CN108103064B - 长链非编码rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长链非编码RNA及其应用。发明选取莱芜猪和大白猪为实验材料，用高通量测序方法，比较二者肌内脂肪组织基因表达谱，鉴定筛选与成脂分化及脂代谢相关的关键差异表达lncRNA——XLOC_015408，进一步分析显示XLOC_015408调控基因AKR家族成员AKR1CL1和AKR1C4的表达。本发明寻找到与肌肉脂肪代谢密切相关的基因，在畜牧业分子育种中具有重要作用。

Description

长链非编码RNA及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及长链非编码RNA及其应用，更 具体地涉及长链非编码RNA、其调控的基因AKR1CL1和AKR1C4在选育高品 质家畜品种中应用。

背景技术

lncRNA是一类长度大于200个nt且不表现蛋白质编码潜能的RNA。在细 胞增殖分化、个体发育、信号转导、干细胞维持、代谢等重要生命活动中发挥关 键的调控作用，与多种重大疾病的发生密切相关，参与基因组印记、X染色体 沉默以及染色质修饰、核内运输、转录干扰、转录激活等多种重要的调控过程， 涉及到表观遗传调控、转录调控及转录后调控等多个层面。lncRNA的表达水平 相对于编码蛋白基因比较低，说明lncRNA可能主要起调控作用。根据lncRNA 在基因组上的位置，一个lncRNA可以归于以下5类中的1种正义链(sense)、 反义链(antisense)、双向(bidirectional)、内含子间(intronic)、基因间(intergenic)。

AKR(醛酮还原酶)是一类可利用NAD(P)(H)为辅酶，能够分别将醛和酮 还原成一级和二级醇类的蛋白酶。迄今所知，AKR超家族由140多个成员组成， 可以分为15个家族，序列同源性高于40％的成员归于一个家族，而序列同源性 高于60％的成员可以进一步组成一个亚家族。现有的研究表明AKR家族成员多 与组织肿瘤的发生发展相关，但是没有文章研究其与肌内脂肪的关系。

本研究选取莱芜猪和大白猪为实验材料，利用RNA-seq技术和生物信息学 方法，比较分析大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织基因表达谱，鉴定筛选与成脂分化 及脂代谢相关的关键差异表达长链非编码RNA——XLOC_015408，进一步分析 显示XLOC_015408调控基因AKR家族成员AKR1CL1和AKR1C4的表达。本 发明发现了调控猪肌内脂肪沉积的分子标志物，并进一步研究他们的相互作用关 系，结果显示这些分子标志物可用于选育高肉品质畜禽品种，在畜牧业分子育种 中具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种lncRNA，所述lncRNA为XLOC_015408，与猪 肌内脂肪相关，序列与SEQ ID NO.1具有90％以上序列同源性。

优选的，XLOC_015408序列与SEQ ID NO.1具有95％以上序列同源性；更 优选的，长链非编码RNA序列为SEQ ID NO.1。

更优选的，所述lncRNA来源为猪。

为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候 选基因XLOC_015408，进一步通过分子细胞生物学方法验证了XLOC_015408 及其靶基因与猪肌内脂肪密切关系，可用于预测或辅助预测猪肉品质，在畜牧业 育种中具有重要的意义。

本发明的目的在于提供一种检测肌内脂肪的试剂，试剂通过测序技术、核酸 杂交技术或核酸扩增技术检测XLOC_015408的表达水平。

优选的，通过高通量测序技术、探针杂交技术、基因芯片技术或荧光定量 PCR技术检测XLOC_015408的表达水平。

更优选的，核酸扩增检测XLOC_015408的表达水平的试剂含有一对特异性 扩增XLOC_015408的引物；核酸杂交检测XLOC_015408的表达水平的试剂包 括与XLOC_015408的核酸序列杂交的探针。

进一步，核酸扩增检测XLOC_015408的表达水平的试剂包含一对用于核酸 扩增的引物，序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

进一步，上述检测肌内脂肪的试剂检测的样本为猪。

进一步，上述检测肌内脂肪的试剂检测的样本为组织，优选为肌内脂肪组织。

本发明的目的在于提供下述任意一项应用：

上述lncRNA在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述lncRNA在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述lncRNA在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

