CN108409479A - 杀线虫微生物有机肥及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杀线虫微生物有机肥，该微生物有机肥含甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO.10834浓缩菌液、氨基寡糖素、腐殖酸和草炭粉；所述甲基营养型芽孢杆菌浓缩菌液、所述氨基寡糖素、所述腐殖酸和所述草炭粉的重量份配比为：0.1～10：0.01～0.1：5～10：80～94。该微生物有机肥的制备方法为：取细度为0.05～0.2mm草炭粉、腐殖酸和氨基寡糖素，30～50rpm搅拌20～30min；加入甲基营养型芽孢杆菌浓缩物，50～80rpm搅拌20～30min；调pH值为5.5～8.0；在40～50℃条件下，干燥至水分含量为5～10%；利用粉碎机粉碎，过40～60目筛子，得微生物有机肥。将所述的杀线虫微生物有机肥在防治线虫病和作物增产中应用。本发明的微生物有机肥具有药肥双重功效，具有高效、绿色、安全的特点，且抗逆性好，生产成本低廉。

Description

杀线虫微生物有机肥及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及肥料制备技术领域，具体涉及一种杀线虫微生物有机肥及其制备方法和应用。

背景技术

随着我国农业种植结构的调整，蔬菜的栽培面积不断扩大，连作重茬现象普遍，为蔬菜根结线虫的发生和发展提供了有利条件。

根结线虫主要危害蔬菜的侧根和须根，形成大小不同的瘤状根结，根结初期为乳白色，后期变为淡褐色，发病严重时根结相互连接成念珠状，根结呈球形，表面又生成许多须根，该根呈团状，剖开根结可看到白色呈梨形的雌成虫。目前，根结线虫病已经成为威胁我国蔬菜安全生产的主要病害。

小麦孢囊线虫病也是近年来我国发生的一种新的小麦土传病害，病原线虫主要危害小麦的根部，侵入小麦的根系并在其中繁殖形成球瘤状根结，从而抑制植物对营养的吸收，造成小麦地上部分叶片发黄，植株矮化，造成减产，严重威胁着我国小麦的安全生产。

植物寄生线虫每年给我国农作物的安全生产带来严重的经济损失，农业生产上亟需一种安全有效的防控方法。由于化学农药带来的问题日益突出，“十三五”明确提出要减少农药化肥的使用量，因此，开发和推广对生态环境安全友好的生物农药，用于防控植物寄生线虫已经成为一个重要途径。

针对我国植物寄生线虫病害防治及生产中存在的难点，开发高效稳定且能够大规模生产的微生物有机肥是可持续农业发展的迫切需求，是亟待解决的棘手问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种杀线虫微生物有机肥及其制备方法和应用。既能有效抑制蔬菜根结线虫和小麦孢囊线虫的发生，又能促进作物的生长。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种杀线虫微生物有机肥，含甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO. 10834浓缩菌液、氨基寡糖素、腐殖酸和草炭粉；所述甲基营养型芽孢杆菌菌液、所述氨基寡糖素、所述腐殖酸和所述草炭粉的重量份配比为：0.1～10：0.01～0.1：5～10：80～94。

进一步的，所述甲基营养型芽孢杆菌菌液的有效活菌数为1～15亿/克。

进一步的，所述甲基营养型芽孢杆菌菌液的制备方法为：

（1）活化菌株：种将甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO. 10834接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在30℃下，培养32小时；

（2）一级种子培养：将步骤（1）培养的菌种接种至第一液体培养基中，在温度为28～35℃，转速150～210 rpm下，培养6～12小时，得一级种子液；

（3）二级种子培养：将一级种子液接种至含有液体发酵培养基的种子发酵罐中，初始pH值为7.2～7.5，在28～35℃，转速170～220 rpm下，培养6～12小时，得二级种子液；

（4）发酵培养：按体积比为1～5%的接种量将二级种子液接种至含所述液体发酵培养基的发酵罐中，在转速180～240rpm，压力0.06～0.08兆帕下培养32～36小时，得该菌菌悬液；

