CN108913681A - 鼻腔脱落细胞rna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种鼻腔脱落细胞RNA提取方法，包括采用鼻息肉脱落细胞置于细胞裂解液中进行RNA提取的步骤；通过刷取或粘取鼻息肉表面获取的鼻息肉脱落细胞，将获取鼻息肉脱落细胞置于细胞裂解液中，于不大于4℃条件下保存备用,采用吸附柱法提取鼻腔脱落细胞RNA。本发明提供的采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，构建了一个新的检测方法，避免进行病理活检，因此可以在不同随访阶段取样，进行患者病程追踪，提供了一种无创的方法获得患者鼻腔上皮细胞，避免了患者的感染风险。

Description

鼻腔脱落细胞RNA的提取方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及鼻腔脱落细胞RNA的提取方法。

背景技术

伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是鼻窦黏膜的慢性炎症，查体可见鼻腔或中鼻道息肉形成。CRSwNP常见症状为鼻堵、流涕或鼻涕倒流、嗅觉减退、面部闷胀感或压力感，持续时间超过12周。患病率约为0.5-4％，CRSwNP常伴有哮喘和过敏性鼻炎，有报道7％的哮喘患者患有CRSwNP，而26-48％的CRSwNP患有哮喘。CRSwNP发病机制目前还不确定，黏膜上皮细胞破坏、宿主免疫系统失衡和病原微生物入侵可能是其发病的主要原因。CRSwNP主要的治疗方式是手术和药物治疗。但研究表明，即使通过规范的药物或手术治疗，慢性鼻窦炎伴鼻息肉的复发率仍高达56％，严重影响患者生活质量，同时带来高额医疗支出，但临床却缺乏根治性治疗方法，因而成为鼻科学研究领域的重点。

依据嗜酸性粒细胞浸润的程度可以将CRSwNP分为嗜酸性粒细胞型(EosinophilicCRSwNP，ECRSwNP)与非嗜酸性粒细胞型(Noneosinophilic CRSwNP，nonECRSwNP)，二者的临床表现、用药和预后均不同，嗜酸性粒细胞型的临床症状较重，以鼻堵和嗅觉减退为主，多合并有哮喘，术后复发率较高。鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润程度与复发关系最为密切，当组织中该细胞百分比超过27％时，复发风险超过90％。嗜酸性粒细胞型息肉对糖皮质激素类药物的敏感度显著高于非嗜酸性粒细胞型。非嗜酸性粒细胞型临床症状一般较轻，且合并哮喘的几率较小，气道炎症较轻，且术后复发率较嗜酸性粒细胞型低，对大环内酯类药物治疗反应好。西方国家以嗜酸性粒细胞型为主，主要表现为TH2炎症反应，而我国的嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型比例均约占一半，主要表现为TH1/TH17炎症反应为主。综上所述，嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型在免疫病理类型、临床症状、药物治疗反应和预后存在明显不同。不同伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎的炎症/病理分型治疗策略不同。所以对伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎的病理分型的鉴定显得尤为重要。

目前对两种亚型的判断主要依据鼻腔黏膜活检后组织病理标本染色，缺乏无创性生物学标志物用于鉴别诊断。患者在鼻内镜下获得息肉标本后，进行石蜡固定等病理标本的常规处理，然后进行苏木素伊红的染色，接下来通过高倍显微镜观察组织浸润的炎细胞(主要的炎细胞包括嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，浆细胞)浸润个数，进行细胞分型。然而现有的该方法存在以下问题：该方式为有创检查，增加了患者的感染风险，不适用于免疫力较低人群如儿童、老年人等；而取材时鼻腔出血，往往引起患者恐惧和担忧；另外通过该方法难以获得疾病的实时动态变化信息：不能在术后对愈合期黏膜进行病理活检。但临床数据表明慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分类会随药物治疗、手术治疗等转归，用治疗前的病理活检结果无法代表全部疾病时期的特征；同时组织病理切片较局限，只能反映切片位置的标本炎症状态，不能反映组织的全貌，可能会造成误诊，而且每张片子都需要病理科医生人工计数，难以批量操作。

