KR20170124728A - 인간과 마우스 관련 유전자 오염진단 시약, 이를 포함하는 분석 키트 및 오염 분석방법 - Google Patents

인간과 마우스 관련 유전자 오염진단 시약, 이를 포함하는 분석 키트 및 오염 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 본 발명은 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델의 뱅킹 과정에서 발생될 수 있는 종간의 오염여부를 확인할 수 있는 유전자형 진단키트 및 이를 이용한 오염도 판별방법에 대한 것이다. 본 출원에 의하면 마우스와 관련된 유전자의 오염을 모두 파악할 수 있고, 진단 민감도와 특이도가 100%에 가깝도록 높으며, 신속하게 검사할 수 있고, 마우스 오염을 예측하는 데에 매우 유용하다.
따라서, 본 발명은 인간과 마우스와 관련된 유전자의 오염을 미리 예측함으로써, 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델을 이용한 항암제 유효성 평가에 적용시킬 수 있고, 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델을 이용한 세포은행에도 지대한 기여를 할 수 있어 의료 산업상 매우 유용한 효과가 있다.

Description

인간과 마우스 관련 유전자 오염진단 시약, 이를 포함하는 분석 키트 및 오염 분석방법{Reagent for detecting cross contamination of PDX-model related with human and mouse, the kit comprising the same, and the method for the cross contamination detection}
본 출원은 환자유래 이종이식(PDX, patient derived xenograft) 모델에 있어서, 환자 유래 기질의 종양 및 마우스 기질 종양의 비율을 측정하기 위한 것으로서, 상기 이종이식 모델의 세대가 진행되면서 인간의 암 조직 또는 세포가 사라지고 마우스 기질로 전환됨에 따라 인간과 마우스의 기질 비율이 달라지므로, 암 조직 또는 세포 발생의 근원을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 마우스와 인간 유전자의 오염을 진단할 수 있는 프라이머 및 프로브가 포함된 분석 키트 및 이를 이용한 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도 분석 방법에 대한 것이다.
최근 환자맞춤형 항암치료를 통해 암을 극복하고자 하는 연구가 경쟁적으로 수행되고 있다. 항암치료를 위한 약물 개발 과정에서 새로운 치료제의 임상 시험 진입 여부를 결정하는 전임상 평가(preclinical test)는 성공 가능성이 높은 치료제를 선정하기 위해 중요한 과정으로서, 이 때 이용되어야 하는 이상적인 모델은 정확한 치료 반응 예측, 선행된 표적 분자 경로(molecular pathway)의 이해, 실제 임상 환자를 대변할 수 있는 조직학적, 분자적, 암 주위 미세환경의 보존, 약동학적 또는 약력학적 분석의 용이성 등 여러 조건을 만족해야 한다. 현재 새로운 항암 치료제에 대한 전임상 평가가 이루어지는 주요 세가지 모델은 유전자 조작 모델(genetically engineered models), 인간 암세포주에 기반한 이종 이식 모델(xenografts derived from 인간 tumor cell lines) 및 환자에서 유래한 암조직을 면역결핍 마우스에 바로 이식하는 이종 이식 모델(tumorgrafts from patients implanted directly into immunodeficient mice)이 있다.
지난 수십년 동안 다양한 암종을 대표하는 세포주 패널에 기반한 이종 이식 모델은 실제 임상에서 성공에 대한 예측도가 낮아, 주요 한계점으로 지적되어 왔다. 이를 극복하기 위한 대안으로, 외과적으로 절제된 환자 유래 암조직을 면역 결핍 마우스에 바로 이식하는 환자 유래 암조직 이종 이식 모델(patient-derived tumorgrafts, PDX)이 제시되었다. 환자유래 이종이식(PDX, patient derived xenograft) 및 세포유래 이종이식(CDX, cell derived xenograft) 종양 모델은 신약개발에 필요한 임상적 모델을 제공할 수 있으며, 환자유래 이종이식 모델은 마우스 모델에서 환자의 임상 실제상황을 더 잘 요약할 수 있기 때문에 전 임상연구에서 새로운 항암제에 접근하는 데 널리 사용되고 있다. 환자유래 이종이식 모델은 외과적으로 절제한 환자의 조직을 면역부전 마우스에 이식하여 정착시키는 것으로서, 이종 이식된 조직은 순차적으로 계대 배양, 냉동보관 및 재활성(revive) 시킬 수 있다. 또한, 연속적인 계대과정에서 초기에 유지되던 환자유래 기질이 점차 마우스 기질세포를 대체되면서 그 절대적인 양이 감소하나 상대적인 암과 기질의 비율은 유지되는 것으로 보고되었다. 초기와 후기 계대의 이종 조직에 대해 시행한 유전자 발현 프로파일의 비교를 통해 시간에 따른 기질 특성의 변화를 유추할 수 있으며, 또한 인간과 마우스에만 각각 선택적인 유전자 발현 어레이 분석을 통해 암과 암주위 미세 환경을 분리하여 분석할 수 있다. 따라서 환자유래 이종이식 및 세포유래 이종이식 종양 모델에서 환자 유래 기질의 종양 및 마우스 기질 종양의 비율을 측정함으로써 연속적인 계대과정에서 초기에 유지되던 환자유래 기질이 점차 마우스 기질세포로 대체되면서 나타날 수 있는 마우스 유래 조직의 오염을 용이하게 분석할 수 있는 방법이 요구된다.
