CN107746817B - 甲基营养型芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用,特别是在水体中解磷的应用。同时对比了甲基营养型芽孢杆菌对有机磷和无机磷降解效果的差别,结果表明,在同一生长环境下,甲基营养型芽孢杆菌对有机磷降解效果要高于无机磷,因此,利用甲基营养型芽孢杆菌的解磷作用进行生物降磷,不产生二次污染,有利于保护环境,进一步实现可持续发展。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域,具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌对水体中磷的降解作用。
背景技术
甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus)是2010年MunusamyMadhaiyan等人报道的新种。甲基营养型芽孢杆菌可以利用甲烷、甲醛等低碳化合物,这类细菌多为杆状,在自然界中分布广泛。
室内活性测定结果表明,甲基营养型芽孢杆菌经培养后产生的物质对植物真菌类病害具有较强的抗菌活性;毒理学研究及环境影响研究证明,其对人畜没有不良影响,无致病性,对环境无害。多年田间试验证明,甲基营养型芽孢杆菌对黄瓜、番茄灰霉、晚疫病、棉花黄枯萎病及苹果树腐烂病等防治效果显著。同时,甲基营养型芽孢杆菌也可作为PGPR促进植物生长,为新型的生物杀菌剂。
磷在促进海洋生物正常生长、维持海洋生态平衡方面发挥了无可替代的作用。但海水中磷过快、过度增长,使水里的含磷量增高,形成富营养化,浮游生物和淡水藻类大量繁殖,水的含氧量下降,水质恶化浑浊,鱼虾难以生存,大量生长的受污染的淡水藻类又产生大量的藻类毒素,这些藻类毒素又是致癌物质,如蓝绿藻类,就有明显的促肝癌作用。
对于已经造成的磷污染,可根据具体情况采用相应的处理措施降低磷的危害,比较有效的方法是生物降磷和湿地降磷,这样不产生二次污染,有利于保护环境。
但甲基营养型芽孢杆菌在生物降磷这一作用并未发现,相关文献也并未涉及报道过。
发明内容
本发明在研究一种甲基营养型芽孢杆菌的功能过程中,意外发现一种甲基营养型芽孢杆菌,其在生物解磷中效果非常显著。
本发明研究的甲基营养型芽孢杆菌为甲基营养型芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus,是从养殖土壤中筛选出来的,于2017年1月16日保藏于中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCC No.13626,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在一种实施方式中,将甲基营养型芽孢杆菌(含菌量为1×106cfu/mL左右)接入灭菌过的含磷培养基中,接种量为2%,置于摇床,30℃,200r/min震荡培养。
在应用时,所述的甲基营养型芽孢杆菌为活菌或死菌,优选活菌,且含菌量为1×106cfu/mL左右。
通过实验发现这种甲基营养型芽孢杆菌具有较好的解磷效果,可以用来生产解磷固钾肥,从而减少化学肥料的使用量;使用后,有效地保护水体中的优势菌群,改善水体微生态环境,降低农药残留。在解磷实验过程中,发现甲基营养型芽孢杆菌对有机磷的解磷效果更佳。因此,利用甲基营养型芽孢杆菌的解磷作用,能够效地保护水体中的优势菌群,改善水体微生态环境,降低农药残留。
附图说明
图1为有机磷培养基;
图2为无机磷培养基;
图3为标准溶液的钼蓝反应;
图4为origin做图的标准曲线;
图5为甲基营养型芽孢杆菌对有机磷和无机磷培养基中溶磷量的影响。
具体实施例
本实验所用的菌种为从养殖土壤中筛选甲基营养型芽孢杆菌,保藏号为CGMCCNo.13626。
该菌株16S rDNA序列如下所示:
GAGTGCGCTGCTATAATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCCGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTCACATGAGG
对该菌株的16S rDNA进行PCR扩增,序列与GenBank数据库中已登录的序列进行同源性比较,该菌株的16S rDNA序列与甲基营养型芽孢杆菌同源性达99%。
实验原理:
钼锑抗分光光度法测定磷,在一定酸度、锑离子存在下,磷酸根与钼酸铵形成锑磷钼混合杂多酸,它在常温下可迅速被抗坏血酸还原为钼蓝,可在波长为700nm下测定吸光度。
实验仪器:
50mL比色管;分光光度计;移液管、容量瓶等。
实验试剂:
1+1硫酸:浓硫酸与蒸馏水的体积比为1∶1混匀
抗坏血酸溶液:100g/L(10%)该溶液贮存在棕色玻璃瓶中,在约4℃保存。如颜色变黄,则弃去重配。
钼酸盐溶液:溶解13g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL水中。溶解0.35g酒石酸锑氧钾[K(SbO)C4H4O6·1/2H2O]于100mL水中。
在不断搅拌下,将钼酸铵溶液徐徐加到300mL 1+1硫酸中,加酒石酸锑氧钾溶液混合均匀,贮存在棕色的玻璃瓶中约4℃保存。
磷酸盐贮备溶液:将优级纯磷酸二氢钾(KH2PO4)于110℃干燥2h,在干燥器中放冷,称取0.2197g溶于水中,移入1000mLmL容量瓶中。加1+1硫酸5mL,用水稀释至标线。此溶液每毫升含50.00μg磷(以P计)。
磷酸盐标准溶液:吸取10.00mL磷酸贮备液于250mL容量瓶,用水稀释至标线,此溶液每毫升含2.00μg磷,临用时现配。
实验步骤:
(1)培养基配制
培养基有两种,有机磷培养基和无机磷培养基:
无机磷培养基配方为:葡萄糖10g,(NH4)2SO4 0.5g,硫酸镁0.3g,氯化钠0.3g,氯化钾0.3g,亚硫酸铁0.03g,硫酸锰0.03g,Ca3(PO4)2 5g,蒸馏水1L,pH7.0。
有机磷培养基配方:以2g卵磷脂(本实验用的是鸡蛋黄)代替Ca3(PO4)2,另外再加CaCO3 5g,其它与无机磷培养基一样。
配制好的培养基分装到500mL锥形瓶中,每瓶装50mL,每种培养基各5瓶。图1为有机磷培养基,图2为无机磷培养基。
