CN105557757A - 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法 - Google Patents
一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物农药与微生物肥料领域，具体公开的是一种含有芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法，该可湿性粉剂的原料由下列重量组份组成：甲基营养型芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：滑石粉20-30份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素0.2-1份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.1-0.5份，2，6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份。本发明制备的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂施入大田后芽孢萌发速度快，萌发率高，可明显提高其肥效与对植物病害防治效果，减少芽孢的用量，降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药与微生物肥料领域，具体涉及一种含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法。
背景技术
我国每年使用大量的化学农药制剂与化肥，极易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康。而生物农药副作用小，对人无害，是一种具有广阔前景的绿色农药，日益成为全球农药发展的一种趋势。
芽孢杆菌是目前生物农药与微生物肥料中研究最多的一种微生物，它具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，其营养细胞能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，因此，在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面显示出了广阔的应用前景。
甲基营养型芽孢杆菌是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，该菌在自然界中广泛存在，具有独特的一碳代谢途径，能够将自然界中取之不尽的一碳化合物如甲醇、甲醛等转变为菌体自身所需的营养物质，同时又会产生多种有益的代谢副产物丝氨酸、维生素B12、聚P羟基丁酸盐等。对人畜无毒无害，不污染环境，具备生命力强，能产生多种抗菌素和酶，具有抗菌活性和极强的抗高温，抗强酸强碱能力，甲基营养型芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常用见内生细菌，尤其是在植物的根、茎内部。甲基营养型芽孢杆菌通过成功定植于烟草、水稻等植物根际、体表或体内，改变其周围菌群环境和种类，与病原菌竞争植物周围的位点，并且分泌多种抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到改良土壤和生防的目的，具有防病和促生作用。因此国内这几年对其研究较多，如吕倩等在南海深海分离一株甲基型营养型芽孢杆菌具有较强抑制黄瓜炭疽病菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌等植物病原真菌的活性，有防治作物真菌病害的研发价值。
王洪梅从土壤中分离筛选出一株对番茄青枯病病原菌有较强抑菌效果的甲基营养型芽孢杆菌株N5。菌株N5具有产生铁载体、β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶以及多种脂肽类抗菌物质的能力。菌体发酵后与有机肥(猪粪︰氨基酸肥料=1︰1)混合后进行二次发酵制成生物有机肥，并用盆栽试验验证其生防和促生效果。结果表明：利用菌株N5制备的生物有机肥可以促进番茄的生长，提高根系的活力。生物有机肥可有效防治番茄青枯病，其中营养钵使用生物有机肥的处理其生防效果优于大盆使用生物有机肥的处理，特别是营养钵和大盆均使用生物有机肥的处理其生防效果达69%，而使用有机肥并不能有效防治番茄青枯病。使用生物有机肥显著增加根际土壤中细菌、放线菌的数量，减少真菌和青枯劳尔氏菌的数量。
赵月菊等在专利号201410601775.4中公开了一株甲基营养型芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用，用于防治赤霉病，穗腐病或根腐病等。
云利等(冯云利，2011)在研究烤烟品种NC297内生细菌种群组成时，发现该菌是烟草内生细菌的优势种群，且对烟草黑胫病菌有抑制作用；MunusamyMadhaiyan从水稻根际土壤中获得具有利用甲醇和促生作用的新型细菌甲基营养型芽孢杆菌(MunusamyMadhaiyan,2010)；刘伟从烟草土壤中分离一株甲基营养型芽孢杆菌LW-6，采用温室盆栽试验测定LW-6的抑菌和促生作用，结果显示该菌处理的烟草植株在接种烟草青枯病菌后防治效果为70.37%；其可定植于烟草根际土壤，具有良好的定植能力；其对烟草有明显促生作用。菌株LW-6在烟草青枯病防治中具有潜在的利用价值。
周登博等在专利号201210247234.7中公开了一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16，还公开了该菌株在制备具有防控香蕉枯萎病作用的药物中的用途以及含该菌株的微生物制剂，该制剂不仅对多种香蕉病原菌具有更好的拮抗作用，还对植株生长具有促进作用。
唐满仓等在专利号201410654499.8公开了一种含甲基营养型芽孢杆菌与叶枯唑的杀细菌组合物及其在防治烟草青枯病，水稻白叶枯病或大白菜的软腐病的应用。在专利号201210579898.3中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂，其可湿性粉剂是采用特定的方法制得的甲基营养型芽孢杆菌的原粉，轻质碳酸钙，十二烷基苯磺酸钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾和分散剂亚甲萘磺酸钠组成，能较好的防治柑溃疡病的用途。在专利号201210579899.8中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌的生物菌剂及其制备方法。在专利号201410654587.8中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌的水分散粒剂及其制备方法和应用。
林克明等在专利号201210550128.6中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04及在防治辣椒的青枯病，柑橘的炭疽病上的应用。
姬广海等在专利号201210241442.6中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌BWJ及其在十字花科蔬菜根肿病防治的应用。杨德昌等在专利号201410303095.4中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和对黄瓜灰霉病和苹果腐烂病具有较强的防治效果。可湿性粉剂芽孢含量不低于30亿/克。
