CN111575201A - 一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法。本发明利用干酒糟丰富的营养组分，采用碱性蛋白酶酶解干酒糟产生的酶解液作为发酵培养基溶剂，通过控制发酵pH，流加补料以及维持溶氧量，实现了生防益生菌多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌高密度混合发酵，发酵液中多粘类芽孢杆菌有效活菌数可达到1.2‑1.5×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数可达到8.0‑9.0×109CFU/mL，缩短了发酵时间，提高了生产效率。利用干酒糟酶解渣制备的复合芽孢杆菌菌剂中有效活菌数或活孢子数可达到3.0‑6.6×1011CFU/g，实现了干酒糟原料全利用，降低了菌剂生产成本。

Description

一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法。
背景技术
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)与坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)是芽孢杆菌属、革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧环境下易培养，能够产生芽孢，对人及动植物无致病性，已被多个国家或地区列为重要的生物农药与生物防治制剂。其中，多粘类芽孢杆菌被我国列为免做安全鉴定的一级菌种，也是美国环境保护署批准的商业化应用微生物之一，而坚强芽孢杆菌已被巴西国家卫生监督局批准作为生物杀线虫剂或种子处理剂使用。多粘类芽孢杆菌能够分泌包括多肽类抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶以及胞外多糖等在内的多种代谢活性物质，可促进植物生长、诱导植物免疫抗性以及拮抗病原微生物，但是缺乏对农作物虫害的防治作用。坚强芽孢杆菌能够分泌抗菌蛋白(酶)类活性产物，并快速定植植物根际，通过抑菌作用及孢子萌发能够强力杀灭根结线虫、胞囊线虫、金色线虫、异皮线虫、畜禽肠道蛔虫等多种动植物害虫、幼虫及虫卵，但是不具备促进植物生长或免疫抗性等方面的综合效价。因而，多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌如若作为复合菌剂施用，在生防促生及抑菌灭虫方面将具有显著的协同互补作用，发展前景与应用价值巨大。
事实上，有效活菌数或孢子数是芽孢杆菌菌剂产品的重要指标之一，通过高密度发酵技术可有效提高发酵活菌数或孢子数，提升生物效价，满足工业生产需要。目前，多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌研究集中在单一菌株的发酵优化及菌剂制备，但普遍存在有效活菌数不高、发酵周期较长、培养组分复杂等问题。针对多粘类芽孢杆菌，在专利CN102559564B中公开了一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，对多粘类芽孢杆菌菌株B-306所需可溶性淀粉、蛋白胨、氯化钠、氯化钙与磷酸氢二钠以及培养pH、温度、转速及接种量等条件进行了优化，发酵24小时后，多粘类芽孢杆菌有效活菌数由优化前3.17×108CFU/mL提高至5.3×109CFU/mL。在专利CN106434458B中公开了一种多粘类芽孢杆菌及其菌剂和制备与应用，采用固体发酵方式，培养基主要包括甜高粱秸秆粉，麸皮，米糠，豆粕粉，淀粉，麦饭石，酵母粉，碳酸钙，硫酸镁，磷酸二氢钾以及硫酸锰，发酵培养72-144小时后，所制备菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为2-4×1010CFU/g。专利CN104694446B公开了一种多粘类芽孢杆菌JX-13及其应用，采用液体发酵方式，培养基主要包括豆粕、马铃薯淀粉、蔗糖、酵母粉、碳酸钙以及硫酸锰，发酵条件为溶氧100％、转速350rpm、pH7.0-7.2以及温度30℃，发酵培养36小时后，所制备菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1×1010CFU/g。专利CN104099278B公开了一种培养高产量多粘类芽孢杆菌的方法，培养基主要由稻壳、玉米粉、土豆、油茶茶渣饼、磷酸氢二钾以及硫酸锰组成，36-38℃发酵培养70-74小时，所制备菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为2.73×1010CFU/g。
针对坚强芽孢杆菌，孙静等[1-2]以豆粕为底物，对坚强芽孢杆菌PC024发酵工艺条件进行了优化，围绕接种量、料水比、发酵时间、发酵温度进行响应面分析实验，发酵100小时后，有效活菌数可达到1.23×1010CFU/g。在专利CN108913636A中公开了一种坚强芽孢杆菌菌粉的制备方法，培养基由玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉、碳酸钙、硫酸铵、磷酸氢二钾、七水硫酸镁以及氯化钠九种成分组成，在28℃，90-110rpm，pH6-7条件下发酵培养24-36小时。在专利CN108913636A中公开了一种抗重茬肥料，所用坚强芽孢杆菌发酵培养基包含玉米粉、鱼粉、壳聚糖、硫酸铵、碳酸钙、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁以及消泡剂九种组分，培养温度29-31℃，培养36-40小时后，发酵液中坚强芽孢杆菌有效活菌数可达到2×109CFU/mL以上。在专利CN106399159B中公开了一种坚强芽孢杆菌菌剂及其制备方法与应用，所用发酵培养基包含酵母粉、玉米淀粉、葡萄糖、氯化钙、豆粕粉及消泡剂六种组分，调节pH8.1-8.3，温度30℃-36℃，通气量为0.5-1vvm，转速150-200rpm，发酵40-48小时后，所制备坚强芽孢杆菌菌剂有效活菌数为1×1010-12CFU/g。
综上，现有多粘类芽孢杆菌或坚强芽孢杆菌单一菌剂制备及发酵技术主要围绕接种量、发酵温度、pH以及培养时间进行优化，发酵培养基组分较复杂，以豆粕、玉米淀粉、葡萄糖、鱼粉、无机盐等为主要组成，一方面有效活菌数与生产强度较低，另一方面由于发酵结束后孢子数低，导致单一菌剂生产成本很高。因而，基于多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌，开发高密度混合发酵技术，制备复合芽孢杆菌菌剂，如若提高有效活菌数，提高孢子数，缩短发酵时间，降低菌剂制备成本，研究意义与应用价值巨大。
上述对背景技术的陈述仅是为了方便对本发明技术方案(使用的技术手段、解决的技术问题以及产生的技术效果等方面)的深入理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，旨在解决现有多粘类芽孢杆菌或坚强芽孢杆菌发酵及菌剂制备技术中，有效活菌数较低、孢子数低、发酵时间较长、菌剂制备成本高的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌高密度混合发酵方法，包括以下步骤：
S1：多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌分别涂布于活化培养基，28-37℃，活化培养18-24小时；