선행기술문헌
-특허문헌
(특허문헌 1) KR2014-0133399 A
(특허문헌 2) US2015-0253340 A1
(특허문헌 3) JP2012-175928 A
(특허문헌 4) JP2007-209281 A
본 출원은 환자 유래 이종이식 모델에 있어서 환자 유래 기질의 종양 및 마우스 기질 종양의 비율을 측정함으로써 인간 유전자의 오염을 진단할 수 있는 진단키트 및 이를 이용한 유전자 오염도 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델에 있어서, 이식한 조직 또는 세포의 연속적인 계대과정에서 초기에 유지되던 환자유래 기질이 점차 마우스 기질세포로 대체되면서 나타날 수 있는 마우스 유래 조직의 오염을 용이하게 분석하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 출원은 인간과 마우스의 이종이식세포에 포함된 환자 유래 기질의 종양 및 마우스 기질 종양의 비율을 측정하기 위한 프라이머 및 프로브를 포함하는 진단키트에 관한 것이며, 상기 진단 키트를 이용하여 마우스 유래 조직의 오염을 분석할 수 있다. 특히, 상기 진단키트는 조직, 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델 등의 검체에서 오염 유무와 그 유전자형을 신속 정확하게 자동 분석하는데 매우 유용하다. 또한, 상기 분석 방법에 의하면 마우스와 관련된 유전자의 오염을 모두 파악할 수 있고, 진단 민감도와 특이도가 100%에 가깝도록 높으며, 유전자의 오염도를 신속하게 검사할 수 있다.
본 출원의 환자유래이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트는 서열번호 1 내지 4 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 9 및 10 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 예를 들어, 상기 서열번호 1 및 2 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머는 인간의 알부민 유전자 증폭용 프라이머이며, 상기 서열번호 3 및 4 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머는 마우스의 알부민 유전자 증폭용 프라이머일 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 4 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 유전자의 특이적인 부위와 상보적으로 결합함으로써 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 상기 서열번호 1 내지 4 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 9 및 10 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 진단키트를 이용하여 인간과 마우스의 이종이식세포에 포함된 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자 비율을 측정함으로써 환자유래 이종이식 세포의 오염도를 분석할 수 있다.
또한, 상기 진단키트는 증폭된 유전자를 검출하는 표지수단을 이용하여 인간과 마우스의 이종이식세포에 포함된 유전자의 비율을 판별하는 것을 특징으로 한다. 하나의 예시에서, 상기 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지수단을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 FAM, HEX, MGB 또는 BHQ1를 사용할 수 있다.
본 출원의 환자유래이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트의 또 다른 구현예는, 서열번호 5 내지 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 11 및 12 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 5 및 6 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머는 인간의 파폴라 유전자 증폭용 프라이머이며, 상기 서열번호 7 및 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머는 마우스의 파폴라 유전자 증폭용 프라이머일 수 있다. 상기 서열번호 5 내지 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 유전자의 특이적인 부위와 상보적으로 결합함으로써 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자를 증폭시킬 수 있다. 따라서, 상기 서열번호 5 내지 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 11 및 12 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 진단키트를 이용하여 인간과 마우스의 이종이식세포에 포함된 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 비율을 측정함으로써 환자유래 이종이식 세포의 오염도를 분석할 수 있다.
따라서, 본 출원의 환자유래이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트는 서열번호 1 내지 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 9 및 12 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 진단키트를 이용하여 인간과 마우스의 이종이식세포에 포함된 인간의 알부민 유전자와 마우스의 알부민 유전자 비율 및 인간의 파폴라 유전자와 마우스의 파폴라 유전자 비율을 측정할 수 있다.
또한, 본 출원에서는 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction), 특히 Conventional PCR, real-time PCR 또는 dd PCR(Droplet Digital PCR)을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 실행함으로써, 환자유래 이종이식 세포에서 인간의 유전자와 마우스 유전자의 비율을 측정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 '중합효소연쇄반응' 또는 'PCR(polymerase chain reaction)'은 일반(비정량) PCR과 정량 PCR을 포괄하는 것으로서, 예를 들어, 일반 PCR, 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이나, 문맥에 따라 '일반 PCR'을 가리키는 개념으로 사용될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 환자유래이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트에서 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 1 pmol 이상일 수 있으며, 이 경우, 환자유래 이종이식 세포의 오염도를 진단하는데 있어서 민감도를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, real-time PCR을 사용하여 유전자를 증폭시키는 경우에는, 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 1 pmol 이며, dd PCR을 사용하여 유전자를 증폭시키는 경우에는, 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 5 pmol 일 수 있다.
본 출원은 또한, 전술한 진단키트를 사용하여 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법에 관계한다.
예시적인 본 출원의 오염도 판별 방법은 전술한 진단키트를 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 따라, 전술한 진단키트에서 기재한 내용과 중복되는 내용은 생략하기로 한다.
본 출원의 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법의 일 구현예는, 서열번호 1 내지 4 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자를 PCR 방법에 의해 증폭하는 단계; 서열번호 9 및 10 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 가수분해시키는 단계; 및 상기 프로브에 결합 된 표지수단을 검출하는 단계를 포함 하며, 상기 오염도 판별방법에 의하면, 환자유래 이종이식 모델에 있어서 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자 비율을 측정할 수 있다.
본 출원의 오염도 판별방법의 또 다른 구현예는, 서열번호 5 내지 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자를 PCR 방법에 의해 증폭하는 단계; 서열번호 11 및 12 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 가수분해시키는 단계; 및 상기 프로브에 결합 된 표지수단을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 오염도 판별방법에 의하면, 환자유래 이종이식 모델에 있어서 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자 비율을 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법은 다음과 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 오염도 판별방법은 다음과 같이 7단계를 포함하여 구성될 수 있다.
