CN108913763A - 检测鼻腔脱落细胞中saa2基因表达量的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的非诊断目的的方法及应用，包括以下步骤：从鼻腔脱落细胞中提取RNA，将总RNA逆转录为cDNA，采用定量聚合酶链反应将cDNA中的SAA2基因和内参基因分别采用SAA2基因的特异性引物和内参基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，基于扩增产物的检测结果计算SAA2基因表达量。本发明方法，以有效筛选的SAA2基因作为生物标志物，提供对其基因表达量的检测方法，实现对鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的计算，能够有效获取SAA2基因表达量，且提供的方法简单快捷，敏感性高，重复性好，适宜广泛推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法。
背景技术
慢性鼻窦炎伴鼻息肉(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是鼻窦黏膜的慢性炎症，查体可见鼻腔或中鼻道息肉形成。CRSwNP常见症状为鼻堵、流涕或鼻涕倒流、嗅觉减退、面部闷胀感或压力感，持续时间超过12周。患病率约为0.5-4％，CRSwNP常伴有哮喘和过敏性鼻炎，有报道7％的哮喘患者患有CRSwNP，而26-48％的CRSwNP患有哮喘。CRSwNP发病机制目前还不确定，黏膜上皮细胞破坏、宿主免疫系统失衡和病原微生物入侵可能是其发病的主要原因。CRSwNP主要的治疗方式是手术和药物治疗。但研究表明，即使通过规范的药物或手术治疗，慢性鼻窦炎伴鼻息肉的复发率仍高达56％，严重影响患者生活质量，同时带来高额医疗支出，但临床却缺乏根治性治疗方法，因而成为鼻科学研究领域的重点。
依据嗜酸性粒细胞浸润的程度可以将CRSwNP分为嗜酸性粒细胞型(EosinophilicCRSwNP，ECRSwNP)与非嗜酸性粒细胞型(Noneosinophilic CRSwNP，nonECRSwNP)，二者的临床表现、用药和预后均不同，嗜酸性粒细胞型的临床症状较重，以鼻堵和嗅觉减退为主，多合并有哮喘，术后复发率较高。鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润程度与复发关系最为密切，当组织中该细胞百分比超过27％时，复发风险超过90％。嗜酸性粒细胞型息肉对糖皮质激素类药物的敏感度显著高于非嗜酸性粒细胞型。非嗜酸性粒细胞型临床症状一般较轻，且合并哮喘的几率较小，气道炎症较轻，且术后复发率较嗜酸性粒细胞型低，对大环内酯类药物治疗反应好。西方国家以嗜酸性粒细胞型为主，主要表现为TH2炎症反应，而我国的嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型比例均约占一半，非嗜酸性粒细胞型主要表现为TH1/TH17炎症反应为主。综上所述，嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型在免疫病理类型、临床症状、药物治疗反应和预后存在明显不同。不同慢性鼻窦炎伴鼻息肉的炎症/病理分型治疗策略不同。所以对慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分型的鉴定显得尤为重要。
目前对两种亚型的判断主要依据鼻腔黏膜活检后组织病理标本染色，缺乏无创性生物学标志物用于鉴别诊断。患者在鼻内镜下获得息肉标本后，进行石蜡固定等病理标本的常规处理，然后进行苏木素伊红的染色，接下来通过高倍显微镜观察组织浸润的炎细胞(主要的炎细胞包括嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，浆细胞)浸润个数，进行细胞分型。鼻腔黏膜病理活检的缺点如下：1.为有创检查：增加了患者的感染风险，不适用于免疫力较低人群如儿童、老年人等；取材时鼻腔出血，往往引起患者恐惧和担忧。2.难以获得疾病的实时动态变化信息：不能在术后对愈合期黏膜进行病理活检。但临床数据表明慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分类会随药物治疗、手术治疗等转归，用治疗前的病理活检结果无法代表全部疾病时期的特征。3.费时且增加就医成本，从获取组织样本到获取病理结果一般3-4个工作日。由于无法当日或次日获得结果，外地患者就医等产生额外的交通费、住宿费、挂号费，增加了就医成本。4.存在一定的人为误差，不同的病理医生计数的炎细胞数量有可能不同，影响息肉分型的判断。5.组织病理切片较局限，只能反映切片位置的标本炎症状态，不能反映组织的全貌，可能会造成误诊。6.每张片子都需要病理科医生人工计数，难以批量操作。
近年兴起的实时荧光定量PCR弥补了上述技术的不足。该方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后根据荧光信号对所测DNA样品进行定量分析，该方法操作简便，敏感性高，重复性好且结果准确性高。然而现有技术中尚未公开有效提供检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，以更好的获取到鼻腔脱落细胞内SAA2基因含量情况。
发明内容
本发明针对上述的技术问题，提出一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：从鼻腔脱落细胞中提取RNA，将总RNA逆转录为cDNA，采用定量聚合酶链反应将cDNA中的SAA2基因和内参基因分别采用SAA2基因的特异性引物和内参基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，基于扩增产物的检测结果计算SAA2基因表达量。
作为优选，SAA2基因的上游引物如SEQ ID NO:3所示，SAA2基因的下游引物如SEQID NO:4所示；
所述内参基因为GAPDH，所述内参基因的上游引物如SEQ ID NO:5所示，所述下游引物如SEQ ID NO:6所示。
作为优选，所述鼻腔脱落细胞采用毛刷于鼻息肉表面获取，且将获取鼻腔脱落细胞后的毛刷置于细胞裂解液中于4℃以下保存。
作为优选，从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括两种方法，其中第一种方法包括以下步骤：
步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中，并加入等体积的乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，离心处理后，除去收集管中的滤液，将所述RNA纯化柱置于收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL～700μL的第一缓冲液，离心处理后，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL～800μL第二缓冲液，离心处理后，除去第二滤液，取RNA纯化柱经洗脱得到RNA。
作为优选，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加10～100μL DNA酶反应液，经静置处理后，加入300μL～700μL所述第二缓冲液，离心处理后，除去第三滤液，取RNA纯化柱经洗脱后采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA；
所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取DNA酶缓冲液、重组DNA酶，去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。优选所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取5μL10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。