阮志勇等在专利号201310628536.3中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌及微生物菌剂和它们的应用。邵海锋在专利号201410148228.5中公开了一种甲基营养型芽孢杆菌及其制备生物型肥料增效剂的方法。
单俊伟等在专利号201410148953.2中公开了一种耐盐性甲基营养型芽孢杆菌菌株LJ及其在盐碱地改良，烟草细菌性病害、病毒性病害、真菌性病害防治上有较好的效果。
植物病害生防甲基营养型芽孢杆菌的研究开发应用目前已取得了不少成就，但其发展过程中仍存在不少问题。如我们生产的甲基营养型芽孢杆菌主要以芽孢数量的多少来衡量，从上面我们发现现阶段甲基营养型芽孢杆菌发酵过程中的芽孢含量不高，不到100亿cfu/ml；另外，经过我们试验发现有芽孢杆菌产品超过50%的芽孢施入地中由于没有及时萌发而失去其效果。如王倩利用枯草芽孢杆菌TR21防治巴西蕉枯萎病时，前期试验利用TR21菌株NB发酵液灌根和叶腋接种都能有效防治枯萎病，但是利用芽孢制备可湿性粉剂的灌根与叶腋效果却不理想，显示了去掉发酵液后的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下降。
芽孢杆菌在自然界中分布广泛，当外部条件适合生长时，芽孢会由休眠状态经过一系列复杂生理生化反应成长为营养体并恢复新陈代谢作用，这个过程称为萌发(germination)。自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂在液体中混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。
在现阶段，还没有公开报道有关甲基营养型芽孢杆菌的芽孢萌发剂的文献，也未有在甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂中加入芽孢萌发剂的研究的报道。
另外，由于不同的芽孢杆菌与湿润剂，分散剂等助剂的相容性，载体对各类芽孢杆菌吸附性各不相同，将现有的芽孢杆菌可湿性粉剂的配方或制备工艺无法用于制备含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂；可湿性粉剂中有效菌的吸附量，存活率，对有害菌的防治效果及可湿性粉剂量的稳定性差异较大，其整个可湿性粉剂的制备方法必须全盘考虑各载体吸附能力，对甲基营养型芽孢杆菌的干燥过程中保护作用，湿润剂，分散剂对可湿性粉剂的悬浮率，湿润时间的影响，并且对芽孢萌发剂进行全面的筛选才能够得到湿润时间短，悬浮率高，芽孢保存时间久，使用后芽孢能快速萌发的，防效好的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
发明内容
针对上述现有技术的不足，提供一种含有芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，芽孢萌发剂能使甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂融入水后，甲基营养型芽孢能快速萌发，大大提高甲基营养型芽孢的萌发率，其制备的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂芽孢含量为不低于300亿CFU/克，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85S，细度粉碎过400目筛，水份含量不高于5%，制备方法稳定，且发酵的甲基营养型芽孢杆菌的芽孢含量高达250亿CFU/ml。
为了达到上述目的，一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成：甲基营养型芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：滑石粉20-30份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素0.2-1份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.1-0.5份，2，6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份。
一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成：
一、甲基营养型芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用NA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中NA固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养48小时，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的甲基营养型芽孢杆菌接种于装有120L甲基营养型芽孢杆菌液体培养基的200L种子发酵罐，初始pH值为7.2，温度为30℃，通风1:1，开搅拌，转速为200r/min；从菌种接种后18h时，菌体生长处于指数生长期，转入2000L的发酵罐的发酵培养基中，以70%的罐装量，pH值为7.2，温度为30℃，开搅拌，转速为160r/min，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：1，其后通气量为1：1.2；培养28-36小时，检测其芽孢含量超过250亿CFU/ml，即可结束发酵，作为甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
其中，所述NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖12g/L，豆粕粉15g/L，鱼粉5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，碳酸钙2g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：葡萄糖3g/L，玉米粉22.5g/L，豆粕粉37.8g/L，酵母膏6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将甲基营养型芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：滑石粉20-30份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；混匀后喷雾干燥，得到甲基营养型芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素0.2-1份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.1-0.5份，2，6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份；混匀得到甲基营养型芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的甲基营养型芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量不低于300亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85s，水分含量低于5%，真空包装，即为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的最佳重量份组成为：甲基营养型芽孢杆菌发酵液60份；填料：滑石粉26份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素0.7份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.4份，2，6-吡啶二羧酸钙0.2份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