1. 표준 및 대조군 검체의 준비
본 출원은 환자유래이종이식 뱅킹과정에서 발생할 수 있는 마우스 기질세포의 오염여부를 분석할 수 있는 real-time PCR 키트를 이용한 오염도 판별방법에 관한 것이다. 이를 위하여, 각 유전자에 해당하는 표준 및 대조군의 검체는 Mini Gene을 합성하여 준비하였다. 하나의 예시에서, 상기 검체는 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델의 조직 또는 환자 유래 조직(세포)에서 획득할 수 있다.
2. DNA 분리
상기 단계 1에서 얻은 각종 검체로 부터 적정 방법을 수립하여 DNA를 분리하였다.
3. 단일(Single) real-time PCR
인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자 4개 각각의 증폭을 위한 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 고안하고, 적정 real-time PCR 조건을 수립하였고, 상기 real-time PCR은 단일 PCR로 수행 하였으며, 각 유전자에 해당되는 프라이머의 농도 비율을 달리하여 각각의 조건을 수립하였다.
4. 클론 확보
상기 각 유전자를 포함하는 DNA 절편이 포함된 클론을 합성하였다. 상기 클론은 본 출원의 진단키트의 반응조건 수립 시, 표준 및 대조군의 검체로 사용하였다.
5. 프로브 디자인
인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자 4 종의 housekeeping 유전자를 real-time PCR 과정에서 가수분해 반응으로 파악 할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인 하였다.
예를 들어, 상기 타겟 유전자에 결합되는 타켓 프로브는 서열번호 9 내지 12의 염기서열을 가지는 Taq Man 프로브이며, 3'말단쪽에 MGB 또는 BHQ가 결합되는 것이 바람직하다.
6. real-time PCR 장비에서 반응 및 분석 조건 수립
상기 단계 4에서 얻은 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두 개를 조합 한 것과 다양한 농도로 조성된 표준 검체를 주형으로 하여 마우스와 인간 유전자를 단일 PCR로 증폭 하고 가수분해 반응을 수행한 후 realtime PCR 장비로 분석하여 적정조건을 수립하였다.
7. real-time PCR 키트를 이용한 환자유래이종이식 검체 분석
상기 단계 3에서 PCR을 수행 한 후 시퀀싱 반응으로 유전자 유형이 확인된 바 있는 환자유래이종이식 검체의 DNA를 대상으로 다시 단일 real-time PCR을 수행 한 후 realtime PCR 장비로 분석하였다. 이에 따라, 본 출원의 진단키트의 민감도와 특이도, 재현성을 분석하였으며, 오염도 분석을 위한 최적조건을 다시 수립하였다.
8. ddPCR 장비에서 반응 및 분석조건 수립
상기 단계 4에서 얻은 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두 개를 조합 한 것과 다양한 농도로 조성된 표준 검체를 주형으로 하여 마우스와 인간 유전자를 단일 PCR로 증폭 하고 가수분해 반응을 수행한 후 ddPCR 장비로 분석하여 적정조건을 수립하였다.
9. ddPCR을 이용한 환자유래이종이식 검체 분석
상기 단계 3에서 PCR을 수행한 후 시퀀싱 반응으로 유전자 유형이 확인된 바 있는 환자유래이종이식 검체의 DNA를 대상으로 다시 단일 real-time PCR을 수행 한 후 ddPCR 장비로 분석하였다. 이에 따라, 본 출원의 진단키트의 민감도와 특이도, 재현성을 분석하였으며, 오염도 분석을 위한 최적조건을 다시 수립하였다.
또한, 하나의 예시에서, 본 출원의 올리고뉴클레오티드 프로브, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 표지수단을 포함하는 진단키트는 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델 등의 검체로부터 DNA를 추출 하는 시약인 commercial 제품(Manual 방식 또는 자동화방식)으로 추출된 DNA를 사용하며, 1) 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자 4 종의 real-time PCR 증폭관련 시약, 2) 유전자 증폭 시에 양성 대조군으로 사용할 플라스미드 DNA 클론, 3) 오염도 분석용 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고, 상기 키트를 이용한 real-time PCR 반응에 필요한 반응액을 모두 포함할 수 있다.
이에 따라, 본 출원의 인간 및 마우스 관련 유전자 오염도 분석 키트 및 환자유래 이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트 및 오염도 판별방법은 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델 과정 중에 마우스 유전자의 오염 여부와 그 유전자형을 신속하고 정확하게 분석할 수 있으며, 나아가, 인간과 마우스와 관련된 유전자의 오염 정도를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 정량적으로 나타낼 수 있다.
본 출원은 환자유래이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트 및 오염도 판별방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 마우스와 관련된 유전자의 오염을 모두 파악할 수 있고, 진단 민감도와 특이도가 100%에 가깝도록 높으며, 신속하게 검사할 수 있고, 마우스 오염을 예측하는 데에 매우 유용하다.
따라서, 본 발명은 인간과 마우스와 관련된 유전자의 오염을 미리 예측함으로써, 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델을 이용한 항암제 유효성 평가에 적용시킬 수 있고, 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델을 이용한 세포은행에도 지대한 기여를 할 수 있어 의료 산업상 매우 유용한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 미니클론을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 conventional PCR 결과이다.
도 2는 본 발명의 인간의 gDNA와 마우스의 gDNA를 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 conventional PCR 결과이다.
