CN107779408A - 一种用于防治金龟子的球孢白僵菌及其微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种属于生物防治领域的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG‑17，其保藏编号为CGMCC No.14781。还公开了含有该菌株的微生物菌剂。该菌株对金龟子的杀虫活性高，防治效果好，而且杀虫谱广，同时对北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟3种金龟子种群、以及它们的成虫和幼虫有较高的杀虫活性，可广泛应用于花生、大豆、玉米、马铃薯等作物和草坪、果树等经济作物的金龟子的防治；另外，作为天然产物的JG‑17对环境友好、对人畜无毒；更可贵的是，本发明球孢白僵菌施用后能在感病金龟子虫体上进行自我繁殖，从而继续侵染下一代或其他金龟子种群，也进一步降低了成本。

Description

一种用于防治金龟子的球孢白僵菌及其微生物菌剂
技术领域
本发明属于生物防治领域，具体地说涉及一种球孢白僵菌，还涉及利用该菌制备的微生物菌剂，以及它们在防治金龟子方面的用途。
背景技术
金龟子是鞘翅目金龟子科昆虫的总称，全世界约有3万多种，我国约有1300种，其幼虫和成虫均可对作物和林木等造成危害。在我国为害作物的金龟子有100余种，其中华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita Faldermann)、暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)和铜绿丽金龟(Anomala corpulenta Motschulsky)是危害最重、造成损失最大的三个种群。
金龟子幼虫，俗称蛴螬，喜食作物的种子、根、块茎以及幼苗，造成缺苗、断垄，果实形成空壳或烂果，影响产品的品质和产量，严重时可造成作物绝收。金龟子成虫昼伏夜出，取食作物和林木的叶片，危害严重时常造成大片果树叶片残缺不全，甚至全树叶片被吃光。蛴螬具有生活环境隐蔽、适应性强的特点，是世界公认的难于防治的地下害虫之一。
华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita Faldermann)幼虫主要为害草坪、阔(针)叶树根部及幼苗；其成虫取食杨、柳、榆、桑、核桃、苹果等多种果树和林木的叶片。暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)幼虫主要为害花生、豆类和薯类作物的地下部分，其成虫主要为害榆、柳、杨、核桃、桑、苹果、梨、向日葵和大豆等。铜绿丽金龟(Anomala corpulentaMotschulsky)幼虫主要为害花生、大豆、玉米、棉花和果树等植物的根系，其成虫的寄主有苹果、山楂、海棠、梨、杏、桃、李、梅、柿和核桃等，以苹果属果树受害最重。
防治金龟子的主要方法是化学防治，常用的化学药剂主要有吡虫啉、辛硫磷、毒死蜱和丁硫克百威等。化学药剂对金龟子有一定的防治效果，但化学农药的长期使用，加剧了害虫的抗药性的提高，产品农药残留越来越高，环境污染严重，另一方面化学农药容易杀伤天敌，破坏生态平衡。因此采用专化性强、害虫不易产生抗药性、且对天敌和环境友好的生物防治方法受到越来越多的关注。
针对金龟子的生物防治主要是应用性诱剂、天敌和昆虫病原真菌，其中性诱剂可在田间诱捕金龟雄虫，同时干扰雌雄成虫交配，减少雌虫产卵，但性诱剂对幼虫没有作用，且诱芯稳定长效的问题有待解决。寄生性天敌如弧丽钩土蜂，对金龟幼虫有一定的专化性，但自然寄生率较低。
在金龟科害虫生物防治中，已有利用白僵菌防治金龟子幼虫蛴螬的报道，如利用白僵菌防治花生田蛴螬(孙明海等，农药科学与管理，2009，30(12)：49-50)；用球孢白僵菌防治花生蛴螬，防效为67.2％～74.0％(陈正州等，现代农业科技，2011，4:144-146)；用球孢白僵菌防治甘蔗田蛴螬，防治效果为54.29％(俞德洪，现代农业科技，2016，6:131-132)；用白僵菌防治甘蔗田蛴螬和金龟子(CN103461387A)。但是上述白僵菌防治金龟科害虫多局限于金龟子的幼虫，且已有的白僵菌对金龟子幼虫均具有较明显的专化性，即一种白僵菌只对某一种金龟子幼虫有相对较好的防治效果；另外，上述白僵菌对金龟子的防治效果还不十分理想，因此在实际应用中经常和化学药剂混合应用。
