CN112877452A - 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112877452A
CN112877452A CN201911197113.4A CN201911197113A CN112877452A CN 112877452 A CN112877452 A CN 112877452A CN 201911197113 A CN201911197113 A CN 201911197113A CN 112877452 A CN112877452 A CN 112877452A
Authority
CN
China
Prior art keywords
identifying
denaturation
pcr amplification
paecilomyces farinosus
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911197113.4A
Other languages
English (en)
Inventor
钱正明
谢美霞
郑雅丹
李春红
李文庆
金李玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yichang Shanchengshuidu Cordyceps Co ltd
Dongguan Dongyangguang Cordyceps Research And Development Co ltd
Original Assignee
Yichang Shanchengshuidu Cordyceps Co ltd
Dongguan Dongyangguang Cordyceps Research And Development Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yichang Shanchengshuidu Cordyceps Co ltd, Dongguan Dongyangguang Cordyceps Research And Development Co ltd filed Critical Yichang Shanchengshuidu Cordyceps Co ltd
Priority to CN201911197113.4A priority Critical patent/CN112877452A/zh
Publication of CN112877452A publication Critical patent/CN112877452A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用。本发明适用于检测或辅助检测待测样品是否含有粉拟青霉，鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉。本发明提供的特异性引物对通过PCR技术可以快速、准确、灵敏地实现上述应用，且引物特异性强，准确度高，扩增效果好，重复性好，耐受性好，适宜推广应用，能鉴别粉拟青霉与其他品种的拟青霉，也能用于属间鉴别。

Description

鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
技术领域
本发明生物学技术领域，具体涉及鉴别粉拟青霉菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用。本发明技术适用于检测或辅助检测待测样品中是否含有粉拟青霉菌；鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉菌。
背景技术
粉拟青霉是拟青霉属中一种寄主范围广泛的虫生真菌(拉丁名：Paecilomycesfarinosus)，可侵入鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目等多种昆虫，在适宜的条件下，粉拟青霉分生孢子发育出牙管，进入虫体内，吸取虫体内的水分和养分，生长、伸长为菌丝，菌丝不断分枝、增殖，侵入虫体内各个器官，直到整个虫体内充满菌丝，使虫体内生理代谢混乱或代谢障碍而死亡、僵硬。
目前，常用传统形态学的手段，常规培养后在显微镜下观察菌丝和孢子形态差异来鉴定粉拟青霉。但镜检存在取样不均一，准确度不高的问题，且操作费时，要求检验人员具备专业的理论知识和实践技能。因此，发明一种能快速鉴别中药材是否含有粉拟青霉或者鉴定待测样品或者鉴定样品是否为粉拟青霉的技术迫在眉睫。近年来，随着中药鉴定学的发展，中药鉴定的新技术和新方法不断被应用，其中分子生物学的引入，使得可以从基因层面解决中药品种混乱的问题。尚未见报道从基因特异性引物扩增特异性片段层面去鉴定粉拟青霉。
发明内容
为弥补现有技术的空白，解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于粉拟青霉ITS基因设计的鉴定粉拟青霉菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用。本发明首次对粉拟青霉进行了特异性引物的设计，适用于检测或辅助检测待测样品中是否含有粉拟青霉菌；鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉菌。本发明提供的特异性引物对通过PCR技术可以快速、准确、灵敏地实现上述应用，且引物特异性强，准确度高，扩增效果好，重复性好，耐受性好，适宜推广应用。
具体的，
一方面，本发明提供了一种鉴定粉拟青霉菌的特异性引物，其序列如下：
NF154：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’；
NR428：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’。
一方面，本发明提供了一种鉴定粉拟青霉菌的试剂盒，包含以下引物：
NF154：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’；
NR428：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’。
另一方面，本发明提供了一种鉴定粉拟青霉菌的方法，包括使用本发明所述的引物或本发明所述的试剂盒。
另一方面，本发明提供了一种鉴定粉拟青霉菌的方法，包括步骤：
a)提取待测样品的基因组DNA；
b)利用本发明所述的粉拟青霉菌特异性引物或本发明所述的鉴定粉拟青霉菌的试剂盒对步骤a)中的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