도 3, 도 4 및 도 5는 본 발명의 미니클론 0.01ng을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 real-time PCR 결과이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 인간의 gDNA와 마우스의 gDNA를 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 real-time PCR 결과이다.
도 8은 본 발명의 미니클론을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 ddPCR 결과이다.
도 9는 본 발명의 미니클론을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 ddPCR 결과이다.
도 10은 본 발명의 인간 gDNA와 마우스 gDNA을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 ddPCR 결과이다.
도 11은 본 발명의 인간 gDNA와 마우스 gDNA을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 ddPCR 결과이다.
도 12는 본 발명의 환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식모델의 gDNA을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 real-time PCR 결과이다.
도 13은 본 발명의 환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식모델의 gDNA을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 real-time PCR 결과이다.
도 14는 본 발명의 환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식 모델의 gDNA을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 ddPCR 결과이다.
도 15는 본 발명의 환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식 모델의 gDNA을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 ddPCR 결과이다.
이하 본 출원에 따르는 실시예를 통하여 본 출원을 보다 상세히 설명하나, 본 출원의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델의 배양 과정에서 생길 수 있는 마우스 유전자의 오염을 신속 정확하게 분석하고, 환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델 뱅킹에 SOP로 적용코자 할 때도 유용한 오염진단키트 및 방법에 관한 것이다.
이하, 다음에서 설명되는 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형 될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술되는 실시예에 한정 되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공하는 것이다.
1) 대조군 검체의 준비 및 DNA 추출
본 발명에서는 DNeasy, Blood & Tissue kit (Qiagne, 69506)를 이용하여 DNA를 추출하였으나 본 기술을 수행하기 위해 commercial 제품을 사용하여 DNA를 추출하였다. 본 키트를 사용한 DNA 추출방법은 다음과 같다.
① 환자유래 조직 및 환자유래 이종이식 또는 세포유래 이종이식 조직을 centrifuge tube에 모아 300 Xg에서 5분 동안 원심분리하고, 200㎕ 의 PBS로 잘 풀어준다.
② Proteinas K를 20 ㎕ 첨가한다.
③ Buffer AL 200 ㎕를 첨가하고, vortexing한 다음 56℃에서 10분 동안 반응시킨다. Ethanol (96-100%) 200 ㎕를 첨가하고, vortexing하여 섞어준다.
④ 상기의 혼합물을 2 ml collection tube에 꽂은 DNeasy Mini spin column에 옮긴 후, 1분 동안 8,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).
⑤ DNeasy Mini spin column을 새로운 2 ml collection tube에 옮긴 후, Buffer AW1 500 ㎕를 첨가하여 1분 동안 8,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).
⑥ DNeasy Mini spin column을 새로운 2 ml collection tube에 옮긴 후, Buffer AW2 500 ㎕를 첨가하여 3분 동안 14,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).
⑦ DNeasy Mini spin column을 새로운 2 ml collection tube에 옮긴 후, 1분 동안 14,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).
⑧ DNeasy Mini spin column을 깨끗한 1.5 ml 또는 2 ml microcentrifuge tube에 옮긴 후, Buffer AE 200 ㎕를 DNase membrane에 직접 떨어뜨린다. Room temperature에서 3분 동안 반응시킨 후, 8,000 rpm으로 원심분리 한다.
이렇게 추출된 DNA 판정기준은 다음과 같다.
DNA나 RNA의 경우 260nm 파장에서 최고의 흡광도를 보이며, 자외선 흡수 복사량은 DNA량에 비례하여 260nm 파장에서 흡광도 값이 1.0이면 ds-DNA는 50 ug/ml의 농도를 나타낸다. 따라서 순수한 DNA의 가정 하에서 260nm 파장에서 흡광도 값이 2.0이면 ds-DNA는 100 ug/ml의 농도를 나타낸다. 유사 파장에서 간섭이 가능한 물질로는 단백질, phenol 등이 있는데 이들은 280nm 파장에서 최고의 흡광도를 보인다. 이와 같이 간섭물질이 있을 경우에 260nm 파장과 280nm 파장의 흡광도 비율 (A260/A280)로 다른 물질과의 오염여부를 확인할 수 있다. 간섭물질이 없는 순수한 DNA의 경우는 260nm 파장과 280nm 파장의 흡광도 비율 (A260/A280)이 1.8이상의 값을 보이며 이 값이 2.0이라면 이는 100% 순수한 DNA (또는 RNA)라고 정의 내릴 수 있다. 만약, 단백질이나 phenol 등에 오염된 경우에는 260nm 파장과 280nm 파장의 흡광도 비율 (A260/A280)이 1.8이하의 값을 보인다. 이러한 경우에는 시료의 정량이 정확하지 않을 수도 있다. 파장에서 흡광도가 1인 경우에 ds-DNA는 50 ㎍/ml, ss-DNA는 33 ㎍/㎕, RNA는 40 ㎍/ml, oligomer는 25 내지 35 ㎍/ml의 농도를 나타낸다.
또한 추출된 DNA의 purity는 A260/A280 ratio 는 1.8 내지 2.1, A260/A230 ratio는 1.5 내지 2 이상 범위 내에 측정되어야 한다.
2) 표준 및 대조군 검체의 준비
상기 유전자형 분석에 표준물질이 될 관련 유전자인 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자 4종이 포함된 플라스미스 DNA 클론을 합성하여 준비하였다.
