CN112725514A

CN112725514A - 一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字pcr引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112725514A
Application number: CN202110195788.6A
Authority: CN
Inventors: 闫邦奇; 廖力; 徐淼锋; 林伟; 水克娟; 黎财慧
Original assignee: Gongbei Customs Technology Center
Current assignee: Gongbei Customs Technology Center
Priority date: 2021-02-22
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2021-04-30

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。所述定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物的核苷酸序列为：DCXC‑ITS‑F：5’‑CTGCGAACACCACAGCAGTTG‑3’(SEQ ID No.1)，DCXC‑ITS‑R：5’‑CATTTGCTTGCTTCTTGACTGA‑3’(SEQ ID No.2)。所述定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR探针的核苷酸序列为：DCXC‑ITS‑P：5’‑AGATGCCACTGCGACAGGAGGGTC‑3’(SEQ ID No.3)。采用上述引物和探针能够对冬虫夏草进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

Description

一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

冬虫夏草是一种属于真菌类植物，是寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫绿蝙蝠蛾的幼虫体内的虫和真菌的结合体。这种真菌和青霉菌类似，同属于真菌的子囊菌纲，当它的子囊孢子成熟散落后，冬季遇到垫居在土中的虫草蝙蝠蛾的幼虫，就钻到虫的身体内萌发为菌丝体，吸收虫体的养料。从冬季到夏季，菌丝体慢慢把幼虫内部吃光，剩下死幼虫的一层皮，里面包的是变得密实的藏着大量养料的菌丝体了，这便称作“冬虫”；到了夏天，这个菌核从幼虫头顶上长出草来，露于土外细长如棒，即所谓的“夏草”。历来统称为冬虫夏草或冬虫草、虫草。

冬虫夏草作为我国传统的名贵食疗滋补品，素与人参、鹿茸齐名。始载于《本草从新》、《本草纲目拾遗》等典籍，为历代医家推崇倍至的良药。据《重庆堂随笔》云称冬虫夏草，具温和平补之性，为治疗虚证、虚痞、虚胀、虚痛之圣药，功胜九香虫。凡阴虚阳亢而为喘逆痰嗽者，授之悉效，调经种子有专能也。《云南中草药》亦载：“冬虫夏草，补肺、壮肾阳，治痰饮喘咳、诸虚劳损所不足之症宜用之。”

由于冬虫夏草的中药材价值珍贵，常常被不法分子假借其他原料来冒充，或者在冬虫夏草中掺杂其它原料。为满足检验监管工作和相关部门打假执法的需要，希望提供一种可靠的冬虫夏草检测方法。

当前所用于冬虫夏草的分子生物学检测方法较少，主要为常规PCR或荧光定量PCR，常规PCR检测繁琐不便，而荧光定量PCR所用的标准曲线又会对测量结果产生影响，因此上述方法均不能满足实际的检测需要。

而数字PCR作为核酸定量的新技术，本质上将一个传统的PCR反应分成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立扩增和检测目的序列，减少了背景序列及抑制物对PCR反应的干扰，从而大大提高了检测的灵敏度。其中ddPCR(微滴式数字PCR)更是无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的定量检测，解决了荧光定量PCR所用的标准曲线对测量结果产生影响等问题。

因此，研发出一种可更好用于检测冬虫夏草的试剂盒及方法成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法，能够对冬虫夏草进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物，所述引物的核苷酸序列为：

DCXC-ITS-F：5’-CTGCGAACACCACAGCAGTTG-3’(SEQ ID No.1)，

DCXC-ITS-R：5’-CATTTGCTTGCTTCTTGACTGA-3’(SEQ ID No.2)。

一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR探针，所述探针的核苷酸序列为：

DCXC-ITS-P：5’-AGATGCCACTGCGACAGGAGGGTC-3’(SEQ ID No.3)。

本发明基于ITS(内转录间隔区)序列进行特异性引物和探针的设计，经所述引物扩增得到的片段长度为130bp。

优选的，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。

所述荧光基团选自FAM、TET、HEX、CY3或JOE，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。

一种定量检测冬虫夏草的试剂盒，包括上述检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物和检测冬虫夏草的微滴式数字PCR探针。

优选的，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针，

所述检测内参基因的引物的核苷酸序列为：

ZJ-5.8S-F：5’-CATCGATGAAGAACGCAGCG-3’(SEQ ID No.4)，

ZJ-5.8S-R：5’-ATGACGCTCGAACAGGCATGC-3’(SEQ ID No.5)；

所述检测内参基因的探针的核苷酸序列为：

ZJ-5.8S-P：5’-TGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG-3’(SEQ ID No.6)。