该甲基营养型芽孢杆菌发酵的各级培养基是经过多年的优化试验得到的，特别是其发酵培养基，是考察了30多种芽孢杆菌培养基成份中筛选出来的，并充分考虑到了各个培养基成份相互影响，采用正交试验进行多次优化培养基与培养条件，优化后发酵甲基营养型芽孢杆菌的浓度超过250亿CFU/ml，远远高于原先甲基营养型芽孢杆菌的培养浓度（90亿CFU/ml），为后面生产出高浓度的可湿性粉剂打下基础。
自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，通常情况下，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。本发明可湿性粉剂中含有芽孢萌发剂：蛋氨酸，2，6-吡啶二羧酸钙是从苷氨酸，L-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸，肌苷，2，6吡啶二羧钙，果糖中进行单因素试验，及两两组合性试验得到的具有明显诱导甲基营养型芽孢萌发的萌发剂。经过试验，本发明的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂与水进行润湿混合均匀，芽孢萌发剂与芽孢充分接触后，从而促使其快速萌发，经过试验，30分钟后，芽孢萌发率已经达到80%以上，而未加芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢在4小时后，其芽孢萌发率只达到了55%左右。
本发明人通过对载体（如膨润土，滑石粉，高岭土，硅藻土，白炭黑，磷矿粉，轻质碳酸钙）、助剂（润湿剂和分散剂）（聚乙烯醇，聚乙二醇，CMC-Na，吐温-60，十二烷基苯磺酸钠，T型木质素，十二烷基硫酸钠，茶皂素，MorwetEFW，MorwetD425，My100，D110，阿拉伯权胶，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐，辛基酚聚氧乙烯醚，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠，甲基纤维素，木质素磺酸钠）填料（硅藻土，高岭土，膨润土，白炭黑，轻质碳酸钙，滑石粉）、紫外线保护剂（抗坏血酸，糊精，十二烷基苯磺酸钠，刚果红，羧甲基纤维素，卵磷脂），干燥保护剂（脱脂奶粉，蔗糖，谷氨酸钠，麦芽糖，甘露糖，甲基纤维素等）进行筛选，其每种助剂对甲基营养型芽孢杆菌的芽孢存活，悬浮性，湿润性进行试验，最后通过多轮单因素与正交试验确定甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的配方。通过验证，本发明的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂在20-25℃下保存一年，其芽孢存活率还可达到245亿CFU/克。
本发明的可湿性粉剂采有真空包装，减少芽孢与空气的接触，降低了其萌发的机率。
本发明的可湿性粉剂的水分含量低于5%，低水分含量的可湿性粉剂中即使含有芽孢萌发剂（蛋氨酸，2，6-吡啶二羧酸钙），对其贮存过程中的芽孢活性也没有明显的影响，没有减少其在贮存过程中的芽孢。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、这是国内首次有针对性的将甲基营养型芽孢杆菌的芽孢萌发剂加入甲基营养型芽孢杆菌可湿剂进行工业化生产，大大提升了芽孢萌发速率与萌发率，解决了因为芽孢萌发慢，萌发率低而导致的防治效果差，效果不稳定的问题，减少了芽孢用量，降低生产成本；
2、通过多次优化发酵培养基与发酵条件，得到了甲基营养型芽孢杆菌芽孢含量高达250亿CFU/ml的发酵液；
3、得到一种含芽孢萌发剂的检测其芽孢含量不低于300亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85s，水分含量低于5%，真空包装的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
具体实施方式
本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。
实施例1
一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成：由甲基营养型芽孢杆菌发酵液60份；填料：滑石粉26份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素0.7份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.4份，2，6-吡啶二羧酸钙0.2份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成：
一、甲基营养型芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用NA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中NA固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养48小时，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的甲基营养型芽孢杆菌接种于装有120L甲基营养型芽孢杆菌液体培养基的200L种子发酵罐，初始pH值为7.2，温度为30℃，通风1:1，开搅拌，转速为200r/min；从菌种接种后18h时，菌体生长处于指数生长期，转入2000L的发酵罐的发酵培养基中，以70%的罐装量，pH值为7.2，温度为30℃，开搅拌，转速为160r/min，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：1，其后通气量为1：1.2；培养28-36小时，检测其芽孢含量为258亿CFU/ml，即结束发酵，作为甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
