CN106686983A - 甲基营养型芽孢杆菌作为植物生长刺激剂和生物控制要素的应用、以及该物种的分离物 - Google Patents

甲基营养型芽孢杆菌作为植物生长刺激剂和生物控制要素的应用、以及该物种的分离物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物作为植物生长刺激剂和用于对细菌、昆虫、真菌和植物病原线虫进行生物控制的应用。更具体地，本发明涉及芽孢杆菌属微生物、更具体为甲基营养型芽孢杆菌物种及其培养物作为植物生长刺激剂和用于对细菌、昆虫、真菌和植物病原线虫进行生物控制的应用、包含这些细菌的组合物、不同培养方法以及包含其的产品。

Description

甲基营养型芽孢杆菌作为植物生长刺激剂和生物控制要素的 应用、以及该物种的分离物
技术领域
本发明的主要应用在农业方面。本发明的细菌以及由所述细菌产生的产物可用作植物生长刺激剂以及用于控制诸如细菌、昆虫、真菌和线虫等植物病原体。
背景技术
1.植物病原生物体
植物病原生物体是植物的疾病的重要成因；其决定着植物的形状、功能或完整性的变化并可导致植物死亡。线虫、细菌、昆虫、真菌和病毒被包括在这类植物病原生物体中。
最重要的一类是植物病原真菌，其特别包括以下属的物种：葡萄孢属(Botrytis)、腐霉属(Pythium)、链格孢属(Alternaria)、镰孢菌属(Fusarium)、疫霉属(Phytophthora)、丝核菌属(Rhizoctonia)、刺盘孢属(Colleotrichium)、弯孢壳属(Eutypa)、根霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、核盘菌属(Sclerotinia)和轮枝孢属(Verticillium)。其会导致如叶斑、组织增生或黑穗病等局部损伤或者当其影响根或维管系统时导致广泛损伤，使得植物枯萎和死亡。存在超过8000种侵袭植物的物种，其中一些极具特异性，而另外一些则具有广泛的宿主。这些生物体所造成的经济影响极为重大。举例而言，当灰葡萄孢(Botrytis cinnerea)影响葡萄园时，在酿酒工业中会产生上千吨废物。
由细菌所导致的植物疾病比由真菌或病毒所致的植物疾病的发生率更低(Vidhyasekaran 2002)。植物病原细菌包括：解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)，其导致称作火疫病的疾病，特别是影响梨树、苹果树、欧楂树、柑橘树和观赏蔷薇科；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Pectobacterium carotovorum)，软腐病元凶；青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，其导致种植茄科以及超过50个科的植物的腐烂和枯萎；不同的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)致病变种，其导致斑点、灼伤和溃烂；根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，一种导致在珠托(collar)、根部和较不常见在茎部的肿瘤的细菌，并且具有包括超过700个物种在内的宽客体谱；和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，其特别是导致植物中的斑点和灼伤。
线虫在农业中也极为重要。其是尺寸为0.2mm至1mm的微型虫，在其上部具有刺用于从植物进食。幼虫从植物与潮湿土壤接触的任何部分进入，但主要通过吸收根毛的尖端进入，因其刺不够有力。一旦其驻留于组织中，其既不移动也不改变位置。症状表现为出现典型根瘤或根部变粗。这种损伤导致维管阻塞并阻止通过根的吸收，这转化为植物发育缓慢以及枯萎、缺绿症和生长遏制的症状。植物病原线虫包括根结线虫属、孢囊线虫属、穿孔线虫属和根腐线虫属的物种。
昆虫害虫也是植物中的重要问题。在某些情况下，其是细菌和/或病毒感染载体。在其它情况下，其可能令植物虚弱，甚至中断其生长和发育，而控制或消除昆虫害虫极为复杂。在钻孔甲虫的情形中即是如此，其割透树皮而到达下方以筑成其通道，雌虫在通道内产卵；或橄榄蓟马，其通过食取芽、叶、花、果实和嫩苗而吸取植物的汁液，同时将毒素注入植物，阻断其生长并使受影响的器官变形。另一个实例是粉虱，其吸取汁液直至叶开始显示出黄色斑驳斑点并最终干枯。此外，这种昆虫制造的分泌物有利于真菌增殖。导致植物损伤的主要昆虫的其它实例有蚜虫、切叶蚁、介壳虫、锯蝇、天竺葵蛾(geranium bronzes)、花金龟子等。
2.植物病原体控制
为了控制上述植物病原体并增加作物产率，通常使用化学品，这些化学品在某些情况中具有高的关联毒性，这对环境造成负面影响。水和土壤均受到污染；如授粉昆虫等作为农业根本的生命体受到毁灭，且动物和人类健康受到影响。2009年10月21日的欧洲议会和理事会的2009/128/EC指令确立了实现所述化合物的可持续利用的行动框架并强调了开始增加农业生产力和资源效率的生态学可持续创新行动的优先区域。
化学品在农业中的无差别使用的替代方案是使用有益微生物，包括真菌和细菌。这是一种可显著减少使病原体变得具有抗性的风险的非污染性的环境友好型方法。
2.1植物促生根际细菌(PGPR)
根际细菌(rhizobacteria)是土壤中生长于根部附近的微生物，其还广泛用于生物控制。由于这些细菌在自然中最常见于根际，其通常不会损害其它有益生物体，而且在许多情况下其通过刺激植物生长并使农业生产更为可持续而有益于生态系统。反过来，其对人类健康的影响极小或没有影响。这些也称为植物促生根际细菌或PGPR的微生物拓殖于植物根部，与植物病原体竞争并对其进行控制，并充当肥料。
PGPR的特征在于其通过直接或间接机制刺激植物生长的能力。直接刺激包括：固氮(Sessitsch等，2002)；激素生成，例如增加根的伸长、分生和尺寸的生长素、赤霉素和细胞分裂素(Perrine等，2004；García de Salamone等，2001)；磷酸盐溶解(Rodríguez和Fraga,1999)；和嗜铁素分泌(Carson等，2000)等。间接植物生长刺激包括涉及对植物病原生物体(细菌、真菌和线虫等)进行生物控制的各种机制，包括：竞争生态位或基质；生成水解性酶(蛋白酶、脂酶、几丁质酶、胶原蛋白酶和葡聚糖酶)；生成抗生素(Hassan等，1997；Essalmani和Lahlou,2003)；根部拓殖，将其转化为减慢线虫侵袭的“生物壳罩”(Rodríguez-Kábana 1997；Loeppler 1997)；根渗出物改性，使其更不吸引线虫(Oostendorp和Sikora,1990)；产生嗜铁素以及由某些PGPR产生挥发性化合物(例如，乙偶姻和2,3-丁二醇)，这导致植物对感染的抗性增加(也称为诱导系统抗性或ISR)(Choudhary和Johri2009)；以及产生阻止线虫发育的H2S(Mena 2004和2005)。
通过所有上述机制，在土壤中给定的浓度(要求至少106个微生物/ml)下，PGPR不仅充当植物生长刺激剂(植物强化剂或植物肥料)，还充当生物控制剂，从而防止植物病原细菌、真菌和线虫的发展。
在最广泛使用的PGPR细菌中有节杆菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)和沙雷氏菌属(Serratia)等属的物种(Kloepper等2004)。其它诸如微变冢村氏菌(Tsukamurelia paurometabola)等也得以使用，例如在生物杀线虫剂中，其可有效控制根结线虫属(Meloidogyne)物种、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和根腐线虫属(Pratylenchus)物种。其作用模式与释放硫化氢和几丁质酶有关(Mena 2004和2005)。
2.1.1芽孢杆菌属的细菌
农业中在控制病原体方面或作为PGPR最为广泛使用的细菌之一是芽孢杆菌属的细菌。
来自该属的细菌具有许多上述特性，且另一方面孢子形成提供了该属在商业制备物中的长期生活力，这不同于如假单胞菌属、根瘤菌属或沙雷氏菌属等其它根际细菌。
市场上存在芽孢杆菌属的各种商业产品。这包括特别是：
描述芽孢杆菌属的微生物在生物控制中的应用的其它专利/专利申请有：
