KR20210068893A - 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법 - Google Patents

주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

일 양상으로서의 분석방법은 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 효과적으로 분석할 수 있고, 종래기술 대비 산술적 오류가 발생할 가능성을 낮출 수 있다.

Description

주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법{A method for analyzing the distribution of human derived cells in the heterologous animal}
주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법에 관한 것이다.
세포 치료제의 개발을 위한 동물실험은 안전성 및 유효성 평가에 있어서 필수적인 과정이다. 이 때, 실험동물 모델에 원하는 세포를 주입한 후 어느 장기에 얼마만큼 분포되며, 언제까지 존재하는지 등을 분석하는 방법을 '체내 세포 분포 평가'로 칭한다.
최근에는 크게 두 가지, 첫째는 이미지로 관찰하는 방법과, 둘째는 실시간 중합효소반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 분석하는 방법으로 체내 세포 분포 평가를 수행한다.
이 중 실시간 중합효소반응을 이용한 방법은 정밀한 정량분석으로써 가장 많이 쓰이고 있다. 그러나, 이러한 실시간중합효소반응을 이용한 방법으로 분석하는 경우, 대부분은 일부분의 또는 랜덤한 여러 부분의 조직을 떼어내어 여기서 동량의 DNA 또는 RNA(이후 '핵산'으로 표기)를 취하여 분석한 후 그 수치 내에서 비교하기 때문에, 첫째로 각 조직의 세포마다 다른 양의 핵산이 존재하는 점을 고려하지 않은 기계적 단순비교를 할 수밖에 없고, 둘째로 각 장기의 전체 핵산의 양을 알 수 없으므로 반응시킨 핵산의 양을 전체 장기대비로 계산하기 어려우며, 셋째로 극히 일부분의 조직을 떼어 검사하는 경우 산술적 오류가 결과에 반영될 확률이 매우 높은 단점이 있다. 즉, 세포가 균질하게 장기에 도포되는 것을 전제로 일부의 조직을 떼어내어 분석하는 것이기 때문에, 그 일부분에 조금의 세포가 있을 경우에는 나머지 부분에 실제로 세포가 존재하지 않거나 훨씬 적은 양이 존재함에도 산술적인 계산으로 인해 부적절하게 많은 세포수로 계산될 수 있는 오류가 포함될 수 있거나(false-positive), 반대로 떼어내어 분석한 그 일부분의 조직에 세포가 없고 나머지 부분에 세포가 있을 경우에는, 취하여 분석한 시료에서 0값이 나오기 때문에 장기 전체에 전혀 세포가 존재하지 않는 것처럼 거짓음성으로 계산될 수 있는(false-negative) 여지가 많다.
한국등록특허 제1334072호
주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 양태로서, 인간 유래 세포와 이를 주입한 이종 동물의 특정 장기 내 핵산을 각각 추출하고, 인간 특이적 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 물질을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)을 수행하는 단계; 및 임계 사이클(Ct; threshold cycle) 값을 비교하여 상기 이종 동물의 장기 내에 존재하는 주입된 인간 유래 세포의 수를 정량하는 단계를 포함하는, 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법을 제공한다.
상기 이종(異種) 동물이란, 동물 중 인간과는 다른 종, 즉, 인간을 제외한 동물을 의미하는 것으로서, 상기 방법은 인간 유래 세포를 인간이 아닌 다른 동물에 주입하여 이의 체내 분포도를 분석하는 방법에 관련된 것이다.
상기 이종 동물의 예시로서, 쥐, 토끼, 개, 돼지, 원숭이 등일 수 있으나, 인간 유래 세포를 주입하여 동물 모델로 사용할 수 있는 인간이 아닌 동물 개체라면 반드시 이에 제한되지는 않는다.
상기 인간 유래 세포에 있어서, 인간으로부터 수득할 수 있는 세포라면 그 종류에 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는 인간 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 구체적으로는 인간의 골수 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 인간 유래 세포에 있어서, 1개의 세포일 수 있고, 복수개의 세포일 수도 있으며, 상이한 세포 수를 갖는 복수개의 세포 군집을 의미하는 것일 수도 있다.
상기 장기에 있어서, 간, 신장, 비장, 뇌 및 생식기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 상기 이종 동물의 체내에서 별개로 적출되어 전체를 용해(lysis)시킬 수 있는 장기라면 특별히 제한되지는 아니한다.