作为优选，当进行RNA提取时基因组含量较低或材料起始量较少时，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：所述步骤1中，所述鼻腔脱落细胞溶解于细胞裂解液中后先加入至基因组DNA吸附柱中取滤液，再向所述滤液中加入等体积的乙醇。
作为优选，为了获取更高浓度的RNA，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：取待洗脱的RNA纯化柱加入去RNA水解酶的蒸馏水或焦碳酸二乙酯处理水，室温静置后，经离心处理、洗脱所述RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。
其中步骤1采用细胞裂解液能够迅速破碎鼻腔脱落细胞并抑制鼻腔脱落细胞释放出的核酸酶的物质；采用基因组DNA吸附柱用于去除基因组DNA；步骤2中的RNA纯化柱用于富集RNA；其中收集管用于收集去除基因组DNA后的溶液，用于去除吸附有RNA的纯化柱的杂质的第一缓冲液、用于去除RNA溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液。
具体的，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第一种方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于300μL细胞裂解液中，并加入等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀；立即将混合液加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；
步骤3：取5μL 10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液，向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加50μL DNA酶反应液，室温静置15分钟，加入350μL所述第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第三滤液；
步骤4：将步骤3中除去第三滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。
或者所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括以下步骤：
步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，取滤液，向所述滤液中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；
步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。
作为优选，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第二种方法，包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1mL～20mL RNA抽提液进行溶解、振荡后加入所述RNA抽提液体积的0.1～0.5倍的氯仿，震荡混匀，室温静置，将所述离心管离心，取上清液，加入所述氯仿体积的0.5～3倍的异丙醇，混匀后静置、离心，弃上清，保留第一沉淀，向所述第一沉淀中加入所述异丙醇体积的0.5～5倍的浓度65％～90％的乙醇，经洗涤后混匀、离心，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，再次离心，除去上清液，继续向所述离心管中加入0.01～5mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。
作为优选，所述RNA抽提液为Trizol、RNAiso Blood、RNAiso Plus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中的任一种或几种的试剂。
作为优选，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第二种方法，包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1～20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置3～7min；加入40μL～5mL氯仿，震荡混匀，室温静置3～7min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；取上清液40μL～8mL，加入等体积的异丙醇，混匀后静置8～12min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度65％～90％的乙醇，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心10～20min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液，静置10～20min后继续向所述离心管中加入0.01～5mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。
具体的，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第二种方法，包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置5min；加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，于4℃，12000r/min离心15min；取上清液200μL，加入200μL异丙醇，混匀后静置10min，于4℃，12000r/min离心15min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度75％的乙醇，于4℃，7500r/min离心15min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于4℃，7500r/min离心2min，除去上清液，静置15min后继续向所述离心管中加入50μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.7～2.1，得到RNA。
作为优选，将总RNA逆转录为cDNA的方法包括以下步骤：取1～3μL的逆转录混合液、0～10μL的去RNA水解酶蒸馏水和提取的RNA于37℃温度条件下发生反转录反应15min，后于84℃温度条件下发生反转录酶的失活反应，得到逆转录产物cDNA。
作为更优选的，将总RNA逆转录为cDNA的方法包括以下步骤：取2μL的所述逆转录混合液，8μL的所述去RNA水解酶蒸馏水，以及总量不超过500ng或体积不超过8μL的总RNA，所述去RNA水解酶蒸馏水补齐至10μL；轻柔混匀后进行逆转录反应,条件如下:在37℃的条件下，进行15分钟的反转录反应；在85℃的条件下，进行5秒的反转录酶的失活反应；产物4℃放置。其中反应体系可按需求相应放大，10μL反应体系可最大使用500ng的总RNA，本领域技术人员可根据实际需要进行选择。
作为优选，所述实时荧光定量PCR扩增包括以下步骤：
步骤1：制备实时荧光定量PCR反应液：包括1μL～25μL的PCR预混合液，0μL～10μL的双蒸水补齐总体积用水至10μL，0μL～2μL的机器荧光补偿及矫正剂，0.01～100μM的SAA2基因的上游引物，0.01～100μM的SAA2基因的下游引物，0.01～100μM的内参基因的上游引物，0.01～100μM的内参基因的下游引物，0.01μL～5μL的cDNA；
步骤2：采用两步法PCR扩增标准程序或三步法PCR扩增标准程序进行实时荧光定量PCR检测；