c)利用步骤b)中获得的扩增产物鉴定所述待测样品。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性15sec-45sec，49℃-58℃退火15sec–45sec，72℃延伸10sec，25-35个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性15sec，52℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性20sec，52℃退火20sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性35sec，52℃退火35sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸10sec，25个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸10sec，35个循环；72℃延伸5min。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各0.75μL-1μL，DNA模板量为0.059ng-236.4ng，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各0.75μL-1μL，DNA模板量为0.059ng-100ng，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，0.0591ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，0.591ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，5.91ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，59.1ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，59.1ng/μL的DNA模板2μL，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，59.1ng/μL的DNA模板4μL，ddH2O补足至25μL。
在一些实施例中，对获得的扩增产物琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定；琼脂糖凝胶电泳方法：PCR产物5μL，电压120V，时间30min；鉴定粉拟青霉菌特征在于，可以获得大小为200-300bp唯一条带。
另一方面，本发明提供了一种使用本发明所述的方法鉴定粉拟青霉菌的试剂盒。
另一方面，本发明提供了本发明所述引物的应用，其特征在于，包括：
制备用于检测或辅助检测粉拟青霉菌的试剂盒；
检测或辅助检测待测样品中是否含有粉拟青霉菌；
制备用于鉴定或辅助鉴定粉拟青霉菌的试剂盒；
鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉菌；
制备用于鉴定或辅助鉴定粉拟青霉菌的真伪性的试剂盒；
鉴定或辅助鉴定粉拟青霉菌的真伪性。
另一方面，本发明提供了本发明所述方法的应用，其特征在于，包括：
检测或辅助检测待测样品中是否含有粉拟青霉菌；
鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉菌；
鉴定或辅助鉴定粉拟青霉菌的真伪性。
详细说明
本发明将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出。本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本发明申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术，或如本发明申请所控制的范围。
本发明所使用的“引物”是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR(聚合酶链式反应)技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
本发明所使用的“鉴定粉拟青霉菌的方法”包括但不限于检测或辅助检测待测样品中是否含有粉拟青霉菌；鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉菌；鉴定或辅助鉴定粉拟青霉菌的真伪性。
本发明所使用的“琼脂糖凝胶电泳方法”为用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法，其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用，本发明使用的琼脂糖凝胶浓度为2％。
本发明所使用的“2x PrimeSTAR Max premix”为PCR反应中使用的一种扩增体系，含有PrimeSTAR HS DNA聚合酶、2mM Mg2+、0.4mM dNTP。
本发明所使用的“Pfu Mix”为PCR反应中使用的一种扩增体系，含有Pfu DNA聚合酶、0.4mM dNTP、100mM KCl、20mM Tris-Cl、3mM MgCl2、溴酚蓝。
本发明所使用的“PCR Mix”为PCR反应中使用的一种扩增体系，含有0.1U/μL TaqDNA聚合酶、0.4mM dNTP、100mM KCl、20mM Tris-Cl、3mM MgCl2、溴酚蓝。
本发明所使用的“PCR扩增体系”是指PCR体外扩增所需试剂的一个组合。PCR为聚合酶链式反应的缩写，是一种体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
本发明所使用的“mM”为浓度单位mmol/L的缩写。
本发明所使用的“ddH2O”为无菌双蒸水的缩写。
NF154序列为序列表中SEQ ID NO.1：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’
NR428序列为序列表中SEQ ID NO.2：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’
本发明提供的粉拟青霉菌特异性引物NF154/NR428特异性强，扩增效果好，耐用性好，灵敏度高，适用条件广，可以鉴别冬虫夏草，凉山虫草，戴氏虫草，亚香棒虫草，新疆虫草，马草，水黑草，白草，蛹虫草，蝉花等多种物种是否含有粉拟青霉菌，也可用于区别粉拟青霉与金龟子绿僵菌，球孢白僵菌，布氏白僵菌、粘孢白僵菌、多形白僵菌、宛式拟青霉等。
附图说明
图1NF154/NR428不同退火温度考察凝胶电泳图，其中1代表S10；2代表S11；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图2NF154/NR428不同反应时间考察凝胶电泳图，其中1代表S10；2代表S11；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图3NF154/NR428不同反应轮数考察凝胶电泳图，其中1代表S10；2代表S11；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图4NF154/NR428不同引物量考察凝胶电泳图，其中1代表S10；2代表S11；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图5NF154/NR428不同酶考察凝胶电泳图，其中1代表S10；2代表S11；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图6NF154/NR428不同模板量考察凝胶电泳图，其中1-7依次代表S11模板量236.4ng/118.2ng/59.1ng/5.91ng/0.591ng/0.0591ng/0.00591ng,N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图7NF154/NR428重复性考察凝胶电泳图，其中1-6代表S11；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图8NF154/NR428中间精密度考察凝胶电泳图，其中1-6代表S11；N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