经检索，未发现同时对多种金龟子种群，并且同时对金龟子成虫和幼虫具有较高杀虫活性的白僵菌的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种球孢白僵菌菌株，该菌株对金龟子杀虫活性高，防治效果好，并且杀虫谱广，对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟幼虫和成虫均具有高毒杀能力，而且不存在环境污染和产生抗药性问题。
本发明另一目的在于提供一种微生物菌剂。
本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
本发明第四目的在于提供上述球孢白僵菌在防治金龟子上的用途。
本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治金龟子上的用途。
本发明第六目的在于提供用于鉴定上述球孢白僵菌的分子标记。
本发明第七目的在于提供利用上述球孢白僵菌防治金龟子的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG-17，其保藏编号为CGMCC No.14781。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述的微生物菌剂的活性成分为上述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG-17的分生孢子。
上述微生物菌剂，其剂型为液体制剂或固体制剂等。
上述微生物菌剂，其液体制剂为孢悬液等
本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将低温保存的球孢白僵菌菌株JG-17在PDA平板培养基上活化，挑取单菌落接种在PDA平板培养基上，在25～28℃培养5～7天，得活化菌株；
(2)种子液制备：用无菌接种环挑取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL PDB液体培养基中，在25～28℃、转速为180～220rpm的摇床上培养17～24小时，得种子液；
(3)固体发酵培养：按照液固比(V/W)5～10％的比例将步骤(2)中的种子液接入到袋装灭菌的玉米固体培养基(自然pH值)中，搅拌均匀，在25～28℃条件下发酵培养5～7天，得固体发酵料；
(4)将步骤(3)所得的固体发酵料倒入托盘中，在干燥通风处晾干，待发酵料含水量低于5％时，通过分孢器分离获得分生孢子粉；再用体积百分比为0.02％(v/v)的吐温-80水溶液稀释分生孢子粉，得液体制剂。
上述制备方法步骤(1)中所述的PDA平板培养基的组成成分及其重量比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1L，自然pH。
上述制备方法步骤(2)中所述的PDB液体培养基的组成成分及其重量比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，自然pH。
所述的PDA平板培养基和PDB液体培养基均按照常规方法制备。
上述制备方法步骤(3)中所述的玉米固体培养基的的组成成分及其比例为：粒径大小2～4mm的玉米碎颗粒，颗粒大小混杂即可，其余成分重量百分比为：色拉油0.2～0.5％，无机盐水溶液0.2％；所述无机盐水溶液的组成成分及重量百分比为0.05％KH2PO4、0.01％MgSO4、0.2％NH4NO3，其余为水。
上述制备方法，将步骤(3)中所得的固体发酵料进行二次粉碎，得固体制剂。
玉米固体培养基制备方法及其JG-17固体培养方法如下：将粉碎机粉碎得到的大小不规则的玉米碎颗粒在常温水中浸泡3～4小时，使玉米碎颗粒平均含水量达到25％左右，然后将玉米碎颗粒捞出并控去多于水分，添加色拉油防止灭菌过程中玉米颗粒黏成团，同时添加无机盐溶液，充分混合均匀后，将培养基置于聚丙烯PP塑料袋内，每袋装400g湿料，用聚丙烯PP管扎口，管口依次用三层棉布和封口膜封口，121℃高温蒸汽灭菌40min。灭菌完成待培养基冷却后，接种球孢白僵菌JG-17种子液，混合均匀后在25～28℃下进行培养。
上述微生物菌剂，其含有的球孢白僵菌JG-17菌株的分生孢子数大于50×108个孢子/g固体制剂，或1×108个孢子/mL液体制剂(或称：孢悬液)。
上述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)JG-17在防治金龟子成虫或幼虫上的应用
上述微生物菌剂在防治金龟子成虫或幼虫上的应用。