近年兴起的实时荧光定量PCR弥补了上述技术的不足。该方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后根据荧光信号对所测DNA样品进行定量分析，该方法操作简便，敏感性高，重复性好且结果准确性高。然而现有技术中尚未筛选得到有效检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的基因，且进一步的更未公开有效提供检测判断伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的基因的提取方法的相关步骤。由此针对本领域中，获取基于实时荧光定量PCR检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的方法研究无法突破，且存在较大的阻碍。而在建立荧光定量PCR方法时，针对RNA的提取步骤至关重要，由此可见，能否提供一种针对鼻腔脱落细胞RNA的方法，使其能够作为建立荧光定量PCR方法的基础，且操作便捷，重复性好，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明针对上述的技术问题，提出一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中，并加入等体积的乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，离心处理后，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL～700μL的第一缓冲液，离心处理后，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL～800μL第二缓冲液，离心处理后，除去第二滤液，取RNA纯化柱经洗脱得到RNA。

作为优选，通过刷取或粘取鼻息肉表面获取的鼻息肉脱落细胞，将获取鼻息肉脱落细胞置于细胞裂解液中，于不大于4℃条件下保存备用。

作为优选，采用毛刷于鼻息肉表面按压20～40s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于细胞裂解液中得到鼻息肉脱落细胞备用。

作为优选，包括以下步骤：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加10～100μL DNA酶反应液，经静置处理后，加入300μL～700μL所述第二缓冲液，离心处理后，除去第三滤液，取RNA纯化柱经洗脱后采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

作为优选，包括以下步骤：所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取DNA酶缓冲液、重组DNA酶，去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。优选所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取5μL 10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。

作为优选，当进行RNA提取时基因组含量较低或材料起始量较少时，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：所述步骤1中，所述鼻腔脱落细胞溶解于细胞裂解液中后先加入至基因组DNA吸附柱中取滤液，再向所述滤液中加入等体积的乙醇。

作为优选，为了获取更高浓度的RNA，从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：取待洗脱的RNA纯化柱加入去RNA水解酶的蒸馏水或焦碳酸二乙酯处理水，室温静置后，经离心处理、洗脱所述RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

作为优选，所述细胞裂解液细胞裂解液包括缓冲液和二硫苏糖醇。

上述中，其中步骤1采用细胞裂解液能够迅速破碎鼻腔脱落细胞并抑制鼻腔脱落细胞释放出的核酸酶的物质；采用基因组DNA吸附柱用于去除基因组DNA；步骤2中的RNA纯化柱用于富集RNA；其中收集管用于收集去除基因组DNA后的溶液，用于去除吸附有RNA的纯化柱的杂质的第一缓冲液、用于去除RNA溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液。

作为优选，采用分光光度计测量RNA纯度OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

具体的，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第一种方法，包括以下步骤：

步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于300μL细胞裂解液中，并加入等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀；立即将混合液加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：取5μL 10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液，向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加50μL DNA酶反应液，室温静置15分钟，加入350μL所述第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第三滤液；

步骤4：将步骤3中除去第三滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

或者所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括以下步骤：

步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，取滤液，向所述滤液中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

作为优选，所述鼻腔脱落细胞RNA为鼻腔脱落细胞中用于判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因的RNA。

作为优选，所述判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因为CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提供的鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，构建了一个新的检测方法，避免进行病理活检，因此可以在不同随访阶段取样，进行患者病程追踪，提供了一种无创的方法获得患者鼻腔上皮细胞，避免了患者的感染风险，且使最终获取的RNA纯度高，有利于RNA的保护，适宜针对鼻息肉脱落细胞进行RNA提取的操作，且成本较低便于操作。

2、本发明提供的鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，能够有效的在微量鼻息肉脱落细胞中提取得到RNA，为后续定量检测判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因提供了基础和保障，且本发明所提供的提取方法简单快捷，重复性好，适宜在科学研究领域广泛推广应用。

3、本发明提供的采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，为日后针对伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的检测基因筛选技术提供了基础，为临床指导和药物治疗提供了可靠的基础。保证了用于检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的试剂盒在临床应用的可行性。

4、本发明采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，通过采用刷取或粘取的方式从鼻息肉的表面获取鼻息肉细胞来提取获得RNA，以便于为确定患者的伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的研究提供基础和保障，避免了对患者造成创面，提高了患者检查的安全性，且操作更便捷，节约了人力成本。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，包括采用鼻息肉脱落细胞置于细胞裂解液中进行RNA提取的步骤。