其中，所述NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖12g/L，豆粕粉15g/L，鱼粉5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，碳酸钙2g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：葡萄糖3g/L，玉米粉22.5g/L，豆粕粉37.8g/L，酵母膏6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将甲基营养型芽孢杆菌发酵液60份；填料：滑石粉26份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份；混匀后喷雾干燥，得到甲基营养型芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素0.7份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.4份，2，6-吡啶二羧酸钙0.2份；混匀得到甲基营养型芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的甲基营养型芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量为320亿cfu/g，悬浮率为92%，润湿时间为66s，水分含量为3.5%，真空包装，即为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
实施例2甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的芽孢萌发试验
向芽孢萌发体系中添加萌发剂后，芽孢开始萌发，体系在600nm的光密度随着萌发率的增大而减小(芽孢折光性高，而萌发后吸光性增强)，当萌发率达到100%时，光密度降低到初始值的50-60%，并且在此范围内光密度的减小量与芽孢萌发率的增加量成反比，即芽孢的萌发率是光密度降低率的2倍。通过测量芽孢体系在600nm光密度的降低率可以计算芽孢的萌发率。
制备的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂与水按1：1000的比例进行润湿混合均匀，30℃下，30分钟后，经过检测，芽孢萌发率已经达到80%，而未加芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢在4小时后，其芽孢萌发率只达到了55%。
实施例3
一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成：由甲基营养型芽孢杆菌发酵液50份；填料：滑石粉22份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠2份；分散剂：茶皂素0.4份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.2份，2，6-吡啶二羧酸钙0.2份；紫外保护剂：抗坏血酸0.8份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖2份，甘露醇0.5份。
一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成：
一、甲基营养型芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用NA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中NA固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养48小时，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的甲基营养型芽孢杆菌接种于装有120L甲基营养型芽孢杆菌液体培养基的200L种子发酵罐，初始pH值为7.2，温度为30℃，通风1:1，开搅拌，转速为200r/min；从菌种接种后18h时，菌体生长处于指数生长期，转入2000L的发酵罐的发酵培养基中，以70%的罐装量，pH值为7.2，温度为30℃，开搅拌，转速为160r/min，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：1，其后通气量为1：1.2；培养30小时，检测其芽孢含量为254亿CFU/ml，即结束发酵，作为甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
其中，所述NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖12g/L，豆粕粉15g/L，鱼粉5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，碳酸钙2g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：葡萄糖3g/L，玉米粉22.5g/L，豆粕粉37.8g/L，酵母膏6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将甲基营养型芽孢杆菌发酵液50份；填料：滑石粉22份；紫外保护剂：抗坏血酸0.8份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖2份，甘露醇0.5份；混匀后喷雾干燥，得到甲基营养型芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：十二烷基苯磺酸钠2份；分散剂：茶皂素0.4份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.2份，2，6-吡啶二羧酸钙0.2份；混匀得到甲基营养型芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的甲基营养型芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量为304亿cfu/g，悬浮率为88%，润湿时间为79s，水分含量为4.5%，真空包装，即为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
实施例4含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂在黄瓜上的应用效果
1．试验地点：辽宁省葫芦岛市绥中县万家镇某农户蔬菜大棚
2．试验方法：分9区，每区67平米，做三个重复；
试验组：移植时将幼苗用200倍含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释液沾根20分种，在定植后10天后，用含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍稀释液灌根1次，在黄瓜生长期间，叶面喷施1：500倍可湿性粉剂，20天1次，连喷3次；
对照组一：移植时将幼苗用200倍未含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂稀释液沾根20分种，在定植后10天后，用未含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍稀释液灌根1次，在黄瓜生长期间，叶面喷施1：500倍未含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，20天1次，连喷3次；
