培养，取12～14h时菌液为短小芽孢杆菌固体发酵种子液；
将所述短小芽孢杆菌固体发酵种子液接种于灭菌的短小芽孢杆菌固体发酵培养基中，搅拌均匀；将发酵物料平摊于37℃下发酵培养20～22小时，镜检芽孢率>90％；将发酵培养所获得的发酵产物直接85℃进行干燥粉碎，获得短小芽孢杆菌菌剂。
4.根据权利要求3所述的利用固体发酵培养基生产高产量IAA的短小芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于，所述短小芽孢杆菌菌剂中的活菌含量为2*1011CFU/g。
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