上述试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

上述试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

上述试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

本发明的目的在于提供XLOC_015408靶基因及其表达产物在预测或辅助预 测家畜肌肉品质中的应用，所述XLOC_015408靶基因为AKR家族基因。

优选的，AKR家族基因为AKR1CL1和/或AKR1C4基因。

本发明的目的在于提供XLOC_015408靶基因及其表达产物在选育具有不同 家畜肌肉品质猪中的应用，所述XLOC_015408靶基因为AKR家族基因。

优选的，AKR家族基因为AKR1CL1和/或AKR1C4基因。

进一步，通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测AKR1CL1和/ 或AKR1C4基因的表达水平。

优选的，核酸扩增技术采用一对特异性引物扩增AKR1CL1和/或AKR1C4 基因；核酸杂交包括与AKR1CL1和/或AKR1C4基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，通过免疫方法检测AKR1CL1和/或AKR1C4基因表达产物的表达 水平。

优选的，通过ELISA检测试剂盒和/或胶体金检测试剂盒检测AKR1CL1和/ 或AKR1C4基因表达产物的表达水平。

优选的，家畜为猪。

一种检测肌内脂肪的试剂盒，试剂盒包含用于核酸扩增的引物对，序列选自： SEQID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对；SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7组成的 引物对。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对XLOC_015408的 任何特定变体的基因表达进行定量。在一些实施方案中，其具有与XLOC_015408 序列至少85％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序 列。

术语“同源”是主要是指序列上的同源，也就是用来说明两个或多个蛋白质 或DNA序列具有相同的祖先。同源的序列一般有相似的功能。蛋白质和DNA 的同源性常常通过它们序列的相似性来判定，相似性是指序列比对过程中用来描 述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低。 一般来说，当相似程度高于50％时，常推测检测序列和目标序列可能是同源序列； 当相似性程度低于20％时，就难以确定其是否具有同源性。

核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩 增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA 逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环， 以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA 制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷 贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核 酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝， TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过 程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核 苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接 酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多 个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物 延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰 的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行 的聚合酶介导的引物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和置换的 链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分 子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往 往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能 和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记， 其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂 交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的 碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同 源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部 核苷酸中通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标， 2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、 TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即， 核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的 条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。在其结构内含有互 补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern 或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为 探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组 织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色 体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他 转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本， 并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别 使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或 其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

附图说明

图1为肌内脂肪差异表达基因分布图；

图2为差异表达基因qRT-PCR验证结果图；

图3为差异表达基因XLOC_015408的qRT-PCR验证结果图；

图4为AKR1CL1和AKR1C4基因的qRT-PCR验证结果图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1样品采集制备及实验设计

实验猪屠宰之后，迅速采集其背最长肌肌内脂肪组织，剪成小块，装填入5mL 冻存管中，投入液氮冷冻，之后转移到-80℃冰箱长期保存，用于总RNA的提取， 实验设置3组，分别对大白猪肌内脂肪组织(D_JN)与莱芜猪肌内脂肪组织(L_JN) 中的lncRNA进行鉴定，及分析他们肌内脂肪组织基因表达谱，每个样本设置3个 重复。

实施例2样品总RNA的提取及质控

分别取出等量低温保存的脂肪组织样品，按照使用说明书，使用mirVana^TM RNA抽提试剂盒提取每个脂肪组织样本的总RNA，分离的总RNA样品保存在-80℃ 冰箱。应用NanoDrop 2000分光光度计测定RNA样品的浓度以及OD260 nm/OD280nm值，并且控制在1.9～2.1之间，应用Bioanalyzer 2100评估总RNA的 质量，并控制RIN>＝7且28S/18S>＝0.7，利用RNase-free DNaseⅠ消除潜在的基因 组DNA污染。

实施例3cDNA文库构建和RNA测序

链特异性cDNA文库

(1)Ribo-zero kit去除rRNA

(2)RNA片段化

(3)双链cDNA合成及纯化

(4)末端修复，加入A碱基

(5)测序接头连接

(6)DNA片段富集纯化

(7)文库质检

(8)本研究共建立6个cDNA文库，分别为D_JN_1、D_JN_2、D_JN_3(大 白猪肌内脂肪组织cDNA文库)以及L_JN_1、L_JN_2、L_JN_3(莱芜猪肌内脂 肪组织cDNA文库)。

RNA-Seq(Illumina Sequence)

文库质检合格之后，应用Illumina HiSeqTM 2500测序平台，采用双端测序(Paired-end Sequence)，对cDNA文库进行测序分析，下机数据为原始测序数据 rawreads。