步骤3：计算SAA2基因表达量。
作为更优选的，制备实时荧光定量PCR反应液：包括5μL的PCR预混合液，2.8μL的双蒸水补齐总体积用水至10μL，0.2μL的机器荧光补偿及矫正剂，0.5μL的SAA2基因的上游引物，0.5μL的SAA2基因的下游引物，0.5μL的内参基因的上游引物，0.5μL的内参基因的下游引物，1ng/μL的所述cDNA或0.01μL至5μL的所述RNA。
作为优选，所述两步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性30秒；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应15秒，在60℃的条件下，反应60秒，退火延伸，如此进行40个循环；
所述三步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性2分钟；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应1分钟，在55℃的条件下，反应1分钟，在72℃的条件下，反应1分钟，如此进行40个循环；最后72℃，7分钟退火延伸；
计算所述SAA2基因表达量的方法为：计算ΔCT或2-ΔΔCT来计算目的基因的表达量；其中ΔCT＝(CT(SAA2)-CT(GAPDH))，-ΔΔCT＝-(ΔCT(处理标本CT(SAA2)-CT(GAPDH))-健康对照组平均ΔCT)；健康对照组平均ΔCT＝∑每个对照组ΔCT(CT(SAA2)-CT(GAPDH))/对照组样本数。
一种上述检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法在制备用于检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，以有效筛选的SAA2基因作为生物标志物，提供对其基因表达量的检测方法，实现对鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的计算，能够有效获取SAA2基因表达量，提供的方法简单快捷，敏感性高，重复性好，适宜广泛推广应用。
2、本发明提供的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其中SAA2(血清淀粉样蛋白A2)是蛋白质编码基因。其在炎症和组织损伤的应答中高度表达。该蛋白还在高密度脂蛋白代谢和胆固醇稳态中起重要作用。其高表达与慢性炎症性疾病有关，包括动脉粥样硬化，类风湿性关节炎，阿尔茨海默病和克罗恩氏病等。目前现有技术中尚未公开有SAA2基因，更未发现该基因的用途。其中发明提供的针对鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法可用于检测鼻腔脱落细胞中SAA2表达情况。可用于进一步为鼻腔伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的检测基因筛选技术提供了基础，为临床指导和药物治疗提供了可靠的基础。保证了用于检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的试剂盒在临床应用的可行性。
3、本发明提供的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，根据实际需求采用ΔCt或2-ΔΔCt法的相对定量法，选择了表达量相对恒定的内参基因，用内参基因的数量进行标准化，通过测定样品目的基因与内参基因的Ct值差异计算目的基因表达量，方法简便快速，检测精度高，可降低检测成本，节约检测时间。结果便于判读等优点。大大提升了实验效率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：从鼻腔脱落细胞中提取RNA，将总RNA逆转录为cDNA，采用定量聚合酶链反应将cDNA中的SAA2基因和内参基因分别采用SAA2基因的特异性引物和内参基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，基于扩增产物的检测结果计算SAA2基因表达量。
本发明通过蛋白质组学和转录组学方法经大量的创造性实验筛选得到通过计算SAA2基因表达量来检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型，且提供的针对SAA2基因表达量的计算方法简便可靠，准确性高。目前现有的技术中尚未提供相应的任何报道。其中针对SAA2基因为已知基因，基因ID为6289，其DNA序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。DNA序列如SEQIDNO:1所示的基因NM号为001127380.2，DNA序列如SEQIDNO:2所示的基因NM号为030754.4。
在一可选实施例中，SAA2基因的上游引物如SEQIDNO:3所示，SAA2基因的下游引物如SEQIDNO:4所示。针对SAA2基因的上游引物和下游引物的设计，敏感性更高，在进行检测SAA2基因表达量时，使结果更准确，重复性更好。
在一可选实施例中，所述内参基因为GAPDH，所述内参基因的上游引物如SEQIDNO:5所示，所述下游引物如SEQIDNO:6所示。针对该处特征的设计，结合上述SAA2基因的上游引物和SAA2基因的下游引物，获取合适的ΔCT值，以进行SAA2基因表达量计算，且具有较高的准确率。
在一可选实施例中，所述鼻腔脱落细胞采用毛刷于鼻息肉表面获取，且将获取鼻腔脱落细胞后的毛刷置于细胞裂解液中于4℃以下保存。本发明的方法基于该种方式避免了对患者造成创面，提高了患者检查的安全性，且操作更便捷，节约了人力成本和就医成本。
在一可选实施例中，从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括两种方法，其中第一种方法包括以下步骤：
步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中，并加入等体积的乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，离心处理后，除去收集管中的滤液，将所述RNA纯化柱置于收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL～700μL的第一缓冲液，离心处理后，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL～800μL第二缓冲液，离心处理后，除去第二滤液，取RNA纯化柱经洗脱得到RNA。
作为优选，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加10～100μL DNA酶反应液，经静置处理后，加入300μL～700μL所述第二缓冲液，离心处理后，除去第三滤液，取RNA纯化柱经洗脱后采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA；
所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取DNA酶缓冲液、重组DNA酶，去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。优选所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取5μL10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。
作为优选，当进行RNA提取时基因组含量较低或材料起始量较少时，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：所述步骤1中，所述鼻腔脱落细胞溶解于细胞裂解液中后先加入至基因组DNA吸附柱中取滤液，再向所述滤液中加入等体积的乙醇。