（5）浓缩菌液。

优选的，所述第一液体培养基配方为：牛肉膏0.5g，蛋白胨1.5g，鱼粉0.3g，氯化钠0.6g，水100ml；所述第一液体培养基的pH值为7.2。

优选的，所述液体发酵培养基配方为：黄豆粉2g，玉米粉0.5g，鱼粉0.3g，碳酸钙0.6g，磷酸二氢钾0.6g，硫酸镁0.06g，水100ml。

设计一种所述的杀线虫微生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：

（1）取细度为0.05～0.2mm草炭粉、氨基寡糖素和腐殖酸，30～50rpm搅拌20～30min；

（2）加入甲基营养型芽孢杆菌浓缩菌液，50～80rpm搅拌20～30min；调pH值为5.5～8.0；

（3）在40～50℃条件下，干燥至水分含量为5～10%；

（4）利用粉碎机粉碎，过40～60目筛子，得微生物有机肥。

所述的杀线虫微生物有机肥在防治蔬菜根结线虫病和小麦孢囊线虫病中的应用。

优选的，在防治蔬菜根结线虫病时的施用方法为：每666.7m²沟施有机肥10～20kg或每株灌根有机肥的50～100倍稀释液100ml。

优选的，在防治小麦孢囊线虫病时的施用方法为：所述微生物有机肥作为基肥，每亩用量20～40kg。

所述的杀线虫微生物有机肥在在番茄、黄瓜和小麦增产中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明微生物有机肥具有药肥双重功效，具有防病促生的作用。既能有效抑制蔬菜根结线虫和小麦孢囊线虫的发生，又能促进作物的生长，提高作物的抗逆性，最终提高农作物的产量。

2.本发明微生物有机肥各组成分协调配合增效，能有效改善土壤根际微生物菌落构成形态，杀灭线虫体，并增加土壤通透性，改善土壤肥力，促进作物的根系生长和营养吸收。

3.本发明微生物有机肥具有高效、绿色、安全的特点，能减少农药化肥的使用，有利于农作物的无公害生产，有利于提升作物的品质。

4.本发明微生物有机肥中各成分兼容协调性好，如，氨基寡糖素、腐殖酸和草炭粉等成分有利保持芽孢杆菌等微生物的增殖和活性，而芽孢杆菌的代谢活动则有利于氨基寡糖素、腐殖酸、草炭粉等物质的有效分解，转化为作物易吸收的有效成分。

5.本发明所选甲基营养型芽孢杆菌能够产生芽孢，抗逆性好，可以在一些极端的环境中长期存活，利于保存，非常适用于微生物菌肥的保存、加工和应用，也有利于其施用后在土壤中快速增殖，从而建立菌群优势。

6.本发明的微生物有机肥生产成本低廉，能够提升农产品国际竞争力，易推广普及。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

微生物菌株为甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO. 10834（参见申请专利文献201511026963.X）。

实施例一：微生物有机肥的制备

1. 甲基营养型芽孢杆菌的培养

（1）将甲基营养型芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在30℃下，培养32h后得到活化菌种；

（2）将活化后的甲基营养型芽孢杆菌接种至第一液体培养基中，在温度为28～35℃，转速150～210 rpm，培养6～12 h，得到一级种子液；

其中，第一液体培养基配方为牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%，鱼粉0.3%，氯化钠0.6%，PH7.2；

（3）将一级种子液接种至含有液体发酵培养基的种子发酵罐中，初始pH值为7.2～7.5，在28～35℃，转速为170～220 rpm条件下，培养6～12小时，制得二级种子液；

其中，液体发酵培养基配方为黄豆粉2%，玉米粉0.5%，鱼粉0.3%，碳酸钙0.6%，磷酸二氢钾0.6%，硫酸镁0.06%；

（4）将二级种子液按照1～5%的接种量接种至含有上述液体发酵培养基的发酵罐中，在转速为180～240rpm，压力为0.06～0.08兆帕的条件下发酵培养32～36小时，得甲基营养型芽孢杆菌的菌悬液并进行浓缩，得到500亿/克的菌体浓缩物；

