CN111187744A

CN111187744A - 同温层芽孢杆菌高密度工业发酵培养基及其发酵方法

Info

Publication number: CN111187744A
Application number: CN202010181763.6A
Authority: CN
Inventors: 赵晶; 张瑞振
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2020-03-16
Publication date: 2020-05-22

Abstract

同温层芽孢杆菌高密度工业发酵培养基及其发酵方法，涉及微生物发酵。所述工业发酵培养基的原料：酵母粉、豆粕粉、葡萄糖、玉米淀粉、玉米蛋白粉、NaCl、MgSO₄、Na₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、K₂HPO₄、MnSO₄、NH₄Cl，pH值8.0～9.0。发酵方法：1)将同温层芽孢杆菌Bacillus stratosphericus A3440接种于2216E琼脂培养基上活化，再接种于种子培养基，摇床培养得一级种子液；将一级种子液接种至装有工业发酵培养基的种子罐中发酵，得二级种子液；将二级种子液接种至装有工业发酵培养基的发酵罐中，发酵36～48h后结束发酵。原料易得，发酵成本低，节能环保。

Description

同温层芽孢杆菌高密度工业发酵培养基及其发酵方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵，尤其是涉及一种同温层芽孢杆菌(Bacillusstratosphericus A3440)高密度工业发酵培养基及其发酵方法。

背景技术

水产养殖是人类获取动物蛋白的重要途径，中国的水产养殖总量约占世界的60.5％(Mo W Y,Man Y B,Wong M H.Use of food waste,fish waste and foodprocessing waste for China's aquaculture industry:Needs and challenge[J].Science of the Total Environment,2017,613-614:635-643.)。随着水产养殖生产的日益集约化和商业化，水产养殖业面临着养殖环境恶化，饲料原料短缺，水产病害频发等一系列问题(Hai N V.The use of probiotics in aquaculture[J].Journal of AppliedMicrobiology,2015,119(4):917-935)。这些年来国家出台许多政策来减少或者禁止某些抗生素或者活性化学药物的使用，因此，人们越来越关注寻找其他安全、非抗生素和环保的替代方法来治疗这些疾病。水产中益生菌的应用是控制感染源和治疗疾病的一种很有前景的替代方法。益生菌具有促进生长，改善消化，增强免疫力以及改善水质的作用。

水产益生菌是一种可以改善宿主体内和外界生活环境菌群结构的活性微生物，能够提高宿主的饲料利用率、增强抗病力(Verschuere L,Heang H,Criel G,et al.Selectedbacterial strains protect Artemia spp.from the pathogenic effects of Vibrioproteolyticus CW8T2[J].Applied&Environmental Microbiology,2000,66(3):1139-1146)。而菌种是水产养殖动物用益生菌制剂质量控制的源头，是产量、质量和效果的重中之重。根据中华人民共和国农业部公告第2045号《饲料添加剂品种目录(2013)》现阶段我国农业部饲料添加剂名录中批准使用的益生菌种类包括了芽孢杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、假单胞菌共有34种微生物。但是目前应用在水产养殖上的益生菌制剂多为陆源微生态制剂衍生而来，也有少量分离自水产动物，由于使用对象生态习性的差异，并不能完全适用于海水养殖动物，其益生效果也受到限制。因此，开发海洋源益生菌，具有功能性强、针对性高等特点，有助于提升海水养殖产品质量及规范海水动物饲用益生菌的使用。本发明所涉及的同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus A3440)，由本申请人分离自健康海水水产养殖动物肠道，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253；申请人在中国专利201510180738.5中公开芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法；在前期研究中，同温层芽孢杆菌能够分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、褐藻胶酶，5种消化酶，且无致病基因以及遗传稳定。前期试验表明，该菌对初始体重(0.64±0.22)g、初始壳长(1.69±0.21)cm的皱纹盘鲍幼鲍投喂含同温层芽孢杆菌的配合饲料，经过90天的养殖后，试验组的壳长与体重增长率对比对照组分别提高了48.54％和136.21％。在对初始体重(7.84±0.55)g、体长(6.70±0.18)cm的斜带石斑鱼投喂含同温层芽孢杆菌的配合饲料，经过110天的养殖后，体重增长率比对照组提高了30.04％。试验结果证明，同温层芽孢杆菌A3440能够显著提高养殖动物的体重增长率，促进生长，因此具有广阔的应用前景。

