CN104630353A - 一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒 - Google Patents

一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒，该试剂盒通过检测EBV-miR-BART1-5p的表达水平可以有效的反映鼻咽癌病情的进展，辅助鼻咽癌的诊断和疗效监测，并在鼻咽癌高危人群的筛查中表现出潜在的应用价值。本发明所述试剂盒还包含鼻咽刷，采用该鼻咽刷直接获取鼻咽部病变部位的样本，不仅具有无痛、无侵袭性的优点，而且鼻咽刷获取的脱落细胞可以直接反映鼻咽部肿瘤的特性，因此鼻咽刷取材联合EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测，可以帮助临床医生对鼻咽癌进行快速诊断，且在鼻咽癌的疗效监测和随访中起到较大的辅助作用。

Description

一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒。
背景技术
鼻咽癌是一种高侵袭性、高转移性的恶性肿瘤，在中国南方和东南亚地区广泛流行。尽管鼻咽癌早期临床阶段的病人总生存率达到了约90％，但大部分的患者就诊时已是鼻咽癌晚期，其生存率低于50％；鼻咽癌治疗后的复发和远处转移进一步导致了更差的预后。因此，临床上鼻咽癌的早期诊断和及时治疗是提高患者生存率、改善预后的关键突破口。如何寻找和建立简单可信的生物学标志物用于高发区鼻咽癌的筛查和早期诊断是临床上亟待解决的问题。
已有研究表明，遗传易感性、高发区特有的环境因素和EB病毒感染等因素在鼻咽癌的发病中扮演着重要的角色。尽管EBV在世界范围内有较高的感染率，EBV感染与鼻咽癌的发病也是紧密相关的。在高发区，几乎100％的未分化型鼻咽癌(WHO III型)的病变部位都可以检测到EBV基因组的存在；此外，鼻咽鳞状细胞癌(WHO I型)和非角化型鼻咽癌的发生也与EBV感染密切相关。在高发区，鼻咽上皮细胞的EBV感染是鼻咽癌的一个重要特征。
鼻咽癌诊断的金标准是鼻咽镜下进行组织活检取材，之后由病理医生进行病理诊断。由于取材有创、取材组织小、且依赖镜下肉眼观察，因此约有10％的患者在首次取材时诊断失败，医生和患者需面临再次或多次取材、或随访观察的抉择，易延误病情。在此情况下，目前临床上缺乏特异性辅助诊断的方法用于参考。EBV相关的血清学指标(包括VCA-IgA、EA-IgA等)已纳入临床检测。但这些血清学抗体指标最大的缺点是不能实时反映鼻咽癌发病和进展状况，且存在特异性以及灵敏度不足的问题，在临床上仅能提供有限参考。血浆游离EBV拷贝数的检测是一个用于鼻咽癌诊断的较好的生物学指标，但其对鼻咽癌的早期诊断缺乏足够的灵敏度。因此，临床上缺乏一种快捷、无创、可重复的取材手段以及有效的生物学指标用于鼻咽癌的筛查、早期诊断、疗效监测及预后评估。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒，所述试剂盒包括总RNA提取试剂、逆转录试剂、EBV-miR-BART1-5p的逆转录引物、荧光定量PCR试剂、EBV-miR-BART1-5p的定量PCR引物。本领域技术人员很容易知晓，所述逆转录试剂包括逆转录酶、逆转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂和水，所述荧光定量PCR试剂包括Taq DNA聚合酶、聚合反应缓冲液和水。优选地，所述总RNA提取试剂为Trizol试剂。
优选地，所述EBV-miR-BART1-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述EBV-miR-BART1-5p的逆转录引物序列如SEQ ID NO:5所示。
优选地，所述EBV-miR-BART1-5p的定量PCR引物包括：
正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示。
优选地，所述试剂盒还包括与EBV-miR-BART1-5p匹配的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。
优选地，所述试剂盒还包括内参基因、内参基因逆转录引物和内参基因的荧光定量PCR引物。
优选地，，所述内参基因为人的RNU6B。
优选地，所述试剂盒还包括鼻咽刷，所述鼻咽刷包括刷头和柄杆，所述柄杆由第一柄杆、连接部和第二柄杆组成，所述刷头与所述第一柄杆连接，所述第一柄杆通过所述连接部与所述第二柄杆相连，所述连接部为可连续弯曲的连接部。
优选地，所述刷头由塑料杆和设置于所述塑料杆上的尼龙植绒拭子组成，所述第二柄杆的末端表面设有防滑点状凸起。
