CN105638740A - 一种根结线虫诱吸剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种根结线虫诱吸剂及其应用，属植物病害防治技术领域。该生物诱吸剂用菌种保藏号为CGMCC？No.11851的Bacillus？methylotrophicus？Mo-TB菌株，经试管斜面种子培养、液体培养、发酵罐大量培养、及诱吸剂的制备步骤得到。所述的生物诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。所述的生物诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配后在防治根结线虫病中的应用。本发明的有益效果在于：1、生物诱吸剂对一平方米内土壤中根结线虫二龄幼虫的诱吸率在80％以上。2、生物诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配使用，提高了防治根结线虫病的效果。3、生物诱吸剂具有成本低、无残留、对人畜安全的特点，能显著提高常规杀线虫农药的防效效果。

Description

一种根结线虫诱吸剂及其应用
技术领域：
本发明涉及一种根结线虫诱吸剂及其应用，属植物病害防治技术领域。
背景技术：
根结线虫(Meloidogynespp.)是多种农作物的重要病原之一。根结线虫在全世界农作物上每年造成的经济损失就高达1000亿美元(Okaetal.,2009)。在国内，近年来随着设施蔬菜栽培面积扩大，连作、设施环境密闭和高温高湿等原因导致根结线虫的危害日益加重，致使蔬菜减产30-50％，严重时甚至绝收(王艳艳等，2014)。在山东寿光的几十万亩大棚番茄种植中，即使施用大剂量的化学杀线剂，根结线虫病株率仍在25％以上，减产约30％。根结线虫的二龄幼虫是侵染作物的唯一虫态，其分泌的蛋白类物质能诱发植物根细胞增生成巨大细胞，进而堵塞植物吸收营养和水分的导管，引起作物生长不良、萎蔫、枯死等症状(卢志军，2012)。
目前防治根结线虫病常用的措施有轮作、化学防治、生物防治和栽培抗病品种等。轮作被广泛应用，但由于根结线虫寄主范围广，一般只有水旱轮作才有一定的效果，但水旱轮作在很多区域无法实施。栽培抗线虫的作物品种是简单有效的措施，遗憾的是现有的各种作物栽培品种中能抗线虫病的少之又少；此外，抗源材料的匮乏加大了选育抗性品种的难度(韩生成等，1999)。利用线虫天敌微生物研发的生物杀线剂，因其对人畜的安全性和环境的友好性一直被寄予很大的期望。目前，利用食线虫真菌(Pochoniachlamydosporia、Paecilomyceslilacinus、Hirsutellaspp.，Arthrobotrysspp.等)和生防细菌(Pasteuriapenetrans、Bacillusthuringiensis、Pseudomonasspp.、Streptomycesavermitilis等)国内外注册登记的商品化线虫生防制剂近20种；但由于防效相对较低和不稳定很难推广应用(Davies&Spiegel，2011)。化学防治是目前防治根结线虫的主要措施。但随着溴甲烷的禁用(Ristaino&Thomas,1998)，以及涕灭威、灭线磷、呋喃丹、威百亩等化学杀线虫剂高毒高残等弊端的显现，目前农业上兼顾防效和安全性的化学杀线剂仅有噻唑膦、阿维菌素等为数不多的几个产品。
根结线虫在土壤中呈无规律的不均匀分布，这给防治带来了极大的困难。常用的生物杀线剂、化学杀线剂的用量一般为2-3公斤/亩。若采用穴施于根部的方法，一旦过了药剂的持效期，根部之外的线虫仍可侵染作物造成损失；若采用撒施混土的方法，药剂给过度稀释，很难保证良好的防治效果。
嗅觉趋化性(Olfactorychemotaxis)是线虫中常见的一种行为(Bargmann,etal.,1993)。土壤微生物可产生某些挥发物性物质作为线虫的嗅觉趋化性物质，诱吸线虫靠近。这些气味性物质被认为与线虫的趋化行为(Zhang,etal.,2005)以及线虫对食物的选择有关(Pradel,etal.,2007)。
Bacillusmethylotrophicus是韩国人2010年作为新种报道的一种可以代谢甲醇、促进植物生长的细菌(Madhaiyanetal.,2010)，该细菌对多种植物病原真菌还有很好的拮抗效果(莫明和等，2012)；但该微生物对根结线虫的诱吸功能及其在线虫防治中的应用至今未见公开报道。
参考文献：
BargmannCI,HartwiegE,HorvitzHR.1993.Odorant-selectivegenesandneuronsmediateolfactioninC.elegans.Cell,74,515-527.
