CN111321229B - 一种肝癌预测模型的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝癌预测模型的构建及应用。申请人构建了肝癌的预测模型并进行了验证，结果显示，本申请构建的模型不仅具有很好的普适性，适用于各种生物信息学算法，并且准确性和灵敏度都很高。本申请提供的模型为临床肝癌的诊断奠定基础。

Description

一种肝癌预测模型的构建及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学研究及生物信息学研究领域，具体的涉及一种肝癌预测模型的构建及其应用。

背景技术

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国乃至世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一，目前针对肝癌的治疗手段主要包括手术切除、肝移植、射频消融、经肝动脉化疗栓塞术等，肝癌患者的生存期延长，生存质量得到一定改善。然而，由于肝癌起病及进展隐匿，发现时往往己失去手术机会，且复发及转移率仍居高不下，总体预后仍较差。因此，迫切需要寻找新的诊断和治疗方法，尤其是早期诊断，来提高患者的生存质量。

MicroRNAs(miRNA)是一类短小(长度约为22个核苷酸)的非编码RNA分子，通过破坏mRNA的稳定结构或通过抑制翻译调节基因的表达而发挥作用。有报道显示miRNA与肝癌的发生和发展密切相关，在癌组织中存在显著的差异表达，有的miRNA在肝癌组织中上调表达，有促进肿瘤生长、增殖和转移的作用；有的miRNA在肝癌组织中下调表达，有抑制肿瘤生长、增殖和转移的作用。有的miRNA和肝癌的预后存在相关性，提示miRNA可作为肿瘤的诊断或预后的预测标志物。

本研究中，申请人通过文献的调研及实验验证，选择几个和肝癌相关性较好的miRNA，继而应用随机森林构建了肝癌的预测模型，对构建的模型通过支持向量机和决策树算法对构建的预测模型进行验证，发现该模型在三种算法中准确性和灵敏度都很高，显示本申请构建的肝癌预测模型具有很好的普适性，本申请提供的模型为临床肝癌的诊断奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌预测模型，该模型的检测指标为下列miRNA中的一种或几种：miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p、miR-182-5p。

本申请的目的还在于提供上述肝癌预测模型在制备肝癌诊断产品中的应用。

所述肝癌诊断产品检测样本中miRNA和/或其前体的转录情况，或者miRNA调控的靶基因的表达，检测所述miRNA选自下列中的一种或几种miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p、miR-182-5p。

进一步，上述miRNA在肝癌样本中高表达。

所述的样本为外周血、组织。

进一步，肝癌诊断产品采用高通量测序方法和/或定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中miRNA和/或其前体的表达情况。

优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miRNA和/或其前体的表达情况。

优选的，所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增miRNA和/或其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与miRNA和/或其前体的核酸序列杂交的探针。

本发明的目的还在于提供上述肝癌预测模型在制备肝癌患者预后诊断试剂中的应用。

进一步，预后诊断试剂检测样本中miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p和miR-182-5p的表达量。

定义：

现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。

(1)Northern杂交

又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。

(2)miRNA表达谱芯片

原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

(3)核酶保护分析技术(RPA)

miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。

(4)RAKE法

RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。

(5)原位杂交(in situ hybridization)

原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(LockedNucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。

(6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)

是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。

(7)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)

荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

(8)测序法

大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3’末端。当5’端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个miRNA，明显提高了检测效率。

高通量测序(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(nextgeneration sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。

说明书附图

图1是三种分类器的ROC曲线图；

图2是5种miRNA各自的生存曲线图；

图3是肝癌预测模型的生存曲线图；

图4是差异miRNA-mRNA的靶向且负相关网络图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1肝癌相关的miRNA的筛选

1、样本收集

收集32例病理组织学确诊为原发性肝癌患者的癌组织及相对应>3cm的癌旁组织样本，所有的样本均在手术切除离体30min内装入冻存管内，迅速放进液氮罐中，转移至实验室-80℃超低温冰箱。

排除标准：术前经过抗肿瘤治疗，患有其他脏器恶性肿瘤疾病史。

2、样本总RNA的提取及质量分析

使用TRIzol法提取组织总RNA。

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥2可以初步判定总RNA质量较好。

3、逆转录：

采用miRNA第一链cDNA合成(货号：B532451-0020)进行miRNA cDNA反转录。

在试管中分别加入ToTal RNA 2μg，2×miRNA RT SoluTion Mix 10μL，miRNA RTEnzyme Mix 2μL，RNase-Free water补至20μL，移液器轻轻混匀上述配制的反应液，在水浴锅中37℃加热60min，85℃加热5min。短暂离心后-20℃冰箱中保存。

4、Q-PCR反应：

通过文献调研，初步选定了8个候选miRNA(miR-10b-3p、miR-10b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-196b-5p、miR216b-5p、miR-224-5p)。

1)引物设计

扩增miR-10b-5p的引物

正向引物：TACCCTGTAGAACCGAATTTGTG(SEQ ID NO.1)

扩增miR-10b-3p的引物

引物：ACAGATTCGATTCTAGGGGAAT(SEQ ID NO.2)

扩增miR-224-5p的引物

引物：TCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAG(SEQ ID NO.3)

扩增miR-96-5p的引物

引物：TTTGGCACTAGCACATTTTTGCT(SEQ ID NO.4)

扩增miR-182-5p的引物

引物：TTTGGCAATGGTAGAACTCACACT(SEQ ID NO.5)

扩增miR-183-5p的引物

引物：TATGGCACTGGTAGAATTCACT(SEQ ID NO.6)

扩增miR-196b-5p的引物

引物：TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG(SEQ ID NO.7)