由于5.8S基因具有较高的保守性，因此本发明将5.8S基因作为内参基因，并设计得到上述检测内参基因的引物和探针。

更优选的，所述检测内参基因的探针的5’端标记有荧光基团，所述检测内参基因的探针的3’端标记有淬灭基团。为实际检测需要，检测特异性基因的探针与检测内参基因的探针在5’端所标记的荧光基团不相同。

一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR方法，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以所述样品DNA为模板，加入上述试剂盒中的引物和探针、ddPCR Super Mix和蒸馏水，得到反应体系；

(3)将步骤(2)配制的反应体系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴发生器中生成微滴；

(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。

优选的，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、10μmol/L的上下游引物(DCXC-ITS-F和DCXC-ITS-R)各1.8μL、10μmol/L探针(DCXC-ITS-P)0.5μL、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。

优选的，步骤(2)中上游引物的终浓度为600-1200nmol/L，下游引物的终浓度为600-1200nmol/L，探针的终浓度为150-400nmol/L。

优选的，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本研究采用双通道法，即对检测冬虫夏草内源基因ZJ-5.8S和特异性基因DCXC-ITS的探针进行不同的荧光标记，在同一个PCR反应体系中同时测定内源基因和特异性基因的分子数，建立基于微滴式数字PCR技术的定量检测方法，应用于冬虫夏草及其产品的快速鉴定和分析，具有高效、准确、快速的特点，为检验监管工作和相关部门打假执法提供的更有力的依据，对提升中药材成分定量检测能力，规范相关企业的生产行为，保障中药材市场安全具有重大的意义。

附图说明

图1为实施例4中特异性检测的结果；

图2为实施例5中检测冬虫夏草的线性范围拟合标准曲线，其中A为内参基因ZJ-5.8S的拟合标准曲线，B为特异性基因DCXC-ITS的拟合标准曲线；

图3为实施例7中90％含量的冬虫夏草数字PCR检测结果，其中通道1用于检测DCXC-ITS，通道2用于检测ZJ-5.8S。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实验材料：冬虫夏草DCXC-01购自中国食品药品检定研究院，古尼虫草GNCC-01采自云南，古尼虫草GNCC-02采自广东，戴氏虫草DSCC-01采自广东，凉山虫草LSCC-01采自云南，蛹虫草YCC-01采自云南，新疆虫草XJCC-01采自新疆。

主要试剂及仪器：恒温孵育仪(德国Eppendorf公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；KingFisher mL核酸自动提取仪(美国赛默飞世尔公司)；NanoDrop1000微量紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)；Bio-Rad QX200TM Droplet Digital PCR系统(包括微滴生成卡、微滴发生器、封膜仪、梯度PCR仪和微滴荧光检测仪)(美国伯乐公司)；移液枪(德国艾本德公司)。CTAB裂解液(20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl)；磁珠吸附缓冲液(5g/LCTAB，40mmol/L NaCl)；磁珠悬浮液(洛阳爱森生物科技有限公司)；TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，EDTA二钠1mmol/L，pH为8.0)；75％酒精；2×ddPCR supermix for probes、微滴生成油(droplet generation oil for probes)、微滴分析油(ddPCR droplet readeroil)(美国伯乐公司)。

实施例1

本实施例提供一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物、探针，发明人基于ITS(内转录间隔区)序列，通过分析冬虫夏草区别于其他相近真菌类的特异性保守区域，使用分子生物学软件进行特异性引物和探针的设计。

其中设计得到的引物核苷酸序列为：

DCXC-ITS-F：5’-CTGCGAACACCACAGCAGTTG-3’(SEQ ID No.1)，

DCXC-ITS-R：5’-CATTTGCTTGCTTCTTGACTGA-3’(SEQ ID No.2)；

其中设计得到的探针核苷酸序列为：

DCXC-ITS-P：5’-AGATGCCACTGCGACAGGAGGGTC-3’(SEQ ID No.3)。

DCXC-ITS-P探针的5’端标记有荧光基团FAM，DCXC-ITS-P探针的3’端标记有淬灭基团BHQ1。

使用上述引物扩增得到的片段长度为130bp。

实施例2

本实施例提供一种定量检测冬虫夏草的试剂盒，包括实施例1中的引物DCXC-ITS-F、DCXC-ITS-R和引物DCXC-ITS-P，还包括检测内参基因的引物ZJ-5.8S-F、ZJ-5.8S-R和探针ZJ-5.8S-P，检测内参基因的引物的核苷酸序列为：