微生物发酵是指通过微生物的生长培养和化学变化，大量生产细胞本身和积累专门的代谢产物的反应过程(韩德权,王莘.微生物发酵工艺学原理[M].北京:化学工业出版社,2013,3:1-3)。而原料是发酵工业微生物有效利用营养物质、满足自身生长和发酵产物产出的重要基础，其组分主要由碳源、氮源、无机盐、微量元素、水等几大类物质组成。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供原料易得，发酵成本低，节能环保，可解决发酵过程中培养基盐度过高易腐蚀发酵罐等问题的一种高密度工业发酵培养基。

本发明的另一目的在于提供基于上述高密度工业发酵培养基的一种同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法。

所述高密度工业发酵培养基的原料按质量百分比可为：酵母粉0.4％～0.7％、豆粕粉2％～5％、葡萄糖1％～4％、玉米淀粉1％～4％、玉米蛋白粉0.3％～0.6％、NaCl0.3％～0.6％、MgSO₄0.3％～0.6％、Na₂HPO₄ 0.3％～0.6％、(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％、K₂HPO₄ 0.04％～0.1％、MnSO₄ 0.04％～0.07％、NH₄Cl 0.1％～0.3％，pH值8.0～9.0。

所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，包括以下步骤：

1)将保存于-80℃的同温层芽孢杆菌Bacillus stratosphericus A3440接种于2216E琼脂培养基上，经25～30℃恒温培养36～48h活化；

2)将活化好的同温层芽孢杆菌单菌落接种于装有已经消毒灭菌的种子培养基的容器中，再将容器置于恒温摇床培养，得到一级种子液；

3)将一级种子液接种至装有已经消毒灭菌的高密度工业发酵培养基的种子罐中，设置各发酵参数进行发酵，发酵36～48h后结束发酵，得到二级种子液；

4)将二级种子液接种至装有已经消毒灭菌的高密度工业发酵培养基的发酵罐中，设置各发酵参数进行发酵，发酵36～48h后结束发酵。

在步骤1)中，所述活化可活化2次。

在步骤2)中，所述接种的接种量可为3％～6％；所述种子培养基原料配方按质量百分比为：蛋白胨0.7％、酵母粉0.7％、NaCl 0.5％、MgSO₄ 0.4％、Na₂HPO₄ 0.5％、(NH₄)₂SO₄0.4％；所述恒温摇床培养的条件可为：恒温摇床180～200rpm，25～30℃培养36～48h。

在步骤3)中，所述一级种子液的装液量为罐体积的60％～70％；

在步骤4)中，所述发酵培养基的灭菌条件可为115～121℃下消毒灭菌30min所述发酵罐可采用100～1000L发酵罐；所述发酵培养基的装液量为罐体积的60％～70％。所述发酵参数可为：通气量0.8～1.2(V/V·min)、罐压0.1～0.2MP、搅拌转速180～400rpm、发酵时间36～48h。所述发酵的温度可为25～30℃，发酵的时间可为36～48h。

本发明所涉及的同温层芽孢杆菌高密度工业发酵原料中碳源主要有酵母粉、葡萄糖和玉米淀粉；有机氮源主要有豆粕粉、玉米蛋白粉。这些原料均为饲料工业中的原料具有易获取，价格低的优势并且原料中所含的粗蛋白和碳水化合物的比例大，保证了发酵过程中能够满足菌体生长所需的各种营养元素。本发明所涉及的同温层芽孢杆菌是一株海洋细菌，发酵过程中的盐度会比较高，而海水会使发酵设备易被腐蚀，因此需要选择合适的无机盐组分及添加量来替代海水和降低盐度。发酵原料中选择NaCl、MgSO₄、Na₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl作为原料中无机成分中的主要成分来替代海水，即保护了发酵设备不被腐蚀也降低了发酵液的盐度。发酵过程中所涉及的参数简单也易调整。本发明所涉及的同温层芽孢杆菌高密度工业发酵原料及发酵条件，为海洋源海水养殖动物益生菌制剂的工业化生产提供理论依据与技术支持。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

1)来源健康海水养殖动物消化道分离的微生物作为益生菌，具有较高的同源性、稳定性和适用性。

2)本发明中的中试发酵培养基组分中的豆粕粉，玉米淀粉，玉米蛋白粉均是易获得和价格低廉的原料，可以降低发酵成本。

3)本发明中的中试发酵培养基组分中的无机盐替代了海盐，解决了发酵过程中培养基盐度过高易腐蚀发酵罐的问题。

4)本发明的发酵条件中发酵转速是根据生长曲线进行调整，维持在180～400rpm范围，既保证了发酵时对数生长期的溶氧，也使得细胞不因高转速而出现机械损伤，也使得发酵过程中更加的节能。