2. 甲基营养型芽孢杆菌有机肥的制备

取细度为0.05mm的草炭粉、腐殖酸和氨基寡糖素，30 rpm搅拌20min；再加入甲基营养型芽孢杆菌菌液浓缩物，50rpm搅拌20min；pH值为5.5～8.0，其中，草炭粉、腐殖酸、氨基寡糖素、甲基营养型芽孢杆菌浓缩物的重量份配比为：80：10：0. 1：9.9；在40℃条件下，干燥至水分含量为5%；利用平板计数法测定活菌数量，活菌量15亿/克；利用粉碎机粉碎，过40目筛子，即得微生物有机肥。

实施例二：微生物有机肥的制备

与实施例一不同之处在于，取细度为0.1mm的草炭粉、腐殖酸和氨基寡糖素，40rpm搅拌25min；再加入甲基营养型芽孢杆菌菌液浓缩物，65rpm搅拌25min；其中，草炭粉、腐殖酸、氨基寡糖素、甲基营养型芽孢杆菌浓缩物的重量份配比为：88：7：0.06：4.94；在45℃条件下，干燥至水分含量为7%；利用平板计数法测定活菌数量，活菌量6.5亿/克；利用粉碎机粉碎，过50目筛子，即得微生物有机肥。

实施例三：微生物有机肥的制备

与实施例一不同之处在于，取细度为0.2mm的草炭粉、腐殖酸和氨基寡糖素， 50rpm搅拌30min；再加入甲基营养型芽孢杆菌菌液浓缩物，80rpm搅拌30min；其中，草炭粉、腐殖酸、氨基寡糖素、甲基营养型芽孢杆菌浓缩物的重量份配比为：94：5：0. 01：0.99；在50℃条件下，干燥至水分含量为10%；利用平板计数法测定活菌数量，活菌量1亿/克；利用粉碎机粉碎，过60目筛子，即得微生物有机肥。

实施例四：甲基营养型芽孢杆菌对二龄幼虫的致死能力测定

测定甲基营养型芽孢杆菌对南方根结线虫和小麦孢囊线虫的二龄线虫（J2）的致死作用。

具有方法为：将甲基营养型芽孢杆菌的培养液200ul加入50ul线虫液（2000条/ml），同时设空白液体培养基做对照，放入15℃培养箱中，24h和48h后观察线虫的死亡情况，采用NaOH刺激法判断线虫的死活。

表1 发酵液对二龄线虫的校正致死率（%）

。

从表1中可以看出，甲基营养型芽孢杆菌发酵液对南方根结线虫和小麦孢囊线虫具有强烈的抑制作用，其中，处理24 h后对南方根结线虫的校正致死率分别为54%，48h后对南方根结线虫的校正死亡率为83%。甲基营养型芽孢杆菌发酵滤液对小麦孢囊线虫的校正死亡率分别达到62%（24 h）和89%（48 h）。

实施例五：微生物有机肥对蔬菜根结线虫的抑制作用检测

（1）番茄根结线虫

试验地点：河南省现代农业研究开发基地温室大棚，试验地块根结线虫发生较重。番茄品种：金棚秋盛。处理如下：

处理1：实施例二有机肥，移栽时10 kg/亩沟施。

处理2：实施例二有机肥剂量加倍，移栽时20 kg/亩沟施。

处理3：中农绿康防线虫微生态制剂，移栽时6 kg/亩沟施。

处理4：中农绿康防线虫微生态制剂，移栽时12 kg/亩沟施。

处理5：0.5%阿维菌素颗粒剂，移栽时6 kg/亩沟施。

处理6：对照

在番茄植株收割时采用五点取样法取植物根系，每点一株，调查根系发病程度，并根据下列分级标准进行分级，计算防治效果。

分级标准：

0级，根系上无根结；

1级，轻度感染，根结较少，根结率为1%~25%；

3级，根结较多，根结率为25%~50%；

5级，在虫瘤上有再次根结，51%-75%根系有根结；

7级，根结相互连接成根结团块，76%以上根系有根结。

检测结果如表2所示：

表2微生物有机肥对番茄根结线虫的防治效果

。

注：每列数据后不同小写字母表示0.05水平上显著差异；下表同

从表2可以看出，微生物有机肥10 kg/亩沟施处理对番茄根结线虫防治效果达61.8%，微生物有机肥20 kg/亩沟施处理防治效果达67.3%，超过了阿维菌素颗粒剂的65.5%。另外，中农6kg/亩和12 kg/亩沟施处理的防治效果分别为52.7%和60%，次于微生物有机肥对番茄根结线虫的防治效果。