상기 방법에 있어서, 인간 유래 세포를 이종 동물에 주입하는 데에 있어서, 인간 유래 세포를 이종 동물의 각 장기로 도달할 수 있도록 당업계 주지된 방법을 자유로이 사용하여 주입할 수 있으나, 구체적으로는 인간 유래 세포를 이종 동물의 정맥 내로 주입하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 이러한 경우, 인간 유래 세포를 이종 동물의 혈액을 이용하여 인간 유래 세포를 각 장기에 도달하게 할 수 있어, 그 체내 분포를 보다 다양하게 확인할 수 있다는 장점이 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 핵산을 추출하는 단계는 당업계 통상적으로 알려진 방법을 자유로이 선택하여 수행할 수 있고, 구체적으로는 각종 DNA 추출 키트(DNA Extraction Kit)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행할 수 있으며, 반드시 특정 방법으로 제한되지는 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 핵산을 추출하는 단계는 상기 이종 동물의 특정 장기 내 존재하는 전체 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 것일 수 있는데, 이는 상기 특정 장기의 일부만에 포함된 핵산을 추출하여 전체를 추정하는 방법이 아닌, 상기 특정 장기의 전체에 포함된 핵산을 한번에 모두 추출하여 인간 유래 세포의 분포도를 분석한다는 의미일 수 있고, 이러한 경우, 특정 장기의 부분별 핵산의 분포 차이에 따른 산술적 오차를 감소시킬 수 있다는 장점이 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 핵산을 추출하는 단계는 인간 유래 세포와 이를 주입한 이종 동물의 특정 장기 전체의 각각의 용해물(lysate)로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함할 수 있는데, 이는 인간 유래 세포와 이를 주입한 이종 동물의 특정 장기 전체에 존재하는 핵산을 효과적으로 추출하기 위한 방법일 수 있고, 특히, 상기 특정 장기 전체의 용해물로부터 핵산을 추출하는 경우, 상술한 바대로, 특정 장기의 부분별 핵산의 분포 차이에 따른 산술적 오차를 감소시킬 수 있다는 장점이 있다.
상기 인간 특이적 유전자에 있어서, 인간 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 코딩하는 유전자(Homo sapiens chromosome 12, GRCh38.p12 Primary Assembly, Sequence ID: NC_000012.12)일 수 있는데, 타 유전자를 사용하는 경우, 구체적으로는 인간 특이적 Alu 유전자를 사용하는 경우에 비하여 거짓-양성(false-positive)의 미미한 증폭에 따른 후속 보정과정의 필요성이 감소하고, 마우스를 이종 동물 모델로 사용하는 경우에 있어서 교차활성(cross-activity)을 방지할 수 있어 특이성을 더 높일 수 있고, 사본(copy)의 수가 많아 실시간 중합효소 반응시에 보다 짧은 사이클 수를 가지게 되므로 그 효율이 더 높다는 장점이 있다.
상기 상보적으로 결합하는 물질에 있어서, 실시간 중합효소반응에 사용될 수 있는 물질이라면 당업계 주지된 물질을 자유로이 선택할 수 있고, 구체적으로는 프라이머(primer), 프로브(probe) 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 프라이머는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 뉴클레오티드 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 뉴클레오티드 서열을 말한다.　프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제/중합 효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
　상기 프로브는 올리고뉴클레오티드와 상보적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 뉴클레오티드 단편을 의미하며, 형광 등으로 표지될 수 있다. 프로브의 길이는 당업계 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기　프라이머 또는 프로브는 포스포르아미디트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있고, 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고함), 10 내지 90 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 70 nt, 10 내지 60 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 40 nt, 10 내지 30 nt, 10 내지 25 nt, 20 내지 100 nt, 30 내지 90 nt, 40 내지 80 nt, 50 내지 70 nt, 20 내지 60 nt, 20 내지 50 nt, 30 내지 40 nt, 20 내지 30 nt, 또는 20 내지 25 nt인 것일 수 있다.
상기 인간 특이적 유전자로서 인간 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 코딩하는 유전자를 사용하는 경우, 상기 상보적으로 결합하는 물질은 구체적으로 서열번호 1의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 3의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있는데, 상기 프라이머 세트와 프로브를 사용하는 경우 상기 GAPDH 유전자에 고도로 특이적으로 결합하여 인간 유래 세포의 분포도의 정량적 분석의 정확도를 상승시킬 수 있다는 장점이 있다.