ZJ-5.8S-F：5’-CATCGATGAAGAACGCAGCG-3’(SEQ ID No.4)，

ZJ-5.8S-R：5’-ATGACGCTCGAACAGGCATGC-3’(SEQ ID No.5)；

检测内参基因的探针的核苷酸序列为：

ZJ-5.8S-P：5’-TGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG-3’(SEQ ID No.6)。

使用上述引物扩增得到的片段长度为125bp。

该检测内参基因的探针的5’端标记有荧光基团HEX，3’端标记有淬灭基团BHQ1。由于5.8S基因具有较高的保守性，因此本发明将5.8S基因作为内参基因，并设计得到上述检测内参基因的引物和探针。

实施例3

本实施例提供一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR方法，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以样品DNA为模板，加入实施例2中试剂盒的引物和探针、ddPCR Super Mix和蒸馏水，得到反应体系；

(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析，计算得出样本的核酸浓度。

其中样品DNA提取方法不作限制，可选用CTAB法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、异硫氰酸胍法或碱裂解法。

其中步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、每种上下游引物各1.8μL，浓度为10μmol(在反应体系中的终浓度为900nmol/L)、每种探针0.5μL，浓度为10μmol/L(在反应体系中的终浓度为250nmol/L)、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。

步骤(3)的具体操作为：将上述20μL反应体系和70μL矿物油一同加入到微滴发生卡的相应孔中，在微滴发生器上自动生成微滴，然后将产生的40μL油包水微滴小心地转移到96孔反应板中，再将96孔反应板在封膜仪上封膜，最后在梯度PCR仪上进行扩增反应。

步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。扩增完成后通过微滴式数字PCR荧光分析系统中进行荧光分析，在连接仪器的软件中进行设置：选择绝对定量方法，将特异性基因通道设置为FAM荧光通道，内参基因通道设置为HEX荧光通道，进行荧光数据分析。

实施例4

特异性检测

选取经实时荧光PCR方法特异性验证过的样品(已知悉样品的具体种类)，按实施例3中的检测方法进行ddPCR(微滴式数字PCR)特异性扩增，从而验证该检测方法的特异性。

检测结果如图1所示，实施例1中的特异性引物和探针可对冬虫夏草样品DCXC-01(对应C02)进行有效的扩增，而被测样品GNCC-01，GNCC-02，DSCC-01，LSCC-01，YCC-01，XJCC-01(以上样品分别对应A06、B06、C06、D06、E06、F06)等对照组和空白对照组CK(对应H06)均未有信号扩增，表明该方法能够特异性的扩增冬虫夏草。

实施例5

灵敏性检测

为了确定数字PCR检测体系的灵敏度，将1ng/μL阳性样品DNA，分别稀释至200pg/μL、40pg/μL、8pg/μL、1.6pg/μL和0.32pg/μL等5个浓度梯度，采用实施例3的方法进行灵敏度检测(由于样品DNA占反应体系体积的十分之一，因而反应体系中模板量浓度为样品DNA的十分之一)，每个浓度梯度做3次重复试验。统计每个反应的拷贝数，测试该方法体系的灵敏度。灵敏度检测结果如表1所示，线性范围内的数据拟合标准曲线如图2所示。

表1检测冬虫夏草的微滴式数字PCR方法的线性范围

通过表1中实际拷贝数的检测结果，绘制得到图2的数据拟合标准曲线。由图2中A可以看出，在内参基因ZJ-5.8S的拷贝数位于3.27-963.6的区间内可以呈现出良好的线性，R²为0.9963，所有浓度组的RSD值位于2.79％到15.71％之间，均小于25％；由图2中B可以看出，DCXC-ITS基因拷贝数位于0.67-948.53的区间内可以呈现出良好的线性，R²为0.9975，所有浓度组的RSD值位于2.22％到17.32％之间，均小于25％。表明本方法在模板量浓度为0.16-100pg/μL时具有良好的定量检测能力。