作为优选，为了获取更高浓度的RNA，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：取待洗脱的RNA纯化柱加入去RNA水解酶的蒸馏水或焦碳酸二乙酯处理水，室温静置后，经离心处理、洗脱所述RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。
其中步骤1采用细胞裂解液能够迅速破碎鼻腔脱落细胞并抑制鼻腔脱落细胞释放出的核酸酶的物质；采用基因组DNA吸附柱用于去除基因组DNA；步骤2中的RNA纯化柱用于富集RNA；其中收集管用于收集去除基因组DNA后的溶液，用于去除吸附有RNA的纯化柱的杂质的第一缓冲液、用于去除RNA溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液。
具体的，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第一种方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于300μL细胞裂解液中，并加入等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀；立即将混合液加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；
步骤3：取5μL 10×DNA酶缓冲液、4μL重组DNA酶，41μL去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液，向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加50μL DNA酶反应液，室温静置15分钟，加入350μL所述第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第三滤液；
步骤4：将步骤3中除去第三滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。
或者所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括以下步骤：
步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，取滤液，向所述滤中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；
步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。
其中步骤1采用细胞裂解液能够迅速破碎鼻腔脱落细胞并抑制鼻腔脱落细胞释放出的核酸酶的物质；步骤1采用基因组DNA吸附柱用于去除基因组DNA；步骤2中的RNA纯化柱用于富集RNA；其中收集管用于收集去除基因组DNA后的溶液，用于去除吸附有RNA的纯化柱的杂质的第一缓冲液、用于去除RNA溶液中的杂质和盐分的第二缓冲液。
在一可选实施例中，从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第二种方法，包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1mL～20mL RNA抽提液进行溶解、振荡后加入所述RNA抽提液体积的0.1～0.5倍的氯仿，震荡混匀，室温静置，将所述离心管离心，取上清液，加入所述氯仿体积的0.5～3倍的异丙醇，混匀后静置、离心，弃上清，保留第一沉淀，向所述第一沉淀中加入所述异丙醇体积的0.5～5倍的浓度65％～90％的乙醇，经洗涤后混匀、离心，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，再次离心，除去上清液，继续向所述离心管中加入0.01～5mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。
优选所述RNA抽提液为Trizol、RNAiso Blood、RNAiso Plus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中的任一种或几种的试剂。
在一优选实施例中，所述从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第二种方法，包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1～20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置3～7min；加入40μL～5mL氯仿，震荡混匀，室温静置3～7min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；取上清液40μL～8mL，加入等体积的异丙醇，混匀后静置8～12min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度65％～90％的乙醇，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心10～20min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液，静置10～20min后继续向所述离心管中加入0.01～5mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。
具体的，从鼻腔脱落细胞中提取RNA的第二种方法，包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置5min；加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，于4℃，12000r/min离心15min；取上清液200μL，加入200μL异丙醇，混匀后静置10min，于4℃，12000r/min离心15min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度75％的乙醇，于4℃，7500r/min离心15min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于4℃，7500r/min离心2min，除去上清液，静置15min后继续向所述离心管中加入50μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.7～2.1，得到RNA。
作为优选，将总RNA逆转录为cDNA的方法包括以下步骤：取1～3μL的逆转录混合液、0～10μL的去RNA水解酶蒸馏水和提取的RNA于37℃温度条件下发生反转录反应15min，后于84℃温度条件下发生反转录酶的失活反应，得到逆转录产物cDNA。
在一可选实施例中，将总RNA逆转录为cDNA的方法包括以下步骤：取2μL的所述逆转录混合液，8μL的所述去RNA水解酶蒸馏水，以及总量不超过500ng或体积不超过8μL的总RNA，所述去RNA水解酶蒸馏水补齐至10μL；轻柔混匀后进行逆转录反应,条件如下:在37℃的条件下，进行15分钟的反转录反应；在85℃的条件下，进行5秒的反转录酶的失活反应；产物4℃放置。
在一可选实施例中，所述实时荧光定量PCR扩增包括以下步骤：
步骤1：制备实时荧光定量PCR反应液：包括1μL～25μL的PCR预混合液，0μL～10μL的双蒸水补齐总体积用水至10μL，0μL～2μL的机器荧光补偿及矫正剂，0.01～100μM的SAA2基因的上游引物，0.01～100μM的SAA2基因的下游引物，0.01～100μM的内参基因的上游引物，0.01～100μM的内参基因的下游引物，0.01μL～5μL的cDNA；
步骤2：采用两步法PCR扩增标准程序或三步法PCR扩增标准程序进行实时荧光定量PCR检测；
步骤3：计算SAA2基因表达量。
具体的，制备实时荧光定量PCR反应液：包括5μL的PCR预混合液，2.8μL的双蒸水补齐总体积用水至10μL，0.2μL的机器荧光补偿及矫正剂，0.5μL的SAA2基因的上游引物，0.5μL的SAA2基因的下游引物，0.5μL的内参基因的上游引物，0.5μL的内参基因的下游引物，1ng/μL的所述cDNA。