在一可选实施例中，通过刷取或粘取鼻息肉表面获取的鼻息肉脱落细胞，将获取鼻息肉脱落细胞置于细胞裂解液中，于不大于4℃条件下保存备用。本发明的方法基于该种方式避免了对患者造成创面，提高了患者检查的安全性，且操作更便捷，节约了人力成本。

在一可选实施例中，采用毛刷于鼻息肉表面按压20～40s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于细胞裂解液中得到鼻息肉脱落细胞备用。采用上述限定方法，在操作时效果最佳，通过最简便的方式有效的获取到鼻息肉脱落细胞。满足鼻腔脱落细胞RNA的提取方法的需求。

在一可选实施例中，所述细胞裂解液细胞裂解液包括缓冲液和二硫苏糖醇。本发明优选的上述细胞裂解液能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶的物质。

在一可选实施例中，本发明提供两种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，一种包括以下步骤：

步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中，并加入等体积的乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，离心处理后，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL～700μL的第一缓冲液，离心处理后，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL～800μL第二缓冲液，离心处理后，除去第二滤液，取RNA纯化柱经洗脱得到RNA。

上述中，为了进一步提高RNA纯度，还包括以下步骤：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加10～100μL DNA酶反应液，经静置处理后，加入300μL～700μL所述第二缓冲液，离心处理后，除去第三滤液，取RNA纯化柱经洗脱后采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

在一可选实施例中，还包括以下步骤：所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取DNA酶缓冲液、重组DNA酶，去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。优选所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取5μL10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。

在一可选实施例中，当进行RNA提取时基因组含量较低或材料起始量较少时，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：所述步骤1中，所述鼻腔脱落细胞溶解于细胞裂解液中后先加入至基因组DNA吸附柱中，再经离心处理后取上清液。

在一可选实施例中，为了获取更高浓度的RNA，从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：取待洗脱的RNA纯化柱加入去RNA水解酶的蒸馏水或焦碳酸二乙酯处理水，室温静置后，经离心处理、洗脱所述RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

在一可选实施例中，所述细胞裂解液细胞裂解液包括缓冲液和二硫苏糖醇。

上述中，其中步骤1采用细胞裂解液能够迅速破碎鼻腔脱落细胞并抑制鼻腔脱落细胞释放出的核酸酶的物质；采用基因组DNA吸附柱用于去除基因组DNA；步骤2中的RNA纯化柱用于富集RNA；其中收集管用于收集去除基因组DNA后的溶液，用于去除吸附有RNA的纯化柱的杂质的第一缓冲液、用于去除RNA溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液。

在一可选实施例中，采用分光光度计测量RNA纯度OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

具体的，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第一种方法，包括以下步骤：

步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于300μL细胞裂解液中，并加入等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀；立即将混合液加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：取5μL 10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液，向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加50μL DNA酶反应液，室温静置15分钟，加入350μL所述第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第三滤液；

步骤4：将步骤3中除去第三滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

或者所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括以下步骤：

步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，取滤液，向所述滤液中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

在一可选实施例中，所述鼻腔脱落细胞RNA为鼻腔脱落细胞中用于判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因的RNA。

在一优选实施例中，所述判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因为CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因。

针对CLC基因为已知基因，基因ID为1178，其DNA序列如SEQIDNO:1所示，基因NM号为001828.5；针对CST1基因为已知基因，基因ID为1469，其DNA序列如SEQIDNO:2所示，基因NM号为001898.2；针对ALOX15基因，基因ID为246，其DNA序列如SEQIDNO:3所示，基因NM号为001140.4；针对SAA2基因，基因ID为6289，DNA序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，DNA序列如SEQIDNO:4所述的基因NM号为001127380.2，DNA序列如SEQIDNO:5所示的基因NM号为030754.4。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1：

样本的收集与处理：

某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由细胞裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。

一种鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于100μL细胞裂解液中，并加入等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀；立即将混合液加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：取1μL 10×DNA酶缓冲液、1μL重组DNA酶，8μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液，向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加10μL DNA酶反应液，室温静置15分钟，加入300μL所述第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第三滤液；

步骤4：将步骤3中除去第三滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，利用分光光度计测量RNA纯度，并得到OD260/OD280比值为1.7，得到可以用于检测鼻腔脱落细胞中CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因的RNA溶液。

实施例2：

样本的收集与处理：

某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由细胞裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。