DaviesK,SpiegelY.2011.Biologicalcontrolofplant-parasiticnematodes:Buildingcoherencebetweenmicrobialecologyandmolecularmechanisms.Inseries:ProgressinBiologicalControl,Vol.11,Springer,Doi10.1007/978-1-4020-9648-8.
MadhaiyanM,PoonguzhaliS,KwonSW,SaTM.2010.Bacillusmethylotrophicussp.nov.anovelspeciesofmethanolutilizing,plant-growthpromotingbacteriumisolatedfromrice.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,60:2490-2495.
OkaY,ShukerS,TkachiN.2009.NematicidalefficacyofMCW-2,anewnematicideofthefluoroalkenylgroup,againsttheroot-knotnematodeMyloidogynejavanica.PestManagementScience,1082-1089.
PradelE,etal.2007.DetectionandavoidanceofanaturalproductfromthepathogenicbacteriumSerratiamarcescensbyCaenorhabditiselegans.ProcNatlAcadSciUSA.104,2295-2300.
RistainoJ,ThomasW.1998.Agriculture,methylbromideandtheozonehole:canwefillthegap？PlantDisease,81:964-997.
ZhangY,LuH,BargmannCI.2005.PathogenicbacteriainduceaversiveolfactorylearninginCaenorhabditiselegans.Nature,438,179-184.
韩生成，刘清利，孟颂东，杨怀义，田波.1999.植物寄生线虫分子生物学和抗线虫基因工程策略的研究进展.农业生物技术学报，7(4):395-399.
卢志军.2012.蔬菜根结线虫病害综合治理.中国农业出版社.
莫明和，林碧莲，黄英，周峰.2012.一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用，专利号ZL201010561580.3.
王艳艳，魏珉，杨凤娟，等.2014.蔬菜根结线虫致病机理及其防控技术研究进展.中国蔬菜,2:9-14.
发明内容：
本发明的目的在于提供一种根结线虫诱吸剂及其应用。
本发明的根结线虫诱吸剂经如下步骤得到：
(1)、利用分离细菌的常规方法从根结线虫的体内分离到BacillusmethylotrophicusMo-TB菌株；B.methylotrophicusMo-TB菌株已于2015年12月9日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCCNo.11851；
(2)、B.methylotrophicusMo-TB菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，32℃下培养2天后获得斜面种子；
(3)、B.methylotrophicusMo-TB菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，150rpm条件下摇床培养3天；
(4)、B.methylotrophicusMo-TB菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(5)、诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.methylotrophicusMo-TB菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.methylotrophicusMo-TB菌体原粉，将B.methylotrophicusMo-TB菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.methylotrophicusMo-TB菌株在糖蜜中的活菌数含量在5×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.2即制得该根结线虫诱吸剂。
所述的根结线虫诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。
所述的根结线虫诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配后在防治根结线虫病中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、诱吸剂对一平方米内土壤中根结线虫二龄幼虫的诱吸率在80％以上。
2、诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配使用，提高了防治根结线虫病的效果。
3、本发明的根结线虫诱吸剂具有成本低、无残留、对人畜安全的特点，能显著提高常规杀线虫农药的防效效果。
具体实施方式：
1.本发明中B.methylotrophicusMo-TB菌株的培养及诱吸剂的制备
本发明的生物诱吸剂经如下步骤得到：