（2）黄瓜根结线虫

试验地点：河南省现代农业研究开发基地温室大棚，试验地块根结线虫发生较重。黄瓜品种：津研1号。处理如下：

处理1：实施例二有机肥，移栽时、移栽后20天、40天用100倍稀释液，100ml/株各灌根一次。

处理2：中农绿康防线虫微生态制剂，移栽时、移栽后20天、40天用50倍稀释液，100ml/株各灌根一次。

处理3：对照。

调查方法同番茄根结线虫。

检测结果如表3所示：

表3 微生物有机肥对黄瓜根结线虫的防治效果

。

从表3可以看出，微生物有机肥灌根处理对黄瓜根结线虫的防治效果达63.9%，超过中农灌根处理的60.7%。

实施例六：微生物有机肥对小麦孢囊线虫的抑制作用

（1）盆栽试验

从许昌地区发生小麦禾谷孢囊线虫病的田块中采集土壤，过筛后与灭菌土按1：0.5混合（25～30个孢囊/100 g），然后将实施例二有机肥和中农绿康防线虫微生态制剂分别按照2%的量与病土混合均匀，每杯装病土200g。供试小麦品种为郑麦366，每纸杯播种6粒，同时设不接菌肥的病土处理为阴性对照， 6次重复，15～20℃温室中培养，90天后，调查发病情况。

将植株从纸杯中取出，并且尽可能保持根系完整。将取出的植株根系用自来水冲洗干净，放在盛有清水的塑料盆中进行调查单株孢囊数，计算孢囊减退率。

孢囊减退率（%）=（对照单株孢囊数－处理单株孢囊数）/对照单株孢囊数×100%

检测结果如表4所示：

表4微生物有机肥对小麦禾谷孢囊线虫病室内防治效果测定

。

结果显示，微生物有机肥处理对小麦禾谷孢囊线虫具有较好的防治效果，孢囊减退率达到44.6%，超过了中农绿康防线虫微生态制剂的41.3%。

（2）田间试验

2016年10月在郑州郊区发生小麦禾谷孢囊线虫病的地块进行生防菌剂的田间防效测定，供试小麦品种为郑麦366，在播种前整地时将微生物有机肥作为基肥撒入地中，然后旋耕，每亩用量20、40kg。重复3 次，共9个小区，随机区组排列。小区面积12m²，播量为12.5kg/亩。在小麦灌浆期调查孢囊形成情况，田间取样方法采取随机三点取样，用小铁铲将植株根系完整挖出，调查单株孢囊量。

检测结果如表5所示：

表5 杀线虫微生物有机肥对小麦禾谷孢囊线虫病田间防治效果测定

。

结果显示，杀线虫微生物有机肥的单株孢囊数都比对照显著减少，其中，杀线虫微生物有机肥20kg/亩撒施的孢囊减退率为35.1%，杀线虫微生物有机肥40kg/亩撒施的孢囊减退率为42.3%。

实施例七：微生物有机肥对农作物生长和产量的影响

（1）对番茄生长和产量的的影响

试验处理与实施例五（1）相同，记录每个处理的番茄整个生育期中的产量，并在植株收割时调查番茄的株高、茎粗和鲜重。利用Microsoft Excel 进行数据分析，利用SPSS软件进行方差分析。