(2)标准曲线的绘制
取数支50mL具塞比色管,分别加入磷酸标准液0、0.5mL、1.0mL、3.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL,加水至50mL。向比色管中共加入10%抗坏血酸1mL,混匀。30s后加入钼酸盐溶液2mL,混匀后放置15min。用721分光光度计,于700nm波长,以零度溶液调零,测量吸光度。标准溶液磷含量分别是0、1、2、6、10、20、30μg。
对应的吸光度为0、0.010、0.017、0.084、0.100、0.191、0.290。图3为标准溶液的钼蓝反应,以溶液浓度为横坐标。A700为纵坐标,绘制标准曲线。图4为origin做图的标准曲线。
(3)样品测定
水样预处理:取25.0mL混匀水样于50mL具塞刻度管中,加过硫酸钾溶液4mL,加塞后管口包一小块报纸用线扎紧,以免加热时玻璃塞冲出。高压蒸汽灭菌。(消解作用)
取10mL消解的水样,加入50mL比色管中,用水稀释至标线。以上按绘制标准曲线的步骤进行显色和测量,首先测出空白对照的吸光度,有机磷空白对照为0.301,无机磷的空白对照为1.65。
测出吸光度后减去空白对照的吸光度并从标准曲线上查出含磷量。
注:表1为测出的吸光度减去空白的结果;表2为接种后有机磷培养基和无机磷培养基的溶磷量的变化。
由公式:磷酸盐(P,mg/L)=m/V,
式中m——由校准曲线查得的含磷量,μg;V——水样体积,mL。
表1
表2
由实验结果可知,甲基营养型芽孢杆菌表现出了较强的解磷能力。
在有机磷培养基中,随着培养时间的延长,该菌株的解磷能力表现出先增长,再下降而后趋于稳定的趋势,溶磷量保持在1.122μg/mL左右(图5)。表明该菌株对有机磷在培养的前48h内解磷能力较好,而后期可能由于碳源等营养物质的耗竭、以及菌体生长繁殖受到抑制等,使解磷能力有所降低。
在无磷培养基中,随着培养时间的延长,该菌株的解磷能力表现出波动趋势(图5)。该菌株对无机磷在培养的96h时,解磷能力达到最好,溶磷量为1.122μg/mL,可能由于菌体在无机盐中的解磷能力与培养基的pH和菌体的生长状况有关,使甲基营养型芽孢杆菌对有机磷的解磷能力优于无机磷。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏绿科生物技术有限公司
<120> 甲基营养型芽孢杆菌及其应用
<130> 20170720
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> Bacillus methylotrophicus
<400> 1
gagtgcgctg ctataatgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120
cggggctaat accggatggt tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg 180
ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360
caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420
agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgccgtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600
cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720
cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780
aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840
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gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020
gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200
ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg 1260
ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccttta tggagccagc cgccgaaggt 1440
cacatgagg 1449
Claims (6)
1.一种甲基营养型芽孢杆菌( Bacillus methylotrophicus) ,其特征在于,2017年1月16日保藏于中国科学院微生物研究所,保藏号为CGMCC No .13626。
2.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌( Bacillus methylotrophicus) 在生物解磷中的应用。
3.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌( Bacillus methylotrophicus) 在降解水体中磷的应用。
4.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌( Bacillus methylotrophicus) 在有机磷降解中的应用。
5.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌( Bacillus methylotrophicus) 在制备解磷固钾肥中的应用。
6.根据权利要求2~5任一项所述的应用,其特征在于,在应用时,所述的甲基营养型芽孢杆菌( Bacillus methylotrophicus) 为活菌或死菌。
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