一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于300μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，于12000转/min的条件下离心60s，取滤液，向所述滤液中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，利用分光光度计测量RNA纯度，OD260/OD280比值为2.0，得到可以用于检测鼻腔脱落细胞中CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因的RNA溶液。

实施例3：

样本的收集与处理：

某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由细胞裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。

一种鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于300μL细胞裂解液中经12000转/分钟，离心15min后取上清液，向所述上清液中加入等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀；立即将混合液加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入500μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：取5μL 10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液，向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加50μL DNA酶反应液，室温静置15分钟，加入700μL所述第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第三滤液；

步骤4：将步骤3中除去第三滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，利用分光光度计测量RNA纯度，OD260/OD280比值为2.1，得到鼻腔脱落细胞中RNA溶液。

实施例4：

样本的收集与处理：

某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由细胞裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。

一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于2000μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，于12000转/min的条件下离心60s，取滤液，向所述滤液中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入700μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入800μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；

步骤3：取10μL 10×DNA酶缓冲液、8μL重组DNA酶，82μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液，向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加100μL DNA酶反应液，室温静置15分钟，加入700μL所述第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第三滤液；

步骤4：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，利用分光光度计测量RNA纯度，OD260/OD280比值为2.0，得到可以用于检测鼻腔脱落细胞中CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因的RNA溶液。

鼻腔脱落细胞RNA的提取方法本发明提供的采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，为日后针对伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的检测基因筛选技术提供了基础，为临床指导和药物治疗提供了可靠的基础。保证了用于检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的试剂盒在临床应用的可行性。

序列表

<110> 张罗

王成硕

闫冰

杨军

北京市耳鼻咽喉科研究所

首都医科大学附属北京同仁医院

<120> 鼻腔脱落细胞RNA的提取方法

<130> CC18K10085CCN

<141> 2018-07-03

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 649

<212> DNA

<213> human

<400> 1

catttaaatt ctgcagctca gagattcaca cagaagtctg gacacaattc agaagagcca 60

cccagaagga gacaacaatg tccctgctac ccgtgccata cacagaggct gcctctttgt 120

ctactggttc tactgtgaca atcaaagggc gaccacttgc ctgtttcttg aatgaaccat 180

atctgcaggt ggatttccac actgagatga aggaggaatc agacattgtc ttccatttcc 240

aagtgtgctt tggtcgtcgt gtggtcatga acagccgtga gtatggggcc tggaagcagc 300

aggtggaatc caagaatatg ccctttcagg atggccaaga atttgaactg agcatctcag 360

tgctgccaga taagtaccag gtaatggtca atggccaatc ctcttacacc tttgaccata 420

gaatcaagcc tgaggctgtg aagatggtgc aagtgtggag agatatctcc ctgaccaaat 480

ttaatgtcag ctatttaaag agataaccag acttcatgtt gccaaggaat ccctgtctct 540

acgtgaactt gggattccaa agccagctaa cagcatgatc ttttctcact tcaatcctta 600

ctcctgctca ttaaaactta atcaaacttc acaaaaaaaa aaaaaaaaa 649

<210> 2

<211> 782

<212> DNA

<213> human

<400> 2

gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct 60

ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg 120

tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg 180

cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca 240

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacaga 300

ccgttggggg ggtgaattac ttcttcgacg tagaggtggg ccgcaccata tgtaccaagt 360

cccagcccaa cttggacacc tgtgccttcc atgaacagcc agaactgcag aagaaacagt 420

tgtgctcttt cgagatctac gaagttccct gggagaacag aaggtccctg gtgaaatcca 480

ggtgtcaaga atcctaggga tctgtgccag gccattcgca ccagccacca cccactccca 540

ccccctgtag tgctcccacc cctggactgg tggcccccac cctgcgggag gcctccccat 600

gtgcctgcgc caagagacag acagagaagg ctgcaggagt cctttgttgc tcagcagggc 660

gctctgccct ccctccttcc ttcttgcttc taatagccct ggtacatggt acacaccccc 720

ccacctcctg caattaaaca gtagcatcgc ctccctctga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aa 782