3) 단일(Single) real-time PCR
환자유래 이종이식 모델 또는 세포유래 이종이식 모델 배양 과정에서 생길 수 있는 cross contamination을 검사하기 위해서 관련 인간과 마우스 유전자를 각각 증폭시켰다. 이들 PCR 증폭을 위하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 먼저 선택 및 고안하였다.
본 발명에서 발명된 프라이머는 인간과 마우스에 따라 구분되는 housekeeping 유전자를 사용하여 디자인 되었다.
본 발명의 프라이머는 다음과 같이 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자 4개를 검출하는 프라이머 (서열번호 1 내지 8)로 구성되어 있으며, 인간의 알부민과 파폴라 유전자와 마우스의 알부민과 파폴라 유전자의 PCR은 각각 142, 131, 134, 133bp 길이의 산물을 각각 증폭한다. 각 유전자별 PCR 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 나타냈다.
No. Sequence (5'-> 3') Length
(mer) 		GC ( % ) Tm (℃) Amplicon
Size
(bp) 		Direction Gene Gene Bank No.
1 GGTCTGAGGAGAAAGTGTAGCA 22 50 60.2
142		 Forward
인간 알부민
NG_009291
2 CAGAGGTTTTTCACAGCATTCC 22 45.5 58.3 Reverse
3 GATTGATAAAGCCAGGGTGAT 21 42.9 55.9
131		 Forward
마우스 알부민
NC_000071.6
4 ACTGTCACTGTCACTGTCAAGC 22 50 60.2 Reverse
5 CGTTAGGATATGTGGTAAGCGT 22 45.5 58.3
134		 Forward
인간 파폴라
NC_000014.9
6 ATAAACGCATCCATTACCTCCA 22 40.9 56.5 Reverse
7 TTCCTGGGTCAAGGTTACTTAG 22 45.5 58.3
133		 Forward
마우스 파폴라
NC_000078.6
8 AAAGTGATCGCCAGATTCAATG 22 40.9 56.5 Reverse
4) 키트의 프로브 고안
인간과 마우스 관련 유전자의 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하기 위해 선정된 housekeeping 유전자의 유전자형 검색을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브(서열번호 9 내지 12)를 고안하였다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 디자인은 본 발명의 목적에 따라 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자 4개에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 유전자형 특이적 프로브(genotype specific probe)로서 올리고뉴클레오티드를 설계하였고, 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 PyroMark Assay Design 이나 Primer3을 활용하여 유전자형 특이적 프로브를 디자인하였다.
이때, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는 23±2bp의 올리고뉴클레오티드로 설정하여 4종의 유형 특이적 프로브를 1차 설계하였고, 상기 마우스 기질세포의 오염(contamination) 유무 진단을 위한 인간과 마우스와 관련된 유전자형 진단 관련 시약과 키트는 각각 인간의 알부민과 파폴라 유전자와 마우스의 알부민과 파폴라 유전자까지 총 4종의 유전자를 검색표적으로 한다. 예를 들어, 상기 타겟 유전자에 결합되는 타켓 프로브는 서열번호 9 내지 12의 염기서열을 가지는 Taq Man 프로브이며, 3'말단쪽에 MGB 또는 BHQ가 결합되는 것이 바람직하다.
상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 서열번호 및 유형은 하기 표 2에 정리하였다.
No. Sequence (5'-> 3') Length
(mer) 		GC ( % ) Tm (℃) Direction Gene Gene Bank No.
9 CCAACTTACTTATAGGCGGACCTTG 25 48 62.9 Reverse 인간 알부민 NG_009291
10 AAAGTCTCACCACATGACTGCCCAA 25 48 62.9 Reverse 마우스 알부민 NC_000071.6
11 AGGTTGCGTGCTCTTATGGCAGAAA 25 48 62.9 Forward 인간 파폴라 NC_000014.9
12 TGTTTCTTATGCCTCCATAGGTGGT 25 44 61.3 Forward 마우스 파폴라 NC_000078.6
5-1) Conventional PCR 반응 및 분석 조건 수립
상기 3) 단일(Single) real-time PCR 에서 수립된 인간과 마우스관련 유전자의 각 유형별 클론을 주형으로 하여, 인간과 마우스 관련 유전자를 conventional PCR로 증폭한 후, 전기영동을 진행하여 각각의 유전자 증폭을 확인하였다.
인간과 마우스 관련 유전자의 유전자형을 확인하기 위한 PCR의 조성과 조건은 하기와 같이 수행하였다.
Conventional PCR 조성과 조건
1. Component
Component Volume
Miniclone (10 ng) 1 ㎕
Primer mix F,R (10 pmol/ul) 1 ㎕
LightCycler Probe Master (2X) 10 ㎕
Water, PCR-grade 8 ㎕
Total volume 20 ㎕
gDNA (30 ng) 1 ㎕
Primer mix F,R (10 pmol/ul) 1 ㎕
LightCycler Probe Master (2X) 10 ㎕
Water, PCR-grade 8 ㎕
Total volume 20 ㎕
상기 표와 같이 PCR mixture를 준비한다.
2. Program
Program Temperature Hold
Pre-Incubation 95 5 m
Amplification 30 cycles 95 20 s
55~65 30 s
72 1 m
Cooling 12 30 s
PCR machine에 상기와 같은 프로그램으로 PCR 한 후, 전기영동으로 증폭된 각각의 amplicon(PCR product)를 확인한다.
미니클론을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 conventional PCR 결과는 도 1에 나타내었으며, 인간의 gDNA와 마우스의 gDNA를 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 conventional PCR 결과는 도 2에 나타내었다.