上述应用中所述的金龟子是指华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblitaFaldermann)、暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)或铜绿丽金龟Anomala corpulentaMotschulsky)等。
本发明还提供了用于鉴定上述球孢白僵菌JG-17的分子标记，所述的分子标记由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。
利用上述球孢白僵菌防治金龟子的方法，在种植时，将上述JG-17的液体制剂或固体制剂通过穴施法施入穴中，其中每穴施用孢子浓度为5×107～1×108个孢子/ml的孢悬液20mL，或者每穴施用孢子浓度为5×108～20×108个孢子/g的固体制剂15g。
上述微生物菌剂的使用方法，以花生为例，在花生种植时期，采用穴施法施药，将上述JG-17孢悬液直接兑水稀释成5×107～1×108个孢子/ml，每穴施用量为孢悬液20mL；或使用固体制剂5×108～20×108个孢子/g固体制剂，每穴施用固体颗粒15g，花生生长期间可再用普通农用喷雾器将JG-17孢悬液喷于花生根部，连续施药3次，以达到持续控害的效果。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG-17对金龟子的成虫和幼虫的杀虫活性高、防治效果好；(2)杀虫谱广，本发明菌株JG-17对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟3种鞘翅目金龟子的成虫和幼虫均有较高的毒杀作用；(3)应用范围广，可用于花生、大豆、玉米、马铃薯等作物和草坪、果树及苗圃等经济作物的金龟子成虫和幼虫的防治；(4)本发明菌株JG-17为天然产物，对环境友好、对人畜无毒，可以有效降低高毒农药的使用量，改善产品品质，减少环境污染；(5)本发明微生物菌剂使用简单、生产成本低；(5)本发明球孢白僵菌可在施用后在感病金龟子虫体上自我繁殖，进而形成流行病，从而可以继续侵染下一代或其他金龟子种群，也进一步降低了使用成本。
生物保藏
本发明球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG-17，己于2017年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14781。
附图说明
图1为JG-17菌株菌丝照片。
图2为JG-17菌株分生孢子照片。
图3为JG-17菌株的系统发育树图。
图4为JG-17孢悬液感染的华北大黑鳃金龟成虫照片。
图5为JG-17孢悬液感染的暗黑鳃金龟成虫照片。
图6为JG-17孢悬液感染的铜绿丽金龟成虫照片。
图7为JG-17孢悬液感染的金龟幼虫照片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的解释和说明，但是本发明不限于此。如无特别说明，以下实施例中所用的方法均为常规方法，所用的化学试剂均为常规试剂。
实施例1本发明球孢白僵菌菌株JG-17的发现和分离过程
本发明球孢白僵菌JG-17菌株，是河北省农林科学院植物保护研究所在饲养华北大黑鳃金龟过程中意外得到的。2017年4月，在饲养华北大黑鳃金龟过程中意外发现一自然感病死亡、体表具白色菌丝的金龟成虫，保湿处理后，感病成虫体表产生白色孢子，经PDA培养基(其组成成分及其重量比为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1L，自然pH)培养分离得到一株真菌菌株，命名为JG-17。将孢子接种在PDA平板培养基上培养至产生分生孢子，收集分生孢子至灭菌冷冻瓶中，用无菌水稀释，冷冻干燥，研磨后-20℃保存备用。
实施例2本发明菌株JG-17的分类鉴定
(一)根据形态特征进行初步鉴定分类
在PDA平板培养基上培养观察菌株JG-17的生物学特征，结果(见图1和图2)在PDA培养基上，菌落初期白色绒状，背面无色，产孢细胞浓密簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的泡囊上，培养7d左右开始产生分生孢子，产孢细胞单生，分生孢子呈椭圆形，分生孢子透明光滑，大小1.6–2.0×2.7–4.2μm。这些特征与《真菌鉴定手册》(魏景超编著.上海科学技术出版社.1979年)中描述的白僵菌属(Beauveria)形态特征基本一致，初步判定该菌株属于白僵菌(Beauveria)。
(二)根据ITS序列特征在分子水平上进行鉴定分类
