发明内容
本发明的目的是提供一株对植物青枯病、炭疽病具有防治作用的甲基营养型芽孢杆菌。该甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169,该菌株已于2012年5月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCCNo.M2012169。
所述的一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCCNo.M2012169,其菌株的16S rRNA基因序列如序列表中SEQ ID NO1所示。
本发明的另一目的在于提供所述的一种甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的用途,其用于防治植物的青枯病或炭疽病。尤其是用于防治辣椒的青枯病或柑橘的炭疽病。
本发明的再一目的在于提供前述的甲基营养型芽孢杆菌三炬-04的使用方法,即将其发酵,制成发酵液使用。
在本发明的较佳实施例中,所述的发酵为液体发酵,以1-10%接种量接种发酵罐,进行好氧深层发酵,发酵温度20-30℃,发酵周期36-45h。
在本发明的较佳实施例中,液体发酵培养基包括:蔗糖0.5-2%、酵母膏0.5-2%、磷酸二氢钾0.05-0.02%、硫酸镁0.01-0.10%、氯化钠0.01-0.10%、碳酸钙0.01-0.10%、pH5-9。
在本发明的较佳实施例中,发酵液再制成液体产品或固体产品使用。
在本发明的较佳实施例中,发酵液中加入稳定剂后,经无菌灌装即为液体产品。
在本发明的较佳实施例中,固态产品为:把发酵液按10-20%的比例喷洒在灭菌后的有机培养基上,混合搅拌均匀,在放置至少10h后包装成袋。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一株对辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病具有较高防治效果的甲基营养型芽 孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169及其菌剂。该菌剂具有很好的防治和修复辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病功效,且较为稳定,无有毒的化学物残留,不污染农产品和环境,性价比高和施用方便的优点。本发明将在辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病的防治中发挥重要的作用,应用前景广阔。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明:
实施例1菌种分离和鉴定
甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169菌的分离:采集福建省南靖县和溪镇乐土村六斗山(东经117°1ˊ30",北纬24°56ˊ20",海拔360米)的土壤,从该土壤中通过营养琼脂平板分离获得一株甲基营养型芽孢杆菌,命名为三炬-04,已于2012年5月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC No.M2012169。经鉴定,该菌为甲基营养型芽孢杆菌,具有以下特征:单个细胞0.7~0.8×2~3微米,着色均匀。无荚膜,周生鞭毛,能运动。革兰氏阳性菌,芽孢0.6~0.9×1.0~1.5微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色,在液体培养基中生长时,常形成皱醭,需氧菌,适宜生长温度28~30℃,适宜pH值为5-9。菌种的显微照片见图1。
菌株三炬-04生理生化特性
表型及生理生化特性-酶活、碳源同化
+:阳性反应;.:阴性反应;W:弱阳性反应
生理生化特性一碳源同化
+:阳性反应;.:阴性反应;W:弱阳性反应
菌株三炬-04的16S rRNA基因序列
TGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGG
GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC
GGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGC
TTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA
CGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC
TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC
CGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC
GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGG
CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG
CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGGCGTAAAGGGCTCG
CAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTC
ATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGT
AGCGGTGAAATGCGTAGAGATGGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCT
AGCGGTGAAATGCGTAGAGAATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCT
CTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA
GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC
CGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTC
GCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG
ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCAT
GGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGC
AACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGG
TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAC
CTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGA
GGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCG
ACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATA
CGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACC
CGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCC
根据上述检测结果,将该菌株鉴定为:
菌株三炬-04:甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)
实施例2菌剂制备
(1)培养基:①斜面培养基:蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、土壤浸出液250ml、琼脂18g、蒸馏水750ml、pH7.2-7.5;(土壤浸出液:土壤50g,加水200ml,灭菌1h,过滤补水至250ml。)②液体种子培养基:葡萄糖1.2%、酵母膏0.75%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.08%、pH7.2;③液体发酵培养基:蔗糖1.0%、酵母膏0.65%、磷酸二氢钾0.08%、硫酸镁0.05%、氯化钠0.02%、碳酸钙0.05%、pH7.2。
(2)生产斜面制备:把配制好的斜面培养基在灭菌锅中121℃、25分钟灭菌后,取出斜置冷却至室温,取出保藏斜面,于无菌室中转管,1支保藏斜面转三支生产斜面,接种好的生产斜面置于培养箱中28℃恒温培养2-3天,即可进行生产接种;
(3)液体种子制备:液体种子培养基配制好后分装于1000ml三角瓶中,置于灭菌锅121℃、25分钟灭菌后,冷却至室温,取生产斜面接种于三角瓶中,一支生产斜面接种三个三角瓶,接种后置于摇床中28℃培养30-40h后,为一级成熟种子;即可接种于二级种子培养,接种量为5%,培养温度为28℃,时间28-35h;以5%接种量接种于种子罐,28℃培养24-30h。
(4)液体发酵:以3%接种量接种发酵罐,进行好氧深层发酵,通风量:1∶0.25~0.75(m/m),发酵温度28℃,发酵周期36-45h,发酵结束以显微镜镜鉴芽孢率(90%)来判定发酵周期的结束。
(5)产品:①液体产品:发酵液中加入一定量稳定剂后,无菌灌装成液体产品(500-1000ml/瓶);②固态产品:在无菌包装车间中,把发教液按15%的比例喷洒在灭菌后的有机培养基(麸皮)上,混合搅拌均匀,24h后包装成袋(20kg/袋)。该两种产品即 为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04CCTCC No.M2012169。
生产的菌剂产品经过长期的实验室实验和田间试验,确定具有防治辣椒的青枯病、柑橘的炭疽病,促进作物生长增加作物产量等功能。
实施例3对辣椒促生长作用实验
取生长状况,健康程度都一样的辣椒苗60棵,移栽时设三种处理:添加固态菌剂作底肥(一次施用)、液体菌剂兑水400倍灌根(三次施用)和不添加菌剂作底肥以清水为对照,其他的栽培管理措施都一样。30d调查促进辣椒植株生长的效果。
表1菌剂对辣椒生长的影响
项目(处理) |
固态菌剂 |
液体菌剂 |
Ck(清水) |
单株株高(cm) |
79.21 |
73.58 |
66.15 |
单株地上部分鲜重(g)
|
29.66 |
28.72 |
20.60 |
单株根鲜重(g) |
1.90 |
1.77 |
1.02 |
从表1可以看出菌剂对辣椒植株的生长具有明显的促进作用。
实施例4对辣椒青枯病防治试验
三炬-04菌剂液体:含菌量≥2亿/ml,固态:含菌量≥2亿/克,72%农用硫酸链霉素(华北制药股份有限公司生产),供试青枯病菌(劳尔氏菌Ralstonia solanacearum)为福建农科院提供,供试辣椒品种明椒3号、中椒11号,供试病菌于LB和NA培养基在往复式摇床93rpm、28度震动培养35-40h。田间小区试验地点选择南靖县龙山镇,试验共设四个处理,分别为固态三炬-04菌剂、液体三炬-04菌剂、72%农用硫酸链霉素(2000倍稀释)和清水对照。试验在辣椒苗移栽时进行:①、固态三炬-04菌剂在移栽时每亩用量100公斤,直接施入穴中后再栽上辣椒苗,本项处理整个过程只一次;②、液体三炬-04菌剂兑水稀释400倍,移栽时当定根水浇灌,后每隔10天浇灌一次连续两次,用量每株10ml,整个过程罐根共计3次;③、72%农用硫酸链霉素兑水稀释2000倍,施用方法与处理2相同;④清水,施用与处理2相同。其他的栽培管理措施都一样,每处理三次重复, 每小区22平方米。出现发病后,每10天调查一次各处理区的发病情况,计算发病率,并最终测定各处理区的产量。同时在各处理区随机抽取15株,测其平均株高。
处理后结果分析见表2:用固态三炬-04菌剂处理的效果,略高于液体三炬-04菌剂处理的效果,液体三炬-04菌剂处理效果明显要好于链霉素的效果,说明三炬-04菌剂对辣椒的青枯病的防治有显著的效果。从防治效果看,固态菌剂要优于液体菌剂,从成本角度分析液体菌剂要优于固态菌剂。
表2:三炬-04菌剂对辣椒青枯病抗病防治增产效果
从表2的株高和产量可以看出有用菌剂的辣椒株高明显高于链霉素和对照,产量也分别提高了26.96%、72.22%和18.9%、60.18%,说明菌剂对辣椒抗病增产效果是非常显著的。
实施例5对柑橘炭疽病的防治试验
试验方法:
处理①:甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04液体菌剂兑水稀释400倍;
处理②:25%吡唑醚菌酯EC兑水稀释2000倍;
处理③:20%苯醚甲环唑EW兑水稀释4000倍;
处理④:CK清水对照
各取8年生处于盛产期并在上一年度出现过炭疽病危害柑橘6棵作为处理一小区,每个处理设三个重复,共计12小区。从柑橘炭疽病的初发期开始喷药,喷药工具为手摇式喷雾器,喷药的用水量约为每亩400斤(即3000kg/hm2),均匀喷施于柑橘的叶面、叶背、枝干和果实,喷至叶面稍滴水为止,每隔7天喷一次药,连喷3次。
在用药前、第一次用药后7天、14天(第二次用药后7天)和21天(第三次用药后7天)各调查一次,共调查4次。每小区调查3株柑橘树,每株随机抽查10条叶梢,调查新梢全部叶片,每片叶病斑情况和病级,同时观察果实生长情况,记录叶片总数、病叶数,计算病情指数及平均防效,病叶分级标准:0级:无病斑;1级:病斑面积占整个叶片面积的5%以下;3级:病斑面积占整个叶片面积的6%~15%;5级:病斑面积占整个叶片面积的16%~25%;7级:病斑面积占整个叶片面积的26%~50%;9级:病斑面积占整个叶片面积的51%以上。试验结果见表3。
表3:三炬-04菌剂对柑橘炭疽病的效果
表4:第一次施药后7天防效方差分析
表5:第二次施药后7天防效方差分析
表6:第三次施药后7天防效方差分析
从表3可以看出:
甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)三炬-04液体菌剂兑水稀释400倍平均防效与25%吡唑醚菌酯EC兑水稀释2000倍和20%苯醚甲环唑EW兑水稀释4000倍的平均防效相当,甲基营养型芽孢杆菌的防效略好于2种对照药剂。
从统计分析结果表4、表5、表6可以看出,第一次施药后7天,各药剂处理的显著水平值为0.240,说明各药剂之间无显著性差异。第二次施药后7天和第三次施药后7天,显著水平值分别为0.007和0.005,说明各药剂处理防效之间有显著性差异。