S2：将S1中活化后的多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌单菌落分别接种于种子培养基，28-37℃，150-200rpm震荡培养18-24小时；
S3：将S2中多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌种子液分别按照接种量2.5-5％，共同接种于含有干酒糟酶解液的发酵培养基，28-37℃，150-200rpm搅拌发酵。在发酵过程中，通过气泵维持通气量1.5-3vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，以维持溶氧量30-50％，利用这种气体分散器辅助联合控制溶氧策略，促进细胞高密度繁殖，有利于细胞在生物反应器内积累，降低单位质量细胞的生产成本；通过流加25％的氨水溶液控制pH7.0-7.8；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液中葡萄糖浓度不高于2g/L，此流加方法有利于细胞快速繁殖；
S4：当发酵监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量0.8-1.5vvm，维持溶氧量0-25％，转速100-130rpm，继续发酵1-4小时，通过限制培养条件，利用溶氧限制联合其他培养参数控制策略，有利于促进孢子生成，孢子生成可以提高单位反应体系的孢子得率，提高生产强度，降低菌剂生产成本，最后得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液；
S5：将S4中混合发酵液与载体及冻干保护剂混匀后，高速离心，收集沉淀于-40℃预冷，再真空冷冻干燥即得复合芽孢杆菌菌剂。
上述技术方案中，进一步地，步骤S3所述含有干酒糟酶解液的发酵培养基包括：葡萄糖10-20g/L，可溶性淀粉10-20g/L，蛋白胨5-15g/L，牛肉膏5-15g/L，酵母提取物5-15g/L，碳酸钙5-15g/L，其余为干酒糟酶解液。
上述技术方案中，进一步地，步骤S3所述的气体分散器上微孔直径为0.1-1mm。
上述技术方案中，进一步地，步骤S3所述的补料培养基组成包括：500g/L葡萄糖，50g/L甘油，其余为蒸馏水。
上述技术方案中，进一步地，步骤S4所述的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液中，多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.2-1.5×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为8.0-9.0×109CFU/mL。
上述技术方案中，进一步地，步骤S5所述载体为干酒糟溶液通过碱性蛋白酶酶解后，离心获得的残余固形物。
上述技术方案中，进一步地，所述干酒糟酶解液为质量比5-15％的干酒糟水溶液通过碱性蛋白酶酶解后得到的上清液。
本发明还提供了一种复合芽孢杆菌菌剂，所述的复合芽孢杆菌菌剂由上述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法制备获得。
进一步地，所述的复合芽孢杆菌菌剂中有效活菌数或活孢子数为3.0-6.6×1011CFU/g，包含多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌。
多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌混合培养及发酵的意义及理论依据在于：一方面，多粘类芽孢杆菌可促进植物生长、诱导植物免疫抗性以及拮抗病原微生物，但是缺乏对农作物虫害的防治作用；坚强芽孢杆菌能够高效防治根结线虫等农作物害虫、幼虫及虫卵，但是不具备促进植物生长或免疫抗性等方面的综合效价。因而，多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌混合发酵，作成生物菌剂后在生防促生及抑菌灭虫方面具有显著的协同互补作用。另一方面，多粘类芽孢杆菌产生的肽类抗生素强力拮抗革兰氏阴性菌和真菌，包括酵母、黑曲霉、绿色木霉、植物乳杆菌等常见农业微生物，坚强芽孢杆菌对于多粘类芽孢杆菌分泌的抑菌活性物质具有适应性或抗性，利于实现混合培养及发酵。另外，二者在发酵过程中，表现出共生效果，它们在代谢产物如多肽、多糖等，存在互相利用，二者产生的发酵产物作为对方的底物被利用，有利于二者混合培养。
本发明的有益效果：本发明实现了多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌高密度混合发酵以及高孢子数菌剂制备。干酒糟富含微生物生长所需的复合氨基酸、维生素、微量元素、促生因子以及未知生长因子等重要营养成分，利用碱性蛋白酶酶解干酒糟产生的酶解液作为发酵培养基溶剂，通过气体分散器联合辅助溶氧量控制，兼顾控制发酵pH，流加补料，发酵13-17小时，发酵液中多粘类芽孢杆菌有效活菌数可达1.2-1.5×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数可达8.0-9.0×109CFU/mL；利用干酒糟酶解后产生的酶解渣作为载体制备复合芽孢杆菌菌剂，不需要再额外使用其他载体，所制备的菌剂中活孢子数可达到3.0-6.6×1011CFU/g。本发明相比常规发酵制备菌剂方法，发酵液及菌剂中有效活菌数显著提高，菌剂产品中孢子数显著提高，同时缩短了发酵时间，降低了菌剂生产成本，提高了生产效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明下列实施例所用的菌株及试剂来源如下：
所用多粘类芽孢杆菌CGMCC 1.15984与坚强芽孢杆菌CGMCC 1.3415，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。所用葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、碳酸钙及碱性蛋白酶等生化试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司，干酒糟由大连金微德生物科技有限公司提供。
实施例1：
应用本申请高密度混合发酵方法制备复合芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基与干酒糟酶解液制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母提取物5g/L，碳酸钙5g/L，其余为干酒糟酶解液，pH7-8。
补料培养基：葡萄糖500g/L，甘油50g/L，其余为蒸馏水。
干酒糟酶解液：将干酒糟与蒸馏水按质量比5％混合均匀，用10％氢氧化钠溶液调至pH9-11，80℃水浴处理60分钟，在50℃条件下，按200U/g-干酒糟加入碱性蛋白酶酶解24小时，离心收集上清液即为干酒糟酶解液，干酒糟酶解渣留存备用。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，分别涂布在活化培养基上，28℃静置培养24小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速150rpm，28℃摇瓶培养24小时，分别得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，分别按照接种量2.5％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速150rpm，发酵温度28℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量1.5vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，形成减少通气消耗的前提下，维持溶氧量30％-50％，降低通气成本；通过流加25％氨水溶液维持pH7.0；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液葡萄糖浓度不高于2g/L。