5-2) real-time PCR 반응 및 분석 조건 수립
상기 3) 단일(Single) real-time PCR 에서 수립된 인간과 마우스관련 유전자의 각 유형별 클론을 주형으로 하여, 인간과 마우스 관련 유전자를 real-time PCR로 각각의 유전자 증폭을 확인하였다.
인간과 마우스 관련 유전자의 유전자형을 확인하기 위한 real-time PCR의 조성과 조건은 하기와 같이 수행하였다.
real-time PCR 조성과 조건
1. Component
Component Volume
gDNA (30 ng) 1 ㎕
Primer mix F,R (10 pmol/ul) 1 ㎕
Probe (1pmol/ul) 1 ㎕
LightCycler Probe Master (2X) 10 v
Water, PCR-grade 7 ㎕
Total volume 20 ㎕
Miniclone (0.01ng) 1 ㎕
Primer mix F,R (10 pmol/ul) 1 ㎕
Probe (1pmol/ul) 1 ㎕
LightCycler Probe Master (2X) 10 ㎕
Water, PCR-grade 7 ㎕
Total volume 20 ㎕
2. Program
PCR machine에 다음과 같은 프로그램으로 PCR 한다.
Program Cycles Analysis mode temperature Hold time Acquisition mode
Pre-Incubation 1 None 95 10min None
Amplification 45 Quantification 95 10s None
60 30s Single
Cooling 1 None 40 30s None
단, 프로브 조합 중 인간의 경우에는 올리고뉴클레오티드의 5'말단의 표지수단으로 FAM을 그리고 마우스의 경우에는 올리고뉴클레오티드의 5'말단의 표지수단으로 HEX 형광을 사용하며, 상기 올리고뉴클레오티드 3' 말단의 표지수단으로 MGB 또는 BHQ1을 사용하였다.
미니클론 0.01ng을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 real-time PCR 결과는 도 3, 도 4 및 도 5에 나타내었으며, 인간의 gDNA와 마우스의 gDNA를 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자, 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 real-time PCR 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.
5-3) ddPCR 반응 및 분석 조건 수립
상기 3) 단일(Single) real-time PCR 에서 수립된 인간과 마우스관련 유전자의 각 유형별 클론을 주형으로 하여, 인간과 마우스 관련 유전자를 dd PCR로 각각의 유전자 증폭을 확인하였다.
인간과 마우스 관련 유전자의 유전자형을 확인하기 위한 ddPCR의 조성과 조건은 하기와 같이 수행하였다.
ddPCR 조성과 조건
1. Component
1.1 Minigene의 경우 PCR mixture는 아래의 표와 같이 만든다.
① 아래 표와 같은 조건에서 제한효소를 넣고 55℃에서 5분 동안 반응한다.
Component Volume (㎕)
BseC I (ClaI Isoschizomer) (2unit/㎕) 10
Minigene ( 500ng) 10
② NeucleoSpin Gel and PCR Clean-up으로 enzyme digestion product를 purification 한다.
③ Qubit 정량하여 그 정량값으로 카피수를 계산하여 실험한다.
④ Miniclone PCR mixture를 아래 표대로 만든다.
Component Volume (㎕)
Miniclone (2500copies/㎕) 2.2
Primer Mix 1 (10pmol/㎕) 1.98
Primer Mix 2 (10pmol/㎕) 1.98
Probe 1(5pmol/㎕) 1.1
Probe 2(5pmol/㎕) 1.1
ddPCR Supermix for Probes 11
DW 2.64
Total 22
Note: Primer final conc. 900nM, probe final conc. 250nM
1.2 환자유래 이종이식 모델 샘플의 경우 추출된 gDNA는 PCR mixture는 아래의 표와 같이 만든다.
Component Volume (㎕)
gDNA (5ng/㎕) 2.2 (10ng)
Primer Mix 1 (10pmol/㎕) 1.98
Primer Mix 2 (10pmol/㎕) 1.98
Probe 1(5pmol/㎕) 1.1
Probe 2(5pmol/v) 1.1
ddPCR Supermix for Probes 11
2 units Hind III 1.1
DW 1.54
Total 22
① gDNA, PDX 샘플 PCR mixture는 RT에서 10분간 incubation하여 Hind III digestion을 한다.
② Cartridge holder에 Droplet Generator Cartridge를 장착한다.
③ Channel Electronic Pipette을 이용하여 8-Strip PCR Tube 에서 20ul를 취하여 Cartridge의 sample well에 Loading한다.
Note: 8-Channel Electronic Pipette의 속도를 가장 느리게 설정하여 사용한다.
Note: 만약 Cartridge의 샘플 loading well을 8개를 전부 못 채웠을 경우, 나머지 loading well에는 2x ddPCR Super Mix 와 DW를 1:1로 섞어서 20㎕씩 채운다.
④ Droplet generation Oil을 70㎕씩 Cartridge의 Oil loading well에 Loading한다.
⑤ Droplet Generator Gasket의 위아래를 구분하여 장착하고, QX200™ Droplet Generator넣어 작동시켜 droplet을 생성한다.
⑥ 만들어진 Droplet을 8-Channel multi-pipette을 이용하여 40㎕를 96 well plate로 옮겨 준다.
⑦ Pierceable Foil Heat Seal (BIO-RAD, 181-4040)의 붉은색 선이 아래로 가도록 plate위에 덮고 PX1™ PCR Plate Sealer (180℃, 5초 sealing)에 넣고 Sealing한다.