利用菌株JG-17的菌丝体提取DNA,然后以所提取的JG-17基因组DNA为模板,以真菌ITS区通用引物ITS-4和ITS-5(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)为引物进行PCR扩增,得扩增产物，即JG-17的ITS序列。ITS-4和ITS-5引物序列如下：ITS-4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS-5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR的反应体系(50μL)为:DNA模板1μL，10×PCR Buffer 5μL，Taq DNA聚合酶(5U/L)0.5μL，10mmol/mL dNTP 1μL，10mmol/mL ITS-4 1.5μL，10mmol/L ITS-5 1.5μL，无菌水40μL。PCR的反应条件：95℃4min；94℃1min，54℃1min，72℃2min，35个循环；72℃延伸2min。PCR产物3μL，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。然后送交北京华大基因完成测序。
测序得JG-17的ITS序列(见SEQ ID No.1)，将JG-17的ITS序列于Genbank数据库中进行同源性BLAST比对，结果发现本发明菌株JG-17的ITS序列与球孢白僵菌的ITS序列的同源性在99％以上，同时利用MEGA软件构建系统发育树，结果(见图3)本发明菌株JG-17与球孢白僵菌聚合在一起，说明JG-17在分类上属于白僵菌属(Beauveria)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)；同时对比结果显示JG-17菌株的ITS序列与任何其他球孢白僵菌菌株的ITS序列都不相同，说明JG-17为一种新的球孢白僵菌菌株。
实施例3：球孢白僵菌JG-17微生物菌剂的制备
按照如下步骤进行：
(1)菌种活化：将保存于-20℃的球孢白僵菌菌株JG-17(已于2017年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No.14781)在PDA平板培养基(其组成成分及其重量比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1L，自然pH)上进行活化，培养温度为27℃，挑取单菌落在PDA平板培养基上27℃培养5～7天，得到活化的菌株；
(2)种子液的制备：按常规方法制作PDB液体培养基(其组成成分及其重量比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，自然pH)，在250mL三角瓶中装入PDB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)中活化好的菌株，在27℃、摇床转速190rpm的条件下进行振荡培养24小时，得种子液；
(3)玉米固体培养基的制备：
将粉碎机粉碎得到的粒径大小为2-4mm左右的玉米碎颗粒在常温水中浸泡3～4小时，使玉米碎颗粒平均含水量达到25％左右，将玉米碎颗粒捞出并控去多于水分，添加重量百分比为0.5％色拉油，添加重量百分比为0.2％无机盐水溶液(其组成成分及重量比为0.05％KH2PO4、其余为水0.01％MgSO4、0.2％NH4NO3、其余为水)。充分混合均匀后，将培养基分装到40cm×22cm聚丙烯PP塑料袋内，每袋装400g湿料，用直径4cm、长6cm的聚丙烯PP管扎口，管口依次用三层棉布和封口膜封口，121℃高温蒸汽灭菌40min。待培养基冷却到常温后备用。
(4)固体发酵培养：按照液固比(V/W)5～10％的比例将步骤(2)中所得的种子液接入到步骤(3)的玉米固体培养基中，搅拌均匀，在25～28℃条件下培养，36小时后将固体料松动一次，培养5～7天，观察培养袋中多于三分之二的固体料形成分生孢子后中止发酵，然后将固体发酵料倒入托盘中，在干燥通风处晾干，抽检固体培养基样品，待培养料含水量低于5％时，可通过分孢器分离获得分生孢子粉；将固体发酵料2次粉碎，得固体制剂。
(5)液体制剂制备：按照体积百分比为0.02％(v/v)的比例用吐温-80水溶液稀释步骤(4)中所得的分生孢子粉，得液体制剂或称孢悬液。
实施例4球孢白僵菌JG-17菌株对金龟成虫的杀虫活性测定试验
(一)球孢白僵菌菌株JG-17菌悬液制备：将实施例3中所得的JG-17菌株分生孢子粉用0.02％(v/v)吐温-80水悬液稀释，配制5×107、2×107、5×106、2×106和1×106孢子/mL梯度浓度的孢悬液。
