CN106010985A - 一株粉棒束孢hs05及其应用 - Google Patents

一株粉棒束孢hs05及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株粉棒束孢HS05及应用，粉棒束孢的分类命名为Isaria farinose HS05，该菌株于2016年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.12247，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的粉棒束孢HS05，产孢能力强，对栎旋木柄天牛幼虫杀虫活性强，致死率大于80%。利用该菌株能有效控制栎旋木柄天牛的种群数量。另外，该株粉棒束孢对其他林业害虫松毛虫、松褐天牛、美国白蛾等也具有很好的防效，具有很好的推广应用价值。

Description

一株粉棒束孢HS05及其应用
技术领域
本发明属于生物技术防治技术领域，具体涉及一株粉棒束孢(Isaria farinosa)HS05及其菌剂的制备和在防治林业虫害中的应用。
背景技术
林业有害生物是现代林业生产中，对林业产量影响最大的因素，据国家林业局资料，我国现有林业有害生物8000余种，可造成严重危害的有200多种。自2007年以来，我国林业有害生物每年发生面积均在1.75亿亩以上，占林业灾害总面积的50.69％，是森林火灾面积的数十倍，年均造成损失1101亿元。随着林业产业结构的调整，虫害的控制与防治越来越为人们所重视。一些林业主要发生的虫害如松材线虫病、马尾松毛虫、油松毛虫、美国白蛾、栎旋木柄天牛等为主要的虫害。长期以来，防治林业虫害所使用的农药大多是化学杀虫剂，且杀虫剂品种单一，多种害虫对不少品种已产生了严重的抗性。此外，由于长期大量使用少数几种杀虫剂，致使土壤中农药残毒积累，导致环境污染，破坏了土壤和森林的生态平衡，使得林业虫害发生更为频繁，甚至影响人类的身体健康。因此迫切需要开发具有不同作用机理的、结构新颖、安全有效环保的杀虫剂，尤其是“无公害”的生物源杀虫剂。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株新的粉棒束孢HS05，该菌株经过发酵后产生具有强烈地、广谱地杀死害虫的产物，该菌株及其代谢产物可用于制备广谱杀虫的生防制剂，用于防治林业害虫。本发明的另一目的是提供上述粉棒束孢HS05的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一株粉棒束孢，其分类命名为Isaria farinose HS05，该菌株于2016年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.12247，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述的粉棒束孢HS05在防治林业害虫中的应用。
所述的粉棒束孢HS05的发酵产物在防治林业害虫中的应用。
所述的粉棒束孢HS05的孢子在防治林业害虫中的应用。
所述的粉棒束孢HS05在制备用于防治林业害虫的生防制剂中的应用。
所述林业害虫包括栎旋木柄天牛(Aphrodisium sauteri)、松褐天牛(Monchamusalternatus)、马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)、美国白蛾(Hyphantria cunea)。
所述生防制剂由以下方法获得：将所述粉棒束孢HS05用SDAY固体培养基活化后，挑取少菌丝或孢子种到装量为摇瓶20％-30％体积的SDAY液体培养基中；25℃，180r/min振荡培养72小时，所获得的发酵液为种子液；将种子液转接到灭菌固体发酵培养基上，25℃，RH90％，12L:12D，培养7-10天，37℃烘干2-3天后粉碎所获得的固体即为生防制剂。
所述生防制剂由以下方法获得：将所述粉棒束孢HS05用SDAY固体培养基活化后，挑取少菌丝或孢子接种到装量为摇瓶20％-30％体积的SDAY液体培养基中；25℃，180r/min振荡培养72小时，所获得的发酵液为种子液；将种子液转接到灭菌固体发酵培养基上，25℃，RH90％，12L:12D，培养7-10天，37℃烘干3-4天后，采用旋风分离发酵产物，旋风分离器所获得的粉末状颗粒即为生防制剂。
有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的粉棒束孢HS05具有如下优点：
1)本发明所提供的粉棒束孢HS05具有强烈的广谱致病性，对栎旋木柄天牛(Aphrodisium sauteri)、松褐天牛(Monchamus alternatus)、马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)、美国白蛾(Hyphantria cunea)效果突出。
2)本发明所提供的粉棒束孢HS05的生防制剂能适应较低温环境，在5-10℃的低温环境下，该菌依然生长产孢。
附图说明
图1是粉棒束孢HS05的培养菌落图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
供试昆虫：对栎旋木柄天牛(Aphrodisium sauteri)：黄山风景区采集。松褐天牛(Monchamus alternatus)：滁州常山林场采集。马尾松毛虫(Dendrolimuspunctatus)：南京林业大学北大山试验基地采集。美国白蛾(Hyphantria cunea)：中国科学院植保所购买。
SDAY培养基配方如下：1％酵母浸出粉，4％葡萄糖，1％蛋白胨，加无菌水定量至100％，如若是固体培养基则加入1.5-2％的琼脂，121℃灭菌20分钟。
固体发酵培养基配方如下：70％麦麸，30％谷壳，121℃灭菌20分钟。
实施例1粉棒束孢HS05的分离、鉴定
粉棒束孢HS05，是从黄山风景区死亡栎木中的栎旋木柄天牛幼虫僵虫上中分离得到。方法如下：
将在黄山采集的带菌丝的栎旋木柄天牛幼虫僵虫，从虫体身上挑取孢子，转接到加有抗生素的SDAY培养上，在25℃条件下培养5天。待在培养基上形成菌落后，挑取菌落中心的菌丝块，转到新加有抗生素的SDAY培养基上进行纯化培养。将筛选获得的一株细菌编号为HS05。
1)形态学鉴定：将纯化后得到的菌株接种到SDAY培养基上，放入25℃温箱中培养5d后拿出，观察其菌落正面及反面形态，并用透明胶带粘取培养皿中的少数菌丝体，以蒸馏水作浮载剂，制临时玻片镜检，在蔡司显微镜下观察产孢结构并拍照。
经过SDAY培养基培养，其菌落形态、分生孢子梗、瓶梗、分生孢子等的形态特征如下：菌落白色圆形，绒状疏松或毡状致密，中间凸起或略凸起，边缘整齐或锯齿状，反面黄色、浅黄色或橘黄色，菌丝有隔，透明，光滑。分生孢子梗柱状，基部膨大，向上变细，单生或由3～5个瓶梗组成的轮生体的分枝。分生孢子椭圆形、圆形，光滑，透明或略着色，分生孢子念珠状、长链状或叠瓦状排成斜链，如图1所示。