상기 임계 사이클(Ct; threshold cycle)에 있어서, 실시간　중합효소연쇄반응(Real-Time PCR)에서, PCR 증폭 산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달한 때의 형광신호 세기를 임계값(threshold)이라고 하고, 증폭 프로파일 곡선에서 임계값에 대응되는 증폭 사이클 횟수를 임계 사이클 값이라고 한다. 초기 폴리뉴클레오티드 농도를 달리하여 각각 실시간　중합효소연쇄반응을 수행하였을 때, 초기 폴리뉴클레오티드 양이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 도달하는 증폭 사이클 횟수가 적어지므로 임계 사이클 값이 적어진다. 따라서, 초기 폴리뉴클레오티드 양의 로그값과 임계 사이클 값은 강한 반비례 관계에 있게 되며, 통상적으로 임계 사이클 값을 이용하여 원하는 폴리뉴클레오티드 정량을 수행하게 된다.
따라서, 상기 방법에 있어서, 임계 사이클 값이 낮을수록 상기 이종 동물의 특정 장기 내에 존재하는 인간 유래 세포의 핵산의 양이 많은 것으로 정량할 수 있고, 이는 인간 유래 세포의 임계 사이클 값을 기준으로 대조하여 관계식을 통해 계산함으로써 상기 특정 장기 내에 존재하는 주입된 인간 유래 세포의 수를 정량 할 수 있는 것이다.
구체적으로, 상기 인간 유래 세포 1개 또는 복수개에 포함되어 있는 핵산으로부터 도출된 임계 사이클 값과 상기 특정 장기 내 포함되어 있는 핵산으로부터 도출된 임계 사이클 값을 비교하여 상기 특정 장기 내에 존재하는 주입된 인간 유래 세포의 수를 정량 할 수 있고, 상기 인간 유래 세포가 상이한 세포 수를 갖는 복수개의 세포 군집인 경우, 모든 세포 군집 각각에 포함되어 있는 핵산으로부터 도출된 임계 사이클 값을 이용하여 임계 사이클 관계식 또는 이를 이용한 곡선을 도출해낼 수 있고, 이를 표준(standard)으로 이용하여 상기 특정 장기 내에 존재하는 주입된 인간 유래 세포의 수를 정량 할 수 있다.
일 양태로서의 분석방법은 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 효과적으로 분석할 수 있고, 종래기술 대비 산술적 오류가 발생할 가능성을 낮출 수 있다.
도 1은 표 2에 따라 인간 유래 세포의 수와 이의 용해물(lysate)로부터 추출된 핵산(genomic DNA (gDNA))의 농도가 상이하게 설정된 시료에 대해 표 1의 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 중합효소반응 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 표 2의 인간 유래 세포가 미주입된 마우스의 혈액과 장기에서 추출된 핵산과 표 1의 프라이머와 프로브를 이용한 실시간 중합효소 반응에서 증폭반응이 일어나지 않음을 확인한 결과이다.