优选地，所述刷头中塑料杆的长度为15mm，所述刷头中尼龙植绒拭子的长度为0.5mm，所述第一柄杆的材质为塑料，所述第一柄杆的长度为20mm，所述第一柄杆的直径为1.75mm，所述第二柄杆的材质为塑料，所述第二柄杆的长度为110mm，所述第二柄杆的直径为2.5mm，所述连接部的长度为10mm，所述第一柄杆和第二柄杆之间的夹角呈0°到45°。
鼻咽癌是一种高侵袭、高转移的恶性肿瘤，其早期诊断是一个巨大的挑战。研究认为，EBV编码的microRNAs在鼻咽癌的发生和发展中发挥癌基因的作用，是潜在的鼻咽癌筛查和早期诊断的生物学标志物。本发明中，我们采用无痛、无侵袭性的鼻咽刷取材的方式直接从鼻咽部获取组织样本，并进行了EBV相关microRNA的表达分析。结果表明，EBV-miR-BART1-5p对鼻咽癌的诊断效率优于首次活组织病理检查、血清EBV VCA-IgA以及EA-IgA抗体滴度的检测。更为重要的是EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测在区分早期鼻咽癌(I/II期)、健康对照和更高分期的鼻咽癌方面具有很高的灵敏度。此外，鼻咽癌患者治疗结束后其鼻咽刷样本中EBV-miR-BART1-5p的表达水平显著下调。因此，鼻咽刷取材联合EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测可以有效的反映鼻咽癌病情的进展、辅助鼻咽癌的诊断和疗效监测，并在鼻咽癌高危人群的筛查中表现出潜在的应用价值。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒，该试剂盒通过检测EBV-miR-BART1-5p的表达水平可以有效的反映鼻咽癌病情的进展，辅助鼻咽癌的诊断和疗效监测，并在鼻咽癌高危人群的筛查中表现出潜在的应用价值。本发明所述试剂盒还包含鼻咽刷，采用该鼻咽刷直接获取鼻咽部病变部位的样本，不仅具有无痛、无侵袭性的优点，而且鼻咽刷获取的脱落细胞可以直接反映鼻咽部肿瘤的特性，因此鼻咽刷取材联合EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测，可以帮助临床医生对鼻咽癌进行快速诊断，且在鼻咽癌的疗效监测和随访中起到较大的辅助作用。
附图说明
图1为本发明所述的EBV-miR-BART1-5p在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图2为本发明所述的EBV-miR-BART5在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图3为本发明所述的EBV-miR-BART6-5p在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图4为本发明所述的EBV-miR-BART17-5p在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图5为本发明所述的EBV-miR-BART1-5p在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图6为本发明所述的EBV-miR-BART5在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图7为本发明所述的EBV-miR-BART6-5p在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图8为本发明所述的EBV-miR-BART17-5p在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图9为本发明所述的EBV-miR-BART1-5p在健康人、鼻咽癌I/II期样本、III期样本至IV期样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
图10为鼻咽癌病人治疗前后鼻咽刷样本中EBV-miR-BART1-5p表达水平检测的一种实施例的结果；
图11为本发明所述的鼻咽刷的一种实施例的结构示意图，图中：1、刷头，2、第一柄杆，3、连接部，4、第二柄杆，5、防滑点状凸起。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：研究鼻咽癌诊断及筛查的有效生物学指标
研究目的：
鼻咽癌在中国南方高发且与EBV(Epstein-Barr virus，EB病毒)的感染相关。本研究定量检测并分析了鼻咽刷样本中EBV编码的microRNA的表达水平，以期发现新的可用于鼻咽癌诊断及筛查的有效生物学指标。
实验设计：