在一可选实施例中，所述两步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性30秒；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应15秒，在60℃的条件下，反应60秒，退火延伸，如此进行40个循环；
所述三步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性2分钟；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应1分钟，在55℃的条件下，反应1分钟，在72℃的条件下，反应1分钟，如此进行40个循环；最后72℃，7分钟退火延伸；
计算所述SAA2基因表达量的方法为：计算ΔCT或2-ΔΔCT来计算目的基因的表达量；其中ΔCT＝(CT(SAA2)-CT(GAPDH))，-ΔΔCT＝-(ΔCT(处理标本CT(SAA2)-CT(GAPDH))-健康对照组平均ΔCT)；健康对照组平均ΔCT＝∑每个对照组ΔCT(CT(SAA2)-CT(GAPDH))/对照组样本数。采用ΔCT法或2-ΔΔCt法的相对定量法，选择了表达量相对恒定的内参基因，用内参基因的数量进行标准化，通过测定样品目的基因与内参基因的Ct值差异计算目的基因表达量，方法简便快速，检测精度高，可降低检测成本，节约检测时间。结果便于判读等优点。大大提升了实验效率。
具体的针对同一受试者SAA2与内参基因的表达量差异，内参基因为体内表达较稳定的基因，通常不会随疾病等变化，因此与内参基因比较能够反映目标基因与内参基因的相对丰度，则可采用ΔCT法。针对不同受试者SAA2与内参基因的表达量差异则可采用2-ΔΔCt法。
一种上述检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法在制备用于检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的试剂盒中的应用。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法及应用，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1：
样本的收集与处理：
某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s,旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。
一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：
步骤一：从鼻腔脱落细胞中提取RNA：
步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于300μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，取滤液，向所述滤中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入500μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入600μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；
步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为2.0，得到RNA；
步骤二：逆转录制备cDNA，包括以下步骤：取2μL的所述逆转录混合液，0～8μL的所述去RNA水解酶蒸馏水(根据RNA量用水补齐至8μL)，以及总量不超过500ng或体积不超过8μL的总RNA，所述去RNA水解酶蒸馏水补齐至10μL；轻柔混匀后进行逆转录反应,条件如下:在37℃的条件下，进行15分钟的反转录反应；在85℃的条件下，进行5秒的反转录酶的失活反应；产物4℃放置。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增检测，包括以下步骤：
步骤1：制备实时荧光定量PCR反应液：包括1μL的PCR预混合液，0-10μL的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μL)，0.2μL的机器荧光补偿及矫正剂，1μM的SAA2基因的上游引物，1μM的SAA2基因的下游引物，1μM的内参基因的上游引物，1μM的内参基因的下游引物，0.01μL的所述cDNA，1μg的阳性对照，1μg的阴性对照，阳性对照是含有SAA2的质粒，阴性对照是空质粒(质粒载体)；
步骤2：采用两步法PCR扩增标准程序：所述两步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性30秒；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应15秒，在60℃的条件下，反应60秒，退火延伸，如此进行40个循环。
步骤四：计算所述SAA2基因表达量：
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线,读取SAA2及GAPDH的Ct值，选用△Ct分析法(SAA2的Ct值减GAPDH的Ct值)进行分析，采用GAPDH作为内参基因；阳性对照Ct值<20且阴性对照Ct值>38视为实验有效，否则实验无效；
本实施例采用ΔCT方法比较SAA2与内参基因的表达量差异：得SAA2的平均CT值为22.1，GAPDH的平均CT值为18.9，ΔCT值为3.2。
实施例2：
样本的收集与处理：
某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s,旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。
一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：
步骤一：从鼻腔脱落细胞中提取RNA：
步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于100μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，于12000转/min的条件下离心60s，取滤液，向所述滤中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；
步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为2.0，得到RNA；
步骤二：逆转录制备cDNA，包括以下步骤：取1μL的所述逆转录混合液，0～10μL的所述去RNA水解酶蒸馏水，以及总量不超过500ng或体积不超过8μL的总RNA，所述去RNA水解酶蒸馏水补齐至10μL；轻柔混匀后进行逆转录反应,条件如下:在37℃的条件下，进行15分钟的反转录反应；在85℃的条件下，进行5秒的反转录酶的失活反应；产物4℃放置。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增检测，包括以下步骤：
步骤1：制备实时荧光定量PCR反应液：包括25μL的PCR预混合液，0～10μL的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μL)，0～2μL的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，0.01μM的SAA2基因的上游引物，0.01μM的SAA2基因的下游引物，0.01μM的内参基因的上游引物，0.01μM的内参基因的下游引物，5μL的cDNA，1μg阳性对照，1μg阴性对照，阳性对照是含有SAA2的质粒，阴性对照是空质粒(质粒载体)；