扩增miR-216b-5p的引物

引物：AAATCTCTGCAGGCAAATGTGA(SEQ ID NO.8)

扩增U6 snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA (SEQ ID NO.9)

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO.10)

2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

组成成分	20μl体系
		2×miRNA qPCR masTer mix	10μl
Forward Primer(自备)	0.5μl
		Reverse Primer(10uM)	0.5μl
miRNA第一链cDNA	1μl
		ROX Reference Dye(H)	1μl
ddH2O	至20μl

3)PCR反应条件：95℃ 30s，(95℃ 5s，60℃ 30s)×40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以T6 snRNA作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-△△ct法进行相对定量。

5、结果

结果与文献调研基本一致，肝癌患者组织中几个miRNA表达量显著升高，将RT-PCR的结果通过进行统计，计算各自miRNA的AUC值，结果如下表所示，AUC值作为评价分子的诊断准确率和灵敏度的重要指标，当AUC值大于0.7时，显示分子具有较好的诊断效果，提示miR-10b-3p、miR-10b-5p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-224-5p可能作为检测靶标应用于肝癌的诊断，进一步，将上述6个miRNA利用随机森林算法构建分类模型，按MeanDecreaseGini值从大到小对6个miRNA进行重要性排序,按MeanDecreaseGini值排序结果的顺序，从上而下依次增加1个miRNA，分别利用随机森林算法进行分类，并用十折交叉验证(10-fold cross-validation)过程求准确度，结果显示，当miRNA的数量达到5的时候，准确度首次达到最高点，miR-96-5p的加入反而减低组合物检测的准确性，所以选取前5个miRNA作为最优的biomarkers，即miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p、miR-182-5p。

表2

实施例2肝癌预测模型的验证

采用截止到2018年8月8日，TCGA数据库共收录肝细胞癌患者377例，包含377例患者临床资料、371例患者的mRNA数据以及375例患者的miRNA数据。这些数据均来自肝癌病例组Primary solid Tumor和对照组Solid Tissue Normal。对纳入研究的样本的筛选要求：

①删除没有临床信息的样本；

②删除分期和生存时间信息不完整的样本；

③保留miRNA和mRNA的共同样本。

按以上标准筛选，得到miRNA的病例数和对照数分别为342和50，mRNA的病例数和对照数分别为342和50，并进行整合分析。在整合分析中，对实施例1筛选的5个miRNA，应用随机森林来构建分类模型，并用支持向量机和决策树算法构建分类模型与之比较。

表3

结果发现，3个模型准确度都很高，随机森林准确度最高。用十折交叉验证过程求得的准确率、灵敏度、特异性、AUC的值见表3，各分类器的ROC曲线如图1所示。miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p、miR-182-5p的组合能够用于肝癌的诊断，模型构建成功。

实施例3肝癌预测模型与生存曲线

采用实施例2中的样本，根据临床信息的生存状态以及生存时间，使用工具为R包survival(https://cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)，画出筛选5个miRNA(miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p、miR-182-5p)的五年生存曲线，如图2所示，同时绘制5个miRNA组合后构建的模型的生存曲线，如图3所示。

结果发现，单独5个miRNA中的任意一个均无法有效区分肝癌患者的生存期，但是5个miRNA组合后构建的模型却能够预测肝癌患者生存期的长短。

实施例4miRNA-mRNA靶向关系分析

采用Pearson相关系数法分析miRNA-mRNA的相关性，根据上面筛选的5个miRNA和差异表达mRNA表达量的相关性，得到3756个miRNA-mRNA反相关的关系对(p<0.05，r<0)。

利用包括RNA22，miRanda，miRDB，miRWalk，PICTAR2及Targetscan这些算法预测差异表达miRNA的靶基因，选取≥4个算法预测出来的靶基因，并在miRWalk数据库查找已验证的差异表达的miRNA的靶基因。我们共获得276个miRNA-靶基因关系对，其中预测的miRNA-上调-靶基因-下调249个，验证得到的miRNA-上调-靶基因-下调38个，有11个miRNA-靶基因关系对既在验证里面，也在预测里面。

对上面得到的miRNA-mRNA反相关的关系对和miRNA-mRNA靶向关系对取交集，得到170个miRNA-mRNA靶向且负相关关系对，其中差异表达mRNA共145个，miRNA共5个。利用Cytoscape构建网络图，如图4所示。图中共包括150个nodes，170条edges。

虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。

因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。

序列表

<110> 河北医科大学第三医院

<120> 一种肝癌预测模型的构建及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taccctgtag aaccgaattt gtg 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acagattcga ttctagggga at 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaagtcact agtggttccg tttag 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttggcacta gcacattttt gct 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttggcaatg gtagaactca cact 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatggcactg gtagaattca ct 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taggtagttt cctgttgttg gg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaatctctgc aggcaaatgt ga 22

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (10)

1.一种肝癌预测标志物组合物，其特征在于，所述标志物组合物由miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p和miR-182-5p组成。

2.检测权利要求1所述的标志物组合物的制剂在制备肝癌诊断产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝癌诊断产品检测样本中miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p和miR-182-5p的转录情况。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，样本为组织。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，肝癌诊断产品采用高通量测序方法和/或定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中miRNA的转录情况。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用northern 杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中miRNA的转录情况。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的定量PCR方法包括特异性扩增miRNA的引物；所述的基于探针杂交方法包括与miRNA的核酸序列杂交的探针。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述标志物在肝癌样本中高表达。

9.检测权利要求1所述的标志物组合物的制剂在制备肝癌患者预后诊断试剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，预后诊断试剂检测样本中miR-10b-5p、miR-10b-3p、miR-224-5p、miR-183-5p和miR-182-5p的表达量。

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