实施例4原始数据质控及过滤

原始测序数据(raw reads)，存在低质量和被污染的序列，必须经过质量控 制和过滤，才能进行后续的生物信息学分析过程，保证结果的准确性和可靠性。 主要应用cutadapt(v1.12)和FASTX_toolkit(v0.0.14)软件对raw reads进行质量 控制，后续的分析均基于得到clean reads。具体操作如下：

(1)去除带有接头(adapter)序列污染的reads；

(2)过滤掉序列中无法确定碱基(N)比例大于10％的reads；

(3)去除质量值Q<20的碱基占序列总碱基数大于15％的低质量reads；

结果见表格1，通过质控，每个样本中均得到约90百万条的clean reads，且reads中Q-score≥30碱基比例均约在95％，同时GC碱基含量均约占50％，表明测序数 据结果可靠，质控之后可用于进一步分析。

表1原始数据质量控制结果

实施例5参考基因组比对与转录本拼接

将clean reads比对到参考基因组，对reads进行定位。首先从Ensembl数据库下载猪的参考基因组Sscrofa10.2 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/fasta/sus_scrofa/dna/)以及注释文件 Sscrofa10.2.87.chr.gtf(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/gtf/sus_scrofa)。然后运 用bowtie软件(v2.2.5)(Langmead&Salzberg,2012)bowtie-build建立参考基因组 索引，运用TopHat(v2.0.12)(Trapnell et al.,2009；Kim et al.,2013)软件将每个样 本得到的clean reads比对到参考基因组上，mismatch限制为2，其它选用默认参数。

为了预测新的转录本，需要对转录本进行重建和组装。以TopHat2软件将cleanreads比对到基因组之后得到的序列比对文件accepted_hit.bam(the resultingalignment files)为输入，利用Cufflinks(v2.1.1)(Trapnell et al.,2012；Trapnell etal., 2010)软件对每一个样本进行转录本组装，得到transcript.gtf注释文件。利用Cuffmerge将12个样本的gtf文件组装，合并生成merged_transcript.gtf注释文件。利 用Cuffcompare将merged_transcript.gtf与参考注释文件Sscrofa10.2.87.chr.gtf进行 逐一比对，筛选与其他已知的ncRNA、mRNA等完全匹配或相似的转录本，同时 明确定位转录本的位置信息，鉴定预测潜在的新mRNA和lncRNA。

结果：利用生物信息学软件将Clean reads比对到猪的参考基因组，结果如表 2所示。

表2 Clean reads比对参考基因组结果

实施例6可变剪接事件分析

利用ASprofile(v1.0)(Florea et al.,2013)软件分析每个样本的组装文件，对可变剪切事件进行分类统计。根据外显子的结构及内含子滞留情况，将可变剪切 事件(alternative splicing,AS)定义成12个不同的类别，包括TSS、TTS、SKIP、 XSKIP、MSKIP、XMSKIP、IR、XIR、MIR、XMIR、AE、XAE。

实施例7潜在lncRNA挖掘鉴定

LncRNA是一类长度大于200bp，不编码蛋白质的RNA，基于这两个主要的 特征，对潜在的lncRNA进行鉴定，主要筛选基因间lncRNA(intergenic lncRNA, lincRNA)、内含子间lncRNA(intronic lncRNA)、正义lncRNA(sense lncRNA)和 反义lncRNA(antisenselncRNA)。具体操作如下：

(1)外显子个数和转录本长度筛选：阈值为exon个数≥2，length>200bp， 过滤掉低可信度的单外显子转录本。

(2)编码潜能筛选：对于以上筛选到的转录本，利用PLEK(Li et al.,2014)、 CNCI(Sun et al.,2013b)、CPC(Kong et al.,2007)、Pfam(Finn et al.,2014)这四种软 件预测其蛋白编码潜能，取交集得到lncRNA的最终结果。PLEK是基于优化k-mer 策略，阈值score<0，CNCI基于序列相邻核苷酸三联体频谱，阈值score<0，CPC 基于转录本开放阅读框序列特征，并与UniProt参考数据库BLASTX比对，阈值 score<0，Pfam是一个蛋白家族数据库，将转录本编码框同源比对到数据库，比 对不到的转录本为lncRNA。

