CN104195076A - 一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）三炬-04及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04及其应用，该菌株保藏于保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年5月16日，保藏号为CCTCC No:M2012169。本发明具有很好的防治辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病功效，且较为稳定，无有毒的化学物残留，不污染农产品和环境，性价比高和施用方便的优点。其将在植物的青枯病、炭疽病的防治中发挥重要的作用，应用前景广阔。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04及其应用

技术领域

本发明涉及一株甲基营养型芽孢杆菌与具体应用，特别是涉及一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04菌及其菌剂与该菌剂在防治植物病害中的应用。

背景技术

青枯病是一种广泛分布于热带、亚热带和某些温带地区的世界性病害，是多种农作物减产的主要原因，在我国福建、广东、广西、四川、云南、湖南、江西、浙江、上海、江苏、安徽等省、市(区)都有分布。辣椒的青枯病是辣椒种植过程中最为严重的土传病害之一，由于近几年塑料大棚辣椒春早熟和秋延迟栽培的迅速发展，辣椒青枯病呈逐步上升趋势。春早熟栽培从刚进入盛花结果期(一般在5月上旬)开始发生，秋延迟栽培从10～11月份开始发生。一旦发生，损失严重，常常造成20％～30％的死亡，严重的高达50％以上。秋延迟栽培比春早熟栽培为害更为突出，也是近年来影响辣椒种植的突出问题。

柑桔炭疽病是一种世界性的、为害较重的病害。可引起落叶、枝梢枯死，严重时会造成连片的果园感染，树捎全部枯死，损失惨重，2007年广东的德庆柑橘产区就出现了大面积感染炭疽病，造成严重减产，是一种毁灭性的病害。对于轻微的果实感染会造成果实腐烂及落果，带病果实常在贮运期间发生腐烂，所以又是一种重要的采后病害。柑桔炭疽病对我国的柑橘主产区福建、广东、江西、四川都造成过严重的危害和较大经济损失，对柑橘产业的发展造成严重影响。

对于以上病害传统防治方法大都采用化学农药，然而化学农药效果大都不显著，却同时带来了环境污染、化学残留等副作用，对农产品的质量造成不良影响。对此，具有污染小、而且对人畜毒性小、环境兼容性好、病虫害不易产生抗性等优点的生物修复技术应运而生。生物修复剂是利用微生物本身或其代谢物防治和修复病、虫、杂草等影响的生物制剂，其更符合现代社会对农业生产要求。目前我国在生物修复剂生产始终未能形成规模产业。生物修复剂和生物农药在农药总量中的占有量只为4％左右，与发达国家相比还有较大差距。近年来，我国开发的生物修复剂、生物农药及其它高新技术越来越受到国际生物、农药界的关注。但在品种、剂型、质量和数量方面与发达国家相差甚远，仍远远不能满足国内外市场的需求。发展生物修复剂、生物农药产业对保证农业可持续发展、保障人们的生命与健康、保护生态环境都十分重要，将为我国农产品出口创造十分有利的条件，极大地增强我国农产品的国际竞争力。

发明内容

本发明的目的是提供一株对植物青枯病、炭疽病具有防治作用的甲基营养型芽孢杆菌。该甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169，该菌株已于2012年5月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo.M2012169。

所述的一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCCNo.M2012169，其菌株的16S rRNA基因序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。

本发明的另一目的在于提供所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的用途，其用于防治植物的青枯病或炭疽病。尤其是用于防治辣椒的青枯病或柑橘的炭疽病。

本发明的再一目的在于提供前述的甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法，即将其发酵，制成发酵液使用。

在本发明的较佳实施例中，所述的发酵为液体发酵，以1-10％接种量接种发酵罐，进行好氧深层发酵，发酵温度20-30℃，发酵周期36-45h。

在本发明的较佳实施例中，液体发酵培养基包括：蔗糖0.5-2％、酵母膏0.5-2％、磷酸二氢钾0.05-0.02％、硫酸镁0.01-0.10％、氯化钠0.01-0.10％、碳酸钙0.01-0.10％、pH5-9。

在本发明的较佳实施例中，发酵液再制成液体产品或固体产品使用。

在本发明的较佳实施例中，发酵液中加入稳定剂后，经无菌灌装即为液体产品。

在本发明的较佳实施例中，固态产品为：把发酵液按10-20％的比例喷洒在灭菌后的有机培养基上，混合搅拌均匀，在放置至少10h后包装成袋。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一株对辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病具有较高防治效果的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169及其菌剂。该菌剂具有很好的防治和修复辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病功效，且较为稳定，无有毒的化学物残留，不污染农产品和环境，性价比高和施用方便的优点。本发明将在辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病的防治中发挥重要的作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明菌种的显微照片图(放大1000倍)