步骤2：采用两步法PCR扩增标准程序：所述两步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性30秒；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应15秒，在60℃的条件下，反应60秒，退火延伸，如此进行40个循环。
步骤四：计算所述SAA2基因表达量：
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线,读取SAA2及GAPDH的Ct值，选用△Ct分析法(SAA2的Ct值减GAPDH的Ct值)进行分析，采用GAPDH作为内参基因；阳性对照Ct值<20且阴性对照Ct值>38视为实验有效，否则实验无效；
采用ΔCT方法比较SAA2与内参基因的表达量差异：得SAA2的平均CT值为25.5，GAPDH的平均CT值为18.9，ΔCT值为6.6。
实施例3：
样本的收集与处理：
某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s,旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。
一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：
步骤一：从鼻腔脱落细胞中提取RNA：
步骤1：取基因组DNA吸附柱置于2mL收集管内，将所述鼻腔脱落细胞溶解于2000μL细胞裂解液中后加入至基因组DNA吸附柱中，于12000转/min的条件下离心60s，取滤液，向所述滤中加入等体积的70％乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，12000转/分钟，离心1min，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于2mL收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入700μL的第一缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入800μL第二缓冲液，12000转/分钟，离心30s，除去第二滤液；
步骤3：将步骤2中除去第二滤液的RNA纯化柱安置于1.5mL无RNA水解酶收集管，向RNA纯化柱加入50μL的去RNA水解酶的蒸馏水或0.1％焦碳酸二乙酯处理水，室温静置5分钟，12000转/分钟，离心2min，洗脱RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA溶液的OD260/OD280比值为2.0，得到RNA；
步骤二：逆转录制备cDNA，包括以下步骤：取3μL的所述逆转录混合液，0～8μL去RNA酶及去DNA酶的水(根据RNA量用水补齐至8μL)，以及总量不超过500ng或体积不超过8μL的总RNA，所述去RNA水解酶蒸馏水补齐至10μL；轻柔混匀后进行逆转录反应,条件如下:在37℃的条件下，进行15分钟的反转录反应；在85℃的条件下，进行5秒的反转录酶的失活反应；产物4℃放置。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增检测，包括以下步骤：
步骤1：制备实时荧光定量PCR反应液：包括5μL预混合液(含有PCR所需要的酶和缓冲液)、0-10μL的双蒸水(根据总体积用水补齐至10μL)，0～2μL的染料(用于进行机器的荧光补偿及矫正)，1μM的SAA2基因的上游引物，1μM的SAA2基因的下游引物，1μM的内参基因的上游引物，1μM的内参基因的下游引物，2μL的cDNA，1μg阳性对照，1μg阴性对照；
步骤2：采用两步法PCR扩增标准程序：所述两步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性30秒；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应15秒，在60℃的条件下，反应60秒，退火延伸，如此进行40个循环。
步骤四：计算所述SAA2基因表达量：
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线,读取SAA2及GAPDH的Ct值，选用△Ct分析法(SAA2的Ct值减GAPDH的Ct值)进行分析，采用GAPDH作为内参基因；阳性对照Ct值<20且阴性对照Ct值>38视为实验有效，否则实验无效；
采用ΔCT方法比较SAA2与内参基因的表达量差异：得SAA2的平均CT值为25.0，GAPDH的平均CT值为17.9，ΔCT值为7.1。
本发明上述实施例1～3中，优选的所用的第一缓冲液RWA buffer的生产厂家为Takara公司，货号9767；第二缓冲液RWB buffer的生产厂家为Takara公司，货号9767。但本申请保护范围并局限于上述的第一缓冲液和第二缓冲液。本领域技术人员可根据实际应用需要进行选择。
实施例4：
样本的收集与处理：
78例受试者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3-4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于后续所述裂解液中，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。
一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：
步骤一：从鼻腔脱落细胞中提取RNA：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置5min；加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，于4℃，12000r/min离心15min；取上清液200μL，加入200μL异丙醇，混匀后静置10min，于4℃，12000r/min离心15min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度75％的乙醇，于4℃，7500r/min离心15min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于4℃，7500r/min离心2min，除去上清液，静置15min后继续向所述离心管中加入50μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.8，得到RNA；
步骤二：逆转录制备cDNA步骤同实施例一。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增检测步骤同实施例一。
步骤四：计算所述SAA2基因表达量：
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线,读取SAA2及GAPDH的Ct值，选用△Ct分析法(SAA2的Ct值减GAPDH的Ct值)进行分析，采用GAPDH作为内参基因；阳性对照Ct值<20且阴性对照Ct值>38视为实验有效，否则实验无效；
步骤1：计算健康对照组平均ΔCT：本例中受试者1～10为健康对照组，计算方法如下：平均ΔCT(CT(SAA2)-CT(GAPDH))＝(4.136+4.989+5.246+4.517+4.578+3.457+3.614+4.526+5.102+4.56)/10＝4.4725；
步骤2：计算受试者相对表达量：
以4.4725为基准，求出每个受试者相对表达量(表示本基因在受试者中相对健康对照组平均值的表达高低，数值代表变化倍数，例如1.5相当于该受试者的表达量是健康对照组平均值的1.5倍)，计算结果如表1所示。计算公式为2-ΔΔCT，-ΔΔCT＝-(ΔCT(受试者CT(SAA2)-CT(GAPDH))-平均ΔCT(健康对照组平均ΔCT))。
表1实施例2提供的方法的SAA2基因表达量计算结果
实施例5：
样本的收集与处理：