(3)已知lncRNA的鉴定，ALDB(A Domestic-Animal Long Noncoding RNADatabase)(Li et al.,2015a)是一个家畜动物lncRNA数据库，通过BLASTN工具将 候选lncRNA与数据库中的lncRNA比对，以Identity＝100％，mismatch＝0， E-value<1e-10，gap_opening＝0为条件严格鉴定已知lncRNA。

主要对lncRNA的分类，长度分布及外显子个数进行分析，同时与鉴定得到 的已知mRNA进行比较分析。lncRNA和编码蛋白基因的长度总体上分布趋势比 较一致，较短mRNA转录本密度相对高于lncRNA，本研究中鉴定到的lncRNA平 均长度为2263nt，mRNA平均长度为2028nt。

实施例8不同样品间基因差异表达分析

构建已知mRNA、预测新转录本和lncRNA数据集，利用bowtie和eXpress软 件比对统计分析各转录本在每个样本中的表达丰度(read count)。应用每百万片 段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目(fragments Per kb per Million reads, FPKM)算法对基因的表达水平进行校正，消除因测序深度、基因长度不同及样 本差异对基因表达量的影响。实验具有生物学重复，应用R语言包DESeq2(Anders &Huber,2010)，基于负二项分布，对不同样品间基因(包括lncRNA，mRNA) 进行差异表达分析，Benjamini-Hochberg算法用于对P值进行多重假设检验校正， 得到校正P值(padj)，以|log2FoldChange|≥1(L_JN vs D_JN)且padj≤0.05为条 件筛选差异表达基因。

基于转录本表达量FPKM值，通过构建FPKM值箱线图和密度图，在整体上 对不同脂肪组织样本中的转录本表达量进行分析。组内两品种猪肌内脂肪组织的 转录本的表达量分布比较一致，组间大白猪脂肪组织中转录本相比于莱芜猪，低 表达量转录本较多。样本间转录本表达量分析，可以看出实验数据整体上符合要 求。同时对鉴定得到的lncRNA和mRNA的表达量进行分析，发现mRNA具有相对 高的表达水平，lncRNA的表达量较低，FPKM值主要集中在(0-10]之间，FPKM 值在(0-100]之间的mRNA呈现出均匀分布。

通过对肌内脂肪组织((L_JN vs D_JN)基因进行差异表达分析(图1)，共 鉴定得到56个差异表达lncRNAs(34个上调，22个下调)，715个差异表达mRNAs (371个上调，344个下调)，其中具有4倍以上差异的基因约占48.4％。其中以 AKR1CL1、AKR1C4为代表的差异表达基因和以XLOC_015408为代表的差异表 达长链非编码RNA纳入我们的研究对象。

实施例9差异表达基因GO及KEGG Pathway富集分析

基因本体论(Gene Ontology,GO,http://www.geneontology.org/)是基因功能国际分类标准，由分子功能(molecular function)、生物学过程(biological process) 和细胞组分(cellular component)组成。通路富集分析能确定差异表达基因参与 的主要代谢途径和信号通路，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg)数据库(Kanehisa et al.,2008)作为相关的主要公共数据 库，是进行代谢分析、调控网络研究的主要工具。为了进一步研究差异表达基因 的主要生物学功能，本实验应用CluGO(Bindea et al.,2009)软件，基于超几何分 布检验计算差异表达基因显著富集的GO条目和信号通路，Benjamini-Hochberg算 法校正得到的P值(Q_value)，当Q_value≤0.05时，则富集显著。

大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织中共鉴定出513个数据库已注释的差异表达基 因，分别有210、144、62个基因富集到生物学过程、分子功能和细胞组分的一个 或多个条目，其中大量与脂质代谢和沉积密切相关的GO条目显著富集。依据生 物过程，较多的基因(≥15)富集到脂质生物合成过程(lipid biosynthetic process)、 脂质代谢过程(lipidmetabolic process)、细胞脂质代谢过程(cellular lipid metabolic process)、脂质应答反应(response to lipid)、MAPK级联反应(MAPK cascade)、 MAPK级联反应正调控(positive regulation of MAPK cascade)及MAPK级联反应 调控(regulation of MAPKcascade)。对于分子功能部分，仅显著富集于酶抑制 剂活性(enzyme inhibitoractivity)条目。在细胞组分，显著富集于细胞外基质 (extracellular matrix)、轴突(axon)等相关GO条目中。大白猪和莱芜猪肌内脂 肪沉积存在显著差异，通过GO注释发现，差异表达基因显著富集于与脂质代谢 和细胞分化的生物过程，表明二者肌内脂肪沉积、代谢的分子机制存在差异，受 到不同基因调控。