(二)金龟子成虫的来源：金龟子成虫均为人工野外捕集获得，华北大黑鳃金龟成虫在2017年5月上旬捕集，暗黑鳃金龟成虫和铜绿丽金龟成虫在2017年7月上旬捕集。所有捕集的成虫带回室内，置于养虫笼内。养虫笼底部为60cm×40cm×15cm铁盒，沿着铁盒内沿扣上45cm高、80目纱网制成的罩笼，罩笼一侧留有可粘合的20cm×20cm的窗口，用于投放金龟子及更换饲料。铁盒内放湿度18～20％的湿润细土，土层厚度为5～6cm；将新鲜榆叶插在土中作为成虫的饲料，每日更换新鲜饲料。
(三)试虫盒：将塑料盒(10cm×15cm)用次氯酸钠100倍液浸泡1h，然后用水冲洗干净并晾干，在塑料盒内放湿度18～20％的湿润细土，土层厚度为5～6cm；将新鲜榆叶插在土中作为成虫的饲料。
(四)试验方法：采集金龟子成虫后，在室内饲养3天，然后随机挑取健康成虫，测定不同浓度JG-17孢悬液对金龟子成虫的杀虫活性，以0.02％(V/V)吐温-80水溶液处理作为对照。将待测金龟子成虫浸入JG-17孢悬液中5s，然后用镊子轻轻夹住成虫取出，并用滤纸吸去多于水分，置于试虫盒中，在27℃、光周期12L：12D条件下饲养13天。施药后每天更换补充新鲜榆叶，定期调查死亡虫数，并将死亡试虫取出保湿放置，虫体长出白色菌丝的试虫为白僵菌JG-17侵染致死(见图4、图5和图6)。每个试虫盒中放10头成虫，每处理设3次重复，每个重复10头试虫。计算校正死亡率，通过Probit回归计算JG-17孢悬液对不同金龟成虫的LT50。
死亡率(％)＝死虫数/试虫数×100
校正死亡率(％)＝(处理组死亡率-对照死亡率)/(100-对照组死亡率)×100
从表1可以看出，本发明球孢白僵菌JG-17菌株对三种金龟成虫的杀虫活性有明显差异，致病力均表现出随孢悬液浓度的降低而降低。本发明球孢白僵菌JG-17对铜绿丽金龟的致病力高于暗黑鳃金龟，对暗黑鳃金龟的致病力与对华北大黑鳃金龟的致病力接近。JG-17孢悬液5×107孢子/mL侵染金龟成虫13天，铜绿丽金龟、暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟的校正死亡率分别为96.7％、73.3％和66.7％；说明球孢白僵菌JG-17对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟成虫有非常高的杀虫活性，其中对铜绿丽金龟成虫的杀虫活性高于对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟的杀虫活性。
表1不同浓度JG-17孢悬液侵染金龟子成虫的校正死亡率(％)
从表2可以看出，在浓度为5×107孢子/mL的JG-17孢悬液侵染下，铜绿丽金龟、暗黑鳃金龟和华北大黑鳃金龟达到50％死亡率所需的时间(LT50)分别为7.0天、9.5天和10.5天。说明JG-17对三种金龟子的杀虫速度快，其中JG-17对铜绿丽金龟成虫的速效性大于华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟。
表2 JG-17孢悬液5×107孢子/mL侵染金龟子成虫的致死中时试验结果
华北大黑鳃金龟 暗黑鳃金龟 铜绿丽金龟
LT50(天) 10.5 9.5 7.0
实施例5球孢白僵菌菌株JG-17对金龟子幼虫的杀虫活性试验
(一)JG-17孢悬液制备：将实施例3中制备的JG-17菌株的分生孢子粉用0.02％(v/v)吐温-80水悬液稀释，分别配制成1×108、5×107、2×107、5×106、2×106和1×106孢子/mL梯度浓度的孢悬液。
(二)金龟子幼虫的来源：将实施例4捕集的金龟子成虫在室内饲养至产卵，将卵挑出埋在湿度为20％左右的湿润细土中，待卵孵化为幼虫后，即为1龄幼虫；饲喂土豆块，1龄幼虫蜕皮饲养17～25天，即进入到2龄幼虫，选取健康的1龄和2龄幼虫进行生物活性测定。
(三)幼虫处置室：将规格为高100mm×直径15mm指形管在电热恒温鼓风干燥箱175℃灭菌2小时，每个指形管底部放入1.5cm3大小土豆块作为幼虫饲料，细土曝晒过筛后，加水混匀，使其湿度为18～20％，细土装至指形管四分之三处，作为幼虫处置室。