도 3은 표 3에 따라 인간 유래 세포의 수를 계단희석(serial dilution)의 방법으로 준비한 스탠다드 핵산(gDNA) 샘플과, 인간 유래 세포를 주입한 후 표 3에 표식된 각각의 날짜에 각각 적출한 쥐의 장기로부터 추출한 핵산(gDNA) 샘플을 동시에 하나의 플레이트에서 실시간 중합효소 반응을 실시하여 얻은 증폭결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 도 3의 분석으로부터 도출된 임계 사이클(Ct; threshold cycle) 곡선을 나타낸 것으로서, 스탠다드 샘플은 표준 곡선(Standard Curve)의 빨간색 점으로 표기하고, 이의 R2값이 0.993인 것을 확인함으로써 신뢰할 수 있는 표준 곡선이 얻어졌음을 수치로 확인하였으며, 이 곡선에 대해 분석하고자 하는 쥐의 장기로부터 추출한 핵산(gDNA)샘플에서 증폭된 결과값이 관계식에 대조한 값을 바탕으로 파란점으로 표현됨을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실험방법
사람유래줄기세포를 계수하여 각각 1,250,000개(스탠다드 1번), 312,500개(스탠다드 2번), 78,125개(스탠다드 3번), 19,531.25개(스탠다드 4번), 4,882.81개(스탠다드 5번), 1,220.7개(스탠다드 6번), 305.2개(스탠다드 7번), 76.3개(스탠다드 8번), 19.07개(스탠다드 9번), 4.77개(스탠다드 10번), 0개(스탠다드 11번)으로 하여, 핵산 추출키트 내 시약 중 첫번째 단계의 용해버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 최종 0.3ml이 되도록 맞춘다. 이 때 마우스 혈액, 간, 신장조직을 각각 1/10씩 취하여 동일 양인 용해버퍼(lysis buffer) 최종 0.3ml으로 하여 맞춘다. 이후 핵산추출키트의 프로토콜에 따라 핵산을 추출한다. 마우스 혈액, 간, 신장조직에서 추출한 핵산을 정량하여 각각 482.5, 372.5, 544.4 ng/μl로 추출한 핵산과, 사람세포를 스탠다드로 개수별로 추출한 핵산을 동일 용량의 용출버퍼(elution buffer)로 녹인 후, 1㎕를 취해 실시간중합효소반응에 필요한 시약과 표 1의 인간 특이적 글리세린알데히드-3-인산탈수소효소 (human specific GAPDH) 유전자에 대해 고도로 특이적인 프라이머와 프로브를 각각 필요량만큼 동일하게 넣어준 후, 하나의 실시간 중합효소반응기기 용 플레이트에 하나의 샘플당 3wells씩(triplication) 동일용량으로 넣어준다. 실시간 중합효소반응기기의 반응 설정의 스탠다드 설정을 스탠다드 1번부터 11번까지를 넣은 well을 특정하여 각각 세포수를 입력하고, 마우스 혈액, 간, 신장조직을 각각 1/10씩 넣은 well을 샘플설정으로 한 후 반응을 개시한다.
프라이머, 프로브 서열 인간 GAPDH 유전자 상 위치 길이 Tm (℃) GC%
인간 GAPDH 센스
(서열번호 1)		 CATCAGGTGAGGAAGGCAG 2379 19 59.5 57.9
안티센스
(서열번호 2)		 GGCATTGCTGCAAAGAAAGA 2717 20 56.4 45.0
프로브
(서열번호 3)		 AAGCGGCCAGCCTGGCACCCTATGGAC 2409 27 75.9 66.7
실험결과
상기의 실험방법에 의해 설정된 농도비에 따라 희석된 11개의 인간 유래 세포의 수와, 인간 유래 세포를 주입하지 않은 마우스의 장기 에서 추출한 핵산(gDNA)의 농도를 하기 표 2에 나타내었고, 이는 도 1에서의 그래프값을 얻는 시료의 정보이며, 도 2에서 인간 유래 세포를 주입하지 않은 마우스의 혈액, 간, 신장으로 대표하여 여러 장기에서 거짓양성의 결과값이 나오지 않는 것에 대한 시료의 정보이다.
인간 유래 세포 수 또는 장기 gDNA(ng/μl)
스탠다드 1번 1,250,000 366.0
스탠다드 2번 312,500 91.5
스탠다드 3번 78,125 22.9
스탠다드 4번 19,531 5.7
스탠다드 5번 4,883 1.4
스탠다드 6번 1,221 0.36
스탠다드 7번 305 0.089
스탠다드 8번 76 0.0223
스탠다드 9번 19 0.0056
스탠다드 10번 4.8 0.0014
스탠다드 11번 0 0
인간 유래 세포 미주입 마우스 마우스 혈액 482.5
마우스 간 372.5
마우스 신장 544.4
상기 표 2에 나타낸 인간 유래 세포로부터 추출한 핵산과, 인간 유래 세포를 미주입한 마우스의 혈액 및 장기로부터 추출한 핵산을 표 1의 프라이머와 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 실시한 결과를 도 1과 도 2에 각각 나타내었는데, 도 1과 달리 도 2의 경우, 인간 유래 세포가 존재하지 않아 실시간 중합효소 반응에 따른 증폭이 일어나지 않음을 확인할 수 있다. 이는 표 1의 프라이머 세트 및 프로브의 조합을 이용한 실시간 중합효소 반응이 인간 유래 세포의 분포를 정량하기에 매우 특이적임을 확인할 수 있는 결과이다.