实施例10差异表达基因蛋白-蛋白互作网络分析

蛋白互作研究可以从分子水平揭示蛋白质的功能。因此，基于STRING (http://string-db.org/)蛋白质互作数据库中的互作关系，对差异表达基因进行蛋白 互作网络分析，以更进一步探究大白猪和莱芜猪肌内脂肪组织差异表达基因编码 蛋白间复杂的相互作用关系。STRING数据库中包含物种猪(Sus scrofa)，直接 从数据库中提取出差异基因集列表的互作关系，利用Cytoscape软件对得到的差 异基因编码蛋白互作网络数据文件进行可视化分析。蛋白互作网络图中，节点 (Node)为蛋白质，边缘(Edge)为蛋白之间的相互作用关系，度(Degree)代 表与特定节点相互作用的蛋白质数量，节点大小与此节点的度成正比，节点的颜 色表示差异表达基因的log2FoldChange值。

实施例11差异表达lncRNA的靶基因预测

lncRNA作为一种非编码RNA，其功能主要体现在对靶基因的调控上，主要 包括对距离较远蛋白编码基因的反式作用调控(trans-regulation)，同时，具有相 同表达模式的基因，在功能上具有强的相关性。因此通过对lncRNA与mRNA共 表达、trans分析研究lncRNA的靶基因。

通过计算差异表达lncRNA和mRNA表达量的皮尔森相关系数(Pearsoncorrelation coefficient，PCC)，分析lncRNA和mRNA的共表达关系，以|PCC|>0.8 且P_value<0.05为阈值筛选共表达的lncRNA-mRNA。

lncRNA trans作用靶基因分析，通过lncRNA和mRNA序列间的相互作用关系， 对差异表达lncRNA的trans作用靶基因进行预测，RNAplex(Tafer et al.,2011)软 件用于计算lncRNA和mRNA序列之间的结合自由能(Energy)，结合共表达结果， 以Energy<-20且|PCC|≥0.9鉴定lncRNA trans作用靶基因。

通过分析寻找到XLOC_015408与脂肪代谢相关trans作用靶基因AKR1CL1、AKR1C4，相对于大白猪二者在莱芜猪肌内脂肪含量均较低。

实施例12差异表达lncRNA的荧光定量PCR验证

本研究随机选取在L_JN(莱芜猪肌内组织)vs D_JN(大白猪肌内组织)9个差 异表达基因(lncRNA 4个，mRNA 5个)，每个基因设置3个生物学重复，以猪肌 动蛋白β(actinbeta,ACTB)基因为内参，应用qRT-PCR方法验证基因的表达水 平。应用

PCRSystem 9700(Applied Biosystems,USA)，取约0.5μg的 RNA样品反转录合成cDNA模板。利用

Green PCR Kit (Qiagen,Germany)和

480ⅡReal-timePCR Instrument(Roche,Swiss) 进行qRT-PCR分析。

利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)将待测RNA逆转录成cDNA。

(1)取出存放于-80℃冰箱下提取好的总RNA样品，室温解冻，0.2mL PCR 管中如下配置反转录体系。

(2)逆转录体系(10μL)：总RNA，0.5μg；4×gDNA wiper Mix，2μL； Nuclease-freeH₂O加至8μL，反应条件：42℃2min。加入5×HiScript II Q RT SuperMix IIa，2μL，反应条件：25℃10min，50℃30min，85℃5min。

(3)逆转录完毕后加入Nuclease-free H₂O稀释至100μL，-20℃保存。

Real-time RCR反应

(1)体系配置

表3 PCR体系中组分和体积

组分	体积(μl)
		2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix	5
Forward primer(10μM)	0.2
		Reverse primer(10μM)	0.2
Nuclease-free H2O	3.6
		cDNA	1
共计	10

(2)循环条件

表4 PCR循环条件

3)将PCR体系混合均匀，反应后离心，分到384孔板，在

480Ⅱ Real-time PCR Instrument(Roche,Swiss)上进行qRT-PCR反应和分析。

2-△△Ct法计算各组样本间基因的相对表达量，t-检验对相对表达量进行统 计分析，数据表示为平均数±标准差(Mean±SD)，P<0.05表示差异显著

FASN、XLOC_002561、XLOC_053194、CD36、MAP3K4在大白猪肌内脂 肪中显著上调，XLOC_027632、SCD在莱芜猪肌内脂肪中显著上调表达(图2)。 以上结果与测序结果一致，表明测序结果可靠。