(四)试验方法：对1龄金龟子幼虫的系列测定浓度分别为5×107、2×107、5×106、2×106和1×106孢子/mL的JG-17孢悬液，对2龄金龟子幼虫的系列测定浓度分别为1×108、5×107、2×107、5×106、2×106孢子/mLJG-17孢悬液。挑取健康活泼、龄期大小一致的金龟子幼虫，将试虫逐头浸没在JG-17孢悬液中5s，取出后放在滤纸上吸去多于水分后放入指形管中，待试虫钻入土中后在指形管管口塞入灭菌棉球，如有长时间未钻入土中的试虫，将其取出并挑取新的幼虫重新在相应的JG-17孢悬液浸没处理，至所有处理幼虫均钻入土中。每个指形管放置1头幼虫，每处理设3次重复，每重复10头试虫。27℃下饲养13天，定期检查死虫数，并将死虫挑出保湿处理，待其体表长出白色菌丝体视为菌株JG-17侵染致死(图7)。计算死亡率和校正死亡率，计算公式同实施例4。
从表3和表4可以看出，JG-17菌株对三种金龟子1龄和2龄幼虫的杀虫活性均随侵染浓度的提高而增强；用浓度为5×107孢子/mL的JG-17孢悬液侵染1龄试虫，华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟幼虫13天的校正死亡率分别为56.7％、100％和90.0％。用浓度为1×108孢子/mL的JG-17孢悬液侵染2龄试虫，华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟幼虫13天的校正死亡率分别为76.7％、100％和33.3％。说明球孢白僵菌JG-17对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟幼虫均具有很高的杀虫活性，防治效果好。
表3不同浓度JG-17孢悬液侵染金龟1龄幼虫的校正死亡率(％)
表4不同浓度JG-17孢悬液侵染金龟2龄幼虫的校正死亡率(％)
实施例6球孢白僵菌JG-17对花生田金龟子幼虫蛴螬防效对比试验
(一)试验处理
(1)球孢白僵菌JG-17固体制剂：将实施例3步骤(3)中所得的玉米固体发酵料2次粉碎，得固体制剂。
(2)空白对照：水
(二)试验方法：
本试验在河北省保定市满城区河北省农科院植保所试验农场花生田进行。在2017年5月穴播花生，每穴放2粒花生种子，同时在每穴中放球孢白僵菌JG-17固体制剂15g(含孢量为15×108孢子/g固体制剂)；以在穴内放15mL水的为空白对照。每个处理重复3次，随机排列，小区面积30平米。待2017年9月花生收获时，调查每处理蛴螬蛀果率，计算防治效果。
从表5可以看出，球孢白僵菌JG-17对花生田蛴螬的防效为71.1％，说明本发明球孢白僵菌JG-17及其固体制剂对花生田蛴螬具有非常好的防治效果。
表5 JG-17固体菌剂对花生田蛴螬防效试验结果
处理 蛀果率(％) 防效(％)
JG-17菌剂 18.9 71.1
空白对照 65.4 ——
上述试验结果表明，JG-17菌株对鞘翅目金龟科害虫华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和铜绿丽金龟的成虫和幼虫均具有较高的杀虫活性，因而，将本发明白僵菌JG-17用于这三种金龟害虫的防治，可以起到长期控制地下金龟害虫的持效作用，有效降低化学农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
序列表
<110> 河北省农林科学院植物保护研究所
<120> 一种用于防治金龟子的球孢白僵菌及其微生物菌剂
<141> 2017-11-01
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 593
<212> DNA
<213> Beauveria bassiana
<400> 1
tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtagtcc tacctgattc gaggtcaacg 60
ttcagaagtt gggtgtttta cggcgtggcc acgtcggggt tccggtgcga gttggattac 120
tacgcagagg tcgccgcgga cgggccgcca ctccatttca gggccggcgg tgtgctgccg 180
gtccccaacg ccgacttccc caaagggagg tcgagggttg aaatgacgct cgaacaggca 240
tgcccgccag aatgccggcg ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactggatt 300
ctgcaattca cattacttat cgcgtttcgc tgcgttcttc atcgatgcca gagccaagag 360
atccgttgtt gaaagttttg atttatttgt tttgccttgc ggcgtattca gaagatgctg 420