2. Program
Digital PCR machine에 다음과 같은 프로그램으로 PCR 한다.
Program Name Cycles Temperature Target (℃) Hold time Ramp Rate
Enzyme Activation 1 95℃ 10min ~2℃/sec
Denaturation 40 94℃ 30s
Annealing/Extension 58℃ 1min
Enzyme deactivation 1 98℃ 10min
Hold (optional) 1 4℃ Infinite
단, 프로브 조합 중 인간의 경우에는 올리고뉴클레오티드의 5'말단의 표지수단으로 HEX 형광을 사용하며, 마우스의 경우에는 FAM 형광을 사용하며, 각 올리고뉴클레오티드 3' 말단의 표지수단으로 MGB 또는 BHQ1을 사용하였다.
미니클론을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 ddPCR 결과는 도 8에 나타내었으며, 미니클론을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 ddPCR 결과는 도 9에 나타내었다. 인간 gDNA와 마우스 gDNA을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 ddPCR 결과는 도 10에 나타내었으며, 인간 gDNA와 마우스 gDNA을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 ddPCR 결과는 도 11에 나타내었다.
6) Hu - Mo ID 키트를 이용하여 임상 검체 (예 Pt: PDX 만들기 전 환자의 조직 샘플) 및 PDX 검체(dP. P0: PDX 0세대 샘플, P1: PDX 1세대 샘플)에서 분석
상기 5-2) real-time PCR 반응 및 분석 조건 수립 및 5-3) ddPCR 반응 및 분석 조건 수립에서 기술된 방법대로 임상검체 및 동일한 조직을 심어서 계대배양을 수행하여 얻어진 환자유래 이종이식 모델의 조직을 이용하여 real-time PCR 및 ddPCR을 수행하여 분석하였다.
환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식모델의 gDNA을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 real-time PCR 결과는 도 12에 나타내었으며, 환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식모델의 gDNA을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 real-time PCR 결과는 도 13에 나타내었다.
도 12에 나타나는 바와 같이, PDX002-Pt(환자002)에서는 인간의 알부민 유전자가 29.91, 마우스의 알부민 유전자가 35.26으로 나타나며, PDX002-P0(환자 002의 PDX 0세대)에서는 인간의 알부민 유전자가 27.56, 마우스의 알부민 유전자가 25.68로 나타나며, PDX002-1-1-P1(환자 002의 PDX 1세대)에서는 인간의 알부민 유전자가 27.34, 마우스의 알부민 유전자가 26.59로 나타나고 있다. 또한, PDX005-Pt(환자 005)에서는 인간의 알부민 유전자가 29.96으로 나타나며, PDX005-1-P0(환자 005의 PDX 0세대)에서는 인간의 알부민 유전자가 27.77, 마우스의 알부민 유전자가 28.24로 나타났다. 즉, 상기 결과는 환자유래 이종이식 모델에서 세대가 진행됨에 따른 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자를 나타내고 있으며, 이를 통해 마우스 유래 조직의 오염도를 알 수 있다.
또한, 도 13에 나타나는 바와 같이, PDX002-Pt(환자002)에서는 인간의 파폴라 유전자가 29.17로 나타나며, PDX002-P0(환자 002의 PDX 0세대)에서는 인간의 파폴라 유전자가 27.21, 마우스의 파폴라 유전자가 27.01로 나타나며, PDX002-1-1-P1(환자 002의 PDX 1세대)에서는 인간의 파폴라 유전자가 27.17, 마우스의 파폴라 유전자가 27.99로 나타나고 있다. 또한, PDX005-Pt(환자 005)에서는 인간의 파폴라 유전자가 28.75으로 나타나며, PDX005-1-P0(환자 005의 PDX 0세대)에서는 인간의 파폴라 유전자가 26.83, 마우스의 파폴라 유전자가 29.58로 나타났다. 즉, 상기 결과는 환자유래 이종이식 모델에서 세대가 진행됨에 따른 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자를 나타내고 있으며, 이를 통해 마우스 유래 조직의 오염도를 알 수 있다.
환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식 모델의 gDNA을 이용한 인간의 알부민 유전자, 마우스의 알부민 유전자의 ddPCR 결과는 도 14에 나타내었으며, 환자의 조직과 동일한 조직을 사용한 환자유래 이종이식 모델의 gDNA을 이용한 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 ddPCR 결과는 도 15에 나타내었다.
도 14에 나타나는 바와 같이, PDX002-Pt(환자002)에서는 인간의 알부민 유전자가 84로 나타나며, PDX002-1-P0(환자 002의 PDX 0세대)에서는 인간의 알부민 유전자가 288, 마우스의 알부민 유전자가 410으로 나타나며, PDX002-1-1-P1(환자 002의 PDX 1세대)에서는 인간의 알부민 유전자가 396, 마우스의 알부민 유전자가 208로 나타나고 있다. 또한, PDX005-Pt(환자 005)에서는 인간의 알부민 유전자가 102로 나타나며, PDX005-1-P0(환자 005의 PDX 0세대)에서는 인간의 알부민 유전자가 336, 마우스의 알부민 유전자가 68로 나타났다. 즉, 상기 결과는 환자유래 이종이식 모델에서 세대가 진행됨에 따른 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자를 나타내고 있으며, 이를 통해 마우스 유래 조직의 오염도를 알 수 있다.