图9NF154/NR428引物对用于粉拟青霉的快速PCR鉴别，其中A为NF154/NR428与粉拟青霉样品PCR扩增，1-11代表S1-S11；B为NF154/NR428伪品鉴别，1-15代表S12-S26，16代表S11，以S11作为阳性对照溶液；C为NF154/NR428伪品鉴别，1-15代表S27-S41，16代表S11，以S11作为阳性对照溶液，N代表阴性对照(无菌双蒸水)，M代表Marker。
具体实施方式
为能进一步解释本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点与方案，结合以下附图与具体实施方式对本发明的详述进行进一步地解释。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明做各种修改和改动，这些等价形式同样落于本发明所要求保护的范围内。
实施例1：粉拟青霉菌引物的设计
1、样品来源
表1样品来源
Figure BDA0002294939640000061
注：混合混末*是指人为制作含有粉拟青霉的虫生真菌样品，即将冬虫夏草(S12)、凉山虫草(S27)、戴氏虫草(S28)、亚香棒虫草(S29)、新疆虫草(S30)、马草(31)、白草(S33)、蛹虫草(S34)的粉末按照50:1(g/g)的比例分别与粉拟青霉冻干粉末(S11)混合均匀后得到样品S1～S8。因较难搜集自然界含有粉拟青霉的虫生真菌样品，所以人为制作含有粉拟青霉的样品用以验证。若市面上的药材含有粉拟青霉可通过该方法快速鉴别。
2、实验仪器与试剂
表2实验仪器
仪器名称 型号 生产厂家
涡旋混匀器 Vortex Genie 3 德国IKA
电子天平 MEI002E Metter Toledo
高通量组织研磨仪 Tissue/Ginnder2000 科瑞恩特
离心机 5425 Eppendorf
PCR仪 ProFlex 3*32well Life technologies
核酸蛋白仪 ND-2000 Thermo Scientific
电泳仪 DYY-6D型 北京市六一仪器厂
混合球磨仪 MM400 德国莱驰/广州东锐科技
脉动真空灭菌器 XGLDTED 山东新华医疗器械
迷你离心机 D1008E 北京大龙
凝胶成像系统 Tanon 3500 上海天能科技
微波炉 PJ210C-BF 美的
表3实验试剂
Figure BDA0002294939640000071
3、DNA提取
取样品约30mg至2mL离心管中，利用天根高效植物基因组提取试剂盒提取含有粉拟青霉菌样品以及不含有粉拟青霉样品的DNA。提取物分装5μL/管，放置-20℃备用4、ITS通用引物PCR扩增反应
取粉拟青霉菌DNA提取物，利用ITS通用引物对ITS5F/ITS4R进行PCR扩增反应，PCR产物由测序公司(广州天一辉远基因科技有限公司)测序。
通用引物对：ITS5F：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
ITS4R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR扩增体系：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL，10μmol/L的ITS5F/4R引物对各1μL，DNA模板量(浓度<100ng/μL)为1μL，补充无菌双蒸水至25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性45s，64℃退火45s，72℃延伸1min，35轮；72℃最后延伸10min。
5、PCR产物测序设计特异性引物
基于ITS基因核酸片段设计特异性引物对：将测序得到的粉拟青霉菌基因组序列，通过BLAST数据库比对，获得并下载同源性高的基因序列，应用DNAMAN软件将测得的序列与下载的序列一同进行比对，找到变异位点比较多的片段，将该片段导入引物设计软件PrimerPremier 5.0，设计出10对粉拟青霉特异性引物，并筛选出1对对粉拟青霉具有特异性的引物(PCR产物凝胶电泳图上仅有粉拟青霉样品在200bp～300bp之间出现大小为274bp的预期目标条带，伪品和阴性对照溶液在200bp～300bp之间相应位置无条带)，序列如下：
正向引物NF154：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’
反向引物NR428：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’
实施例2：PCR扩增条件和程序研究
取粉拟青霉样品S10、S11，提取DNA，利用NF154/NR428引物对进行PCR扩增。
1、退火温度研究(49℃/52℃/55℃/58℃)
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，49℃/52℃/55℃/58℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，退火温度为49℃～58℃，粉拟青霉样品溶液均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带，58℃时目标条带的亮度较淡；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。说明在本实验设置的退火温度49℃～58℃范围内，NF154/NR428引物对皆可对粉拟青霉进行鉴定。结果如图1所示。
2、反应时间考察
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可
PCR扩增程序：设置五种反应时间1/2/3/4/5
表4不同反应时间参数设置
Figure BDA0002294939640000091
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，五种不同的反应时间下粉拟青霉供试品溶液均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。说明本实验设置的不同反应时间对粉拟青霉特异性PCR快速检测结果皆无影响。结果如图2所示。
3、反应轮数考察
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，25轮/30轮/35轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，三个不同的反应轮数粉拟青霉供试品溶液均在200～300bp之间有相同的单一目标DNA条带；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。本实验设置的反应轮数为25轮～35轮皆对粉拟青霉特异性PCR快速检测结果无影响。结果如图3所示。
实施例3：耐用性研究
1、不同引物量考察
取粉拟青霉样品S10、S11，提取DNA，利用NF154/NR428引物对进行PCR扩增。