对照组二：用清水喷施与沾根；
3．试验结果：移植后，发现试验组与对照组一沾根了甲基营养型芽孢杆菌的植株叶片比较新鲜，而且生长势好，没有打蔫的了，喷过含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的植株（试验组）比清水组（对照组二）提前一个星期现花；喷过未含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的植株（对照组一）比清水组（对照组二）提前三天现花；在大部分的都开过花后观察发现，发现甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的花开的比喷清水的鲜艳的多，而且花的质量很好，色艳，花大，花看上去就比较“壮”，而且从整个植株的生长来看，生长势明显好于没喷过芽孢杆菌的，期间用过的黄瓜表现为叶色翠绿、植株整齐且土壤表现为疏松，从口感上黄瓜要清脆、香甜。而对照组二（清水组）则叶色黄绿、植株参差不齐。实际测产时，从表1可看出加芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂（试验组）比清水（对照组二）的增产45.33%，未加芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂（对照组一）比清水（对照组二）的增产约18%，从枯萎病的防治情况看，加芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂（试验组）的防治效果达到86.50%，未加芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂（对照组一）的防治效果也达到了61.31%，但较加了芽孢萌发剂的防治效果还是差了25%左右。
表1含芽孢萌发剂的甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂在黄瓜上的应用效果
| 处理 | 产量（kg） | 增产率(%) | 枯萎病病指 | 防效(%) |
| 试验组 | 1510 | 45.33 | 2.89 | 86.50 |
| 对照组一 | 1226 | 18.0 | 8.28 | 61.31 |
| 对照组二 | 1039 | 21.40 |
Claims (3)
1.一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成：由甲基营养型芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：滑石粉20-30份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素0.2-1份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.1-0.5份，2，6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份。
2.根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，由以下几步骤组成：
一、甲基营养型芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用NA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时；在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中NA固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养48小时，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的甲基营养型芽孢杆菌接种于装有120L甲基营养型芽孢杆菌液体培养基的200L种子发酵罐，初始pH值为7.2，温度为30℃，通风1:1，开搅拌，转速为200r/min；从菌种接种后18h时，菌体生长处于指数生长期，转入2000L的发酵罐的发酵培养基中，以70%的罐装量，pH值为7.2，温度为30℃，开搅拌，转速为160r/min，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：1，其后通气量为1：1.2；培养28-36小时，检测其芽孢含量超过250亿CFU/ml，即可结束发酵，作为甲基营养型芽孢杆菌发酵液；
其中，所述NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述甲基营养型芽孢杆菌液体培养基：葡萄糖12g/L，豆粕粉15g/L，鱼粉5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，碳酸钙2g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：葡萄糖3g/L，玉米粉22.5g/L，豆粕粉37.8g/L，酵母膏6g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将甲基营养型芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：滑石粉20-30份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；混匀后喷雾干燥，得到甲基营养型芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：十二烷基苯磺酸钠1-4份；分散剂：茶皂素0.2-1份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.1-0.5份，2，6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份；混匀得到甲基营养型芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的甲基营养型芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量不低于300亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于85s，水分含量低于5%，真空包装，即为甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂。
3.根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征，在于所述甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量分组成：由甲基营养型芽孢杆菌发酵液60份；填料：滑石粉26份；润湿剂：十二烷基苯磺酸钠3份；分散剂：茶皂素0.7份；芽孢萌发剂：蛋氨酸0.4份，2，6-吡啶二羧酸钙0.2份；紫外保护剂：抗坏血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甘露醇0.8份。
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