(5)当发酵12小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量0.8vvm，维持溶氧量0-25％，转速100rpm，继续发酵1-4小时，即得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.2×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为8.0×109CFU/mL。
(6)将上述混合发酵液与干酒糟酶解渣及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为6.6×1011CFU/g的复合芽孢杆菌菌剂。
对照实验1：
应用常规发酵方法制备多粘类芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母提取物5g/L，碳酸钙5g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，涂布在活化培养基上，28℃静置培养24小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速150rpm，28℃摇瓶培养24小时，得到多粘类芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，按照接种量5％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌种子液，搅拌转速150rpm，发酵温度28℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量1.5vvm，直接通过直管口扩散气体；通过流加25％氨水溶液维持pH7.0。
(5)当发酵24小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量0.8vvm，转速100rpm，继续发酵1-4小时，即得到有效活菌数为1.2×109CFU/mL的多粘类芽孢杆菌发酵液。
(6)采用与实施例1中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为3.5×1010CFU/g的多粘类芽孢杆菌菌剂。
对照实验2：
应用常规发酵方法制备坚强芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母提取物5g/L，碳酸钙5g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，涂布在活化培养基上，28℃静置培养24小时，得到活化的坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速150rpm，28℃摇瓶培养24小时，得到坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，按照接种量5％(v/v)接入上述坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速150rpm，发酵温度28℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量1.5vvm，直接通过直管口扩散气体；通过流加25％氨水溶液维持pH7.0。
(5)当发酵26小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量0.8vvm，转速100rpm，继续发酵1-4小时，即得到有效活菌数为8.8×108CFU/mL的坚强芽孢杆菌发酵液。
(6)采用与实施例1中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为2.4×1010CFU/g的坚强芽孢杆菌菌剂。
对照实验3：
应用常规高密度发酵方法制备复合芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，可溶性淀粉10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母提取物5g/L，碳酸钙5g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
补料培养基：葡萄糖500g/L，甘油50g/L，其余为蒸馏水。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，分别涂布在活化培养基上，28℃静置培养24小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速150rpm，28℃摇瓶培养24小时，分别得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，分别按照接种量2.5％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速150rpm，发酵温度28℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量1.5vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，以维持溶氧量30％-50％；通过流加25％氨水溶液维持pH7.0；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液葡萄糖浓度不高于2g/L。
(5)当发酵16小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量0.8vvm，维持溶氧量0-25％，转速100rpm，继续发酵1-4小时，即得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为3.6×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为2.5×109CFU/mL。
(6)采用与实施例1中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述混合发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为1.8×1011CFU/g的复合芽孢杆菌菌剂。