我们首先在鼻咽癌临床活检样本中验证了候选EBV相关microRNA的异常高表达；随后分析了候选microRNA在鼻咽刷样本中的表达水平及其对鼻咽癌的诊断价值，并采用受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)来评估其对鼻咽癌诊断的准确性。
实验方法：
1、本研究中涉及的EBV编码的microRNA的核苷酸序列：
EBV-miR-BART1-5p：6-UCUUAGUGGAAGUGACGUGCUGUG-29(SEQ IDNO:1)
EBV-miR-BART5：15-CAAGGUGAAUAUAGCUGCCCAUCG-38(SEQ IDNO:2)
EBV-miR-BART6-5p：18-UAAGGUUGGUCCAAUCCAUAGG-39(SEQ IDNO:3)
EBV-miR-BART17-5p：22-UAAGAGGACGCAGGCAUACAAG-43(SEQ IDNO:4)。
说明：序列两端的数字代表该microRNA在其前体序列中的起始和结束的位置。
2、鼻咽刷取材
鼻咽刷获取样本是由经验丰富的专科医生在鼻咽内窥镜的引导下进行的。首先通过鼻咽内窥镜对患者鼻咽部进行系统的评估，并通过内窥镜附带的摄像头获取可疑肿瘤部位的照片；在夹取活检组织之前，将鼻咽刷经由鼻腔深入鼻咽腔；随后，在鼻咽上皮的可疑患病部位旋转鼻咽刷头部数次以获取脱落细胞，并快速取出鼻咽刷；立即将鼻咽刷头部(约1.5厘米)剪下来置入含有1毫升RNA later溶液的冻存管中；将样本置于-80℃冰箱直至取用。
3、鼻咽刷样本细胞总RNA提取：
从-80℃冰箱中取出保存的样本，冰上静置，弃去RNA later溶液并加入1mlTrizol试剂充分混匀，室温静置5分钟；将上述混匀的液体转移到1.5ml的Ep管中，加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，静置5分钟；然后在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，则样品会分成三层，小心取上清至一新的Ep管中；加入0.5ml预冷的异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟；4℃，12000rpm，离心10分钟，弃上清；加入1ml预冷75％乙醇，轻轻洗涤沉淀；4℃，8000rpm，离心5分钟，沉于管底的白色沉淀即为RNA，将含RNA沉淀的Ep管放置于冰上10-15分钟以使RNA晾干；加入适量的DEPC水溶解，取适量的RNA进行浓度测定和电泳检样，随后将样本置于-80℃保存。
4、EBV编码的microRNA的逆转录
取50ng的上一步得到的RNA进行反转录，使用Taqman MicroRNA ReverseTranscription Kit(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，用带有茎环的特异引物来进行逆转录，以保证real time PCR时用Taqman探针仅检测到成熟的EBV-microRNA。每个逆转录反应用50ng RNA，内参为RNU6B。
逆转录引物信息如下：
(1)EBV-miR-BART1-5p逆转录茎环引物:
5`-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAG-3(SEQ ID NO:5)。
(2)EBV-miR-BART5逆转录茎环引物：
5`GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGATG-3`(SEQ ID NO:6)。
(3)EBV-miR-BART6-5p逆转录茎环引物：
5`-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTAT-3`(SEQ ID NO:7)。
(4)EBV-miR-BART17-5p逆转录茎环引物：
5`-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTGT-3`(SEQ ID NO:8)。
RNU6B购自美国Applied Biosystems公司，货号是001093；该货号包含了RNU6B的逆转录茎环引物、定量PCR扩增引物和特异性Taqman探针。
逆转录反应体系如下：
上述试剂混匀后，经16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，结束后置于冰上。Specific primer指用于逆转录的特异性引物。
5、EBV编码microRNA的表达检测
取上步得到的cDNA产物做定量检测，体系如下：
特异性扩增引物和Taqman探针信息如下：
(1)EBV-miR-BART1-5p定量PCR扩增引物：
正向引物：5`-GCCGCTCTTAGTGGAAGTGACGTG-3`(SEQ ID NO:9)