5)在本发明的中试发酵培养基和发酵条件下，发酵36h后的同温层芽孢杆菌的生物量达到了1×10¹⁵CFU/ml，比优化前提高了4～5个数量级，芽孢率在90％以上。

附图说明

图1为同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus A3440)中试发酵的生长曲线图。

图2为变速和定速两种发酵方式对同温层芽孢杆菌生物量和芽孢率的影响图。

图3为变速和定速发酵过程发酵液中相对溶氧率变化曲线图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。应理解，以下实施例不是对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述实施例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本发明的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于以下示例的具体数值。

1.材料与方法

1.1菌株

本发明采用的同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus A3440)由本实验室分离自健康海水水产养殖动物肠道，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253。

1.2基础培养基

以2216E液体培养基作为基础发酵培养基：蛋白胨5g/L、酵母膏1g/L、磷酸高铁0.01g/L、过滤陈海水1L。

1.3种子培养基

种子培养基原料配方按质量百分比为：蛋白胨0.7％、酵母粉0.7％、NaCl 0.5％、MgSO₄ 0.4％、Na₂HPO₄ 0.5％、(NH₄)₂SO₄ 0.4％。

1.4发酵培养基

所述提高同温层芽孢杆菌生物的发酵培养基的原料配方按质量百分比为：酵母粉0.5％、豆粕粉3％、葡萄糖1-2％、玉米淀粉1％、玉米蛋白粉0.5％、NaCl 0.5％、MgSO₄0.4％、Na₂HPO₄0.5％、(NH₄)₂SO₄ 0.4％、K₂HPO₄ 0.04％、MnSO₄ 0.04％、NH₄Cl 0.1％，PH值8.0-9.0。

1.5发酵方法

1.5.1菌种的活化

用接种环将保存于-80℃的同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus A3440)接种于2216E固体培养基上，25℃倒置培养48h进行活化2次。

1.5.2种子液培养

从经2次活化之后的2216E平板上挑取一环单克隆菌株，接种于装有100ml已经灭菌好的种子培养基的250ml锥形瓶中，180rpm、25℃培养48h后，然后接种至5L种子罐中发酵得到种子液。

1.5.3发酵罐培养

采用100L发酵罐培养，装入上述发酵培养基60～70L，实消温度为115℃，实消30min。实消结束后，当温度降至培养温度30℃时进行接种，接种量为3％。发酵时通气量1(V/V·min)、罐压0.1MP、温度25℃、转速200～400rpm。用以上发酵培养基和发酵条件发酵36～48h。

1.5.4生长曲线的测定

在发酵罐培养过程中，在发酵的0h、4h、8h、16h、24h、36h、48h取样，稀释10倍后，测定发酵液在630nm条件下的吸光度。以培养时间为横坐标，OD₆₃₀为纵坐标，绘制同温层芽孢杆菌的生长曲线。

1.5.5生物量的测定

取发酵罐培养至平台期的同温层芽孢杆菌的菌液，使用灭菌生理盐水将菌液稀释至适宜的连续三个浓度梯度，每个梯度取100ul稀释液涂布于3个2216E琼脂培养基上，30℃倒置培养至菌落清晰可见后计数。

1.5.6芽孢率的测定

使用稀释平板法，将菌液分别稀释适宜的三个连续梯度，每个梯度吸取100ul涂布于3个2216E平板上，在30℃倒置培养至菌落清晰可见后计数。在80℃条件下将菌液水浴10min后稀释计数，同温层芽孢杆菌的芽孢率按以下方程式计算：

芽孢率＝80℃水浴后活菌数/水浴前活菌数×100％

1.5.7发酵转速的优化

优化发酵过程中的转速，对比变速发酵和定速发酵对同温层芽孢杆菌生物量的影响，发酵过程中变速发酵和定速发酵的转速设置如表1。

表1

2.结果与分析

2.1同温层芽孢杆菌发酵的生长曲线

同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus A3440)中试发酵的生长曲线如图1所示，从生长曲线可以看出在0～4h处于延滞期；在4～24h为对数生长期，是菌体的快速生长阶段；在24h后，生长速度减缓进入平台期；在36h后生物量略微降低，因此选择24～36h作为放罐时间段。