获取细胞前嘱患者用生理盐水冲洗鼻腔，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s,旋转3-4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于裂解液中，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。
一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：
步骤一：从鼻腔脱落细胞中提取RNA步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置7min；加入10mL氯仿，震荡混匀，室温静置7min，于5℃，14000r/min离心20min；取上清液20mL，加入20mL的异丙醇，混匀后静置12min，于5℃，14000r/min离心20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入40mL的浓度90％的乙醇，于5℃，14000r/min离心3min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于5℃，14000r/min离心3min，除去上清液，静置20min后继续向所述离心管中加入5mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为2.1，得到RNA；
步骤二：逆转录制备cDNA步骤同实施例一。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增检测步骤中的制备实时荧光定量PCR反应液同实施例一，针对PCR扩增标准程序采用三步法，所述三步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性2分钟；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应1分钟，在55℃的条件下，反应1分钟，在72℃的条件下，反应1分钟，如此进行40个循环；最后72℃，7分钟退火延伸。
步骤四：计算所述SAA2基因表达量：
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线,读取SAA2及GAPDH的Ct值，选用△Ct分析法(SAA2的Ct值减GAPDH的Ct值)进行分析，采用GAPDH作为内参基因；阳性对照Ct值<20且阴性对照Ct值>38视为实验有效，否则实验无效；
阳性对照孔平均Ct：17.2；阴性对照孔平均Ct：39.7；样品SAA2平均Ct：18.9；样品GAPDH平均Ct：16.4；差异值：18.9-16.4为2.5。表示该患者SAA2表达为GAPDH的0.18倍(1/22.5)。
实施例6：
样本的收集与处理：
获取细胞前嘱患者用生理盐水冲洗鼻腔，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s,旋转3-4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于裂解液中，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。
一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，包括以下步骤：
步骤一：从鼻腔脱落细胞中提取RNA步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置7min；加入0.03mL氯仿，震荡混匀，室温静置7min，于5℃，14000r/min离心20min；取上清液20mL，加入0.015mL的异丙醇，混匀后静置12min，于5℃，14000r/min离心20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入0.0075mL的浓度90％的乙醇，于5℃，14000r/min离心3min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于5℃，14000r/min离心3min，除去上清液，静置20min后继续向所述离心管中加入0.01mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为2.1，得到RNA；
步骤二：逆转录制备cDNA步骤同实施例一。
步骤三：实时荧光定量PCR扩增检测步骤中的制备实时荧光定量PCR反应液同实施例一，针对PCR扩增标准程序采用三步法，所述三步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性2分钟；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应1分钟，在55℃的条件下，反应1分钟，在72℃的条件下，反应1分钟，如此进行40个循环；最后72℃，7分钟退火延伸。
步骤四：计算所述SAA2基因表达量：
反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线,读取SAA2及GAPDH的Ct值，选用△Ct分析法(SAA2的Ct值减GAPDH的Ct值)进行分析，采用GAPDH作为内参基因；阳性对照Ct值<20且阴性对照Ct值>38视为实验有效，否则实验无效；
阳性对照孔平均Ct：16.7；阴性对照孔平均Ct：38.7；样品SAA2平均Ct：19.8；样品GAPDH平均Ct：16.4；差异值：19.8-16.4为3.4。表示该患者SAA2表达为GAPDH的0.09倍(1/23.4)。
序列表
<110> 张罗
王成硕
闫冰
北京市耳鼻咽喉科研究所
首都医科大学附属北京同仁医院
<120> 检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法及应用
<130> CC18K10090CCN
<141> 2018-07-03
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2053
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<213> human
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aggctcacta taaatagcag ccacctctcc ctggcagaca gggacccgca gctcagctac 60
agcacagatc agcaccatga agcttctcac gggcctggtt ttctgctcct tggtcctgag 120
tgtcagcagc cgaagcttct tttcgttcct tggcgaggct tttgatgggg ctcgggacat 180
gtggagagcc tactctgaca tgagagaagc caattacatc ggctcagaca aatacttcca 240
tgctcggggg aactatgatg ctgccaaaag gggacctggg ggtgcctggg ctgcagaagt 300
gatcagttta ttttcagctg aactgtagag agtgaaggaa gaagcctttt ttcttcactc 360
ctacatgacc caggcattga tccaggcaat gaagattcag tgtaaataac caccactaac 420
aagaccatgg cctttggaac ctgtgctaag aggcatggat gagctccctc agcatgtgga 480
tggagactga agagaggtct gaaggctcag tgtggtgtct ccattctcta agaagtttgg 540
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<212> DNA
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<400> 6
cccaatacga ccaaatccgt t 21