·贝莱斯芽孢杆菌菌株作为生物杀真菌剂(US 2010/0179060A1)
·短小芽孢杆菌菌株作为杀线虫剂(WO 2013/067275)
·短小芽孢杆菌菌株作为杀昆虫剂(WO2010146204)
·苏云金芽孢杆菌菌株作为杀线虫剂(WO 2010/078708A1,US 6077506)
·苏云金芽孢杆菌菌株、其基因和毒素作为杀线虫剂(EP 0853671)
·枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和玫红掷孢酵母的三种菌株用于控制植物病原体(WO 2004/024865A2)
·具有杀真菌和杀细菌效果的芽孢杆菌属和副短短芽孢杆菌的几种菌株(WO2010/142055)
在以下专利/专利申请中描述了用作PGPR或用于生物控制的其它细菌：
·沙雷氏菌属菌株用于控制病原体(CA2822178A1).
·苏云金芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌和固氮螺菌的三种菌株作为植物生长刺激剂和生物杀线虫剂(WO2011121408A1)
·含有不同假单胞菌属菌株的制备物作为植物生长刺激剂及生物控制剂(US6048713A)
·食酸戴尔福特菌的硫氧化性和植物生长促进性培养物(US20080242543A1)
·促进植物生长的根瘤菌(WO2003089640A2)
·Shan等(Crop Protection 44(2013),29-37)描述了甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)菌株BC79对水稻疾病(也称作稻瘟病，由真菌稻瘟病菌导致)进行生物控制方面的应用。
·Madhaiyan等(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2010),60,2490-2495)描述了分离自水稻根际的甲基营养型芽孢杆菌物种。
·Khusro等(Indian Journal of Research(2013)，第2卷，第11期，第243-244页)描述了用于增加抗微生物代谢物生产的新型甲基营养型芽孢杆菌菌株的改进。
虽然对发展植物生长刺激策略和/或对细菌、真菌和/或植物病原线虫进行生物控制的策略有诸多尝试，迄今仍迫切需要发展现存的那些策略的替代策略或更好的策略，这些策略能够刺激植物生长和/或在生物学上控制诸如细菌、真菌和/或线虫等植物病原体的存在。
发明内容
本发明涉及微生物作为植物生长刺激剂和/或用于对植物病原细菌、昆虫、真菌和/或线虫进行生物控制的应用。更具体地，本发明涉及作为植物生长刺激剂和/或用于对如细菌、昆虫、真菌和/或线虫等植物病原体进行生物控制的物种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的微生物的应用、对于所述微生物的不同培养方法以及包含其的产品。优选地，本发明涉及用于对如细菌、昆虫、线虫和植物病原真菌等植物病原体进行生物控制的物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物的应用、不同培养方法以及包含其的产品。
在特定实施方式中，本发明涉及作为植物生长刺激剂和用于对如植物病原细菌、昆虫、真菌和/或线虫等植物病原体进行生物控制的物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物的应用、对于所述微生物的不同培养方法以及包含其的产品。优选地，本发明涉及用于对如植物病原细菌、植物病原线虫、植物病原昆虫和植物病原真菌(除属于物种稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的真菌以外)进行生物控制的物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物的应用、不同培养方法以及包含其的产品。
优选地，本发明涉及用于对以下细菌、昆虫、真菌和/或线虫进行生物控制的物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物的应用、不同培养方法和包含其的产品：所述细菌例如为属于物种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的那些细菌；所述真菌例如粉孢子(oidium)、葡萄孢属(Botrytis)，或属于物种链格孢菌(Alternaria alternata)、黑曲霉(Aspergillusniger)、灰葡萄孢(Botrytis cynerea)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi)、米根霉(Rhizopusoryzae)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Thanatephoruscucumeris)和棉花黄萎病菌(Verticillium dahlia)的那些真菌；所述昆虫例如粉虱和蚜虫；所述线虫例如属于根结线虫属(Meloidogyne)、孢囊线虫属(Heterodera)、黄金线虫属(Globodera)、根腐线虫属(Pratylenchus)、针线虫属(Paratylenchus)、短体线虫属(Ratylenchus)、剑线虫属(Xiphinema)、毛刺线虫属(Trichodorus)的物种，以及大致所有寄生植物线虫。
本发明的另一个目的涉及属于甲基营养型芽孢杆菌菌株XT1(保藏号CECT8661)的微生物，该菌株由格拉纳达大学于2014年4月23日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT—Spanish Type Culture Collection)，和/或与菌株XT1具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT1具有高度同源性的微生物的16SrRNA基因DNA序列与菌株XT1的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性；和/或属于甲基营养型芽孢杆菌菌株XT2(保藏号CECT8662)的微生物，该菌株由格拉纳达大学于2014年4月23日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)，和/或与菌株XT2具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT2具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列与菌株XT2的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。
本发明的另一个目的在于包含以下微生物或由其组成的细菌培养物：属于甲基营养型芽孢杆菌菌株XT1的微生物和/或与菌株XT1具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT1具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列与菌株XT1的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性；和/或属于甲基营养型芽孢杆菌菌株XT2的微生物和/或与菌株XT2具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT2具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列与菌株XT2的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。
本发明的另一个目的涉及包含以下微生物的组合物：属于甲基营养型芽孢杆菌菌株XT1的微生物和/或与菌株XT1具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT1具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列与菌株XT1的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性；和/或属于甲基营养型芽孢杆菌菌株XT2的微生物和/或与菌株XT2具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT2具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列与菌株XT2的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。