2.2发酵培养基与培养基2216E和种子培养基生物量和芽孢率的比较

发酵培养基与培养基2216E和种子培养基生物量和芽孢率的比较如表2所示，发酵第36h时，中试发酵培养基同温层芽孢杆菌生物量比2216E和种子培养基提高了4～5个数量级。

表2

2.3发酵转速的优化

发酵过程中对比了转速的变速和定速两种发酵方式对同温层芽孢杆菌生物量和芽孢率的影响。变速和定速两种发酵方式对同温层芽孢杆菌生物量和芽孢率的影响如图2所示，可见，变速发酵比定速发酵使同温层芽孢杆菌在发酵36h的生物量高3个数量级，但产孢率率低于定速发酵。

在发酵过程中，随着细菌到了对数生长期，菌体大量繁殖，此时急剧消耗大量的溶氧。在保持较高的通气量的同时，在一定范围提高转速能够有效的提高培养基的溶氧来满足对数生长期菌株的耗氧需求。当达到平台期，菌体繁殖趋于缓慢平稳，耗氧量降低，此时可以通过降低转速来减少耗能，因此变速培养在发酵过程中是个比较经济的发酵模式。变速和定速发酵过程发酵液中相对溶氧率变化如图3所示，从图3可以看出，在发酵过程中第4h进入对数生长期，耗氧量开始逐渐增大，培养基中的溶氧开始下降，在第8h时下降到最低峰，相对溶氧率将近为零。在定速培养过程中从第8～26h，培养基的相对溶氧率为零；在变速培养过程在第4～24h把转速调至400rpm，能够显著的提高对数生长期的相对溶氧率，从而提高产量，24h之后进入平台期，调低转速至200rpm，是发酵过程中更加节能，也避免较高转速对细胞的机械损伤。

3.总结

综上所述，在本发明的高密度工业发酵培养基和发酵条件下，发酵36h后的同温层芽孢杆菌的生物量达到了1×10¹⁵CFU/ml，比优化前提高了4～5个数量级，芽孢率在90％以上；将种子培养基的碳源、氮源替换成豆粕粉、玉米蛋白粉、玉米淀粉、葡萄糖等工业原料，使得在很大程度上降低了生产成本；本发明中涉及到的发酵条件能够在一定程度上提高对数生长期的发酵液的相对溶氧率，能够有效地提高产量。

Claims

1.高密度工业发酵培养基，其特征在于其原料按质量百分比的组成为：酵母粉0.4％～0.7％、豆粕粉2％～5％、葡萄糖1％～4％、玉米淀粉1％～4％、玉米蛋白粉0.3％～0.6％、NaCl 0.3％～0.6％、MgSO₄0.3％～0.6％、Na₂HPO₄ 0.3％～0.6％、(NH₄)₂SO₄ 0.4％～0.8％、K₂HPO₄0.04％～0.1％、MnSO₄ 0.04％～0.07％、NH₄Cl 0.1％～0.3％，pH值8.0～9.0。

2.同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于包括以下步骤：

3)将一级种子液接种至装有已经消毒灭菌的如权利要求1所述高密度工业发酵培养基的种子罐中，设置各发酵参数进行发酵，发酵36～48h后结束发酵，得到二级种子液；

4)将二级种子液接种至装有已经消毒灭菌的如权利要求1所述高密度工业发酵培养基的发酵罐中，设置各发酵参数进行发酵，发酵36～48h后结束发酵。

3.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤1)中，所述活化是活化2次。

4.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述接种的接种量为3％～6％。

5.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子培养基原料配方按质量百分比为：蛋白胨0.7％、酵母粉0.7％、NaCl 0.5％、MgSO₄0.4％、Na₂HPO₄ 0.5％、(NH₄)₂SO₄ 0.4％。

6.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤2)中，所述恒温摇床培养的条件为：恒温摇床180～200rpm，25～30℃培养36～48h。

7.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤3)中，所述一级种子液的装液量为罐体积的60％～70％。

8.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤4)中，所述发酵培养基的灭菌条件为115～121℃下消毒灭菌30min。

9.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤4)中，所述发酵罐采用100～1000L发酵罐；所述发酵培养基的装液量为罐体积的60％～70％。

10.如权利要求2所述同温层芽孢杆菌高密度工业发酵方法，其特征在于在步骤4)中，所述发酵参数为：通气量0.8～1.2(V/V·min)、罐压0.1～0.2MP、搅拌转速180～400rpm，发酵的温度25～30℃，发酵的时间为36～48h。