应用本发明高密度混合发酵方法，发酵13小时获得多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.2×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为8.0×109CFU/mL，制备的复合菌剂中有效活菌数或活孢子数为6.6×1011CFU/g；应用常规发酵方法，发酵25-27小时获得多粘类芽孢杆菌或坚强芽孢杆菌发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.2×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为8.8×108CFU/mL，制备的单一菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数或活孢子数为3.5×1010CFU/g，坚强芽孢杆菌有效活菌数或活孢子数为2.4×1010CFU/g；应用常规高密度发酵方法，发酵17小时获得多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为3.6×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为2.5×109CFU/mL，制备的复合菌剂中有效活菌数或活孢子数为1.8×1011CFU/g。明显的，采用本发明高密度混合发酵方法，发酵液中多粘类芽孢杆菌有效活菌数提高了3-10倍，坚强芽孢杆菌有效活菌数提高了3-9倍，菌剂中有效活菌数或活孢子数均提高了3-27倍，且缩短了发酵时间，降低了菌剂成本，提高了生产效率。
实施例2：
应用本申请高密度混合发酵方法制备复合芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基与干酒糟酶解液制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，可溶性淀粉20g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏15g/L，酵母提取物15g/L，碳酸钙15g/L，其余为干酒糟酶解液，pH7-8。
补料培养基：葡萄糖500g/L，甘油50g/L，其余为蒸馏水。
干酒糟酶解液：将干酒糟与蒸馏水按质量比15％混合均匀，用10％氢氧化钠溶液调至pH9-11，80℃水浴处理60分钟，在50℃条件下，按200U/g-干酒糟加入碱性蛋白酶酶解24小时，离心收集上清液即为干酒糟酶解液，干酒糟酶解渣留存备用。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，分别涂布在活化培养基上，37℃静置培养18小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速200rpm，37℃摇瓶培养18小时，分别得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，分别按照接种量5％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速200rpm，发酵温度37℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量3vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，以维持溶氧量30％-50％；通过流加25％氨水溶液维持pH7.8；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液葡萄糖浓度不高于2g/L。
(5)当发酵14小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.5vvm，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.4×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为8.8×109CFU/mL。
(6)将上述混合发酵液与干酒糟酶解渣及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为3.0×1011CFU/g的复合芽孢杆菌菌剂。
对照实验1：
应用常规发酵方法制备多粘类芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，可溶性淀粉20g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏15g/L，酵母提取物15g/L，碳酸钙15g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，涂布在活化培养基上，37℃静置培养18小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速200rpm，37℃摇瓶培养18小时，得到多粘类芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，按照接种量10％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌种子液，搅拌转速200rpm，发酵温度37℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量3vvm，直接通过直管口扩散气体；通过流加25％氨水溶液维持pH7.8。
(5)当发酵32小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.5vvm，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到有效活菌数为3.0×109CFU/mL的多粘类芽孢杆菌发酵液。
(6)采用与实施例2中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为2.2×1010CFU/g的多粘类芽孢杆菌菌剂。
对照实验2：
应用常规发酵方法制备坚强芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，可溶性淀粉20g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏15g/L，酵母提取物15g/L，碳酸钙15g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，涂布在活化培养基上，37℃静置培养18小时，得到活化的坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速200rpm，37℃摇瓶培养18小时，得到坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，按照接种量10％(v/v)接入上述坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速200rpm，发酵温度37℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量3vvm，直接通过直管口扩散气体；通过流加25％氨水溶液维持pH7.8。
(5)当发酵36小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.5vvm，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到有效活菌数为1.6×109CFU/mL的坚强芽孢杆菌发酵液。
(6)采用与实施例2中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为1.2×1010CFU/g的坚强芽孢杆菌菌剂。
对照实验3：