反向引物：5`-GTGCAGGGTCCGAGGT-3`(通用引物)(SEQ ID NO:10)
EBV-miR-BART1-5p特异性探针：
FAM 5`-TGGATACGACCACAGCAC-3`MGB(其探针序列如SEQ IDNO:11)。
(2)EBV-miR-BART5定量PCR扩增引物：
正向引物：5`-GCCGCCAAGGTGAATATAGCTGCC-3`(SEQ ID NO:12)
反向引物：5`-GTGCAGGGTCCGAGGT-3`(通用引物)(SEQ ID NO:13)
EBV-miR-BART5特异性探针：FAM-TGGATACGACCGATGGGC-MGB(其探针序列如SEQ ID NO:14)。
(3)EBV-miR-BART6-5p定量PCR扩增引物：
正向引物：5`-GCCGCTAAGGTTGGTCCAATCC-3`(SEQ ID NO:15)
反向引物：5`-GTGCAGGGTCCGAGGT-3`(通用引物)(SEQ ID NO:16)
EBV-miR-BART6-5p特异性探针：FAM-TGGATACGACCCTATGGA-MGB(其探针序列如SEQ ID NO:17)。
(4)EBV-miR-BART17-5p定量PCR扩增引物：
正向引物：5`-GCCGCTAAGAGGACGCAGGCAT-3`(SEQ ID NO:18)
反向引物：5`-GTGCAGGGTCCGAGGT-3`(SEQ ID NO:19)
EBV-miR-BART17-5p特异性探针：FAM-TGGATACGACCTTGTATG-MGB(其探针序列如SEQ ID NO:20)。
实时荧光PCR扩增反应在罗氏Light Cycler480II实时荧光定量PCR仪上进行。每个样品重复三个孔检测，Taqman检测PCR运行条件如下：95℃10分钟，40循环(95℃15秒，60℃1分钟采荧光)，37℃10秒。PCR完成后，经电脑自动分析，查看每个基因的扩增情况，导出相应的阈值循环数Ct，采用2-△Ct方法，以RNU6B为内参，计算每个基因的相对表达量。
6、统计分析
采用Mann-Whitney双尾检验的统计学方法分析病例和对照之间的统计学差异；用单因素方差分析比较多个组之间的差别；用皮尔森相关系数表示活检样本和鼻咽刷样本中microRNA表达水平的相关性，并进行双尾显著性检验，P<0.05时认为存在显著性；受试者工作特征曲线(ROC)被用来评估检测指标的诊断价值，并用曲线下面积(AUC)作为诊断精确度的指数。统计分析采用SPSS 16软件完成。
实验结果：
1、样本收集
本研究涉及到了120例来自不同病人的鼻咽部组织样本，其中包括53例鼻咽癌组织样本、21例慢性鼻咽炎病人的组织样本、24例EBV相关肿瘤病人的组织样本和24例非鼻咽癌头颈部肿瘤患者的组织样本；而24例EBV相关肿瘤病人则包括了21例非霍奇金淋巴瘤病人和3例T/NK细胞淋巴瘤病人，具体的样本信息见表1。本研究还涉及了来自306例参与者的鼻咽刷样本，其中包括153例鼻咽癌患者、48例慢性鼻咽炎患者、5例EBV相关非鼻咽癌的肿瘤患者、10例非鼻咽癌头颈部肿瘤患者和90例健康对照(来自于中国广东省鼻咽癌高发区四会市)的鼻咽刷样本。
表1：组织活检病人样本分布
2、鼻咽部组织样本中候选EBV编码microRNA的表达检测
我们挑选了4个EBV编码的microRNA(EBV-miR-BART1-5p，EBV-miR-BART5，EBV-miR-BART6-5p和EBV-miR-BART17-5p)并检测其在鼻咽部组织样本中的表达水平。结果表明，在对照组中几乎检测不到这些microRNA的表达，但是其在鼻咽癌组织的表达水平则显著上调，见图1、2、3、4，EBV-miR-BART1-5p、EBV-miR-BART5和EBV-miR-BART6-5p在鼻咽癌组织中的表达水平高于所有对照组样本；EBV-miR-BART17-5p在几乎所有的鼻咽癌组织中的表达水平高于对照组样本，其中3例样本低于对照组。四个microRNA的详细表达水平分析见表2。
表2：活检组织样本中候选microRNA的表达情况
3、鼻咽刷样本中候选EBV编码microRNA的表达检测