(1)、利用分离细菌的常规方法从根结线虫的体内分离到BacillusmethylotrophicusMo-TB菌株；B.methylotrophicusMo-TB菌株已于2015年12月9日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.11851；利用细菌16SrRNA基因扩增通用引物(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)经PCR扩展B.methylotrophicusMo-TB菌株的DNA，获得其16SrRNA基因序列并提交到GeneBank公共数据库，B.methylotrophicusMo-TB菌株16SrRNA基因序列在GeneBank公共数据库的序列号为KU297172，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。
(2)、B.methylotrophicusMo-TB菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，32℃下培养2天后获得斜面种子；
(3)、B.methylotrophicusMo-TB菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，150rpm条件下摇床培养3天；
(4)、B.methylotrophicusMo-TB菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(5)、根结线虫诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.methylotrophicusMo-TB菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.methylotrophicusMo-TB菌体原粉，将B.methylotrophicusMo-TB菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.methylotrophicusMo-TB菌株在糖蜜中的活菌数含量在5×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.2即制得该根结线虫诱吸剂。
2.本发明的根结线虫诱吸剂对土壤中根结线虫的诱吸效果试验
南方根结线虫(Meloidogyneincongnita)二龄幼虫的制备：从云南省峨山县化念镇的大棚番茄中采集感染线虫的根瘤，从根瘤中挑取卵囊于培养皿中，加入1％的次氯酸钠溶液降解卵囊壁使卵粒游离出来，然后将培养皿至于28℃的温箱中孵化2-3天。利用贝曼漏斗法(将样品用3层擦镜纸包裹，置于漏斗中，漏斗下端接一长度50厘米的塑料管，塑料管末端用夹子夹住，在漏斗中加满水，放置24小时候从塑料管放出200ml的水，即得线虫悬液。)分离获得大量的二龄龄幼虫，通过离心沉淀和解剖镜下的线虫计数，将线虫悬液浓度调整到1000条/毫升，4℃保存备用。
取田间土壤，晒干后粉碎并过100目筛子，将过筛的细土经过高温湿热灭菌(121℃，灭菌2小时)以杀死土壤中原有的线虫。在室内灭菌土壤按长方形(长×宽＝1.4米×0.1米)铺在塑料布上，土壤厚度为10厘米。取1ml、2ml、3ml、4ml本发明制备的根结线虫诱吸剂(B.methylotrophicusMo-TB菌株的菌体含量为5.5×109个/毫升)分别滴加到棉球中，在上述条形土壤带的一端放入棉球并用土覆盖。在对照处理中用等量的无菌水替代线虫诱吸剂，其余操作相同。在距离棉球端1米位置的土壤中分别加入根结线虫悬液10毫升(含线虫10000条以上)。加入线虫后的72小时取棉球及其附近20厘米范围内的土样1000克，用贝曼漏斗法分离土壤中的线虫，在解剖镜下计数线虫数量，按下述公式计算线虫诱吸率：
线虫诱吸率(％)＝(处理的线虫数-对照的线虫数)/10000×100％
试验结果：如表1所示，在土壤带一段分别加入本发明制备的根结线虫诱吸剂1ml、2ml、3ml、4ml，在距离棉球1米处加入线虫72小时时在棉球及其附近20厘米范围内土壤中分离到的线虫数量从5270条增加到8144条，诱吸率从51.95％提高到80.68％。线虫诱吸剂在加入分别剂量为3ml和4ml时对线虫的诱吸率分别为80.25％和80.68％，二者无显著差异。因此，在田间应用时，本发明的线虫诱吸剂使用剂量以3毫升/株为宜。在此剂量下根部1米范围内80％以上的土壤线虫被诱吸到根部，便于杀灭。
表1根结线虫诱吸剂对根结线虫二龄幼虫的诱吸效果
3.本发明的根结线虫诱吸剂提高噻唑膦对根结线虫病防效的试验
(1)供试药剂
a.根结线虫诱吸剂：本分明制备的根结线虫诱吸剂，B.methylotrophicusMo-TB菌株的菌体含量为5.5×109个/毫升；推荐用量:7500毫升/亩。b.30％噻唑膦微囊悬浮剂：山东省联合农药工业有限公司生产；厂家推荐用量：1000毫升/亩。c.10％噻唑膦颗粒剂：青岛奥迪斯生物科技有限公司生产；厂家推荐用量：2000克/亩。
(2)试验处理设置
处理1：30％噻唑膦微囊悬浮剂1000毫升，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤细土充分混匀。处理2：10％噻唑膦颗粒剂2000克，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤细土充分混匀。处理3：30％噻唑膦微囊悬浮剂1000毫升与10公斤细土充分混匀。处理4：10％噻唑膦颗粒剂2000克与10公斤细土充分混匀。处理5(空白对照)：15公斤细土。
(3)试验方法
试验地点为云南省峨山县化念镇大棚番茄地，前茬作物为番茄，根结线虫病严重。番茄移栽时，分别将处理1-5的药剂穴施到番茄根部，当番茄苗按2500株/亩的种植密度移栽时，处理1-5的施用剂量分别为：7.4克/株，7.8克/株，4.4克/株，4.8克/株，6克/株。每处理100株番茄，三个重复，重复间随机排列。番茄毛移栽时间为2015年4月23日，防效调查时间为2015年10月23日。调查防效时，从每处理的三个重复中各随机拔取50株番茄，获得的150株番茄作为该处理的调查样本。根瘤分级按0-5级进行(Okaetal.,PestManagSci.2012,68:268-275)，0级：无根瘤，1级：1-20％的根有根瘤，2级：21-40％的根有根瘤，3级：41–60％的根有根瘤，4级：61–80％的根有根瘤，5级：81-100％的根有根瘤。病情指数及防效的计算公式如下(Wangetal.,2012,Phytopathology102:267-271)：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100n1-n5表示该根瘤级别的植株数量，S表示调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)；x、y分别代表处理和对照的病情指数。