ataatacaag agtttgaggg tccccggcgg ccgctggtcc agtccgcgtc cggctggggc 480
gagtccgccg aagcaacaat aggtaggttc acataagggt tagggagttg aaaactcggt 540
aatgatccct ccgctggttc accaacggag accttgttac gacttttact tcc 593

Claims (10)

1.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG-17，其保藏编号为CGMCC No.14781。
2.一种微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂的活性成分为权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株JG-17的分生孢子。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于其剂型为液体制剂或固体制剂。
4.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)菌种活化：将低温保存的球孢白僵菌菌株JG-17在PDA平板培养基上活化，挑取单菌落接种在PDA平板培养基上，在25～28℃培养5～7天，得活化菌株；
(2)种子液制备：用无菌接种环挑取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL PDB液体培养基中，在25～28℃、转速为180～220rpm的摇床上培养17～24小时，得种子液；
(3)固体发酵培养：按照液固比(V/W)5～10％的比例将步骤(2)中的种子液接入到袋装灭菌的玉米固体培养基(自然pH值)中，搅拌均匀，在25～28℃条件下发酵培养5～7天，得固体发酵料；
(4)将步骤(3)所得的固体发酵料倒入托盘中，在干燥通风处晾干，待发酵料含水量低于5％时，通过分孢器分离获得分生孢子粉；再用体积百分比为0.02％(v/v)的吐温-80水溶液稀释分生孢子粉，得液体制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的玉米固体培养基的的组成成分及其比例为：粒径大小2～4mm的玉米碎颗粒，颗粒大小混杂即可，其余成分重量百分比为：色拉油0.2～0.5％，无机盐水溶液0.2％；所述无机盐水溶液的组成成分及重量百分比为0.05％KH2PO4、0.01％MgSO4、0.2％NH4NO3，其余为水。
6.权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)JG-17在防治金龟子成虫或幼虫上的应用。
7.权利要求2所述的微生物菌剂在防治金龟子成虫或幼虫上的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于所述的金龟子是指华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita Faldermann)、暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)或铜绿丽金龟Anomala corpulenta Motschulsky)。
9.用于鉴定权利要求1所述的球孢白僵菌JG-17的分子标记，其特征在于所述的分子标记由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成。
10.利用权利要求1所述的球孢白僵菌防治金龟子的方法，其特征在于在种植时，将权利要求3中所述的JG-17的液体制剂或固体制剂通过穴施法施入穴中，其中每穴施用孢子浓度为5×107～1×108个孢子/ml的孢悬液20mL，或者每穴施用孢子浓度为5×108～20×108个孢子/g的固体制剂15g。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109644775A (zh) * 2018-10-10 2019-04-19 黑龙江黑臻生物科技有限公司 一种菇肚耳菌株yd99及其栽培方法
CN110305801A (zh) * 2019-07-31 2019-10-08 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法