EBV编码的四个microRNA在鼻咽癌组织的表达水平显著高于对照组，提示其表达水平的检测对于鼻咽癌的诊断具有潜在的临床应用价值。但是由于鼻咽部组织取材不易且有创，不宜大规模开展。而鼻咽刷可以准确获得能够代表病灶部位的组织，且具有无痛、无创、可以反复开展的优点，病人的依从性较好。因此我们检测了EBV编码的microRNA在鼻咽刷样本中的表达水平。结果表明，四个候选microRNA在鼻咽癌病人的鼻咽刷样本中的表达水平显著高于对照组，而在对照组各个分组之间表达水平无差异，见图5、6、7、8，EBV-miR-BART1-5p、EBV-miR-BART5、EBV-miR-BART6-5p和EBV-miR-BART17-5p在鼻咽癌病人的鼻咽刷样本中的表达水平显著高于所有对照组样本；四个microRNA在各对照组之间的表达水平较低且无显著性差异。。比如说，EBV-miR-BART1-5p在鼻咽癌病人的鼻咽刷样本中表达量的中位数为3.4拷贝/RNU6B，范围为1.4×10-3至9.2×102；而在对照组，其表达水平的中位数为1.8×10-3拷贝/RNU6B，范围为2.4×10-4至 3.9×10-2。即EBV-miR-BART1-5p在鼻咽癌病人的鼻咽刷样本中表达量比对照组升高了1900倍左右(表3)。
表3：鼻咽刷样本中候选microRNA的表达情况
4、EBV-miR-BART1-5p的表达检测对鼻咽癌有很高的诊断价值
受试者工作特征曲线(ROC)的分析结果表明，EBV-miR-BART1-5p的表达水平是一个很好的区分鼻咽癌与对照组的生物标志物。数据分析结果显示，EBV-miR-BART1-5p表达水平的曲线下面积(AUC)值为0.99(95％CI，0.98至1.00)。在截断值设置为0.05拷贝/RNU6B的情况下，EBV-miR-BART1-5p表达水平可以很好地区分鼻咽癌和对照组，灵敏性达到了96.08％，特异性则为100％(表4)。
我们进一步评估了EBV-miR-BART1-5p与临床其他诊断方法在诊断精确度上的优劣。目前，临床开展了血清中EBV VCA-IgA、EA-IgA的检测用于鼻咽癌的筛查和辅助诊断，这两种指标的灵敏度和特异性分别为86.49％、82.00％和69.60％、93.33％(表4)；且在本研究中，有27例病人VCA-IgA的滴度大于截断值，但最终诊断为慢性鼻咽炎；而一些鼻咽癌晚期患者的EA-IgA的检测结果则为阴性。这些结果提示EBV VCA-IgA、EA-IgA的检测用于鼻咽癌的辅助诊断具有很大的局限性。我们也评价了鼻咽刷样本中EBV DNA拷贝数对鼻咽癌的诊断价值，其灵敏度和特异性分别为97.09％和94.74％(表4)。鼻咽癌确诊的主要依据是病灶部位的组织病理检测结果。但是，即使是鼻咽镜引导下的组织活检，其首次活检的灵敏度也仅仅达到了89.32％(表4)。也就是说，鼻咽刷样本中EBV-miR-BART1-5p的检测对鼻咽癌诊断的精确程度高于包括组织活检在内目前所有的检测手段。因此，对该指标进行检测对鼻咽癌的诊断具有很好的辅助作用，临床意义明确。
表4：不同检测指标对鼻咽癌的诊断价值
需要特别指出的是，因为活检取材较小，很容易由于没有取到病灶部位的组织而导致组织活检结果的假阴性。因此，组织活检常常需要重复多次才能最终对鼻咽癌进行确诊，对病人的创伤很大且易延误病情。在本研究所涉及的病人中，有16个病人(16/120，13.3％)进行了两次以上的活检取材才最终确诊(表5)；有一个病人更是经过5次活检取材才最终确诊为鼻咽癌，而该病人一次鼻咽刷取材的EBV-miR-BART1-5p表达水平就高于截断值(0.050拷贝/RNU6B)，若以此结果对该病人进行辅助诊断，则可极大提高鼻咽癌的诊断效率、减轻病人痛苦。因此，得益于鼻咽刷取材的准确性、无创性且可以反复开展的优点，鼻咽刷取材联合EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测可以作为一个切实有效的手段辅助鼻咽癌的诊断。
表5：16例病人的确诊前活检次数和miR-BART1-5p的表达水平
5、鼻咽刷样本中EBV-miR-BART1-5p表达检测可以反映鼻咽癌病情的进展
由于鼻咽癌发病隐匿、进展迅速，鼻咽癌晚期病人预后较差。如何实现鼻咽癌的早发现和早诊断，并在疾病的早期阶段进行干预治疗是提高鼻咽癌患者预后水平的重要环节。在本研究中，我们进一步分析了鼻咽癌不同疾病进展时期EBV-miR-BART1-5p表达水平的变化。结果表明，鼻咽刷样本中EBV-miR-BART1-5p的表达水平在健康人、鼻咽癌I/II期样本、III期样本至IV期样本中的表达水平呈显著递增的趋势(见图9)，表明EBV-miR-BART1-5p的表达水平可以很好地反映病人病情的严重程度。如果采用该指标对高危人群进行定期筛查，可以很好地辅助鼻咽癌的早发现和早诊断。目前，血清中EBVVCA-IgA、EA-IgA的可以检测用于鼻咽癌治疗效果的监测。但是随着治疗的进行，这两个指标的下降具有严重的滞后性，不能准确反映患者的病情。而我们的结果显示，鼻咽癌病人治疗结束后，相比于治疗前其EBV-miR-BART1-5p的表达水平显著下降(见图10)。因此，与目前的监测手段相比，鼻咽刷取材联合EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测可以准确的反映鼻咽癌病情的进展，对鼻咽癌的治疗效果和预后的评估有很好地辅助作用。
