CN115094076A - 一种用于体外检测致突变因子的报告质粒、细胞模型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物学领域，公开了一种用于体外检测致突变因子的报告质粒、细胞模型及其应用。所述荧光报告质粒包括至少一个荧光报告基因及其启动子，每个所述荧光报告基因的启动子后插入有微卫星重复片段，所述微卫星重复片段使所述荧光报告基因的密码子发生框移而不产生发光形式的信号。将所述荧光报告质粒转染至宿主细胞即可构成细胞模型。该荧光报告质粒和细胞模型可通过所述微卫星重复片段的回复性突变用以检测致突变因子。本申请检测系统对于致突变因子的检测具有广谱性、灵敏度、准确性高的特点。

Description

一种用于体外检测致突变因子的报告质粒、细胞模型及其 应用
技术领域
本申请属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于体外检测致 突变因子的报告质粒、细胞模型及其应用。
背景技术
基因突变可以导致癌症发生这一理论已被人们普遍接受。随着生 物医学的发展，以分析致突变物遗传学终点为目标的一些分子生物学 技术已不断向毒理学致突变及基因损伤研究领域深入，经过对危害物 的致突变性和遗传毒性，以及长期低剂量接触潜在危害物的作用研究 分析后，人们发现除了癌症以外，几乎所有人类重大疾病都与基因突 变有关，如高血压、血管畸形、糖尿病、帕金森、老年痴呆、肾病、 肺纤维化、白内障、先天性耳聋、多种血液病和代谢病等。但是引起 基因突变的致突变因子多种多样，有物理的(各种射线)、化学的(多 种化合物)、生物的(多种病毒和细菌毒素)以及遗传因素等，因此， 致突变因子的检测技术就显得非常重要。现有技术对致突变因子的检 测手段主要包括Ames试验、转基因小鼠突变测试系统和哺乳动物细 胞正向突变试验。
Ames试验是最常用的原核生物化合物药物致突变体外检测方法， 原理是鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株在含组氨酸的培养 基中难以生长，当致突变物诱导基因发生回复突变后，回复突变子数 目会明显增加，若回复子数高出空白对照两倍及以上，就可认为该待 测物为强诱变剂，据此可对不含组氨酸样品的体外致突变性作出评价。 转基因小鼠突变测试系统是在体内检测基因突变的方法，利用穿梭载 体于原核和真核之间往返转移，带可回收靶基因载体的转基因小鼠提 供哺乳动物体内基因突变的检测，可以测定自发和诱发突变率，分析 基因突变的组织专一性和顺序变化。哺乳动物细胞正向突变试验是用 来观察特定基因座位是否诱导产生突变的方法，常用的基因座是次黄 嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)和胸苷激酶(TK)，在加入和不加入 代谢活化系统的条件下，将细胞暴露于受试化合物或药物一定时间， 然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6-硫代鸟嘌呤或三氟胸苷的 选择性培养液中能继续分裂并形成克隆集落，而正常细胞在含有这些 碱基类似物的培养基中不能生长，基于突变集落数，计算突变频率以 评价受试化合物或药物的致突变性。
然而上述方法均存在各种缺陷，比如Ames试验不适合检测含有 组氨酸成分的样品，可能会出现假阳性结果，而且鼠伤寒沙门氏菌的 遗传信息仅相当哺乳动物的1/6，数量较少，结构亦较简单，显而易 见，在评价化合物及药物的工作中，其结果外推到人时有较大风险， 准确性难以保证。转基因小鼠突变测试系统在动物体内检测存在成本 高、耗时长、动物个体差异大等问题；更重要的是，其在动物保护及 动物福利方面面临着巨大的挑战和质疑。