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各0.75μL/1μL/1.25μL，DNA模板量(浓度<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，三种不同引物量(0.75μL、1μL、1.25μL)粉拟青霉样品溶液均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带，阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。说明在本实验设置的不同引物量(0.3μM～0.5μM)皆对粉拟青霉特异性PCR快速检测结果无影响。结果如图4所示。
2、不同酶考察
取粉拟青霉样品S10、S11，提取DNA，利用NF154/NR428引物对进行PCR扩增。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可。
PCR扩增体系：2x PrimeSTAR Max DNA Polymerase/Pfu Mix/PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，应用3种酶，粉拟青霉供试品溶液均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带，应用酶Pfu Mix，仅S10样品在200～300bp之间出现较浅的目标条带，应用PrimerSTAR Max DNA Polymerase出现的目标条带较亮，但S11样品出现了较多的非特异性条带；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现条带，结果可靠。说明本实验设置的PCR条件更适于PCR Mix酶。结果如图5所示。
3、不同模板量考察
取粉拟青霉样品S11，提取DNA，利用NF154/NR428引物对进行PCR扩增。
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，浓度59.1ng/μL的DNA模板4μL/2μL/1μL，或者浓度59.1ng/μL稀释10倍/100倍/1000倍/10000倍的DNA模板1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，DNA模板量初始浓度范围为59.1ng/μL，在本实验的模板量梯度设置中，各个不同的模板量(除了0.00591ng的模板量)，粉拟青霉样品溶液均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置未出现条带。说明本发明所述的引物对NF154/NR428在模板量236.4ng～0.0591ng范围内的灵敏度高。结果如图6所示。
实施例4：NF154/NR428引物对重复性研究
取粉拟青霉样品S11，分别提取DNA 6次，平行制备6份样品溶液，分别利用NF154/NR428引物对进行PCR扩增。
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度：10ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，6个平行样品均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带，条带亮度基本一致；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置未出现条带，结果可靠。说明该方法重复性好，可用于粉拟青霉快速检测。结果如图7所示。
实施例5：NF154/NR428引物对中间精密度研究
取粉拟青霉样品S11，提取DNA，平行制成6份样品，分别利用NF154/NR428引物对进行PCR扩增。
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度：10ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，6个平行样品均在200～300bp之间有相同的单一DNA条带，条带亮度一致；阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置未出现条带，结果可靠。该方法满足中间精密度要求，可用于粉拟青霉快速检测。结果如图8所示。
由实施例2-5可得，NF154/NR428引物对的优选PCR反应条件为
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量236.4ng～0.0591ng，无菌双蒸水补足至25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
实施例6粉拟青霉鉴定
取含有粉拟青霉的样品(S1～S11)，和不含有粉拟青霉的样品(S12～S41)，提取DNA，利用NF154/NR428引物对进行PCR扩增。
PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，NF154/NR428引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板量(浓度<100ng/μL)为1μL，无菌双蒸水补足至25μL。
阴性对照液：将模板量换为等量的无菌双蒸水即可。
PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸10s，30轮；72℃最后延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析，11批含有粉拟青霉的阳性样品溶液均在200～300bp之间出现相同的单一DNA条带，表明只要样品中含有微量的粉拟青霉皆可被检测到，表明该对引物的灵敏度高；30个不含有粉拟青霉的样品溶液和阴性对照溶液在200～300bp之间相应位置均未出现与阳性样品溶液相同的DNA目标条带，结果如图9所示。说明该特异性引物对NF154/NR428特异性好，可鉴别粉拟青霉与其他品种拟青霉，可鉴别粉拟青霉与其他不同属的样品，可应用于鉴别粉拟青霉真伪或样品中是否含有粉拟青霉。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司
广东东阳光药业有限公司
<120> 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
<130> 2019.11.28
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cccaaactct gtattctc 18
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggccggcggt atacag 16

Claims (10)

1.一种鉴定粉拟青霉菌的特异性引物，其特征在于，其序列如下：
NF154：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’；
NR428：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’。
2.一种鉴定粉拟青霉菌的试剂盒，其特征在于，包含以下引物：
NF154：5’-CCCAAACTCTGTATTCTC-3’；
NR428：5’-GGCCGGCGGTATACAG-3’。
3.一种鉴定粉拟青霉菌的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒。