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明：

实施例1菌种分离和鉴定

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169菌的分离：采集福建省南靖县和溪镇乐土村六斗山(东经117°1ˊ30"，北纬24°56ˊ20"，海拔360米)的土壤，从该土壤中通过营养琼脂平板分离获得一株甲基营养型芽孢杆菌，命名为三炬-04，已于2012年5月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M2012169。经鉴定，该菌为甲基营养型芽孢杆菌，具有以下特征：单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌，适宜生长温度28～30℃，适宜pH值为5-9。菌种的显微照片见图1。

菌株三炬-04生理生化特性

表型及生理生化特性—酶活、碳源同化

+：阳性反应；.：阴性反应；W:弱阳性反应

生理生化特性一碳源同化

+：阳性反应；.：阴性反应；W:弱阳性反应

菌株三炬-04的16S rRNA基因序列

TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGG

GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC

GGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGC

TTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA

CGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC

TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC

CGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC

GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGG

CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG

CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGGCGTAAAGGGCTCG

CAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTC

ATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGT

AGCGGTGAAATGCGTAGAGATGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCT

AGCGGTGAAATGCGTAGAGAATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCT

CTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA

GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC

CGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTC

GCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA

TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG

ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCAT

GGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC

AACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGG

TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC

CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGA

GGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCG

ACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATA

CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACC

CGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCC

根据上述检测结果，将该菌株鉴定为：

菌株三炬-04：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)

实施例2菌剂制备

(1)培养基：①斜面培养基：蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、土壤浸出液250ml、琼脂18g、蒸馏水750ml、pH7.2-7.5；(土壤浸出液：土壤50g，加水200ml，灭菌1h,过滤补水至250ml。)②液体种子培养基：葡萄糖1.2％、酵母膏0.75％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、碳酸钙0.08％、pH7.2；③液体发酵培养基：蔗糖1.0％、酵母膏0.65％、磷酸二氢钾0.08％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.02％、碳酸钙0.05％、pH7.2。

(2)生产斜面制备：把配制好的斜面培养基在灭菌锅中121℃、25分钟灭菌后，取出斜置冷却至室温，取出保藏斜面，于无菌室中转管，1支保藏斜面转三支生产斜面，接种好的生产斜面置于培养箱中28℃恒温培养2-3天，即可进行生产接种；

(3)液体种子制备：液体种子培养基配制好后分装于1000ml三角瓶中，置于灭菌锅121℃、25分钟灭菌后，冷却至室温，取生产斜面接种于三角瓶中，一支生产斜面接种三个三角瓶，接种后置于摇床中28℃培养30-40h后，为一级成熟种子；即可接种于二级种子培养，接种量为5％，培养温度为28℃，时间28-35h；以5％接种量接种于种子罐，28℃培养24-30h。

(4)液体发酵：以3％接种量接种发酵罐，进行好氧深层发酵，通风量：1∶0.25～0.75(m/m),发酵温度28℃，发酵周期36-45h,发酵结束以显微镜镜鉴芽孢率(90％)来判定发酵周期的结束。

(5)产品：①液体产品：发酵液中加入一定量稳定剂后，无菌灌装成液体产品(500-1000ml/瓶)；②固态产品：在无菌包装车间中，把发教液按15％的比例喷洒在灭菌后的有机培养基(麸皮)上，混合搅拌均匀，24h后包装成袋(20kg/袋)。该两种产品即为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169。

生产的菌剂产品经过长期的实验室实验和田间试验，确定具有防治辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病，促进作物生长增加作物产量等功能。

实施例3对辣椒促生长作用实验

取生长状况，健康程度都一样的辣椒苗60棵，移栽时设三种处理：添加固态菌剂作底肥(一次施用)、液体菌剂兑水400倍灌根(三次施用)和不添加菌剂作底肥以清水为对照，其他的栽培管理措施都一样。30d调查促进辣椒植株生长的效果。

表1菌剂对辣椒生长的影响

项目(处理)	固态菌剂	液体菌剂	Ck(清水)
				单株株高(cm)	79.21	73.58	66.15
单株地上部分鲜重(g)	29.66	28.72	20.60
				单株根鲜重(g)	1.90	1.77	1.02

从表1可以看出菌剂对辣椒植株的生长具有明显的促进作用。

实施例4对辣椒青枯病防治试验

三炬-04菌剂液体：含菌量≥2亿/ml,固态：含菌量≥2亿/克，72％农用硫酸链霉素(华北制药股份有限公司生产)，供试青枯病菌(劳尔氏菌Ralstonia solanacearum)为福建农科院提供，供试辣椒品种明椒3号、中椒11号，供试病菌于LB和NA培养基在往复式摇床93rpm、28度震动培养35-40h。田间小区试验地点选择南靖县龙山镇，试验共设四个处理，分别为固态三炬-04菌剂、液体三炬-04菌剂、72％农用硫酸链霉素(2000倍稀释)和清水对照。试验在辣椒苗移栽时进行：①、固态三炬-04菌剂在移栽时每亩用量100公斤，直接施入穴中后再栽上辣椒苗，本项处理整个过程只一次；②、液体三炬-04菌剂兑水稀释400倍，移栽时当定根水浇灌，后每隔10天浇灌一次连续两次，用量每株10ml，整个过程罐根共计3次；③、72％农用硫酸链霉素兑水稀释2000倍，施用方法与处理2相同；④清水，施用与处理2相同。其他的栽培管理措施都一样，每处理三次重复，每小区22平方米。出现发病后，每10天调查一次各处理区的发病情况，计算发病率，并最终测定各处理区的产量。同时在各处理区随机抽取15株，测其平均株高。