试验结果：如表2所示，30％噻唑膦微囊悬浮剂(处理3)和10％噻唑膦颗粒剂(处理4)单独施用时对根结线虫病的防效分别为67.4％和61.6％；当这两种农药分别与本发明的根结线虫诱吸剂混合施用时，对根结线虫病的防效分别提高至83.6％(处理1)和78.9％(处理2)，防效分别提高了24.04％和28.08％。表明本发明的线虫诱吸剂能显著提高噻唑膦化学杀线虫农药对根结线虫的防治效果。
表2根结线虫诱吸剂提高噻唑膦对根结线虫的防效结果
3.本发明的根结线虫诱吸剂提高阿维菌素对根结线虫病防效的试验
(1)供试药剂
a.根结线虫诱吸剂：本分明制备的根结线虫诱吸剂，B.methylotrophicusMo-TB菌株的菌体含量为5.5×109个/毫升；推荐用量:7500毫升/亩。b.0.9％阿维菌素颗粒剂：宜东国际(香港)有限公司生产；厂家推荐用量：5000公斤/亩。c.5％阿维菌素乳油：石家庄市兴柏生物工程有限公司生产；厂家推荐用量：2000克/亩。
(2)试验处理设置
处理1：0.9％阿维菌素颗粒剂5000克，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤细土充分混匀。处理2：5％阿维菌素乳油2000克，线虫诱吸剂7500毫升，将二者与10公斤细土充分混匀。处理3：0.9％阿维菌素颗粒剂5000克与10公斤细土充分混匀。处理4：5％阿维菌素乳油2000克与10公斤细土充分混匀。处理5(空白对照)：15公斤细土。
(3)试验方法
试验地点为云南省峨山县化念镇大棚番茄地，前茬作物为番茄，根结线虫病严重。番茄移栽时，分别将处理1-5的药剂穴施到番茄根部，当番茄苗按2500株/亩的种植密度移栽时，处理1-5的施用剂量分别为：9克/株，7.8克/株，6克/株，4.8克/株，6克/株。每处理100株番茄，三个重复，重复间随机排列。番茄毛移栽时间为2015年4月23日，防效调查时间为2015年10月23日。调查防效时，从每处理的三个重复中各随机拔取50株番茄，获得的150株番茄作为该处理的调查样本。根瘤分级按0-5级进行(Okaetal.,PestManagSci.2012,68:268-275)，0级：无根瘤，1级：1-20％的根有根瘤，2级：21-40％的根有根瘤，3级：41–60％的根有根瘤，4级：61–80％的根有根瘤，5级：81-100％的根有根瘤。病情指数及防效的计算公式如下(Wangetal.,2012,Phytopathology102:267-271)：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100n1-n5表示该根瘤级别的植株数量，S表示调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)；x、y分别代表处理和对照的病情指数。
试验结果：如表3所示，0.9％阿维菌素颗粒剂(处理3)和5％阿维菌素乳油(处理4)单独施用时对根结线虫病的防效分别为63.8％和60.7％；当这两种农药分别与本发明的根结线虫诱吸剂混合施用时，对根结线虫病的防效分别提高至78.5％(处理1)和76.4％(处理2)，防效分别提高了23％和25.9％。表明本发明的线虫诱吸剂能显著提高阿维菌素杀线虫农药对根结线虫的防治效果。
表3根结线虫诱吸剂提高阿维菌素对根结线虫的防效结果

Claims (3)

1.一种根结线虫诱吸剂，其特征在于该根结线虫诱吸剂经如下步骤得到：
(1)利用分离细菌的常规方法从根结线虫的体内分离到BacillusmethylotrophicusMo-TB菌株；B.methylotrophicusMo-TB菌株已于2015年12月9日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.11851；
(2)、B.methylotrophicusMo-TB菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，32℃下培养2天后获得斜面种子；
(3)、B.methylotrophicusMo-TB菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，150rpm条件下摇床培养3天；
(4)、B.methylotrophicusMo-TB菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(5)、诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.methylotrophicusMo-TB菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.methylotrophicusMo-TB菌体原粉，将B.methylotrophicusMo-TB菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.methylotrophicusMo-TB菌株在糖蜜中的活菌数含量在5×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.2即制得该根结线虫诱吸剂。
2.权利要求1所述的根结线虫诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。
3.权利要求1所述的根结线虫诱吸剂与阿维菌素、噻唑膦化学农药混配后在防治根结线虫病中的应用。
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