应用常规高密度发酵方法制备复合芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，可溶性淀粉20g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏15g/L，酵母提取物15g/L，碳酸钙15g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
补料培养基：葡萄糖500g/L，甘油50g/L，其余为蒸馏水。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，分别涂布在活化培养基上，37℃静置培养18小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速200rpm，37℃摇瓶培养18小时，分别得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，分别按照接种量5％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速200rpm，发酵温度37℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量3vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，以维持溶氧量30％-50％；通过流加25％氨水溶液维持pH7.8；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液葡萄糖浓度不高于2g/L。
(5)当发酵18小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.5vvm，维持溶氧量0％-25％，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为5.0×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为3.6×109CFU/mL。
(6)采用与实施例2中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述混合发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为9.0×1010CFU/g的复合芽孢杆菌菌剂。
应用本发明高密度混合发酵方法，发酵15小时获得多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.4×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为8.8×109CFU/mL，制备的复合菌剂中有效活菌数或活孢子数为3.0×1011CFU/g；应用常规发酵方法，发酵33-37小时获得多粘类芽孢杆菌或坚强芽孢杆菌发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为3.0×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为1.6×109CFU/mL，制备的单一菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数或活孢子数为2.2×1010CFU/g，坚强芽孢杆菌有效活菌数或活孢子数为1.2×1010CFU/g；应用常规高密度发酵方法，发酵19小时获得多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为5.0×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为3.6×109CFU/mL，制备的复合芽孢杆菌菌剂中有效活菌数或活孢子数为9.0×1010CFU/g。明显的，采用本发明高密度混合发酵方法，发酵液中多粘类芽孢杆菌有效活菌数提高了2-5倍，坚强芽孢杆菌有效活菌数提高了2-6倍，菌剂中有效活菌数或活孢子数均提高了3-25倍，且缩短了发酵时间，降低了菌剂成本，提高了生产效率。
实施例3：
应用本申请高密度混合发酵方法制备复合芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基与干酒糟酶解液制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖15g/L，可溶性淀粉15g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物10g/L，碳酸钙10g/L，其余为干酒糟酶解液，pH7-8。
补料培养基：葡萄糖500g/L，甘油50g/L，其余为蒸馏水。
干酒糟酶解液：将干酒糟与蒸馏水按质量比10％混合均匀，用10％氢氧化钠溶液调至pH9-11，80℃水浴处理60分钟，在50℃条件下，按200U/g-干酒糟加入碱性蛋白酶酶解24小时，离心收集上清液即为干酒糟酶解液，干酒糟酶解渣留存备用。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，分别涂布在活化培养基上，30℃静置培养20小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速180rpm，30℃摇瓶培养20小时，分别得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，分别按照接种量4％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速180rpm，发酵温度30℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量2.4vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，以维持溶氧量30％-50％；通过流加25％氨水溶液维持pH7.5；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液葡萄糖浓度不高于2g/L。
(5)当发酵12小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.2vvm，维持溶氧量0％-25％，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.5×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为9.0×109CFU/mL。
(6)将上述混合发酵液与干酒糟酶解渣及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为4.0×1011CFU/g的复合芽孢杆菌菌剂。
对照实验1：
应用常规发酵方法制备多粘类芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖15g/L，可溶性淀粉15g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物10g/L，碳酸钙10g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，涂布在活化培养基上，30℃静置培养20小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速180rpm，30℃摇瓶培养20小时，得到多粘类芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，按照接种量8％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌种子液，搅拌转速180rpm，发酵温度30℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量2.4vvm，直接通过直管口扩散气体；通过流加25％氨水溶液维持pH7.5。