4.一种鉴定粉拟青霉菌的方法，其特征在于，包括步骤：
a)提取待测样品的基因组DNA；
b)利用权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒对步骤a)中的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
c)利用步骤b)中获得的扩增产物鉴定所述待测样品。
5.根据权利要求4所述的鉴定粉拟青霉菌的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性15sec-45sec，49℃-58℃退火15sec–45sec，72℃延伸10sec，25-35个循环；72℃延伸5min；
任选的，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
任选的，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性15sec，52℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
任选的，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性20sec，52℃退火20sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
任选的，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性35sec，52℃退火35sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
任选的，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45sec，52℃退火45sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
任选的，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸10sec，25个循环；72℃延伸5min；
任选的，PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸10sec，35个循环；72℃延伸5min。
6.根据权利要求4所述的鉴定粉拟青霉菌的方法，其特征在于，PCR扩增体系：PCR Mix12.5 μL，10μmol/L的正反向引物各0.75μL-1μL，DNA模板量为0.0591ng-236.4ng，ddH2O补足至25μL；
任选的，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，0.0591ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL；
任选的，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，0.591ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL；
任选的，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，5.91ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL；
任选的，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，59.1ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O补足至25μL；
任选的，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，59.1ng/μL的DNA模板2μL，ddH2O补足至25μL；
任选的，PCR扩增体系：PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各1μL，59.1ng/μL的DNA模板4μL，ddH2O补足至25μL。
7.根据权利要求4所述的鉴定粉拟青霉菌的方法，其特征在于，对获得的扩增产物琼脂糖凝胶电泳方法进行鉴定；琼脂糖凝胶电泳方法：PCR产物5μL，电压120V，时间30min；鉴定粉拟青霉菌的特征在于，可以获得大小为200-300bp唯一条带。
8.一种使用权利要求4-7任一项所述方法鉴定粉拟青霉菌的试剂盒。
9.权利要求1所述引物的应用，其特征在于，包括：
制备用于检测或辅助检测粉拟青霉菌的试剂盒；
检测或辅助检测待测样品中是否含有粉拟青霉菌；
制备用于鉴定或辅助鉴定粉拟青霉菌的试剂盒；
鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉菌。
10.权利要求4-7任一项所述方法的应用，其特征在于，包括：
检测或辅助检测待测样品中是否含有粉拟青霉菌；
鉴定或辅助鉴定待测样品是否为粉拟青霉菌。
CN201911197113.4A 2019-11-29 2019-11-29 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用 Pending CN112877452A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911197113.4A CN112877452A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911197113.4A CN112877452A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112877452A true CN112877452A (zh) 2021-06-01

Family

ID=76039626

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911197113.4A Pending CN112877452A (zh) 2019-11-29 2019-11-29 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112877452A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009145314A1 (ja) * 2008-05-29 2009-12-03 花王株式会社 パエシロマイセス バリオッティの検出方法
CN103045719A (zh) * 2011-10-14 2013-04-17 张艳军 一种用于拟青霉真菌群落结构分析的dgge引物
CN106010985A (zh) * 2016-06-24 2016-10-12 南京林业大学 一株粉棒束孢hs05及其应用
WO2018060474A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Method for modifying the resistance profile of spinacia oleracea to downy mildew
CN107974511A (zh) * 2017-12-07 2018-05-01 重庆太极医药研究院有限公司 粉棒束孢特异性检测试剂盒及其检测方法