2)分子生物学鉴定：
HS05菌株总DNA的提取方法参照OMEGA bio-tek的Fungal DNA Kit(50)试剂盒，得到提取的DNA样本；以提取的菌株总DNA作为基因扩增模版，采用真菌ITS通用引物，进行PCR扩增，PCR产物回收纯化并经行DNA测序后，该序列如SEQ ID NO.1所示。与GenBank中所有已测定的真核生物的ITS序列比较同源性，构建HS05菌株系统发育树，结果表明HS05菌株与GZU4718(Isariafarinosa)聚为一类，并且其形态特征符合(Isaria farinosa)的特征，所以可以鉴定HS05菌株为Isaria farinosa，名为粉棒束孢HS05。
实施例2
以SDAY培养基为基础培养基，高压灭菌后制成平板，在各平板中央移入的目的生防菌的菌饼。分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃共6个不同温度梯度下培养，每个重复4个平板，共3个重复，5d和10d后取出，用十字交叉法测量菌落直径，计算结果如表1。
表1HS05菌株不同温度环境菌落生长速度测定结果
处理温度(℃) 5天后菌落直径(cm) 10天后菌落直径(cm)
5 0.8 2.1
10 1.4 3.2
15 1.7 4.6
20 2.1 5.4
25 3.2 6.1
30 2.8 5.7
结果表明，粉棒束孢HS05在5℃～30℃温度下都能生长，最佳生长温度为25℃，由数据可以看出，该菌在5℃～10℃低温环境下依然可以长出菌丝，结合林区气候，该菌能够在林区定殖。
实施例3
以SDAY培养基为基础培养基，高压灭菌后制成平板，在各平板中央移入的目的生防菌的菌饼。分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃共6个不同温度梯度下培养，每个重复4个平板，共3个重复，7d后取出，完全刮取平板上生长的菌丝，放入三角瓶中，加50mL无菌水在磁力搅拌器中打散，滤去菌丝，制成新鲜的孢子悬浮液。用血球计数板测量孢子数，计算结果如表2。
表2HS05菌株不同温度环境菌落生长速度测定结果
处理温度(℃) 7天后产孢量(亿孢子/cm2)
5 0.4
10 1.1
15 1.9
20 3.1
25 3.9
30 3.4
结果表明，粉棒束孢HS05 7d后不同温度下平板产孢量差距很大，最佳培养温度为25℃左右，30℃其次，可以看出，在5～10℃的低温环境下，该菌依然生长产孢，虽产孢量不大，但是具有一定的抗寒性。考虑到自然环境下，山区的气温普遍偏低，所以该菌作为生物农药制剂，有一定的实际作用价值。
实施例4
将粉棒束孢HS05在25℃SDAY培养基上培养7天后，完全刮取平板上生长的菌丝，放入三角瓶中，加0.05％吐温-80溶液在磁力搅拌器中打散，滤去菌丝，制成新鲜的孢子悬浮液，用血球计数板计数后配成浓度为1×108孢子/mL孢子悬浮液待用。
供试栎旋木柄天牛(Aphrodisium sauteri)幼虫从安徽黄山风景区采集于因栎旋木柄天牛病致死的栎木中，劈出其中的栎旋木柄天牛幼虫幼虫，在新鲜的青冈栎木屑中饲养7天后，挑取低龄、体长相近活力较强的幼虫待用。
供试松褐天牛(Monchamus alternatus)幼虫从安徽滁州常山林场伐取因松材线虫病致死的马尾松，劈出其中的松墨天牛幼虫，在新鲜的木屑中饲养3天后，挑取5～6龄、体长相近活力较强的幼虫待用，其平均体长为30mm。
供试美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫由中国科学院植保所购买，购回后饲养1天，选取2～3龄的活力较强的幼虫待用，饲料由中国科学院植保所提供，灭菌后使用。
供试马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)幼虫从南京林业大学北大山试验基地的马尾松上采集中，选取健康的马尾松毛虫幼虫，在新鲜的马尾松针叶上饲养3天后，挑取体长相近活力较强的幼虫待用。
采用浸渍法接种，将试虫在1×105孢子/mL孢子悬浮液中浸渍5s进行接种，对照浸渍0.05％吐温-80溶液，接种12头，每次实验3个重复，接种后的幼虫置于25℃培养箱内避光饲养，饲养湿度为90％，第5d开始,每天定时观察、记录各处理的具体死亡情况，并将死亡幼虫放在放有己灭菌湿滤纸的培养皿内在25℃用保湿棉球保湿培养，记录死亡幼虫所接种的菌株及致死率，计算结果如表3。
死亡率计算公式：
校正死亡率计算公式：
结果表明，粉棒束孢HS05对所测试的几种害虫均具致病性，对栎旋木柄天牛、美国白蛾的致死率超过70％。对马尾松毛虫，松褐天牛的致死率高于50％。
表3HS05CGMCC No.7996拮抗真菌活性的测定结果
供试昆虫 死亡率(％) 校正死亡率(％)
栎旋木柄天牛 83 82
松褐天牛 75 73
美国白蛾 66 64
马尾松毛虫 50 46
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一株粉棒束孢HS05及其应用
<130> 100
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 568
<212> DNA
<213> Isaria farinosa
<400> 1
aacctgcgga gggatcatta ccgagttttc aactcccaaa cccttttgtg aacataccta 60
tcgttgcttc ggcggactcg ccccagcgtc cggccggccc cgcgccggcc gcggcctgga 120
tccaggcggc cgccggagac ccctaaactc tgtattctca gtatcttctg aatccgccgc 180
aaggcaaaac aaatgaatca aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga 240
agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 300
ttgaacgcac attgcgcccg ccagcattct ggcgggcatg cctgttcgag cgtcatttca 360
accctcgact tccctttggg gaaatcggcg ttggggaccg gcctataccg ccggccccga 420
aatgaagtgg cggcccgtcc gcggcgacct ctgcgtagta atccaactcg caccggaacc 480
ccgacgtggc cacgccgtaa aacccccgac ttctgaacgt tgacctcgga tcaggtagga 540
atacccgctg aacttaagca tatcaata 568