(5)当发酵28小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.2vvm，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到有效活菌数为1.9×109CFU/mL的多粘类芽孢杆菌发酵液。
(6)采用与实施例3中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为2.4×109CFU/g的多粘类芽孢杆菌菌剂。
对照实验2：
应用常规发酵方法制备坚强芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖15g/L，可溶性淀粉15g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物10g/L，碳酸钙10g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，涂布在活化培养基上，30℃静置培养20小时，得到活化的坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速180rpm，30℃摇瓶培养20小时，得到坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，按照接种量8％(v/v)接入上述坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速180rpm，发酵温度30℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量2.4vvm，直接通过直管口扩散气体；通过流加25％氨水溶液维持pH7.5。
(5)当发酵32小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.2vvm，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到有效活菌数为1.2×109CFU/mL的坚强芽孢杆菌发酵液。
(6)采用与实施例3中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为1.4×1010CFU/g的坚强芽孢杆菌菌剂。
对照实验3：
应用常规高密度发酵方法制备复合芽孢杆菌菌剂的步骤如下：
(1)培养基制备：
活化培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，其余为蒸馏水,pH7-8。
发酵培养基：葡萄糖15g/L，可溶性淀粉15g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物10g/L，碳酸钙10g/L，其余为蒸馏水，pH7-8。
补料培养基：葡萄糖500g/L，甘油50g/L，其余为蒸馏水。
(2)将斜面保存菌种经80℃水浴热激5分钟后，分别涂布在活化培养基上，30℃静置培养20小时，得到活化的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌单菌落。
(3)在500mL三角瓶中装入100mL种子培养基，挑取上述活化单菌落，转速180rpm，30℃摇瓶培养20小时，分别得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液。
(4)在3L发酵罐中装入1L发酵培养基，分别按照接种量4％(v/v)接入上述多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌种子液，搅拌转速180rpm，发酵温度30℃。发酵过程中，通过气泵维持通气量2.5vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，以维持溶氧量30％-50％；通过流加25％氨水溶液维持pH7.5；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液葡萄糖浓度不高于2g/L。
(5)当发酵16小时监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量1.2vvm，维持溶氧量0％-25％，转速130rpm，继续发酵1-4小时，即得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为5.6×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为4.0×109CFU/mL。
(6)采用与实施例3中干酒糟酶解渣等量的玉米粉作为菌剂载体，将上述混合发酵液与玉米粉及冻干保护剂混匀，高速离心后收集沉淀置于-40℃预冷6小时，再放入真空冷冻干燥机内冻干36小时，即得有效活菌数或活孢子数为1.5×1011CFU/g的复合芽孢杆菌菌剂。
应用本发明高密度混合发酵方法，发酵13小时获得多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.5×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为9.0×109CFU/mL，制备的复合菌剂中有效活菌数或活孢子数为4.0×1011CFU/g；应用常规发酵方法，发酵29-33小时获得多粘类芽孢杆菌或坚强芽孢杆菌发酵液，其中多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.9×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为1.2×109CFU/mL，制备的单一菌剂中多粘类芽孢杆菌有效活菌数或活孢子数为2.4×1010CFU/g，坚强芽孢杆菌有效活菌数或活孢子数为1.4×1010CFU/g；应用常规高密度发酵方法，发酵17小时获得多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液，多粘类芽孢杆菌有效活菌数为5.6×109CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为4.0×109CFU/mL，制备的复合芽孢杆菌菌剂中有效活菌数或活孢子数为1.5×1011CFU/g。明显的，采用本发明高密度混合发酵方法，发酵液中多粘类芽孢杆菌有效活菌数提高了2-8倍，坚强芽孢杆菌有效活菌数提高了2-8倍，菌剂中有效活菌数或活孢子数均提高了2-29倍，且缩短了发酵时间，降低了菌剂成本，提高了生产效率。
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导作出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。
参考文献
1.孙静,宋晓玲,黄倢.豆粕的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)发酵工艺优化及其营养成分分析.渔业科学进展,2017,38(03):163-171.