检测结果如表6所示：

表6 微生物有机肥对番茄生长和产量的影响

。

结果表明，经过微生物有机肥处理的番茄的株高、茎粗和鲜重均明显优于对照。其中微生物有机肥20 kg/亩沟施处理对番茄植株的促生作用优于微生物有机肥 10 kg/亩处理，微生物有机肥 10 kg/亩沟施处理的株高、茎粗和鲜重分别比对照增加12.2%、23.2和6.3%，而微生物有机肥 20 kg/亩沟施处理分别比对照增加18.6%、28%和20.3%。微生物有机肥菌肥处理也提高了番茄的产量，其中，微生物有机肥 10 kg/亩沟施处理的产量为5262kg/亩，比对照增加22.4%，微生物有机肥 20 kg/亩沟施处理的产量为5916kg/亩，比对照增加37.6%。

（2）对小麦生长的影响

试验处理与实施例六(1)相同，播种30天后分别测量株高、根长和鲜重。利用MicrosoftExcel 进行数据分析，利用SPSS软件进行方差分析。

检测结果如表7所示：

表7 微生物有机肥对小麦生长的影响

。

结果表明，经过微生物有机肥处理的小麦的株高和根长均明显优于对照，分别比对照增加21.2%和5.2%，鲜重比对照增加12.5%。

上面结合实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims (10)

1.一种杀线虫微生物有机肥，其特征在于，含甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO. 10834菌液、氨基寡糖素、腐殖酸和草炭粉；所述甲基营养型芽孢杆菌浓缩菌液、所述氨基寡糖素、所述腐殖酸和所述草炭粉的重量份配比为：0.1～10：0.01～0.1：5～10：80～94。

2.根据权利要求1所述的杀线虫微生物有机肥，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO. 10834菌液的有效活菌数为1～15亿/克。

3.根据权利要求1所述的杀线虫微生物有机肥，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO. 10834菌液的制备方法为：

（1）活化菌株：将甲基营养型芽孢杆菌CGMCC NO. 10834接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在30℃下，培养32小时；

（2）一级种子培养：将步骤（1）培养的菌种接种至第一液体培养基中，在温度为28～35℃，转速150～210 rpm下，培养6～12小时，得一级种子液；

（3）二级种子培养：将一级种子液接种至含有液体发酵培养基的种子发酵罐中，初始pH值为7.2～7.5，在28～35℃，转速170～220 rpm下，培养6～12小时，得二级种子液；

（4）发酵培养：按体积比为1～5%的接种量将二级种子液接种至含所述液体发酵培养基的发酵罐中，在转速180～240rpm，压力0.06～0.08兆帕下培养32～36小时，得该菌菌悬液；

（5）浓缩菌液至需要的浓度。

4.根据权利要求3所述的杀线虫微生物有机肥，其特征在于，所述第一液体培养基配方为：牛肉膏0.5g、蛋白胨1.5g、鱼粉0.3g、氯化钠0.6g、水100ml；所述第一液体培养基的pH值为7.2。

5.根据权利要求3所述的杀线虫微生物有机肥，其特征在于，所述液体发酵培养基配方为：黄豆粉2g、玉米粉0.5g、鱼粉0.3g、碳酸钙0.6g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.06g、水100ml。

6.一种权利要求1所述的杀线虫微生物有机肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取细度为0.05～0.2mm草炭粉、氨基寡糖素和腐殖酸，以30～50rpm的频率搅拌20～30min；

（2）加入甲基营养型芽孢杆菌浓缩菌液，50～80rpm搅拌20～30min；调pH值为5.5～8.0；

（3）在40～50℃条件下，干燥至水分含量为5～10%；

（4）粉碎，过40～60目筛子，得微生物有机肥。

7.权利要求1所述的杀线虫微生物有机肥在防治蔬菜根结线虫病和小麦孢囊线虫病中的应用。

8.权利要求1所述的杀线虫微生物有机肥在防治蔬菜根结线虫病中的应用，其特征在于，在防治蔬菜根结线虫病时的施用方法为：每666.7m²沟施有机肥10～20kg或每株灌根有机肥的50～100倍稀释液100ml。

9.权利要求1所述的杀线虫微生物有机肥在防治小麦孢囊线虫病中的应用，其特征在于，在防治小麦孢囊线虫病时的施用方法为：所述微生物有机肥作为基肥，每666.7m²用量20～40kg。

10.权利要求1所述的杀线虫微生物有机肥在番茄、黄瓜和小麦增产中的应用。