处理后结果分析见表2：用固态三炬-04菌剂处理的效果，略高于液体三炬-04菌剂处理的效果，液体三炬-04菌剂处理效果明显要好于链霉素的效果，说明三炬-04菌剂对辣椒的青枯病的防治有显著的效果。从防治效果看，固态菌剂要优于液体菌剂，从成本角度分析液体菌剂要优于固态菌剂。

表2：三炬-04菌剂对辣椒青枯病抗病防治增产效果

从表2的株高和产量可以看出有用菌剂的辣椒株高明显高于链霉素和对照，产量也分别提高了26.96％、72.22％和18.9％、60.18％，说明菌剂对辣椒抗病增产效果是非常显著的。

实施例5对柑橘炭疽病的防治试验

试验方法：

处理①：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04液体菌剂兑水稀释400倍；

处理②：25％吡唑醚菌酯EC兑水稀释2000倍；

处理③：20％苯醚甲环唑EW兑水稀释4000倍；

处理④：CK清水对照

各取8年生处于盛产期并在上一年度出现过炭疽病危害柑橘6棵作为处理一小区，每个处理设三个重复，共计12小区。从柑橘炭疽病的初发期开始喷药，喷药工具为手摇式喷雾器，喷药的用水量约为每亩400斤(即3000kg/hm2),均匀喷施于柑橘的叶面、叶背、枝干和果实，喷至叶面稍滴水为止，每隔7天喷一次药，连喷3次。

在用药前、第一次用药后7天、14天(第二次用药后7天)和21天(第三次用药后7天)各调查一次，共调查4次。每小区调查3株柑橘树，每株随机抽查10条叶梢，调查新梢全部叶片，每片叶病斑情况和病级，同时观察果实生长情况，记录叶片总数、病叶数，计算病情指数及平均防效，病叶分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；3级：病斑面积占整个叶片面积的6％～15％；5级：病斑面积占整个叶片面积的16％～25％；7级：病斑面积占整个叶片面积的26％～50％；9级：病斑面积占整个叶片面积的51％以上。试验结果见表3。

表3：三炬-04菌剂对柑橘炭疽病的效果

表4：第一次施药后7天防效方差分析

表5：第二次施药后7天防效方差分析

表6：第三次施药后7天防效方差分析

从表3可以看出：

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04液体菌剂兑水稀释400倍平均防效与25％吡唑醚菌酯EC兑水稀释2000倍和20％苯醚甲环唑EW兑水稀释4000倍的平均防效相当，甲基营养型芽孢杆菌的防效略好于2种对照药剂。

从统计分析结果表4、表5、表6可以看出，第一次施药后7天，各药剂处理的显著水平值为0.240，说明各药剂之间无显著性差异。第二次施药后7天和第三次施药后7天，显著水平值分别为0.007和0.005，说明各药剂处理防效之间有显著性差异。

Claims (9)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04，保藏于保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年5月16日，保藏号为CCTCCNo.M2012169。

2.如权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的用途，其特征在于：其用于防治植物的青枯病或炭疽病。

3.如权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的用途，其特征在于：其用于防治辣椒的青枯病或柑橘的炭疽病。

4.如权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法，其特征在于：将其发酵，制成发酵液使用。

5.如权利要求4所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法，其特征在于：所述的发酵为液体发酵，以1-10％接种量接种发酵罐，进行好氧深层发酵，发酵温度20-30℃，发酵周期36-45h。

6.如权利要求4所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法，其特征在于：液体发酵培养基包括：蔗糖0.5-2％、酵母膏0.5-2％、磷酸二氢钾0.05-0.02％、硫酸镁0.01-0.10％、氯化钠0.01-0.10％、碳酸钙0.01-0.10％、pH5-9。

7.如权利要求4所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法，其特征在于：发酵液再制成液体产品或固体产品使用。

8.如权利要求7所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法，其特征在于：发酵液中加入稳定剂后，经无菌灌装即为液体产品。

9.如权利要求7所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法，其特征在于：固态产品为：把发酵液按10-20％的比例喷洒在灭菌后的有机培养基上，混合搅拌均匀，再放置至少10h后包装成袋。