本发明的另一个目的涉及如上所述的细菌、培养物和/或组合物在用于刺激植物生长的方法和/或用于对植物病原生物体进行生物控制的方法中的应用。
更具体地，本发明的一个目的在于属于菌株XT1或XT2的细菌(或如上所述与这些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培养物或组合物、以及包含其中之一的产品或可以从它们或从其培养物获得的产品作为植物生长刺激剂和/或在对诸如细菌、昆虫、真菌和/或线虫的植物病原体进行生物控制中的应用。
更具体地，本发明的一个目的在于属于菌株XT1或XT2的细菌(或如上所述与这些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培养物或组合物、以及包含其中之一的产品或可以从它们或从其培养物获得的产品作为植物生长刺激剂和/或在对诸如真菌(除属于物种稻瘟病菌的真菌以外)和/或线虫等植物病原体进行生物控制中的应用。
优选地，属于菌株XT1或XT2的细菌(或与这些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培养物或组合物、以及包含其中之一的产品或可以从它们或从其培养物获得的产品被用作植物生长刺激剂和/或用于对植物病原体进行生物控制，所述植物病原体选自包括以下物种或由其组成的列表：
属于物种根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌的细菌；属于物种链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌的真菌；属于蚜科的昆虫，以及属于通常称为粉虱的物种的昆虫；和/或线虫，例如属于根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属和/或毛刺线虫属的那些。
优选地，属于菌株XT1或XT2的细菌(或如上所述与这些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培养物或组合物、以及包含其中之一的产品或可以从它们或从其培养物获得的产品被用作植物生长刺激剂和/或用于对线虫进行生物控制，所述线虫优选为属于以下属之一的线虫：根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属和/或毛刺线虫属。
优选地，属于菌株XT1或XT2的细菌(或如上所述与这些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培养物或组合物、以及包含其中之一的产品或可以从它们或从其培养物获得的产品被用作植物生长刺激剂和/或用于对根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌进行生物控制。
优选地，属于菌株XT1或XT2的细菌(或如上所述与这些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培养物或组合物、以及包含其中之一的产品或可以从它们或从其培养物获得的产品被用作植物生长刺激剂和/或用于对真菌进行生物控制，所述真菌属于以下物种：链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌；进而更优选对灰葡萄孢进行生物控制。
优选地，属于菌株XT1或XT2的细菌(或如上所述与这些菌株具有高度同源性的那些微生物)、包含其的培养物或组合物、以及包含其中之一的产品或可以从它们或从其培养物获得的产品被用作植物生长刺激剂和/或用于对以下物种进行生物控制：属于蚜科的昆虫以及属于通常称为“粉虱”的物种的昆虫，更具体地为主要存在于温室中的物种温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)。
本发明的另一个目的涉及用于刺激植物生长的方法，其包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及用于刺激植物生长的方法，其包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及用于对植物病原生物体进行生物控制的方法，其包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及用于对植物病原真菌进行生物控制的方法，所述植物病原真菌属于物种链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌，优选属于物种灰葡萄孢，所述方法包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及用于对植物病原细菌进行生物控制的方法，所述植物病原细菌属于物种根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌，所述方法包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的一个目的涉及用于对植物病原线虫(例如，根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属和/或毛刺线虫属物种)进行生物控制的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及用于对属于蚜科的植物病原昆虫以及属于通常称之为粉虱的物种的昆虫进行生物控制的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明所述的方法还可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的系统。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的滴头。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的自补偿型滴头。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的局部灌溉系统(例如，具有例如旋转或扩散元件的微型喷洒器)。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的喷洒器。
在优选实施方式中，前述方法使用包含甲基营养型芽孢杆菌菌株XT1和/或XT2的细菌、细菌培养物或组合物，所述菌株XT1和XT2分别以保藏号CECT8661和CECT8662保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)。
附图说明
为了对所进行的描述进行补充和有助于改善对根据几个实施方式的本发明的特征和特性的理解，本文以说明性而非限制性的方式展示了以下附图：
图1.XT1和XT2针对葡萄孢菌的抑制区和XT1针对镰孢菌的抑制区。
图2.菌株XT1针对根癌农杆菌的活性。
图3.爪哇根结线虫(M.javanica)在经菌株XT1、XT2和模式菌株处理的番茄植株中的增殖系数。
图4.在经菌株XT1、XT2和模式菌株处理的每个植株中所见的平均线虫数量。
图5.在经菌株XT1、XT2和模式菌株处理的植株中所见的平均线虫数量/g根。
图6.在经菌株XT1处理前受蚜虫影响的油桃树。
图7.于室温在盆中培育50天之后的南瓜植株生长。盆B1和B2接种有菌株XT1，而B3和B4未进行接种因此可以用作对照。
具体实施方式
本发明涉及微生物作为植物生长刺激剂和用于对植物病原细菌、昆虫、真菌和线虫进行生物控制的应用。更具体地，本发明涉及芽孢杆菌属、特别是物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物作为植物生长刺激剂和用于对植物病原细菌、昆虫、真菌和线虫进行生物控制的应用、其培养物、包含这些细菌的组合物、不同的培养方法以及包含这些的产品。优选地，本发明涉及物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物用于对细菌、昆虫、植物病原线虫和真菌进行生物控制的应用、其培养物、包含这些细菌的组合物、不同的培养方法以及包含这些的产品。