WO2019063839A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. CMV RESISTANCE ALLEL
CN109628626A (zh) * 2018-12-07 2019-04-16 广东东阳光药业有限公司 鉴定梯棱羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
CN109825624A (zh) * 2019-03-07 2019-05-31 宜昌山城水都冬虫夏草有限公司 一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对、试剂盒、方法及其用途
CN110484649A (zh) * 2019-09-25 2019-11-22 成都图径生物科技有限公司 荧光定量pcr检测粉拟青霉菌的引物和探针

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009145314A1 (ja) * 2008-05-29 2009-12-03 花王株式会社 パエシロマイセス バリオッティの検出方法
CN103045719A (zh) * 2011-10-14 2013-04-17 张艳军 一种用于拟青霉真菌群落结构分析的dgge引物
CN106010985A (zh) * 2016-06-24 2016-10-12 南京林业大学 一株粉棒束孢hs05及其应用
WO2018060474A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Method for modifying the resistance profile of spinacia oleracea to downy mildew
WO2019063839A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. CMV RESISTANCE ALLEL
CN107974511A (zh) * 2017-12-07 2018-05-01 重庆太极医药研究院有限公司 粉棒束孢特异性检测试剂盒及其检测方法
CN109628626A (zh) * 2018-12-07 2019-04-16 广东东阳光药业有限公司 鉴定梯棱羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
CN109825624A (zh) * 2019-03-07 2019-05-31 宜昌山城水都冬虫夏草有限公司 一种鉴别冬虫夏草真伪的引物对、试剂盒、方法及其用途
CN110484649A (zh) * 2019-09-25 2019-11-22 成都图径生物科技有限公司 荧光定量pcr检测粉拟青霉菌的引物和探针

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAJAHAN JOHNY等: "Isolation and characterisation of Isaria farinosa and Purpureocillium lilacinum associated with emerald ash borer, Agrilus planipennis in Canada", BIOCONTROL SCIENCE AND TECHNOLOGY, vol. 22, pages 723 - 732 *
董彩虹 等: "我国虫草产业发展现状、问题及展望――虫草产业发展金湖宣言", 菌物学报, no. 01, pages 1 - 15 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106957927A (zh) 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN107841566B (zh) 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用
CN113151567B (zh) 用于鉴别花脸香蘑n006#菌株的ssr分子标记及方法
CN112725514A (zh) 一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法
CN112522434A (zh) 一种用于同时检测多种致病性真菌的引物组及试剂盒
CN109371110B (zh) 一种杨树细菌性溃疡病菌的lamp检测试剂盒
CN110735003A (zh) 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法
CN114134218B (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法
CN112877452A (zh) 鉴定粉拟青霉的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
CN113755620B (zh) 一种快速检测两种利什曼原虫的核酸检测试剂盒及其应用
CN112501321B (zh) 结核分枝杆菌的分子分型方法
KR101765677B1 (ko) 결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법
CN110863057B (zh) 一种引物对及其在鉴定宽体金线蛭中的应用
CN108300804A (zh) 用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法
CN112725513A (zh) 一种定量检测西红花的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法
CN109929943B (zh) 甘草issr荧光分子标记引物及其应用
CN114381550A (zh) 用于hpv分型的多靶标核酸检测试剂盒和检测方法
CN109913570B (zh) 用于鉴别川贝母真伪或用于检测川贝母掺伪程度的pcr引物和方法
CN108359746B (zh) 检测由Hela细胞引起的细胞交叉污染的方法及引物
CN113817849A (zh) 一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用
CN112824542A (zh) 鉴别白僵菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
KR20210046887A (ko) 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
CN109628626A (zh) 鉴定梯棱羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
CN109628625A (zh) 鉴定六妹羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用
EP3252167A1 (en) Visually determinable genetic testing

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination