CN104388561A - 肝癌生物标记物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种有利于肝癌诊断的生物标记物miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p,以及其用途可制备用于筛查肝癌或辅助肝癌病理鉴定和临床诊断的试剂盒。试剂盒包括反转录系统和引物系统;反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂;引物系统由miR-182-5p、miR-363-3p、miR-378a-3p的茎环结构反转录引物、扩增引物以及U6 snRNA的扩增引物组成。本发明确定的miRNA与肝癌临床病例指标的密切相关性,能够作为生物标记物对肝癌患者进行筛查和诊断,为临床个体化干预治疗提供有效依据,并具有定量准确、方便临床应用、取材方便,无创伤性,并可连续体外检测等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域,涉及一组肝细胞癌的生物标记物——microRNAs(miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p),及其在辅助个体肝癌筛查、临床诊断与预后判断的应用。
背景技术
在我国,原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,超过85%的原发性肝癌都是由于乙型或丙型肝炎病毒感染,长期酗酒和黄曲霉毒素B1摄入引起的。由于临床缺乏有效的预防、检测及治疗手段,大多数患者发现时已属癌症中晚期,且预后较差,死亡率高。据最新统计全球每年新增约75万肝癌患者,而每年也约有70万人死于肝癌,患者死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。在临床检查中,AFP(Alpha-Fetoprotein)作为常用的肝癌诊断的血清学标记物,但其敏感性和特异性差强人意,仅70%左右的肝癌患者血清内的AFP有明显增高,对于直径小于3cm的肿瘤其敏感性仅为25%,而对于直径大于3cm的肿瘤其敏感性也只有50%。因此,寻找一种新的更可靠的生物学标记物用于肝癌诊断和预后判断,具有广泛的科研价值和临床应用前景。
MicroRNA(miRNA)是一类进化高度保守的,由20-23个核苷酸组成的非编码RNA,miRNA的种子区通过靶向结合mRNA的3’-UTR区来调节靶基因的表达。人类约30%的蛋白表达受到miRNA的调控,许多研究表明miRNA扮演着癌基因或抑癌基因的角色,能够同时调节多个基因,通过结合靶mRNA参与调控肿瘤生成过程。目前,不断累积的研究成果已充分证实miRNA在肿瘤发生与发展过程中呈现出不同的表达水平,具有筛查和诊断肝细胞癌并对治疗方案的选择和预后分析具有潜在的指示作用。
生物标记物是指能将机体的生理和病理状态区分开来的生物分子。筛选到可用于肿瘤早期发现、早期诊断的生物标记物可大大提高肿瘤患者的临床治疗效果。最新数据显示肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达谱,即指肿瘤细胞某几种miRNA的表达水平常与同一组织中的正常细胞存在显著差异,而特征性的miRNA异常表达可望成为用于肿瘤的诊断、病理分级、临床分期、疗效与预后的生物标记物,显示了良好的临床应用前景。
近年来研究人员发现在血浆和血清中也存在独立于细胞之外并且即使在严酷环境下也能明显保持稳定的miRNA分子,而作为生物检测样本,血清具有取材方便、无创伤性、并可连续的体外检测的优点,使得基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的血清miRNA作为分子标记的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效,进而可以克服分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此,开发一种可辅助肝癌筛查和诊断的血清miRNA作为生物标记物,具有广泛的科研价值和临床应用前景。
聚合酶链式反应(Q-PCR)不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术(RT-qPCR)是一种具有革命性意义的定量PCR技术,将之用于肝癌血清样本中miRNAs的定量研究,具有较高的敏感性和特异性。因此本研究通过使用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术对肝癌患者血清与健康人群血清样本中miRNAs进行表达量验证,结果证实了miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p这三条miRNAs在肝癌样本与正常样本中存在差异(P<0.01)。miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p均在肝癌血清中明显高表达,提示其可能参与调控了肿瘤的发生作用。若能筛选与肝癌病理状态有关的特异或异常表达的miRNA作为疾病检测的生物标记物,并研制相应的检测试剂盒,将会大大提升肝癌的检测水平。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种肝癌中可用于稳定、高效率检测肿瘤的生物标记物miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p及其用途。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种有利于肝癌诊断的生物标记物miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p,其特征序列如下:
miR-182-5p:UUUGGCAAUG GUAGAACUCA CACU;
miR-363-3p:AAUUGCACGG UAUCCAUCUG UA;
miR-378a-3p:ACUGGACUUG GAGUCAGAAG GC。
本发明还同时提供了上述生物标记物的用途:制备用于筛查肝癌或辅助肝脏肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。
作为本发明miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的用途的改进:试剂盒包括反转录系统和引物系统;
反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂;
引物系统由miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的茎环结构反转录引物、扩增引物以及U6snRNA的扩增引物组成;
作为本发明的生物标记物miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的用途的进一步改进:试剂盒还包括扩增系统;扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。
检测该标记物的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。茎环是指反转录过程中使用的茎环结构反转录引物,由以下核苷酸序列组成:
miR-182-5p:
GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACAGTGTG;
miR-363-3p:
GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACTACAGA;
miR-378a-3p:
GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACGCCTTC。
荧光定量PCR技术为DNA染料法。
基于DNA染料法的荧光定量PCR检测方法,其中所使用的特异性PCR引物由以下核苷酸序列组成:
miR-182-5p PCR正向引物:GGCTTTGGCA ATGGTAGAAC TC;
miR-363-3p PCR正向引物:GCCAATTGCA CGGTATCCAT;
miR-378a-3p PCR正向引物:GACTGGACTT GGAGTCAGAA G;
miRNAs PCR通用反向引物:CAGTGCAGGG TCCGAGGTAT。
在荧光定量PCR检测方法中,使用长106bp的保守性snRNA(U6 snRNA)作为内参照基因,其PCR引物由以下核苷酸序列组成:
U6 PCR正向引物:CTCGCTTCGG CAGCACA;
U6 PCR反向引物:AACGCTTCAC GAATTTGCGT;
本发明的生物标记物可单独用于肝癌的筛查,可辅助肝脏肿瘤病理鉴定和临床诊断。本发明主要是以miRNA为中心,基于实时荧光定量PCR技术检测和分析miRNA的差异性表达,主要通过以下步骤实现:
(a)制备血清样本;
(b)提取血清样本的总RNA;
(c)反转录反应合成cDNA;
(d)实时荧光定量PCR检测miRNA在不同样本中的表达变化量。
本发明是针对现有肝癌的诊断标记物APF敏感性和特异性不能满足临床诊断的需要,在研究miRNA在肝癌组织中的差异性表达及与临床病理指数的相关性的基础上所获得的。
本发明所述的肿瘤生物标记物为miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p;其应用主要表现在:这三条目标miRNAs在肝癌患者血清与健康人血清中均显示出显著高表达,可选择单独一条miRNA或者多条miRNAs组合的形式来对肝癌患者进行筛查,用于辅助肝癌病理鉴定及临床诊断。
本发明的技术方案是提供一种用于筛查肝癌患者和鉴定肝癌病理特征的试剂盒,其由反转录系统,扩增系统和引物系统组成,其中,反转录系统由反转录酶,反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成;扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成;引物系统由miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的茎环结构反转录引物及miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p和U6snRNA的PCR扩增引物组成。
本发明通过实验得出以下结论,确定了目标miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p均可作为肝细胞癌筛查的生物标记物,其单独或组合形式均可辅助肝脏肿瘤临床病理鉴定及诊断。
1.miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p在肝癌患者血清与健康人血清中表达水平的差异性分析:
本发明运用SPSS 17.0软件中独立样本T检验,分析了目标miRNA在收集到的52例肝癌患者血清样本和25例健康人血清样本中表达的差异性。如图1所示,结果表明这三条目标miRNAs在肝癌血清和正常血清中的表达水平具有显著的差异性,相对差异倍数分别为3.98(P=0.002),6.78(P=0.001),9.03倍(P=0.001),ROC曲线分析结果显示AUC分别为0.803(敏感性=84.6%,特异性=72.0%)、0.845(敏感性=84.6%,特异性=68.0%)、0.880(敏感性=82.2%,特异性=84.0%)。此外,对比正常组,目标miRNAs在AFP阴性肝癌患者中的表达量显著上调,这三条目标miRNAs的相对差异倍数分别为3.01(P=0.001),10.19(P=0.002),10.68倍(P=0.001),ROC曲线分析结果显示AUC分别为0.865(敏感性=100%,特异性=72%)、0.930(敏感性=100%,specificity=84%)、0.970(敏感性=93.75%,特异性=92%),具有较高的诊断准确性。结果表明miRNA的表达水平可反映肝脏的病理特点,miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p用于区分肝癌患者和正常对照具有较好的诊断准确性,尤其对AFP阴性肝癌患者也有较高的诊断意义,进而确定了miRNA可作为肝细胞癌的生物标记物来指示肿瘤的临床病理情况。
2.在不同年龄组、性别、AFP水平、HBV DNA拷贝数及谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平上对miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的表达相关性的分析结果显示,目标miRNAs的表达量与年龄、AFP、HBV DNA拷贝数及谷丙转氨酶水平具有一定的相关性,但与谷草转氨酶水平不具有相关性(P>0.05)。miR-182-5p的相对表达量与年龄(P=0.029)、AFP水平(P=0.001)、HBV DNA拷贝数(P=0.001)存在负相关;miR-363-3p的相对表达量与年龄(P=0.027)、AFP水平(P=0.048)具有负相关,而与谷丙转氨酶(P=0.023)存在正相关。相似的是miR-378a-3p的相对表达量也与AFP水平(P=0.001)、HBV DNA拷贝数(P=0.001)具有负相关而与谷丙转氨酶水平(P=0.04)存在正相关。以上相关性分析结果对研究目的miRNAs与肝癌发生的致病机制具有一定的指示意义。
3.用Log2 scale法反映血清样本中miRNA的变化
Log2 scale是目标miRNA相对于内参基因而言产生的变化以对数反映出来的一种分析方法,用于揭示目标miRNA是否可作为区分患者和正常肝组织的生物标记物。Log2scale法即Log2﹛Ct miRNA/Ct mean(U6)﹜,用于反映miRNA在肝癌血清相对于正常血清中产生的差异变化。其中Ct miRNA代表荧光定量检测到的目标miRNA在样本中的Ct值,而Ct mean(U6)代表内参基因U6 snRNA在样本中的平均Ct值。
用Log2 scale法分析可得miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p,在肝癌患者血清与正常血清中的表达均有显著性差异,且达到了极显著水平(P<0.001)。本发明人经过广泛而深入的研究,鉴别和分离了与肝癌相关的miRNA,在此基础上完成了本发明;并通过miRNA实时荧光定量PCR技术在血清样本中对miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的表达水平进行检测,所提供的试剂盒专门针对于miRNA的检测优化,结果准确可靠。
本发明的优点为:(1)本发明确定的miRNA与肝癌临床病例指标的密切相关性,能够作为生物标记物对肝癌患者进行筛查和诊断,为临床个体化干预治疗提供有效依据。(2)通过实时荧光定量PCR技术对肝癌患者血清中的miRNA的检测,定量准确。相对于芯片技术或者分子杂交,该方法简便快速且经济实用。(3)由于本发明针对的是肿瘤血清中的miRNA,由于血清具有取材方便,无创伤性,并可连续体外检测的优点,因此从血清中寻找生物标记物可以将肝脏肿瘤的筛查和诊断提高至一个新的水平,进而提高治愈率和降低死亡率。(4)可与其他分子指标相结合,为肝脏肿瘤筛查、诊断、治疗与预后提供新的综合性试剂盒,方便临床应用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1:miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p在肝癌血清样本与正常血清样本中相对表达差异倍数,相对于正常组,这三条miRNAs的相对表达差异倍数分别为3.98(P=0.002),6.78(P=0.001),9.03倍(P=0.001)。
图2:A,miR-182-5p区分肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积,AUC=0.803(敏感性=84.6%,特异性=72.0%);B,miR-363-3p区分肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积,AUC=0.845(敏感性=84.6%,特异性=68.0%);C,miR-378a-3p区分肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积,AUC=0.880(敏感性=82.2%,特异性=84.0%)。
图3:miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p在AFP阴性肝癌血清样本与正常血清样本中相对表达差异倍数,相对于正常组,这三条miRNAs的相对差异倍数分别为3.01(P=0.001),10.16(P=0.002),10.68(P=0.001)。
图4:A,miR-182-5p区分AFP阴性肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积,AUC=0.865(敏感性=100%,特异性=72%);B,miR-363-3p区分AFP阴性肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积,AUC=0.930(敏感性=100%,specificity=84%);C,miR-378a-3p区分AFP阴性肝癌患者和健康对照组的受试者工作曲线分析及曲线下面积,AUC=0.8800.970(敏感性=93.75%,特异性=92%)。
具体实施方式
本发明所提供的生物标记物miRNA在制备检测肝癌的临床诊断试剂盒中应用的具体方法如下:
一、实验样本
本发明所使用的血清样本来自杭州西溪医院,肝癌血清样本来自52例接受治疗的肝癌患者,健康人血清样本来自25例体检志愿者。收集5ml全血置于血清收集管;温和颠倒收集管5-8次;常温下静置30min;然后将收集管置于离心机1800×g常温离心10min;将获得的血清转移至1.5mL离心管;13000×g离心2min;分离到的血清置于-80℃冰箱保存待用。样本的具体病理信息见表1。
表1 样本的病理参数信息
二、实验试剂
RNA提取及PCR产物检测过程中所用试剂,如氯仿,异丙醇,乙醇,DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂等常规生化试剂,均购于上海生工公司。PCR扩增试剂(含10×buffer、dNTPsmixture)及反转录反应所用试剂,如RNase抑制剂、M-MuLV反转录酶、5×M-MuLV缓冲液以及反转录用dNTP混合物(各10mM,RNase-free),基于DNA染料法的荧光定量PCR检测试剂盒(含real-time PCR Master Mix、50×ROX reference dye)均购自TaKaRa公司。所有引物委托(miRNA茎环结构反转录引物、PCR正向引物、PCR反向引物)上海生物工程有限公司合成。RNA提取及PCR产物检测过程中所用试剂及采购如下表2、3、4所列:
表2 RNA提取所用试剂及其来源
表3 miRNA反转录所用试剂及其来源
表4 荧光定量PCR所用试剂及其来源
三、实验过程
1.制备样本
肝癌血清样本来自52例接受治疗的肝癌患者,正常血清样本来自25例体检志愿者。收集5ml全血置于血清收集管;温和颠倒收集管5-8次;常温下静置30min;然后将收集管置于离心机1800×g常温离心10min;将获得的血清转移至1.5mL离心管;13000×g离心2min;分离到的血清置于-80℃冰箱保存待用。
2.血清样本中总RNA提取
1)将血清样本于-80℃中取出,在冰上缓慢溶解,取200μl血清转移至新的离心管,加入1ml Qiagen Lysis solution,置于涡旋仪剧烈涡旋20s;
2)室温静置5min,使核蛋白复合物充分溶解;
3)加入200ul氯仿;上下颠倒,剧烈振荡15s,静置分层3min;
4)4℃,12000g离心15min;
5)用移液器吸取上清液体转移到新的离心管,加入1.5倍上清液体积的无水乙醇,上下颠倒混匀,涡旋10s;
6)取700μl上述混合液加到柱子中,8000g离心18s;弃下层,重置柱于收集管上;
7)重复上一步,将剩余混合液也转移至柱中;加入700μl RWT solution,8000g离心18s;弃下层,将柱置于收集管上。
8)加入500μl RPE,8000g离心18s,弃下层,重置柱于收集管上;再次加入500μlRPE,8000g离心2min,弃收集管。把柱子放入新的2ml收集管中,全速离心2min。把柱子置于一新的1.5ml Elution管中(Qiagen试剂盒提供);
9)加入55μl RNase-Free Water;静置1min,使溶液充分与柱结合,然后8000g离心1min;
10)NanoDrop分光光度计(ND-2000)检测总RNA的含量及纯度。
3.设计与合成引物序列
1)miRNA茎环结构反转录引物:
miR-182-5p:(SEQ ID NO:1)
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagtgtg
miR-363-3p:(SEQ ID NO:2)
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactacaga
miR-378a-3p:(SEQ ID NO:3)
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgccttc
2)miRNA的PCR正向引物为:
miR-182-5p(SEQ ID NO:4):ggctttggca atggtagaac tc
miR-363-3p(SEQ ID NO:5):gccaattgca cggtatccat
miR-378a-3p(SEQ ID NO:6):gactggactt ggagtcagaa g
U6 snRNA(SEQ ID NO:7):ctcgcttcgg cagcaca
3)PCR反向引物分别为:
miRNA通用反向引物(SEQ ID NO:8):cagtgcaggg tccgaggtat
U6 snRNA(SEQ ID NO:9):aacgcttcac gaatttgcgt
4.cDNA的合成及荧光定量PCR检测
1).反转录成cDNA
按照以下反转录体系依次加入到RNase free的EP管中,反转录反应体系如下表5所示:
表5 反转录体系各组分
反应条件设置为:
42℃ 60min
70℃ 15min
反应完毕后,保存于4℃冰箱。
本发明我们对miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p设计了特异性的茎环结构反转录引物,单独进行如上操作,单管合成cDNA。
2).将反转录产物进行荧光定量PCR扩增反应
基于DNA染料法的荧光定量PCR检测:
按照以下荧光定量PCR体系将试剂按表6顺序依次加入到200μl EP管中:
表6 荧光定量PCR体系各组分
混匀后稍离心,在ABI 7500中进行荧光定量PCR反应,反应参数设置为:
四、数据处理
荧光定量PCR定量检测miR-451的相对表达变化量时,以U6snRNA为内参基因,来对目标基因进行归一化处理,已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。表达量倍数的变化用公式RQ=2-△△Ct,其中△△Ct=(Ct miRNA-Ct U6)MeanCancer-(Ct miRNA-Ct U6)MeanNormal。RQ代表相对表达量(relative quantation),Ct miRNA和Ct U6分别代表荧光定量检测到的目标miRNA和内参基因U6的Ct值,Cancer代表肝癌组,Nomal代表正常对照组,Mean代表两个实验组的平均值。以上数据,即Ct值均可由荧光定量检测仪配带的检测软件阅读出。定量中设立重复实验和阴性对照实验,定量实验的每个样本重复3次,阴性对照中不加模板cDNA,而以水代替,用于检验是否存在PCR污染和较高的引物二聚体污染。
荧光定量数据的统计学分析采用SPSS 17.0统计分析软件。miRNA在两样本中的相对表达量分析采用levene’s卡方检验和independent-samples t检验,当P值≤0.05时,认为结果在统计学上具有显著性差异,当P值<0.01时,认为结果在统计学上具有极显著性差异。受试者工作特征(ROC)曲线分析及曲线下面积(AUC)是用来判断miRNA诊断疾病的准确性,当AUC在0.7-0.8范围内,认为该方法具一定的准确性;当AUC在0.8-0.9范围内,认为该方法具有较好的准确性;当AUC>0.9时,认为该方法具有高度准确性。
以U6snRNA为内参基因,RT-qPCR分析52例肝癌血清和25例正常血清中miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的相对表达水平,其表达倍数差异性分析的直观表现通过绘制柱状图实现,如图1所示,miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的相对表达差异为3.98(P=0.002),6.78(P=0.001),9.03倍(P=0.001);如图2所示,miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的ROC曲线分析结果显示均具有较好的诊断准确性,AUC分别为0.803,0.845,0.880,本发明均采用SPSS 17.0软件和Origin 8.0绘图软件。此外,结果显示miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p对AFP阴性肝癌患者也有较高的诊断准确性,如图3所示,相对于正常组,AFP阴性肝癌组中miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的相对表达差异为3.01(P=0.001),10.16(P=0.002),10.68倍(P=0.001);如图4所示,这三条miRNAs的ROC曲线分析结果显示AUC分别为0.865、0.930、0.970。结果显示本发明中目标miRNAs用于区分AFP阴性的肝癌患者和正常对照组均具有较高的诊断准确性,可作为肝癌早期诊断的辅助生物标记物。
对miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p的表达量与肝癌患者的病理指标进行相关性分析,结果表明目标miRNAs的表达量与年龄、性别、HBV DNA拷贝数及谷丙转氨酶具有一定的相关性,但与谷草转氨酶水平无相关性(P>0.05)。如表7所示,miR-182-5p的相对表达量与年龄(P=0.029)、AFP水平(P=0.001)、HBV DNA拷贝数(P=0.001)存在负相关;miR-363-3p的相对表达量与年龄(P=0.027)、AFP水平(P=0.048)具有负相关,而与谷丙转氨酶(P=0.023)存在正相关。相似的是miR-378a-3p的相对表达量也与AFP水平(P=0.001)、HBVDNA拷贝数(P=0.001)具有负相关而与谷丙转氨酶水平(P=0.04)存在正相关。以上相关性分析结果对研究目的miRNAs与肝癌发生的致病机制具有一定的指示意义。
表7 miRNAs与不同病理指标的相关性分析
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例,所述miR-182-5p,miR-363-3p,miR-378a-3p还可应用于肝癌患者的唾液,尿液,血浆等体液的检测。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种检测肝细胞癌的生物标记物,其特征为三条miRNA,其序列特征为:
miR-182-5p:UUUGGCAAUG GUAGAACUCA CACU;
miR-363-3p:AAUUGCACGG UAUCCAUCUG UA;
miR-378a-3p:ACUGGACUUG GAGUCAGAAG GC。
2.如权利要求1所述的生物标记物的用途,其特征是:制备用于筛查肝脏肿瘤或辅助肝脏肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的生物标记物的用途,其特征是:所述试剂盒包括反转录系统和引物系统;
所述反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂;
所述引物系统由miR-182-5p、miR-363-3p、miR-378a-3p的茎环结构反转录引物、扩增引物以及U6snRNA的扩增引物组成。
4.根据权利要求2所述的生物标记物的用途,其特征是:所述试剂盒还包括扩增系统;所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。
5.根据权利要求3或4所述的生物标记物的用途,其特征在于:检测该标记物的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。
6.根据权利要求5所述的生物标记物的用途,其特征在于:茎环结构反转录引物,由以下核苷酸序列组成:
miR-182-5p:GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATACGACAGTGTG;
miR-363-3p:GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATACGACTACAGA;
miR-378a-3p:GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATACGACGCCTTC。
7.根据权利要求6所述的生物标记物的用途,其特征在于:所述荧光定量PCR为DNA染料法。
8.根据权利要求7所述的生物标记物的用途,其特征在于:特异性PCR引物由以下核苷酸序列组成:
miR-182-5p PCR正向引物:GGCTTTGGCA ATGGTAGAAC TC;
miR-363-3p PCR正向引物:GCCAATTGCA CGGTATCCAT;
miR-378a-3p PCR正向引物:GACTGGACTT GGAGTCAGAA G;
miRNAs PCR通用反向引物:CAGTGCAGGG TCCGAGGTAT。
9.根据权利要求8所述的生物标记物的用途,其特征在于:在荧光定量PCR检测方法中,使用保守性snRNA的U6snRNA作为内参照基因,其特异性PCR引物由以下核苷酸序列组成:
U6 PCR正向引物:CTCGCTTCGG CAGCACA;
U6 PCR反向引物:AACGCTTCAC GAATTTGCGT。
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