优选地，本发明涉及物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物用于对细菌、昆虫、植物病原线虫和真菌(除属于物种稻瘟病菌的真菌以外)进行生物控制的应用、其培养物、包含这些细菌的组合物、不同的培养方法以及包含这些的产品。
优选地，本发明涉及物种甲基营养型芽孢杆菌的微生物用于对以下物种进行生物控制的应用、其培养物、包含这些细菌的组合物、不同的培养方法以及包含这些的产品：属于物种根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌的细菌；属于物种链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌的真菌；属于蚜科的昆虫，以及属于通常称为粉虱的物种的昆虫；和/或线虫，例如，根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属、毛刺线虫属的物种，以及大致所有的寄生植物线虫。
生物控制(biological control或biocontrol)在本发明中定义为控制害虫、疾病和生长不良的方法，其包括使用活生物体以控制另一种生物(植物病原生物体)群体。
在特定实施方式中，本发明涉及属于保藏号为CECT8661的菌株的细菌，该菌株由格拉纳达大学于2014年4月23日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)。在整个说明书中，可以使用术语“菌株XT1”来指代该菌株。
在另一特定实施方式中，本发明涉及属于保藏号为CECT8662的菌株的细菌，该菌株由格拉纳达大学于2014年4月23日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)。在整个说明书中，可以使用术语“菌株XT2”来指代该菌株。
本发明的一个目的涉及属于菌株XT1和/或XT2的细菌在用于对植物病原生物体进行生物控制的方法和/或在刺激植物生长的方法中的应用。
菌株XT1和XT2属于物种甲基营养型芽孢杆菌。该物种由Madhaiyan等在2010年进行过描述。其分离自水稻植株(水稻(Oryza sativa))的根际。从系统发育学角度而言，物种甲基营养型芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌紧密相关，它们均为在农业领域具有各种应用的微生物。这些物种的同一性百分比为98.2％至99.2％。菌株XT1和XT2与甲基营养型芽孢杆菌的模式种的同一性分别为99.5％和99.3％。该结论是在对整个RNA r16S基因(1500pb)测序后得出的。
本发明的菌株XT1和XT2的科学分类如下：界：细菌界/门：厚壁菌门/纲：杆菌纲/目：芽孢杆菌目/科：芽孢杆菌科/属：芽孢杆菌属。
两种菌株均为产孢子的革兰氏阳性杆菌。其尺寸为1.5μm至3.5μm长，0.5μm宽。它们产生具有不规则边界的象牙色菌落。它们是氧化酶阴性且过氧化氢酶阳性。
菌株XT1和XT2具有周生鞭毛，这赋予其高移动性。它们产生生物膜或膜，这使其能够附着于有生命和无生命的基底并充当针对环境中存在的捕食者的保护因素。形成生物膜使得微生物的附着更容易；如果通过滴灌施用，其会附着于根部。如果通过叶面应用来施用，其将保留在叶际。此外，在根部和在叶和茎的生物膜形成均保护植物免受其它生命体的攻击。
因此，鞭毛的存在和生物膜形成为这些细菌(XT1和XT2)带来了在栖所定殖的优势。
菌株XT1和XT2产生椭圆形非变形孢子。在2xSG培养基中，这些细菌在3至5天中产生大于5x 108个孢子/ml。它们耐盐并且可在宽范围的盐浓度(0至12％(w/v))下最优生长。其在20℃至45℃和在pH为5-10时最优生长。它们具有极低养分要求：这些细菌能够以宽范围的有机化合物(例如，柠檬酸盐或蔗糖)作为唯一碳源生长。它们能以硝酸铵作为唯一氮源生长，而不需要存在酵母提取物或复杂氮源。
孢子形成(这使得细菌在不利条件下维持在栖所中)和极低养分要求(这允许制备低成本的培养基)使菌株XT1和XT2从工业角度而言极具吸引力。
菌株XT1和XT2是兼性厌氧生物。它们在氧气存在时有氧呼吸，而在不存在氧气时(例如在根部中或根部附近)进行丁二醇发酵而产生2,3-丁二醇和乙偶姻。它们使用多种糖作为碳源和能量，从所述糖产生酸。这些菌株所用的糖包括甘油、葡萄糖、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维二塘、乳糖和蔗糖。它们还能进行固氮，即在不存在氮源时它们摄取气态氮并将其转化为氨，氨是植物能使用的氮源。它们产生二羟基丙酮和H2S。
菌株XT1和XT2能够合成螯合化合物，例如，摄取Fe3+而将其转化为Fe2+的嗜铁素化合物。铁离子Fe3+在中性pH具有极低溶解性，因此不能为生物体所用。嗜铁素将这些离子溶解为Fe2+络合物，这可以通过主动运输机制而吸收。
菌株XT1和XT2能够产生许多具有高水解能力的胞外酶，其有助于植株对于基质的可及性。在其它效果中，菌株XT1和XT2能够产生水解淀粉的淀粉酶、水解脲而产生铵的脲酶、水解明胶和酪蛋白的蛋白酶、水解Tween 80和卵磷脂的脂酶、水解DNA的DNA酶、水解有机磷酸盐和无机磷酸盐的磷酸酶以及ACC脱氨酶。
菌株XT1和XT2在用于检测嗜铁素的CAS培养基中产生比Botrybel的贝莱斯芽孢杆菌菌株(其用作对照并生成3mm)更大的清除区(分别为7mm和5mm)。两种菌株在无氮固体培养基中均比对照菌株生长得更好(在固体培养基表面观察到更大量的细菌团)，这指示了更高的固氮活性。因此，其作为肥料微生物的活性更高。
菌株XT1和XT2能够形成生物膜。该活性尚未在此前的商业制备物中得以确定。这一能力使得所述细菌更易于附着至植株的根或叶以发挥其植物保护或生长刺激作用。
更具体地，已发现本发明的菌株XT1和/或XT2目标物比Botrybel制备物的菌株具有更高的酶活性，产生更大的淀粉水解(淀粉酶活性，参见图3)、明胶和酪蛋白(蛋白酶活性)、Tween 80和卵磷脂(脂酶活性)的晕圈(halo)以及更高的ACC脱氨酶和磷酸酶活性(利用磷酸酚酞和磷酸钙测定)。在淀粉、酪蛋白和卵磷脂水解的情形中，观察到作为透明区域出现的水解圈；对于明胶，可以观察其液化的出现，即从固态转变为液态；在Tween 80的情形中，存在更不透明的沉淀区域；对于ACC脱氨酶活性，对在具有氨基环丙烷甲酸作为唯一氮源的培养基中的生长进行了研究；最后，在向具有磷酸酚酞的板添加氨时通过出现的粉红色而观察磷酸酶活性，并且在看到具有该化合物的培养基中生长的细菌团周围产生的透明区域时分析磷酸钙溶解。上述活性在使用Botrybel制备物的贝莱斯芽孢杆菌作为对照时进行分析。
作为针对真菌的生物控制剂的活性，确定了菌株XT1和XT2以及模式株甲基营养型芽孢杆菌针对链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌的抑制值。在灰葡萄孢的情形中，生长抑制值极为显著。针对尖孢镰孢菌的活性较低。一般而言，Botrybel的芽孢杆菌菌株具有相对于菌株XT1和XT2以及模式株更低的活性(在某些情形中具有类似的活性)(参见下文实施例2中表1)。
菌株XT1和甲基营养型芽孢杆菌模式株也显示出针对例如根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌等植物病原细菌的活性，而菌株XT2显示出针对黑腐果胶杆菌和野油菜黄单胞菌的活性(参见下文实施例3中表2)。
菌株XT1、XT2和甲基营养型芽孢杆菌模式株显示出针对禾谷缢管蚜的活性(参见表3)，且菌株XT1显示出针对粉虱的活性(参见下文实施例6，b1)。
菌株XT1、XT2和甲基营养型芽孢杆菌模式株显著降低了爪哇根结线虫的增殖系数以及每棵番茄植株的线虫数和每克根的线虫数(参见图3、4和5)；类似地，使用菌株XT1的处理恢复了在温室中培育且受线虫高度感染的荷兰黄瓜植株(参见下文实施例4b)。
菌株XT1和XT2的另一优点在于其对治疗中通常使用的抗微生物剂的高度敏感性。在固体培养基技术中经扩散后，其对萘啶酸(30μg)、阿莫西林(2μg)、阿莫西林-克拉维酸(30μg)、头孢噻吩(30μg)、粘菌素(10μg)、多西环素30μg、红霉素(15μg)、卡那霉素(30μg)、呋喃妥英(300μg)、诺氟沙星(5μg)、新生霉素(30μg)、利福平(30μg)、甲氧苄啶磺胺甲噁唑(1.25μg-23.75μg)和万古霉素(30μg)敏感。因此，它们不会将抗性基因传递给根际的其它微生物群。
菌株XT1、XT2和甲基营养型芽孢杆菌模式株具有用于针对真菌进行生物控制和用作植物生长刺激剂的额外优点，其在于它们易于培养且因此易于达到工业水平。针对出于相同目的描述的其它属的其它细菌菌株的优点在于菌株XT1和XT2的部分上存在孢子，这带来在储存期间和在条件不适于操作所述微生物时的环境中的总产品稳定性。
菌株XT1、XT2和甲基营养型芽孢杆菌模式株产生降低pH的化合物，例如当其在厌氧条件下发酵糖时的2,3-丁二醇和乙偶姻。此外，它们能够固氮，从而产生嗜铁素和水解酶。所有这些特性都是直接植物生长刺激的机制(Sessitsch等，2002；Perrine等，2004；Rodríguez和Fraga,1999；Carson等2000；Essalmani和Lahlou,2003；Choudhary和Johri,2009)。
菌株XT1、XT2和模式株产生不同的脂肽、表面活性剂。这些表面活性剂脂肽中包括表面活性素，这与枯草芽孢杆菌所产生的相似。更具体地，菌株XT1产生的表面活性素在其脂链中不具有12碳(12C)脂肪酸。
在遵循Cooper等1981的方法提取脂肽后，对于菌株XT1和XT2分别获得了0.12g/l和0.10g/l培养物的产率。模式株产生0.6g/l。脂肽生产在商业制备物Botrybel的芽孢杆菌属菌株的情形中未有描述。更具体地，除表面活性素外，本发明的菌株XT1目标物还产生其它表面活性剂脂肽，例如，芬荠素(fengycin)和地衣素。
菌株XT1、XT2和模式株的细胞干重(CDW)分别为2.7g/l、2.5g/l和2.9g/l。在菌株XT1的情形中，临界胶束浓度(CMC)为0.0025％(0.025mg/ml)；采用该值得到的表面张力为29.7mN/m。在由枯草芽孢杆菌产生且由贩售的表面活性素的情形中，在相同CMC下获得的值为26.7mN/m。换言之，菌株XT1产生极为活跃的脂酶表面活性剂，其显示出与市场上可获取的表面活性素相似的活性。
芽孢杆菌属物种产生的许多脂肽显示出抗生素活性，其在细胞膜水平作用于真菌和革兰氏阴性菌，例如，芬荠素、分支杆菌素、伊枯草菌素、芽孢杆菌素(bacillomycin)、表面活性素、抗霉枯草菌素、制真菌素(Volpon等，2000；Yilmaz等2006)。
更具体地，菌株XT1所产生的脂肽是通过亮氨酸或异亮氨酸与环肽结合的13、14和15碳原子脂肪酸的混合物。这些脂肪酸的相对比例分别为1、6.5和5.7。
根据文献(参见现有技术)，酶(葡聚糖酶、蛋白酶、脂酶、磷酸酶和脲酶)以及不同脂肽的产生和SH2的释放是所述菌株在对真菌、细菌、昆虫和线虫进行生物控制方面的作用的原因。
本发明的另一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及刺激植物生长和/或对植物病原线虫(例如根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属、毛刺线虫属的物种，和大致所有寄生植物线虫)进行生物控制的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及刺激植物(优选未受植物病原生物体影响的植物)生长的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将优选未受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的另一个目的涉及刺激植物生长的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
本发明的一个目的涉及对属于蚜科的植物病原昆虫以及属于通常称为粉虱的物种的昆虫进行生物控制的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得如前文所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触。
在本发明的方法中，本发明的细菌、细菌培养物或组合物可以通过叶面应用(例如，借助喷雾和/或滴注)或者通过常规灌溉或通过漫灌等来与植物(受影响的)接触。
本发明所述的方法可以进一步包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的滴头。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的自补偿型滴头。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的局部灌溉系统(例如，微型喷洒器，可选地具有例如旋转或扩散元件)。例如，本发明的方法可以包括使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的喷洒器。
局部灌溉系统可以定义为：为了保持液体以合适且恒定的水平分配至土壤中，以缓慢、局部且均匀的方式在植物根块中逐滴应用所述液体的分配液体(水、肥料、或者在本情形中为本发明的细菌、培养物或组合物)方法。
局部灌溉系统可以包括滴注、渗出和/或微喷洒系统。
本领域技术人员了解局部灌溉系统如何运行以及如何使用它们。
根据本发明的滴头定义为本发明的细菌、培养物或组合物在待处理的植物附近的输送点。本领域技术人员了解滴头如何运行和如何使用。
因此，本发明的另一个目的涉及对植物病原生物体(优选真菌、细菌和线虫)进行生物控制(预防)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将植物与步骤a中所获得的细菌、细菌培养物或组合物接触，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统。
根据本发明，预防是为使风险最小化而提前采取的行为。本发明的预防的目的在于避免发生可能的损害(受植物病原生物体感染)。
因此，本发明的另一个目的涉及对植物病原生物体(优选真菌、细菌、昆虫和线虫)进行生物控制(处理)的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统。
在本发明的上下文中，术语“处理”应理解为其目的在于治愈或减轻(缓和)疾病或症状的手段的集合。
因此，本发明的另一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述植物病原生物体优选为真菌(除属于物种稻瘟病菌的那些)、细菌(优选根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌)、昆虫(优选属于蚜科的植物病原昆虫，以及属于通常称作粉虱的物种的昆虫)和/或线虫(例如，属于根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属、毛刺线虫属的物种，和大致所有寄生植物线虫)，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统。
本发明的另一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述植物病原生物体优选为：真菌(属于物种链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌)、细菌(优选属于物种根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌)和/或线虫(例如，属于根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属、毛刺线虫属的物种，和大致所有寄生植物线虫)，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统。
分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统可以包括局部灌溉系统、滴头、自补偿滴头、微型喷洒器和/或喷洒器。