<210> 3

<211> 2715

<212> DNA

<213> human

<400> 3

gagcgaaaca tctttgagca agatgggtct ctaccgcatc cgcgtgtcca ctggggcctc 60

gctctatgcc ggttccaaca accaggtgca gctgtggctg gtcggccagc acggggaggc 120

ggcgctcggg aagcgactgt ggcccgcacg gggcaaggag acagaactca aggtggaagt 180

accggagtat ctggggccgc tgctgtttgt gaaactgcgc aaacggcacc tccttaagga 240

cgacgcctgg ttctgcaact ggatctctgt gcagggcccc ggagccgggg acgaggtcag 300

gttcccttgt taccgctggg tggagggcaa cggcgtcctg agcctgcctg aaggcaccgg 360

ccgcactgtg ggcgaggacc ctcagggcct gttccagaaa caccgggaag aagagctgga 420

agagagaagg aagttgtacc ggtggggaaa ctggaaggac gggttaattc tgaatatggc 480

tggggccaaa ctatatgacc tccctgtgga tgagcgattt ctggaagaca agagagttga 540

ctttgaggtt tcgctggcca aggggctggc cgacctcgct atcaaagact ctctaaatgt 600

tctgacttgc tggaaggatc tagatgactt caaccggatt ttctggtgtg gtcagagcaa 660

gctggctgag cgcgtgcggg actcctggaa ggaagatgcc ttatttgggt accagtttct 720

taatggcgcc aaccccgtgg tgctgaggcg ctctgctcac cttcctgctc gcctagtgtt 780

ccctccaggc atggaggaac tgcaggccca gctggagaag gagctggagg gaggcacact 840

gttcgaagct gacttctccc tgctggatgg gatcaaggcc aacgtcattc tctgtagcca 900

gcagcacctg gctgcccctc tagtcatgct gaaattgcag cctgatggga aactcttgcc 960

catggtcatc cagctccagc tgccccgcac aggatcccca ccacctcccc ttttcttgcc 1020

tacggatccc ccaatggcct ggcttctggc caaatgctgg gtgcgcagct ctgacttcca 1080

gctccatgag ctgcagtctc atcttctgag gggacacttg atggctgagg tcattgttgt 1140

ggccaccatg aggtgcctgc cgtcgataca tcctatcttc aagcttataa ttccccacct 1200

gcgatacacc ctggaaatta acgtccgggc caggactggg ctggtctctg acatgggaat 1260

tttcgaccag ataatgagca ctggtggggg aggccacgtg cagctgctca agcaagctgg 1320

agccttccta acctacagct ccttctgtcc ccctgatgac ttggccgacc gggggctcct 1380

gggagtgaag tcttccttct atgcccaaga tgcgctgcgg ctctgggaaa tcatctatcg 1440

gtatgtggaa ggaatcgtga gtctccacta taagacagac gtggctgtga aagacgaccc 1500

agagctgcag acctggtgtc gagagatcac tgaaatcggg ctgcaagggg cccaggaccg 1560

agggtttcct gtctctttac aggctcggga ccaggtttgc cactttgtca ccatgtgtat 1620

cttcacctgc accggccaac acgcctctgt gcacctgggc cagctggact ggtactcttg 1680

ggtgcctaat gcaccctgca cgatgcggct gcccccgcca accaccaagg atgcaacgct 1740

ggagacagtg atggcgacac tgcccaactt ccaccaggct tctctccaga tgtccatcac 1800

ttggcagctg ggcagacgcc agcccgttat ggtggctgtg ggccagcatg aggaggagta 1860

tttttcgggc cctgagccta aggctgtgct gaagaagttc agggaggagc tggctgccct 1920

ggataaggaa attgagatcc ggaatgcaaa gctggacatg ccctacgagt acctgcggcc 1980

cagcgtggtg gaaaacagtg tggccatcta agcgtcgcca ccctttggtt atttcagccc 2040

ccatcaccca agccacaagc tgaccccttc gtggttatag ccctgccctc ccaagtccca 2100

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gaacacattt tactctagag gcatcacctg ggaccttact cctctttcct tccttcctcc 2220

tttcctatct tccttcctct ctctcttcct ctttcttcat tcagatctat atggcaaata 2280

gccacaatta tataaatcat ttcaagacta gaataggggg atataataca tattactcca 2340

caccttttat gaatcaaata tgattttttt gttgttgtta agacagagtc tcactttgac 2400

acccaggctg gagtgcagtg gtgccatcac cacggctcac tgcagcctca gcgtcctggg 2460

ctcaaatgat cctcccacct cagcctcctg agtagctggg actacaggct catgccatca 2520

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gaaataggat tttgaaccca aattgagttt aacaataata aaaagttgtt ttacgctaaa 2640