收集10例大白猪肌内组织样本和10例莱芜猪肌内组织样本进行备选基因 XLOC_015408、AKR1CL1(NM_001038626.2)、AKR1C4(NM_001123075.1) 基因荧光定量验证，具体步骤同上。

引物设计：

XLOC_015408：

上游引物：5’-AGACAGTATCAGAGAAGG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物：5’-GAAGAGGTTGTTGCTATT-3’(SEQ ID NO.3)

AKR1CL1基因：

上游引物：5’-AGGACATCGTTCTAGTTG-3’(SEQ ID NO.4)

下游引物：5’-ATATGGGTTGCTCTCTTC-3’(SEQ ID NO.5)

AKR1C4基因：

上游引物：5’-AGGACATCGTTCTAGTTG-3’(SEQ ID NO.6)

下游引物：5’-ATATGGGTTGCTCTCTTC-3’(SEQ ID NO.7)

结果见图3和图4，XLOC_015408在莱芜猪肌内脂肪中表达量不足大白猪肌 内脂肪组织的五分之一倍，AKR1CL1基因和AKR1C4基因在莱芜猪肌内脂肪中 表达量不足大白猪肌内脂肪组织的三分之一。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明 进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 长链非编码RNA及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5307

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

ctcagaaggt agatttaggt ttgtaggtaa ttcacaagca gattgtgata aaatcagagt 60

caaactccaa cattttaagg gtgactgaga gcagccagcg agacaaggga gggaaacaag 120

aaggatttgt tatcacagaa gacagaaggc tcaggaagtt ttaataagtg aatgggaggt 180

cagcctcctc ttcctttcta gaagagactt gaagatatgc aaagaaagca agctggcgga 240

gagagactgg agataccttg gccctaggga aggtgggaga ggatgggatc agagcagggc 300

aagaagtagc ccttgcaagt caactggaag agttccttac tgatgacttt ttcctgttga 360

agaaagagtt cgtgggcatt tggagacgat gtctaccgta gaaaagcctc agaaagacag 420

tatcagagaa ggctggaaga tgcatcagaa actgaacttc agcagtcaat aaaaatttgg 480

acttaatatg aataaaagcc aggtctatta ctccccgtaa gtgcgcctgt gaatagcaac 540

aacctcttcc cttgcctggc tctattaata tacaagggct ggacctccat gaggactggg 600

gagcaatagg cttcactgcc ctctgtgata atattgcttt catcaagctg ctgaagatga 660

agacacaact tcttcccaaa gaaagtgaac cttcagcata aatccaccat agacaagcaa 720

aatcagaggc tcagtctttt gggagagatt ttatagtctg acccagagta tgtttggatc 780

aactggtaga aaaagcaaag gcatctttcc atgcttggag aatcacatcc aacatctttt 840

caatcaagaa aatatctgca tattaaagaa ggctaaattt caaaatagtg tccaactatt 900

gctcatgaat aaaaatgcag atgcttaagg ccacagaata tcctcaagtt aatgatctct 960

gccacaaatc aattgttcta agggatttta tctaatttaa gtcagtccat ttatgtaaga 1020

accaattcat ataaagagcc actgaagact cagatctcat taaagcacta ctgagtcact 1080

gctcagagat ggctcaagtg tgaagaccag tgatgaccaa cagcaccaag gagaggaagg 1140

tggttctcac atgcactttt tttttttttt tttttttttg ctttttaggg ccacaccctc 1200

agtatgtgga ggttcccagg ctaggggtcc aatcggagct acagctgctt gcctacatca 1260

tggccacagc aacacaggat cccagcctca tctgtgacct acaccacagc tcacagtaat 1320

gccagatcct taacccactg agtgaagcca gggattgaac ctgcaacctc atggatccta 1380

gtcagatttg tttccgctgc gccatgacag gaactcctca tgtgcacttt gaagatggca 1440

ggacaatatc tgacctcaag caaagcagca aagcaactgt attaaaatga agatactttt 1500

agaacacatt tatttggatg ctataaaact aatttttgtt aatcaagatg taaactttaa 1560

acttttcctc aatttctttt ttttaacatt tctactaagg catgtgactc tacctgaatt 1620

atcagatact aggattattt aagggaactt tcataatata aaagcaatgc tctattatac 1680

tcttaagaga actgcagtgc cccacaatgt gaaaaaggca aataataact tacattttaa 1740

aaaccaaaat acttaactct agaatgacaa aaatctaatt agtatttatt gcaagacaac 1800

ttcctccact agggtgatgg ggaaagaatg tgagctttgc agcttcactg tatcatctaa 1860