Claims (11)
1.一种检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：包括以下步骤：从鼻腔脱落细胞中提取RNA，将总RNA逆转录为cDNA，采用定量聚合酶链反应将cDNA中的SAA2基因和内参基因分别采用SAA2基因的特异性引物和内参基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，基于扩增产物的检测结果计算SAA2基因表达量。
2.根据权利要求1所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：SAA2基因的上游引物如SEQ ID NO:3所示，SAA2基因的下游引物如SEQ ID NO:4所示；
所述内参基因为GAPDH，所述内参基因的上游引物如SEQ ID NO:5所示，所述下游引物如SEQ ID NO:6所示。
3.根据权利要求1所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：所述鼻腔脱落细胞采用毛刷于鼻息肉表面获取，且将获取鼻腔脱落细胞后的毛刷置于细胞裂解液中于4℃以下保存。
4.根据权利要求1所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括以下步骤：
步骤1：将所述鼻腔脱落细胞溶解于100～2000μL细胞裂解液中，并加入等体积的乙醇，混合均匀后加入至RNA纯化柱中，离心处理后，除去滤液，将所述RNA纯化柱置于收集管中；
步骤2：向步骤1中获取的所述RNA纯化柱中加入300μL～700μL的第一缓冲液，离心处理后，除去第一滤液；继续向所述RNA纯化柱加入400μL～800μL第二缓冲液，离心处理后，除去第二滤液，取RNA纯化柱经洗脱得到RNA。
5.根据权利要求4所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：向除去所述第二滤液后的RNA纯化柱中添加10～100μLDNA酶反应液，经静置处理后，加入300μL～700μL所述第二缓冲液，离心处理后，除去第三滤液，取RNA纯化柱经洗脱后采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA；
所述DNA酶反应液的制备方法包括以下步骤：取DNA酶缓冲液、重组DNA酶，去RNA酶的双蒸水经混合得到DNA酶反应液。
6.根据权利要求4所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：所述步骤1中，所述鼻腔脱落细胞溶解于细胞裂解液中后先加入至基因组DNA吸附柱中取滤液，再向所述滤液中加入等体积的乙醇。
7.根据权利要求4～6任一项所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，还包括以下步骤：取待洗脱的RNA纯化柱加入去RNA水解酶的蒸馏水或焦碳酸二乙酯处理水，室温静置后，经离心处理、洗脱所述RNA纯化柱，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。
8.根据权利要求1所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：从鼻腔脱落细胞中提取RNA的方法，包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1mL～20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后加入所述RNA抽提液体积的0.1～0.5倍的氯仿，震荡混匀，室温静置，将所述离心管离心，取上清液，加入所述氯仿体积的0.5～3倍的异丙醇，混匀后静置、离心，弃上清，保留第一沉淀，向所述第一沉淀中加入所述异丙醇体积的0.5～5倍的浓度65％～90％的乙醇，经洗涤后混匀、离心，弃上清，保留第二沉淀；盖紧离心管，再次离心，除去上清液，继续向所述离心管中加入0.01～5mL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA；
所述RNA抽提液为Trizol、RNAiso Blood、RNAiso Plus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中的任一种或几种的试剂。
9.根据权利要求1所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：
将总RNA逆转录为cDNA的方法包括以下步骤：取1～3μL的逆转录混合液、0～10μL的去RNA水解酶蒸馏水和提取的RNA于37℃温度条件下发生反转录反应15min，后于84℃温度条件下发生反转录酶的失活反应，得到逆转录产物cDNA；
所述实时荧光定量PCR扩增包括以下步骤：
步骤1：制备实时荧光定量PCR反应液：包括1μL～25μL的PCR预混合液，0μL～10μL的双蒸水补齐总体积用水至10μL，0μL～2μL的机器荧光补偿及矫正剂，0.01～100μM的SAA2基因的上游引物，0.01～100μM的SAA2基因的下游引物，0.01～100μM的内参基因的上游引物，0.01～100μM的内参基因的下游引物，0.01μL～5μL的cDNA；
步骤2：采用两步法PCR扩增标准程序或三步法PCR扩增标准程序进行实时荧光定量PCR检测；
步骤3：计算SAA2基因表达量。
10.根据权利要求9所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法，其特征在于：所述两步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性30秒；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应15秒，在60℃的条件下，反应60秒，退火延伸，如此进行40个循环；
所述三步法PCR扩增标准程序的反应条件包括以下步骤：第1阶段：在95℃的条件下预变性2分钟；第2阶段PCR反应：在95℃的条件下，反应1分钟，在55℃的条件下，反应1分钟，在72℃的条件下，反应1分钟，如此进行40个循环；最后72℃，7分钟退火延伸；
计算所述SAA2基因表达量的方法为：计算ΔCT或2-ΔΔCT来计算目的基因的表达量；其中ΔCT＝(CT(SAA2)-CT(GAPDH))，-ΔΔCT＝-(ΔCT(处理标本CT(SAA2)-CT(GAPDH))-健康对照组平均ΔCT)；健康对照组平均ΔCT＝∑每个对照组ΔCT(CT(SAA2)-CT(GAPDH))/对照组样本数。
11.一种权利要求1～10任一项所述的检测鼻腔脱落细胞中SAA2基因表达量的方法在制备用于检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的试剂盒中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115094076A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-23 | 斯贝福（北京）生物技术有限公司 | 一种用于体外检测致突变因子的报告质粒、细胞模型及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104781415A (zh) * | 2012-06-28 | 2015-07-15 | 卡尔德拉健康有限责任公司 | 用于诊断前列腺癌的靶向RNA-Seq的方法和材料 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN115094076A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-23 | 斯贝福（北京）生物技术有限公司 | 一种用于体外检测致突变因子的报告质粒、细胞模型及其应用 |
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