2.孙静.响应面法优化坚强芽孢杆菌PC024发酵豆粕的研究.2015年中国水产学会学术年会论文摘要集.2015:19.

Claims (9)

1.一种复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌分别涂布于活化培养基，28-37℃，活化培养18-24小时；
S2：将S1中活化后的多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌单菌落分别接种于种子培养基，28-37℃，150-200rpm震荡培养18-24小时；
S3：将S2中多粘类芽孢杆菌与坚强芽孢杆菌种子液分别按照接种量2.5-5％，共同接种于含有干酒糟酶解液的发酵培养基，28-37℃，150-200rpm搅拌发酵；在发酵过程中，通过气泵维持通气量1.5-3vvm，通过气体分散器控制气泡直径0.1-1mm，进而维持溶氧量30-50％；通过流加25％的氨水溶液控制pH7.0-7.8；当葡萄糖浓度降至2g/L时，通过流加10-40mL补料培养基，维持发酵液中葡萄糖浓度不高于2g/L；
S4：当发酵监测到最大菌体浓度OD620后，停止补料，调节通气量0.8-1.5vvm，维持溶氧量0-25％，转速100-130rpm，继续发酵1-4小时，促进孢子产生，得到多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液；
S5：将S4中混合发酵液与载体及冻干保护剂混匀后，高速离心，收集沉淀于-40℃预冷，再真空冷冻干燥即得复合芽孢杆菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，其特征在于，步骤S3所述含有干酒糟酶解液的发酵培养基包括：葡萄糖10-20g/L，可溶性淀粉10-20g/L，蛋白胨5-15g/L，牛肉膏5-15g/L，酵母提取物5-15g/L，碳酸钙5-15g/L，其余为干酒糟酶解液。
3.根据权利要求2所述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，其特征在于，所述干酒糟酶解液为质量百分比5-15％的干酒糟水溶液通过碱性蛋白酶酶解后得到的上清液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，其特征在于，步骤S3所述的气体分散器上微孔直径为0.1-1mm，利用微孔辅助调控溶氧，提高细胞密度。
5.根据权利要求4所述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，其特征在于，步骤S3所述的补料培养基组成包括：500g/L葡萄糖，50g/L甘油，其余为蒸馏水。
6.根据权利要求4所述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，其特征在于，步骤S5所述载体为干酒糟溶液通过碱性蛋白酶酶解后，离心获得的残余固形物。
7.根据权利要求4或6所述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法，其特征在于，步骤S4所述的多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌混合发酵液中，多粘类芽孢杆菌有效活菌数为1.2-1.5×1010CFU/mL，坚强芽孢杆菌有效活菌数为8.0-9.0×109CFU/mL。
8.一种复合芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述的复合芽孢杆菌菌剂由权利要求1至7中任一项所述的复合芽孢杆菌菌剂的高密度混合发酵制备方法制备获得。
9.根据权利要求8所述的复合芽孢杆菌菌剂，其特征正在于，所述的复合芽孢杆菌菌剂中有效活菌数或活孢子数为3.0-6.6×1011CFU/g，包含多粘类芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌。
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