结果：4个EBV编码的microRNA(EBV-miR-BART1-5p,EBV-miR-BART5,EBV-miR-BART6-5p和EBV-miR-BART17-5p)的表达水平对鼻咽癌诊断都具有较高准确度。其中EBV-miR-BART1-5p表达水平对鼻咽癌诊断的效果最优，灵敏度和特异性分别达到了96.08％和100％(AUC＝0.99)。此外，鼻咽癌I/II期或者T1期病人的鼻咽刷样本中EBV-miR-BART1-5p表达水平显著高于对照组(P<0.0001和P<0.0001)，其更高分期病人的鼻咽刷样本中的表达水平也显著高于T1期。我们的结果还表明，鼻咽刷样本中EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测对于鼻咽癌的诊断效率优于首次活检以及血清中VCA-IgA和EA-IgA抗体滴度的检测。
结论：鼻咽刷取材联合EBV-miR-BART1-5p表达水平的检测可以有效的反映鼻咽癌病情的进展、辅助鼻咽癌的诊断和疗效监测，并在鼻咽癌高危人群的筛查中表现出潜在的应用价值。
实施例2
本发明实施例1中所述鼻咽刷的一种实施例，其结构如图11所示，所述鼻咽刷包括刷头1和柄杆，所述柄杆由第一柄杆2、连接部3和第二柄杆4组成，所述刷头1与所述第一柄杆2连接，所述第一柄杆2通过所述连接部3与所述第二柄杆4相连，所述连接部为可连续弯曲的连接部，所述刷头1由塑料杆和设置于所述塑料杆上的尼龙植绒拭子组成，所述刷头1中塑料杆的长度为15mm，所述刷头1中尼龙植绒拭子的长度为0.5mm，所述第一柄杆2的材质为塑料，所述第二柄杆4的材质为塑料，所述第一柄杆2的长度为20mm，直径为1.75mm，所述第二柄杆4的长度为110mm，所述第二柄杆4的直径为2.5mm，所述连接部长度为10mm，所述第一柄杆和第二柄杆之间的夹角呈0°到45°，所述第二柄杆的末端表面设有防滑点状凸起。
本发明所述鼻咽刷的使用方法：通过鼻咽镜观察并评估鼻咽部结构特点，调整连接部使第一柄杆和第二柄杆呈合适的角度，在鼻咽镜的引导下用刷头拭子刷去鼻咽部患侧部位脱落细胞；取出鼻咽刷，于第一柄杆和刷头连接处剪断，将刷头置于EP管中用于进一步的检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括总RNA提取试剂、逆转录试剂、EBV-miR-BART1-5p的逆转录引物、荧光定量PCR试剂、EBV-miR-BART1-5p的定量PCR引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述EBV-miR-BART1-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述EBV-miR-BART1-5p的逆转录引物序列如SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述EBV-miR-BART1-5p的定量PCR引物包括：
正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括与EBV-miR-BART1-5p匹配的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQID NO:11所示。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因、内参基因逆转录引物和内参基因的荧光定量PCR引物。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为人的RNU6B。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括鼻咽刷，所述鼻咽刷包括刷头和柄杆，所述柄杆由第一柄杆、连接部和第二柄杆组成，所述刷头与所述第一柄杆连接，所述第一柄杆通过所述连接部与所述第二柄杆相连，所述连接部为可连续弯曲的连接部。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述刷头由塑料杆和设置于所述塑料杆上的尼龙植绒拭子组成，所述第二柄杆的末端表面设有防滑点状凸起。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述刷头中塑料杆的长度为15mm，所述刷头中尼龙植绒拭子的长度为0.5mm，所述第一柄杆的材质为塑料，所述第一柄杆的长度为20mm，所述第一柄杆的直径为1.75mm，所述第二柄杆的材质为塑料，所述第二柄杆的长度为110mm，所述第二柄杆的直径为2.5mm，所述连接部的长度为10mm，所述第一柄杆和第二柄杆之间的夹角呈0°到45°。
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