此外，在本发明的方法中，可以将本发明的细菌、培养物和/或组合物与受影响的植物接触至少一次、优选至少两次、优选至少三次、优选至少四次、优选至少五次、优选至少六次或者更多次。
此外，本发明细菌、培养物和/或组合物的一次应用与下一次应用(如果其用于多于一次的接触或应用)之间的时间间隔为2天、或3天、或5天、或10天、或15天、或20天、或30天。
优选地，本发明的细菌、培养物和/或组合物与受影响的植物接触两次，一次在时间(t)＝0时，另一次在30天后。
优选地，本发明的细菌、培养物和/或组合物与受影响的植物每10天接触一次持续60天，或每天一次持续8-12天。
此外，在本发明的方法中，本发明的具有至少108集落形成单位(CFU)/ml的微生物浓度的培养物和/或组合物以0.5％至5％(v/v)的稀释度使用，例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v)。优选地，在本发明的方法中，本发明的培养物和/或组合物的微生物浓度为1.5％(v/v)的含5x 108CFU/ml的制备物。
因此，本发明的一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述植物病原生物体优选为：真菌(属于物种链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌)、细菌(优选属于物种根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌)和/或线虫(例如，属于根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属、毛刺线虫属的物种)、属于蚜科的昆虫和属于通常称为粉虱的物种的昆虫、以及大致所有寄生植物线虫和昆虫(优选粉虱、蚜虫)，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.借助分配系统和/或滴头和/或局部灌溉系统和/或喷洒器将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，例如至少一次、优选至少两次、优选至少三次、优选至少四次、优选至少五次、优选至少六次或更多次，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统，其中所述培养物或组合物具有至少108集落形成单位(CFU)/ml的微生物浓度，以0.5％至5％(v/v)的稀释度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，优选每10天一次持续60天、或每天一次持续8-12天。
因此，本发明的一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述植物病原生物体优选为属于物种链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌的真菌，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.借助分配系统和/或滴头和/或局部灌溉系统和/或喷洒器将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，例如至少一次、优选至少两次、优选至少三次、优选至少四次、优选至少五次、优选至少六次或更多次，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统，其中所述培养物或组合物具有至少108集落形成单位(CFU)/ml的微生物浓度，以0.5％至5％(v/v)的稀释度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，优选每10天一次持续60天、或每天一次持续8-12天。
因此，本发明的一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述植物病原生物体优选为细菌，优选属于物种根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌的细菌，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.借助分配系统和/或滴头和/或局部灌溉系统和/或喷洒器将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，例如至少一次、优选至少两次、优选至少三次、优选至少四次、优选至少五次、优选至少六次或更多次，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统，其中所述培养物或组合物具有至少108集落形成单位(CFU)/ml的微生物浓度，以0.5％至5％(v/v)的稀释度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，优选每10天一次持续60天、或每天一次持续8-12天。
因此，本发明的一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述植物病原生物体优选为线虫，例如根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属、毛刺线虫属的物种以及大致所有的寄生植物线虫，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.借助分配系统和/或滴头和/或局部灌溉系统和/或喷洒器将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，例如至少一次、优选至少两次、优选至少三次、优选至少四次、优选至少五次、优选至少六次或更多次，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统，其中所述培养物或组合物具有至少108集落形成单位(CFU)/ml的微生物浓度，以0.5％至5％(v/v)的稀释度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，优选每10天一次持续60天、或每天一次持续8-12天。
因此，本发明的一个目的涉及对植物病原生物体进行生物控制的方法，所述植物病原生物体优选为昆虫，例如属于蚜科的物种，以及属于通常称为粉虱的物种的昆虫，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.借助分配系统和/或滴头和/或局部灌溉系统和/或喷洒器将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，例如至少一次、优选至少两次、优选至少三次、优选至少四次、优选至少五次、优选至少六次或更多次，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统，其中所述培养物或组合物具有至少108集落形成单位(CFU)/ml的微生物浓度，以0.5％至5％(v/v)的稀释度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，优选每10天一次持续60天、或每天一次持续8-12天。
因此，本发明的一个目的涉及刺激植物生长的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得本发明所述的细菌、细菌培养物或组合物；和
b.借助分配系统和/或滴头和/或局部灌溉系统和/或喷洒器将植物(其受或未受植物病原体影响)与步骤a中所获得的细菌、培养物或组合物接触，例如至少一次、优选至少两次、优选至少三次、优选至少四次、优选至少五次、优选至少六次或更多次，为此使用分配本发明的细菌、培养物或组合物的分配系统，其中所述培养物或组合物具有至少108集落形成单位(CFU)/ml的微生物浓度，以0.5％至5％(v/v)的稀释度(例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％和/或5％(v/v))使用，优选每10天一次持续60天、每天一次持续8-12天、或者在30天的时段中两次(一次在第0天时间，另一次在第30天时间)。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”及其变体并非意在排除其它技术特征、添加物、成分或步骤。术语“包含”还涵盖术语“由…组成”。对于本领域技术人员而言，本发明的其它目的、优点和特征将部分地从说明书中且部分地通过将本发明投入实施而得出。通过说明方式提供以下实施例，但并非意在限制本发明。