상기 표 1에 나타낸 프라이머와 프로브를 이용하여, 도 1에 나타난 결과값을 바탕으로 스탠다드 구간을 156,250개(스탠다드 1번), 39062.5개(스탠다드 2번), 9765.63개(스탠다드 3번), 2441.41개(스탠다드 4번), 610.35개(스탠다드 5번)으로 정하여 다음과 같이 실험한다.
사람유래줄기세포 1,108,130개를 준비한 후, 그 중 마리당 1x105개씩을 9마리의 마우스에 정맥 내 주사를 통해 주입한다. 주입한 세포의 남은 208,130개를 초저온 냉동고에 보관한다. 세포 주입 후 1일, 3일, 7일 되는 각각의 시점에 마우스를 안락사 시키고 장기를 적출한다. 적출한 장기를 모두 5ml 튜브에 넣고, 핵산 추출키트 내 시약 중 첫번째 단계의 용해버퍼(lysis buffer)를 첨가하여 최종 600㎕를 맞춘다. 이 튜브를 호모게나이저 기기에 넣고 분쇄하여 용해시킨다. 핵산 추출키트의 제품사양에 맞게 용해된 시료의 1/2인 300㎕을 덜어서 작은 튜브로 옮긴다(예를 들어, 비장이 20mg이고, 핵산추출키트의 적정 추출 시료의 무게가 10mg인 경우, 1/2으로 덜어서 추출하면 되므로, 최종 600㎕로 용해된 시료에서 300㎕을 취하여 작은 튜브로 옮긴다). 세포 주입 후 남겨 보관해 두었던 208,130개의 세포에 핵산 추출키트 내 시약 중 첫번째 단계의 용해버퍼(lysis buffer)를 최종 300㎕이 되도록 첨가하여 호모게나이저 기기에 넣고 분쇄하여 용해시킨 후 이 중 225.2㎕ (156,250개, 스탠다드 1번), 56.3㎕ (39062.5개, 스탠다드 2번), 14.08㎕ (9765.63개, 스탠다드 3번), 3.52㎕ (2441.41개, 스탠다드 4번), 0.88㎕ (610.35개, 스탠다드 5번)로 각각 덜어 새로운 튜브에 넣고, 용해버퍼(lysis buffer)를 스탠다드 1번에 74.8㎕, 2번에 243.7㎕, 스탠다드 3번에 285.92㎕, 스탠다드 4번에 296.48㎕, 스탠다드 5번에 299.12㎕씩 각각 넣어 최종 300㎕로 동일하게 맞춘다. 이후 핵산추출키트의 프로토콜에 따라 스탠다드와 마우스 시료에서 동시에 핵산을 추출한다. 추출한 핵산을 동일 용량의 용출버퍼(elution buffer)로 녹인 후, 1㎕를 취해 실시간 중합효소반응에 필요한 시약과 표 1의 인간 특이적 글리세린알데히드-3-인산탈수소효소 (human specific GAPDH) 유전자에 대해 고도로 특이적인 프라이머와 프로브를 각각 필요량만큼 동일하게 넣어준 후, 하나의 실시간 중합효소반응기기 용 플레이트에 하나의 샘플당 3wells씩(triplication) 동일용량으로 넣어준다. 실시간 중합효소반응기기의 반응 설정의 스탠다드 설정을 스탠다드 1번부터 5번까지를 넣은 well을 특정하여 각각 세포수 156,250개, 39062.5개, 9765.63개, 2441.41개, 610.35개로 입력하고, 마우스 시료를 넣은 well을 샘플설정으로 한 후 반응을 개시한다.
표 1의 프라이머와 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 반응을 실시한 결과 도 3을 토대로 도 4의 Ct(threshold cycle)에 의한 표준곡선(Standard Curve)을 작성하였고 빨간점으로 표식되었다. 여기에 인간 유래 세포를 주입한 마우스(주입후 1일 경과, 3일 경과, 7일 경과)와 미주입 마우스의 장기로부터 추출한 핵산에 의해 도 3에 그래프로 나타난 결과값이 도 4에 표준곡선에 대비한 관계식에 의해 계산값이 파란점으로 표식되었다.