gatggaaaag aactaggact gaactatttt aaataaaata ttggcaaaag aaaaaaaaaa 2700

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<210> 4

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agcacagatc agcaccatga agcttctcac gggcctggtt ttctgctcct tggtcctgag 120

tgtcagcagc cgaagcttct tttcgttcct tggcgaggct tttgatgggg ctcgggacat 180

gtggagagcc tactctgaca tgagagaagc caattacatc ggctcagaca aatacttcca 240

tgctcggggg aactatgatg ctgccaaaag gggacctggg ggtgcctggg ctgcagaagt 300

gatcagttta ttttcagctg aactgtagag agtgaaggaa gaagcctttt ttcttcactc 360

ctacatgacc caggcattga tccaggcaat gaagattcag tgtaaataac caccactaac 420

aagaccatgg cctttggaac ctgtgctaag aggcatggat gagctccctc agcatgtgga 480

tggagactga agagaggtct gaaggctcag tgtggtgtct ccattctcta agaagtttgg 540

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ccaaaaaaat acttagaatg aataagagct agtatttgat agcacaacgg gggactatag 1560

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acccacaaaa aatttttaaa aaggaatgaa ataaaaacat ttgagtttaa gaaaaccaca 1800

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atattaataa agacaagaac ataaataatt tctttggcag aacataagcc atcataatca 1920

gaagataaat aagctgggaa aaatatttgt aactcatatc ctagataaca tactcatttt 1980

ccctgtatat aaaaagtttc tctaatgtga taaataaaaa cacaataaac cagtaaaaaa 2040

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<212> DNA

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<400> 5

aggctcacta taaatagcag ccacctctcc ctggcagaca gggacccgca gctcagctac 60

agcacagatc agcaccatga agcttctcac gggcctggtt ttctgctcct tggtcctgag 120

tgtcagcagc cgaagcttct tttcgttcct tggcgaggct tttgatgggg ctcgggacat 180

gtggagagcc tactctgaca tgagagaagc caattacatc ggctcagaca aatacttcca 240

tgctcggggg aactatgatg ctgccaaaag gggacctggg ggtgcctggg ctgcagaagt 300

gatcagcaat gccagagaga atatccagag actcacaggc cgtggtgcgg aggactcgct 360

ggccgatcag gctgccaata aatggggcag gagtggcaga gaccccaatc acttccgacc 420

tgctggcctg cctgagaaat actgagcttc ctcttcactc tgctctcagg agacctggct 480

atgaggccct cggggcaggg atacaaagtt agtgaggtct atgtccagag aagctgagat 540

atggcatata ataggcatct aataaatgct taagaggtgg aatttgttga aaca 594

Claims (10)

1.一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中，并加入等体积的乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，离心处理后，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于收集管中；

步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL～700μL的第一缓冲液，离心处理后，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL～800μL第二缓冲液，离心处理后，除去第二滤液，取RNA纯化柱经洗脱得到RNA。

2.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：通过刷取或粘取鼻息肉表面获取的鼻息肉脱落细胞，将获取鼻息肉脱落细胞置于细胞裂解液中，于不大于4℃条件下保存备用。

3.根据权利要求2所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：采用毛刷于鼻息肉表面按压20～40s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于细胞裂解液中得到鼻息肉脱落细胞备用。

4.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加10～100μL DNA酶反应液，经静置处理后，加入300μL～700μL所述第二缓冲液，离心处理后，除去第三滤液，取RNA纯化柱经洗脱后采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

5.根据权利要求4所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取DNA酶缓冲液、重组DNA酶，去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。

6.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：所述步骤1中，所述鼻腔脱落细胞溶解于细胞裂解液中后先加入至基因组DNA吸附柱中取滤液，再向所述滤液中加入等体积的乙醇。

7.根据权利要求1～6任一项所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：取待洗脱的RNA纯化柱加入去RNA水解酶的蒸馏水或焦碳酸二乙酯处理水，室温静置后，经离心处理、洗脱所述RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

8.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：所述细胞裂解液细胞裂解液包括缓冲液和二硫苏糖醇。

9.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：采用分光光度计测量RNA纯度OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

10.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：所述鼻腔脱落细胞RNA为鼻腔脱落细胞中用于判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因的RNA；所述判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因为CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因。