实施例
实施例1.菌株XT1和XT2的分离
本发明的目的物菌株XT1(保藏号CECT8661)于1999年分离自位于Fuente dePiedra,Malaga(西班牙)的Capacete湖附近的土壤的根际的样品。菌株XT2(保藏号CECT8662)于2010年分离自Velez河(Malaga,西班牙)的河口附近的土壤。所用的培养基对于菌株XT1为添加有7.5％海盐的MY培养基(Moraine和Rogovin 1966)，且对于菌株XT2为添加有3％海盐的MY培养基。两种菌株均针对约5000个菌落进行特性选择(借助Jain等1991的方法搜寻具有更高的表面活性剂活性的那些)。
实施例2.菌株XT1、XT2和模式株作为抗真菌剂的应用
通过将菌株XT1、XT2、模式株和Botrybel菌株接种至PDA培养基(马铃薯右旋糖琼脂)中的小范围内来建立抗真菌活性(表1)。然后在相对末端安置约1cm2的具有待测试的真菌的菌丝体的琼脂片，并在25℃温育20天之后，测定真菌菌丝体的最大和最小半径，以计算该真菌的生长减少的百分比。
表1.以nm表示的针对不同真菌的最大和最小抑制值，括号中为菌丝体的减少百分比。ND：未测得
在受测真菌中，针对葡萄孢属实现了最高抑制(菌株XT1和XT2)，而针对镰孢菌属实现了最低抑制(图1)。
还测定了菌株XT1和XT2以及模式株针对酿酒酵母(一种具有巨大工业应用的有益酵母)的抗微生物活性，并在其不存在时进行了观察(即，抑制区为0mm)。
实施例3.菌株XT1、XT2和模式株作为抗细菌剂的应用
通过在具有胰酶解大豆琼脂(TSA)的皮氏培养皿中加入6ml无菌TSA(45℃)覆盖物和1ml处于指数生长期的待分析植物病原菌株的培养物(其浓度根据Mac Farland标准相当于1)来测定抗细菌活性。然后，一旦培养基固化，则将100μl来自培养物的上清液接种至板孔中。在温育24小时后，测定抑制区(表2，图2)。
表2.抗细菌活性。结果以生长抑制mm表示。R：具有抗性
实施例4.菌株XT1、XT2和模式株作为对线虫进行生物控制的试剂的应用
a)在用爪哇根结线虫接种的番茄植株中的测试(图3、4和5)
使用5批番茄植株(Solanum lycopersicum)，每批10株。将3批用选定的菌株(2x108CFU)接种然后用爪哇根结线虫J2(1500)接种。最后，使用具有和不具有线虫的两批作为对照。在50天后，测定每个植株的土壤中和根中的线虫数，并计算增殖系数(Talavera等，2012)。所得结果可见图3、4和5。
观察到所有菌株均使线虫增殖系数、每株的线虫数和每g根的线虫数减少，该减少在菌株XT1和XT2的情形中更为显著。
b)采用菌株XT1在具有每年复发的问题(由于土壤中水分过多、难以生根和根出现高度腐烂以及受线虫感染)的荷兰黄瓜作物中进行温室测试。
使用2000m2的区用于滴灌中的滴注，另一个类似的区用作对照。将7.5l培养物在以10天时间间隔的六次施用中施用(每次施用1250I的具有至少108CFU/ml的培养物)。在对照区和处理区中均维持通常的施肥和植物健康处理。对照区的该处理期间损失的植株数为36，而用菌株XT1处理的植株的损失数为6。生产差异同样显著，在经处理区获得了高出30％的生产。
实施例5.菌株XT1、XT2和模式株作为对昆虫进行生物控制的试剂的应用
a)出于测定死亡百分比的目的，用大麦蚜虫(Rhopalosiphum padi)和小黑花蝽象(Anthocoris nemoralis)进行了实验室实验，在这些昆虫上产生了三种甲基营养型芽孢杆菌的三种菌株的细菌培养物及其表面活性剂。由于第一类昆虫是吸啜昆虫，测试仅局部地进行，而在第二种情况中既在局部进行也通过吞咽进行。
通过局部使用在两类昆虫中分析了具有5x 108CFU/ml的菌株XT1和XT2的细菌培养物及其在蒸馏水中浓度为1/1000的表面活性剂的活性。对于每次处理使用10个个体。在小黑花蝽象的情形中，用移液管在其虫体上应用5μΙ，而用刷以相同量对蚜虫进行浸渍。细菌培养基SG用作对照。获得的结果以48h后的存活百分比表示如下：
表3.通过在大麦蚜虫(Rhopalosiphum padi)和小黑花蝽象中的局部使用的死亡率。结果以个体百分比表示。
同样地对小黑花蝽象通过吞咽分析了具有5x 108CFU/ml的菌株XT1、XT2和甲基营养型芽孢杆菌模式株及三种对应表面活性剂(浓度为在蒸馏水中1/1000)的细菌培养物的活性。使用水和Tween 80(1/1000稀释)作为对照。将不同产物施用在以水(1ml)浸湿的海绵上和通过喷雾(0.25ml)施用在食物(地中海斑螟(Ephestia kuheniella)卵)上以确保其良好覆盖。对每个处理进行四次重复，每次5个个体，每日进行观察持续6日。所获得的以死亡率百分比表示的结果如下表所示：
表4.小黑花蝽象中通过吞咽的死亡率。结果以个体百分比表示。
b)此外，对受绿蚜虫和黑蚜虫高度影响的油桃树(桃种油桃变种(Prunus persicavar.nectarina)，见图6)进行了处理。采用具有5x 108CFU/ml的XT1培养物。具体地，每10天通过叶面应用来施用50ml的所述培养物的5％稀释液。在第二次施用后，群体基本消失，但在某些保持卷曲的叶的末端仍有具有蚜虫的小区域并手动除去。一个月后，害虫得到控制。
c)在用菌株XT1处理的温室番茄培养物中观察到类似的粉虱的消失(参见实施例6b1)。
实施例6.菌株XT1、XT2和模式株作为植物强化剂的应用
a)用菌株XT1、XT2和模式株对辣椒植株(辣椒属)和南瓜植株(南瓜属)的盆测试。
使用移种到直径10cm且高15cm的盆中的16棵来自前述植物中每一种的5cm高的幼苗，并令其暴露于室温(20℃至38℃的温度范围)35天。每48h用相同的水量(约50ml)对所述盆进行灌溉。获得每类植物各4批，每批4盆。每7天在灌溉后向每类植物的3批添加5ml的5x108CFU/ml的芽孢杆菌菌株XT1、菌株XT2和模式株的培养物的1/100稀释液。将每类植物的一批(4盆)用作对照，因此其未进行细菌培养物接种。35天后，切下地上部分并干燥。所得结果见于下表中。
表5.菌株XT1、XT2和模式株的植物强化效果
注：在黄瓜作物中，在对照以及用模式株灌溉的那些植株的情形中存在因天气条件和害虫导致的50％植株损失，在用菌株XT2灌溉的植株中存在25％损失；然而，所有用XT1灌溉的植株保持最佳状况。
b)进而，采用菌株XT1进行以下测试：
b.1.在温室梨果番茄(pear tomato)作物中的测试。
借助喷洒以3种不同剂量的含至少108CFU/ml的培养物肉汤(0.5％、1％和1.5％v/v)通过叶面施用进行处理，并进行两次重复(在时间0和30天后)。每次处理栽植6棵植株。使用未经处理的对照。在研究期间，在温室内并且因此在对照中存在几种病害：粉虱、蚜虫、粉孢子和葡萄孢。在用菌株XT1的培养物处理的区域中损失的植株数少于对照区的损失数，最合适的剂量为1.5％(v/v)剂量。另外，从经处理植株摘取的番茄重量大于对照植株的番茄重量(参见表6)。
表6.在用XT1处理后的两个温室梨果番茄作物区的番茄植株损失和摘取的番茄重量
这些结果显示出施用产品与相对于对照的植株生产增加之间有明显趋势，其可归因于对植株的代谢的刺激效果。此外，经处理的植株显示出粉虱和蚜虫害虫的显著减少并且从葡萄孢和粉孢子的感染中恢复。
b.2.对健康已发育的番茄植株(Solanum lycopersicum)、辣椒植株(辣椒属)、南瓜植株(南瓜属)和黄瓜植株(Cucumis sativus)作物采用菌株XT1进行的更长期盆测试
使用每种前述物种(番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(辣椒属)、南瓜(南瓜属)和黄瓜(Cucumis sativus))的4棵10cm高的幼苗。将其移种到直径10cm且高15cm的盆中并令其暴露于室温(15℃至32℃的温度范围)。用相同的水量(约100ml)对所述盆每48h进行灌溉。每7天在灌溉后向一半的盆添加5ml的芽孢杆菌属菌株XT1的培养物的1/100稀释液。另一半盆用作对照，因此未对其进行接种。50天后，切下地上部分并干燥。同样地，记录叶、花和果实的数量以及其高度。所得结果(平均值)见于下表中。获得了86％的地上植物重量增加、57.6％的叶数量增加以及分别为112.5％和137.5％的果实和花的数量增加(见表7)。此外，经处理的植株的尺寸增加了38.3％。南瓜作物的结果可见图7。