实施例6

定量检测限

取在线性范围验证中可以稳定扩增的最低DNA浓度组进行定量检测限(Limit OfQuantitation，LOQ)的验证，本方法研究中的定量检测限是指在方法线性范围内可以进行稳定定量检测最低拷贝数。因此取线性范围验证结果的最低模板量(即0.16pg/μL)进行LOQ值验证。将模板量为0.16pg/μL的样品DNA进行8个平行的微滴式数字PCR扩增，计算每个平行的内参基因和特异性基因的拷贝数，计算平均值和RSD值，试验结果见表2。

表2检测冬虫夏草的微滴式数字PCR方法的LOQ验证结果

由表2可以得出，内参基因ZJ-5.8S的8个平行扩增的拷贝数平均值为3.15个/μL，RSD为15.27％，低于所限定的25％，符合方法要求，说明本方法对单位体系内的内参基因可进行稳定的定量检测的最低拷贝数为63个(由于反应体系为20μL，因此最低拷贝数为20×3.15＝63个)。DCXC-ITS基因的8个平行扩增拷贝数平均值为2.90个/μL，RSD为17.77％，低于所限定的25％，符合方法要求，说明本方法对单位体系内的DCXC-ITS基因可进行稳定定量检测的最低拷贝数为58个(由于反应体系为20μL，因此最低拷贝数为20×2.9＝58个)。

实施例7

准确度验证

将冬虫夏草和古尼虫草完全干燥后混合，分别得到冬虫夏草含量为90％、50％、10％和0.5％的样品，并分别进行核酸提取，将核酸样品稀释到1ng/μL，进行微滴式数字PCR准确度验证，每组8个重复，计算特异性基因和内参基因拷贝数及其百分比，求百分比的平均值，得出实际检测含量，计算RSD，验证方法的准确度。冬虫夏草数字PCR定量检测方法的准确度验证结果见表3所示。

表3检测冬虫夏草的微滴式数字PCR方法的准确度验证

通过表3可知，冬虫夏草理论含量值为90％、50％、10％和0.5％时所测得的含量分别为86.85％、50.95％、11.06％和0.53％，对应检测的RSD值分别为3.83％、2.86％、10.56％和13.31％，三组检测结果的相对标准偏差均小于25％，符合试验方法的要求，而图3表示90％含量的冬虫夏草数字PCR准确度检测结果。由上可知，本方法可针对冬虫夏草样品进行准确的绝对定量检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 拱北海关技术中心

<120> 一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgcgaacac cacagcagtt g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catttgcttg cttcttgact ga 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatgccact gcgacaggag ggtc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catcgatgaa gaacgcagcg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgacgctcg aacaggcatg c 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcgataagt aatgtgaatt gcag 24

Claims

1.一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

DCXC-ITS-F：5’-CTGCGAACACCACAGCAGTTG-3’(SEQ ID No.1)，

DCXC-ITS-R：5’-CATTTGCTTGCTTCTTGACTGA-3’(SEQ ID No.2)。

2.一种定量检测冬虫夏草的微滴式数字PCR探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：DCXC-ITS-P：5’-AGATGCCACTGCGACAGGAGGGTC-3’(SEQ ID No.3)。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。

4.一种定量检测冬虫夏草的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物、权利要求2或3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针，所述检测内参基因的引物的核苷酸序列为：

ZJ-5.8S-F：5’-CATCGATGAAGAACGCAGCG-3’(SEQ ID No.4)，

ZJ-5.8S-R：5’-ATGACGCTCGAACAGGCATGC-3’(SEQ ID No.5)；

所述检测内参基因的探针的核苷酸序列为：

ZJ-5.8S-P：5’-TGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG-3’(SEQ ID No.6)。

6.一种检测冬虫夏草的微滴式数字PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以所述样品DNA为模板，加入权利要求4或5中所述试剂盒中的引物和探针、ddPCRSuper Mix和蒸馏水，配置得到反应体系；

(4)进行扩增反应，反应结束后进行微滴荧光数据分析。

7.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系包括以下组分：2×ddPCR Super Mix 10μL、10μmol/L的上下游引物(DCXC-ITS-F和DCXC-ITS-R)各1.8μL、10μmol/L探针(DCXC-ITS-P)0.5μL、样品DNA 2μL、采用灭菌蒸馏水补足至20μL。

8.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(2)中上游引物的终浓度为600-1200nmol/L，下游引物的终浓度为600-1200nmol/L，探针的终浓度为150-400nmol/L。

9.根据权利要求6所述的微滴式数字PCR方法，其特征在于，步骤(4)中扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个扩增；98℃保持10min使酶失活。