이로부터 미주입한 마우스와 인간 유래 세포를 주입한 마우스 장기(주입후 1일 경과, 3일 경과, 7일 경과) 내 존재하는 인간 유래 세포 수가 나타난 결과를 하기 표 3에 나타내었는데, 구체적으로, 스탠다드로 사용한 인간 유래 세포의 시료 개수는, 스탠다드 1이 156,250개, 스탠다드 2가 39062.5개, 스탠다드 3이 9765.63개, 스탠다드 4가 2441.41개, 스탠다드 5가 610.35개로 각 1/4씩 계단식으로 낮아지는 세포수로 사용하였고, 각각의 Ct값의 평균은, 스탠다드 1이 24.517, 스탠다드 2가 26.448, 스탠다드 3이 28.832, 스탠다드 4가 31.016, 스탠다드 5가 33.437로, 이를 바탕으로 얻어진 표준곡선에 대한 관계식에 따라, 장기 각각에서 미주입의 경우 개체 1,2,3 모두에서 Undetermined의 Ct 값이 도출되었고, 1일 경과의 경우 개체1에서는 35.722, 개체2에서는 36.566, 개체3에서는 Undetermined의 Ct 값이 도출되었고, 3일 경과의 경우 개체1에서는 35.558, 개체2에서는 36.169, 개체3에서는 38.777의 Ct 값이 도출되었고, 7일 경과의 경우 개체 1,2,3 모두에서 Undetermined의 Ct 값이 도출되었다. 이는 상기 Ct 곡선 상에서 1일 경과 개체1의 경우 143.2개, 개체2의 경우 103.4개, 개체3의 경우 0개의 값을 나타내고, 3일 경과 개체1의 경우 155.3개, 개체2의 경우 139.4개, 개체3의 경우 7개의 값을 가리키는 바, 이는 각각 1/2로 희석한 시료로 계산된 값이므로 희석배율을 반영하기 위해 2의 배수를 곱한 결과, 하기 표 4와 같이 실제 장기 내 존재하는 세포 수를 정량 할 수 있었다.
ID Ct Mean Quantity
(Cell numbers)
스탠다드 1번 24.517 156250.0
스탠다드 2번 26.448 39062.5
스탠다드 3번 28.832 9765.6
스탠다드 4번 31.016 2441.4
스탠다드 5번 33.437 610.4
미주입 개체1 Undetermined 0.0
미주입 개체2 Undetermined 0.0
미주입 개체3 Undetermined 0.0
주입 1일차 개체1 35.722 143.2
주입 1일차 개체2 36.566 103.4
주입 1일차 개체3 Undetermined 0.0
주입 3일차 개체1 35.558 155.3
주입 3일차 개체2 36.169 139.4
주입 3일차 개체3 38.777 7.0
주입 7일차 개체1 Undetermined 0.0
주입 7일차 개체2 Undetermined 0.0
주입 7일차 개체3 Undetermined 0.0
희석배율 반영한 값
미주입 주입 후 경과일
1일 3일 7일
개체 1 0 286.3 278.8 0
개체 2 0 206.8 310.6 0
개체 3 0 0.0 14.0 0
평균 0 164.4 201.1 0
표준오차 0 85.3 94.0 0
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> A method for analyzing the distribution of human derived cells in the heterologous animal <130> PN129171KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sense strand <400> 1 catcaggtga ggaaggcag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer antisense strand <400> 2 ggcattgctg caaagaaaga 20 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 aagcggccag cctggcaccc tatggac 27

Claims (8)

  1. 인간 유래 세포와 이를 주입한 이종 동물의 특정 장기 내 핵산을 각각 추출하고, 인간 특이적 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 물질을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계; 및
    임계 사이클(Ct; threshold cycle) 값을 비교하여 상기 이종 동물의 장기 내에 존재하는 주입된 인간 유래 세포의 수를 정량하는 단계를 포함하는, 주입된 인간 유래 세포의 이종 동물 체내 분포도를 분석하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 유래 세포는 인간의 골수 유래 줄기세포인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 장기는 간, 신장, 비장, 뇌 및 생식기로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 인간 유래 세포를 이종 동물의 정맥 내로 주입하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산을 추출하는 단계는 상기 이종 동물의 특정 장기 내 존재하는 전체 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산을 추출하는 단계는 인간 유래 세포와 이를 주입한 이종 동물의 특정 장기 전체의 각각의 용해물(lysate)로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 특이적 유전자는 인간 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 코딩하는 유전자인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 상보적으로 결합하는 물질은 서열번호 1의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트와 서열번호 3의 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것인 방법.
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