Claims (8)

1.一株粉棒束孢，其分类命名为Isaria farinose HS05，该菌株于2016年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No.12247，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的粉棒束孢HS05在防治林业害虫中的应用。
3.权利要求1所述的粉棒束孢HS05的发酵产物在防治林业害虫中的应用。
4.权利要求1所述的粉棒束孢HS05的孢子在防治林业害虫中的应用。
5.权利要求1所述的粉棒束孢HS05在制备用于防治林业害虫的生防制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述林业害虫包括栎旋木柄天牛、松褐天牛、马尾松毛虫、美国白蛾。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述生防制剂由以下方法获得：
将所述粉棒束孢HS05用SDAY固体培养基活化后，挑取少菌丝或孢子种到装量为摇瓶20%-30%体积的SDAY液体培养基中；25℃，180r/min振荡培养72小时，所获得的发酵液为种子液；将种子液转接到灭菌固体发酵培养基上，25℃，RH90%，12L:12D，培养7-10天，37℃烘干2-3天后粉碎所获得的固体即为生防制剂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述生防制剂由以下方法获得：
将所述粉棒束孢HS05用SDAY固体培养基活化后，挑取少菌丝或孢子接种到装量为摇瓶20%-30%体积的SDAY液体培养基中；25℃，180r/min振荡培养72小时，所获得的发酵液为种子液；将种子液转接到灭菌固体发酵培养基上，25℃，RH90%，12L:12D，培养7-10天，37℃烘干3-4天后，采用旋风分离发酵产物，旋风分离器所获得的粉末状颗粒即为生防制剂。
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