gtgataggga aaatatttag ctaaagagta aatgcttggt ataggagttc ctgtcacggc 1920

gcagtggtta atgaatccga ctaggaacca tggggttgag ggtttgatcc ctggccttgc 1980

tcagtgggtt aaggatctgg cattgccgtg agctatggtg tgggtcgcag acgtggctcg 2040

gatcctgagt tgctgtggct ctggcgtagg ctggtggcta cagctctgat tagaccccta 2100

gcctgggaac ctccatatgc ctcaggagtg gctcaagaaa agacaaaaag accaaaaaaa 2160

aaaaaaagaa agagaaaaag taaatgcttg gtatgggagg gctatctttg ttcatctagc 2220

agtcctattt tggaaatctt gcctaaatat ctaaagctgt agcttaatca aattaatctt 2280

ttagaaattt ggatttttca cagtgagtta tttctcttaa aaaagtacac gcacacacac 2340

acttggatca tggtgttttc caaaacagtt tctctcctag tacagcagta ttcaggtctt 2400

agttttcata tatgtgtatt aaatttagaa tttcttggcg ttccggttgt ggctcagggg 2460

gttaagaacc cgactagcat ccatgaggat gtgggttcga tccctggcct tgcccagtgg 2520

gttaaggatc tggtgttaca gggagctctg ggataggttg caaacgtggc ttggatctgg 2580

tgttgctgtg gctgtggcct agggtggcag ctgcagctac aatctgaccc ttagcctgac 2640

aacttccata tgcagcaggt gaggccctaa aaaaggaaaa aacaatttta gaatttcttg 2700

ccacatgtat atgcaatcca caagacatga attccaaatc tatttggggg atagaactag 2760

tctattaaca tccttaggtc agaactttca ttcagctgac ctagccactt ccaaatgaaa 2820

aaggaataga ggaatactct cagcagtatt gctcacagca ttcaggtgaa atgcctaact 2880

aatgctttgg agatcattca aaatatgccc atgagcacag atggcagtac agccctaaac 2940

tgtaagggga acagaaccaa agggatttgc aaagtgatat tagaggaaaa cgtttttttt 3000

tttttttttt ttttaaccaa cactttgtat taaaagtgtg gtcatgtttc aggagcttat 3060

aagcatgata aaaacacatc caggccacct gtctcttcta accaccaaca gctatttgaa 3120

atgggttaca ctgatttatg atacagaaca tgctttcctt gccttccacc atcagtaaca 3180

attctgcaat ttcaacttca gcctgcattt ctacccatgc tgaggacatg ttaggaatcc 3240

ctgactgcca gccttgggta agacgtgcat gtcaggttgt agtgtgacta cactcacctt 3300

ctgtgttaat gcatcctgag ccctgaacca cagtctggcc agtgattttt gcctccaccc 3360

aagaagcttt cttcccttag actgacagct gtagccttat cagcatcaaa tcaaggcttg 3420

cagaaattaa acctgcttga aactaacatc tgacataggc tttaacagaa caaccaaacc 3480

tggttaatcc aaatcacttt gcaaactcca tttttatttg gattaaaaag ctttagatga 3540

acaaacatat gatacataca tattataaga ctagttacca cttaaatctc ttttgataca 3600

gaaatcagaa taaaccaagt tttaatcagg tctgaaaatg ttcaagttca aaagtcaata 3660

ataccaattt ggagattttt acacaaagaa gtgtccctgc ccaattcttc ctcagaggaa 3720

gagaagggtg ggttcaaaaa cagagcaatt caaggccttt aaatcagttg gctgacatac 3780

tgttttaaac ctataggtct tttcccccac ataaacaaaa ttcttttcca tatgaactta 3840

tattttgaaa acatttaggc cattatactt tctaagctgc attactacag ttcctaaaac 3900

tcaggagaaa aaaagatgta tagttcactt gcacttttta aagtcaggac tttttttttt 3960

ttttcttttt ctctttttgg tttttctttc ttggaagatg gctgatctca aatcttatat 4020

cctaaatagt aactgatatt ctccaagtta atatacagaa agacatgatt ctaaaataaa 4080

tacatagagt tctttttttt tttttttttt tttttaaact taattagggc ctgcctagtg 4140

gccccctggc ccggctctac actgccttag ggaagcccct ggctggatct atggttccta 4200

cagcacctct agacactgag aaggagcctg gaggaggagt gctctggctt ctaatgcccc 4260

acataggcca cagtgaagag tttttagagg ctccccaaag aagtctcttc cagaccttaa 4320