또한, 도 15에 나타나는 바와 같이, PDX002-Pt(환자002)에서는 인간의 파폴라 유전자가 106로 나타나며, PDX002-1-P0(환자 002의 PDX 0세대)에서는 인간의 파폴라 유전자가 236, 마우스의 파폴라 유전자가 388로 나타나며, PDX002-1-1-P1(환자 002의 PDX 1세대)에서는 인간의 파폴라 유전자가 290, 마우스의 파폴라 유전자가 202로 나타나고 있다. 또한, PDX005-Pt(환자 005)에서는 인간의 파폴라 유전자가 84로 나타나며, PDX005-1-P0(환자 005의 PDX 0세대)에서는 인간의 파폴라 유전자가 392, 마우스의 파폴라 유전자가 60으로 나타났다. 즉, 상기 결과는 환자유래 이종이식 모델에서 세대가 진행됨에 따른 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자를 나타내고 있으며, 이를 통해 마우스 유래 조직의 오염도를 알 수 있다.
<110> AB, df <120> dfdf <130> dgdgf <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_009291 <400> 1 ggtctgagga gaaagtgtag ca 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_009291 <400> 2 cagaggtttt tcacagcatt cc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000071.6 <400> 3 gattgataaa gccagggtga t 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000071.6 <400> 4 actgtcactg tcactgtcaa gc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000014.9 <400> 5 cgttaggata tgtggtaagc gt 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000014.9 <400> 6 ataaacgcat ccattacctc ca 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000078.6 <400> 7 ttcctgggtc aaggttactt ag 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000078.6 <400> 8 aaagtgatcg ccagattcaa tg 22 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_009291 <400> 9 ccaacttact tataggcgga ccttg 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000071.6 <400> 10 aaagtctcac cacatgactg cccaa 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000014.9 <400> 11 aggttgcgtg ctcttatggc agaaa 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC_000078.6 <400> 12 tgtttcttat gcctccatag gtggt 25

Claims (9)

  1. 환자유래 이종이식 세포를 판별하는 진단키트에 있어서,
    상기 진단키트는 서열번호 1 내지 4 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머와, 서열번호 9 및 10 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 모두 포함하여 이루어지며,
    상기 진단키트는 인간과 마우스의 이종이식세포에 포함된 유전자의 비율을 표지수단을 이용하여 판별하는 것을 특징으로 하는 환자유래이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 진단키트는 서열번호 5 내지 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머와 서열번호 11 및 12 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 더 포함하고,
    상기 진단키트는 인간과 마우스의 이종이식세포에 포함된 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 환자유래 이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지수단인 것을 특징으로 하는 환자유래 이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 1pmol 이상인 것을 특징으로 하는 환자유래이종이식 세포를 판별하기 위한 진단키트.
  5. 서열번호 1 내지 4 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자를 PCR 방법에 의해 증폭하는 단계;
    서열번호 9 및 10 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 가수분해시키는 단계; 및
    상기 프로브에 결합된 표지수단을 검출하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 환자유래 이종이식 세포를 판별하는 방법에 있어서, 상기 방법은 환자유래 이종이식 모델에 있어서 인간의 알부민 유전자 및 마우스의 알부민 유전자의 비율을 측정하여 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법.
  6. 서열번호 5 내지 8 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자를 PCR 방법에 의해 증폭하는 단계;
    서열번호 11 및 12 의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 가수분해시키는 단계; 및
    상기 프로브에 결합된 표지수단을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자유래 이종이식 세포를 판별하는 방법에 있어서, 상기 방법은 환자유래 이종이식 모델에 있어서 인간의 파폴라 유전자 및 마우스의 파폴라 유전자의 비율을 측정하여 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지수단인 것을 특징으로 하는 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 1pmol 이상인 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법.
  9. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 PCR방법은 Conventional PCR, real-time PCR 또는 ddPCR(Droplet Digital PCR) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인간세포에 대한 마우스 유전자의 오염도를 판별하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210068893A (ko) * 2019-12-02 2021-06-10 의료법인 성광의료재단 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080569B (zh) * 2020-09-30 2022-12-02 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 用于检测体内移植人源细胞的特异性引物、试剂盒及方法
CN112899351B (zh) * 2021-02-03 2022-08-26 东华大学 一种双重荧光定量pcr检测pdx模型小鼠细胞浸润状态试剂盒
US20240093308A1 (en) * 2022-08-01 2024-03-21 Idexx Laboratories, Inc. Human Fractional Abundance Assays

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007209281A (ja) 2006-02-10 2007-08-23 Japan Health Science Foundation 種特異的プライマーを用いる動物種検出方法および種検出プライマー
KR101239387B1 (ko) * 2010-06-17 2013-03-11 문우철 인유두종바이러스의 유전자형 분석용 ｄｎａ 칩, 이를 포함하는 키트 및 유전자형 분석방법
JP5680989B2 (ja) 2011-02-25 2015-03-04 ハウス食品グループ本社株式会社 非ヒト動物を検出するためのプライマー・プローブセット
WO2014078850A1 (en) 2012-11-19 2014-05-22 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Method of cancer diagnosis, progression and response to therapy using a primary xenograft mouse model for cancer serum biomarker discovery
KR101674468B1 (ko) 2013-05-07 2016-11-10 재단법인 아산사회복지재단 환자유래 일차배양 암세포의 배양방법 및 일차배양 암세포를 이용하여 제작된 암 환자와 동일한 이종 이식 동물모델의 구축 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession Number NG_009291 (2014.09.24.)* *
최문석. 2007년 대한간학회 추계학술대회 정보. 페이지 S22-S27 (2007.)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210068893A (ko) * 2019-12-02 2021-06-10 의료법인 성광의료재단 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법

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