CN110317770A (zh) * 2019-08-15 2019-10-11 贵州正春林业科技服务有限公司 一种白僵菌孢子的提取方法
CN113481109A (zh) * 2021-07-30 2021-10-08 沧州市农林科学院 一种布氏白僵菌及其在防治金龟子中的应用
CN115747082A (zh) * 2022-12-23 2023-03-07 贵州省生物研究所 一种白僵菌固体培养基及其应用
CN117987281A (zh) * 2024-03-14 2024-05-07 云南农业大学 一种球孢白僵菌Bbzy230628菌株及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101245319A (zh) * 2008-04-07 2008-08-20 河北省农林科学院植物保护研究所 一种球孢白僵菌hfw-05菌株及其应用
CN105670938A (zh) * 2016-02-03 2016-06-15 河北省农林科学院植物保护研究所 一种毒杀华北大黑鳃金龟的球孢白僵菌及其应用
CN105941486A (zh) * 2016-05-16 2016-09-21 江西天人生态股份有限公司 一种农用杀虫组合物及其应用
CN107258823A (zh) * 2017-06-14 2017-10-20 齐鲁工业大学 一种防治蛴螬的白僵菌颗粒剂制备方法及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101245319A (zh) * 2008-04-07 2008-08-20 河北省农林科学院植物保护研究所 一种球孢白僵菌hfw-05菌株及其应用
CN105670938A (zh) * 2016-02-03 2016-06-15 河北省农林科学院植物保护研究所 一种毒杀华北大黑鳃金龟的球孢白僵菌及其应用
CN105941486A (zh) * 2016-05-16 2016-09-21 江西天人生态股份有限公司 一种农用杀虫组合物及其应用
CN107258823A (zh) * 2017-06-14 2017-10-20 齐鲁工业大学 一种防治蛴螬的白僵菌颗粒剂制备方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张丽坤等: "球孢白僵菌对东北大黑鳃金龟的侵染效果", 《东北农业大学学报》 *
张民照等: "《生物农药及其应用技术问答 第2版》", 31 January 2016, 中国农业大学出版社 *
熊绍员等: "球孢白僵菌防治花生蛴螬的试验研究", 《第二十四届中国植保信息交流暨农药械交易会论文集》 *
王运兵，吕印谱: "《无公害农药实用手册》", 31 March 2004, 河南科学技术出版社 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109644775A (zh) * 2018-10-10 2019-04-19 黑龙江黑臻生物科技有限公司 一种菇肚耳菌株yd99及其栽培方法
CN109644775B (zh) * 2018-10-10 2021-03-19 黑龙江黑臻生物科技有限公司 一种菇肚耳菌株yd99及其栽培方法
CN110305801A (zh) * 2019-07-31 2019-10-08 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所 一种菌袋培养球孢白僵菌孢子粉的方法
CN110317770A (zh) * 2019-08-15 2019-10-11 贵州正春林业科技服务有限公司 一种白僵菌孢子的提取方法
CN113481109A (zh) * 2021-07-30 2021-10-08 沧州市农林科学院 一种布氏白僵菌及其在防治金龟子中的应用
CN113481109B (zh) * 2021-07-30 2022-11-25 沧州市农林科学院 一种布氏白僵菌及其在防治金龟子中的应用
CN115747082A (zh) * 2022-12-23 2023-03-07 贵州省生物研究所 一种白僵菌固体培养基及其应用
CN117987281A (zh) * 2024-03-14 2024-05-07 云南农业大学 一种球孢白僵菌Bbzy230628菌株及其应用
CN117987281B (zh) * 2024-03-14 2024-06-04 云南农业大学 一种球孢白僵菌Bbzy230628菌株及其应用

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