表7.XT1在辣椒、黄瓜、番茄和南瓜植株中的灌溉效果。示出平均值。

Claims (36)

1.甲基营养型芽孢杆菌物种的细菌的应用，其用于对植物病原细菌和/或植物病原线虫和/或植物病原真菌进行生物控制的方法，所述植物病原真菌不属于稻瘟病菌物种。
2.如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌物种的细菌的应用，其用于对植物病原线虫进行生物控制的方法。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述线虫属于根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属和毛刺线虫属。
4.一种属于甲基营养型芽孢杆菌物种的微生物菌株XT1(保藏号CECT8661)，其由格拉纳达大学于2014年4月23日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT—Spanish TypeCulture Collection)、和/或与菌株XT1具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT1具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列与菌株XT1的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。
5.一种属于甲基营养型芽孢杆菌物种的微生物菌株XT2(保藏号CECT8662)，其由格拉纳达大学于2014年4月23日保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT—Spanish TypeCulture Collection)、和/或与菌株XT2具有高度同源性的微生物，其中基于DNA序列的所有核苷酸的同一性，所述与菌株XT2具有高度同源性的微生物的16S rRNA基因DNA序列与菌株XT2的16S rRNA基因DNA序列具有至少99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的同一性。
6.一种微生物培养物，其包含权利要求4或5所述的微生物。
7.如前述权利要求所述的微生物培养物，其由权利要求4或5所述的微生物组成。
8.一种组合物，其包含权利要求4或5所述的微生物。
9.权利要求4或5所述的微生物和/或权利要求6至7中任一项所述的培养物和/或权利要求8所述的组合物在刺激植物生长的方法中的应用。
10.权利要求4或5所述的微生物和/或权利要求6至7中任一项所述的培养物和/或权利要求8所述的组合物在对植物病原生物体进行生物控制的方法中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述植物病原生物体是细菌和/或昆虫和/或真菌和/或线虫。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述植物病原生物体是昆虫。
13.如前述权利要求所述的应用，其特征在于，所述昆虫属于蚜科或通常称为“粉虱”的任何物种。
14.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述植物病原生物体是线虫。
15.如前述权利要求所述的应用，其特征在于，所述线虫属于以下属之一：根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属或毛刺线虫属。
16.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述植物病原生物体是真菌。
17.如前述权利要求所述的应用，其特征在于，所述真菌属于选自由以下组成的列表中的一种或多种物种：链格孢菌、黑曲霉、灰葡萄孢、尖孢镰孢菌、恶疫霉菌、樟疫霉菌、米根霉、核盘菌、水稻纹枯病菌和棉花黄萎病菌。
18.如前述权利要求所述的应用，其特征在于，所述真菌属于灰葡萄孢物种。
19.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述植物病原生物体是细菌。
20.如前述权利要求所述的应用，其特征在于，所述细菌属于以下物种：根癌农杆菌、黑腐果胶杆菌、青枯雷尔氏菌和野油菜黄单胞菌。
21.一种刺激植物生长的方法，其包括以下步骤：
a.获得权利要求1至8中任一项所述的微生物和/或细菌培养物和/或组合物；和
b.将植物与步骤a中所获得的微生物和/或细菌培养物和/或组合物相接触。
22.一种对植物病原生物体进行生物控制的方法，其包括以下步骤：
a.获得权利要求1至8中任一项所述的微生物和/或细菌培养物和/或组合物；和
b.将受植物病原体影响的植物与步骤a中所获得的微生物和/或细菌培养物和/或组合物相接触。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述植物病原生物体是线虫。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述线虫属于以下属之一：根结线虫属、孢囊线虫属、黄金线虫属、根腐线虫属、针线虫属、短体线虫属、剑线虫属或毛刺线虫属。
25.如权利要求21至24中任一项所述的方法，其特征在于，通过叶面应用将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物接触。
26.如前述权利要求所述的方法，其特征在于，借助喷雾和/或滴加将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物接触。
27.如权利要求21至26中任一项所述的方法，其特征在于，借助于使用局部灌溉系统而将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物接触。
28.如前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述局部灌溉系统是微型喷洒器。
29.如权利要求21至26中任一项所述的方法，其特征在于，借助使用喷洒器而将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物接触。
30.如权利要求21至29中任一项所述的方法，其特征在于，通过使用滴头而将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物接触。
31.如权利要求21至29中任一项所述的方法，其特征在于，将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物接触至少两次，一次在t＝0时，而另一次在至少30天之后。
32.如权利要求21至31中任一项所述的方法，其特征在于，权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物具有至少5×108集落形成单位(UFC)/ml的微生物浓度，其以0.5％至5％(v/v)的稀释度使用。
33.如前述权利要求所述的方法，其特征在于，权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物具有1.5％(v/v)的微生物浓度。
34.如权利要求21至33中任一项所述的方法，其特征在于，将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物在6天中接触至少6次。
35.如权利要求21至33中任一项所述的方法，其特征在于，将权利要求1至8中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物在30天中接触至少2次。
36.如权利要求21至33中任一项所述的方法，其特征在于，将权利要求1至7中任一项所述的微生物、细菌培养物和/或组合物与受影响的植物在30天中接触至少2次，一次在时间t＝0时，另一次在时间t＝30天时。
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