aaagggaaat aaaatgggtg tatgaaataa ataaataact taaccaaaat taaatttcag 4380

gttctttggt gtaattcaac gatgtctaga aataaaatca cctgattgta ttatatagtc 4440

catgatgatt caatggccca aataaccagg aactgaattt tttaaaatct gattcagttt 4500

aacaataagg tactgacata ctattgcaat atattttttt tccaagttca gaatttttaa 4560

aaatacttga tgcaaattga gatccagtgg ttgactacag gcaactaaat tacaagggcc 4620

tcttgtattt aaagtatctg gatacaagag actttgtttc atgctacact cttatcccca 4680

tgatttagca agaatggtaa ttaaatgtcc aggtattgat tcataccaga ttagaagaaa 4740

aaaagtatcc tttgagagtc accctctcaa ttcataaaca gcagtggaag ctctaccaca 4800

atggcaacca ccttgttaca ataaagcaga cttcaaaaac attgagtgaa atactgttgc 4860

atgtttgaca ctttctacct gtctgggtat tacataatgc ctccaaatgt ttttactggg 4920

gtcatataag agagatacgg tcatcaaacc caagtgtctg gggatctgta atggtctttt 4980

tagtgagcat tttcttaatt aaattatgac tcctttctcc tgaaattcaa aagcacaagc 5040

taaaatttaa aaattatttt agaaagtctt aaatttctgg ttgagaattt taactctgaa 5100

acttagaaga aaaaaaatgc cgcatctgat gaggaaataa agaataaaaa aacagatttg 5160

catatgcagg caatctatcc ttttacaatt atgcttctga tatagctcat atataattaa 5220

tgcactccct tccctatgtt aggttaggtg ttatgtttaa aaataaatca cctccatgca 5280

cactgcaatg ttttcttcaa gatgaac 5307

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

agacagtatc agagaagg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 3

gaagaggttg ttgctatt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 4

aggacatcgt tctagttg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 5

atatgggttg ctctcttc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 6

aggacatcgt tctagttg 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 7

atatgggttg ctctcttc 18

Claims (8)

1.一种lncRNA，所述lncRNA为XLOC_015408，与猪肌内脂肪相关，序列为SEQ ID NO.1。

2.下述任意一项应用：

权利要求1所述的lncRNA在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求1所述的lncRNA在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求1所述的lncRNA在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

3.一种检测肌内脂肪的试剂，试剂通过测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术检测权利要求1所述的lncRNA的表达水平，其特征在于，核酸扩增检测XLOC_015408的表达水平的试剂含有一对特异性扩增XLOC_015408的引物，引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；核酸杂交检测XLOC_015408的表达水平的试剂包括与XLOC_015408的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，试剂检测的样本为猪。

5.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，试剂检测的样本为猪的肌内脂肪组织。

6.下述任意一项应用：

权利要求3-5任意一项所述的试剂在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；

权利要求3-5任意一项所述的试剂在制备预测或辅助预测猪肉品质试剂中的应用；

权利要求3-5任意一项所述的试剂在选育具有不同肌肉品质猪中的应用。

7.XLOC_015408靶基因及其表达产物在预测或辅助预测家畜肌肉品质中的应用，所述XLOC_015408靶基因为AKR1CL1和/或AKR1C4基因，其特征在于，使用特异性引物对扩增XLOC_015408靶基因表达情况，引物对序列选自：由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对；由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7组成的引物对。

8.XLOC_015408靶基因及其表达产物在选育具有不同家畜肌肉品质猪中的应用，所述XLOC_015408靶基因为AKR1CL1和/或AKR1C4基因，其特征在于，使用特异性引物对扩增XLOC_015408靶基因表达情况，引物对序列选自：由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5组成的引物对；由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7组成的引物对。

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