哺乳动物细胞正向突变试验 中能检测到突变的条件是靶基因HPRT或TK基因外显自发生移码突 变或碱基替换突变，导致其蛋白功能发生改变，然而哺乳动物基因组 经过成百万年的进化，其编码序列往往是非常保守的，不易发生突变， 而一些易突变的非保守序列如微卫星序列的突变也可导致严重后果， 但是却不能被检测到，导致突变检测的灵敏度往往不高，出现假阴性 结果；而且实验过程中细胞的堆叠生长、死细胞的干扰及观察活细胞 时不能染色等问题，都会导致细胞克隆不好辨认，这就要求实验人员 必须具有相当成熟的经验，且有足够的耐心，观察结果也直接影响着 对化合物及药物致突变能力的判定，不同人对细胞生长情况的判定很 难统一标准，这也会导致结果出现偏倚，存在结果可靠性不强的缺陷； 另外，实验过程中往往需要加入选择剂对突变细胞进行筛选培养，一 般在10天左右才能对克隆形成情况进行统计，为了更准确的观察克 隆情况，有时候需要对细胞进行固定染色，过程繁琐耗时。
因此，研究开发出快捷简便的高敏感性基因突变检测方法和体系 将有助于新药研究的安全性评价和环境因素的安全性评估，有利于保 障可持续发展，具有重要的研究价值和现实意义。
发明内容
针对现有检测致突变物方法存在的检测过程繁琐耗时长，以及准 确度差和灵敏度低的缺陷，本申请的目的在于提供一种体外基于荧光 报告质粒的检测系统和应用，该系统对于致突变因子的检测具有广谱 性、灵敏度、准确性高的特点。
为了实现本申请的发明目的，本申请具体通过以下技术方案实现：
作为本申请的第一个实施方案，提供了一种用于体外检测致突变 因子的荧光报告质粒，所述荧光报告质粒的编码基因包含至少一段由 荧光报告基因和控制所述荧光报告基因表达的启动子以及长度为非3 倍数的微卫星重复片段构成的DNA序列，所述启动子位于所述荧光 报告基因的起始密码子的上游，所述微卫星重复片段插入在所述荧光 报告基因的起始密码子和第一个氨基酸密码子之间，所述微卫星重复 片段使所述荧光报告基因的密码子发生框移而不能表达，所述微卫星 重复片段在所述致突变因子的诱导作用下能产生突变而使所述荧光 报告质粒正常表达所述荧光报告基因。
如图1所示，该方案通过将能使所述荧光报告基因的密码子发生 框移突变的所述微卫星重复片段插入于所述荧光报告基因的起始密 码子之后，由于所述微卫星重复片段使所述荧光报告基因的密码子发 生框移，信使RNA的密码子也随之变化，致使无法表达所述荧光报 告基因，从而实现对荧光报告基因的沉默。而在致突变因子的检测中， 所述荧光报告质粒在致突变因子的诱导作用下，当所述微卫星重复片 段发生突变序列长度的变化，所述荧光报告基因序列又重新恢复为正 常密码子序列，开始转录翻译所荧光报告基因，产生发光形式的信号， 根据是否产生发光形式的信号判断致突变因子的突变作用。
其中，由于核苷酸在转录翻译过程中，每三个碱基形成一个密码 子，对应一种氨基酸，当所述微卫星重复片段为长度非3倍数时，会 致使所述荧光报告基因的密码子在翻译过程中发生框移，从而影响荧 光蛋白无法编码合成，得到的所述荧光报告质粒而不产生发光信号。 所述荧光报告基因是指可以编码合成任何以发光形式测定的信号的 序列，比如红色荧光蛋白(mCherry)、蓝色荧光蛋白(BFP)或绿 色荧光蛋白(GFP)的编码基因。
在具体的方案中，当所述荧光报告基因为一个时，即所述荧光报 告基因单独为红色荧光蛋白(mCherry)、蓝色荧光蛋白(BFP)或 绿色荧光蛋白(GFP)时，在荧光蛋白编码基因的起始密码子后插入 一个所述微卫星重复片段致使该荧光蛋白无法表达；当所述荧光报告 基因为多个，即所述荧光报告基因选自红色荧光蛋白(mCherry)、 蓝色荧光蛋白(BFP)或绿色荧光蛋白(GFP)中两个以上时，在每 个荧光蛋白编码基因的起始密码子后均插入一个所述微卫星重复片 段致使两个荧光蛋白均无法表达。
所述微卫星重复片段选自单核苷酸微卫星序列或二核苷酸微卫 星序列。
微卫星亦称简单串联重复序列(STR)，是由1～6个碱基(bp) 单元组成的短串联重复序列，重复次数从几次到数十次。微卫星在原 核生物和真核生物基因组分布广泛，在基因组的诸多位置上都有微卫 星的存在，且可以对基因功能产生影响。由于具有多次串联重复的序 列特征，微卫星非常容易受到各种因素影响而发生插入或者缺失突变， 即微卫星不稳定性。在该方案中所述微卫星重复片段利用微卫星序列 在诱导剂的存在下极易发生突变的特性，可以提高所述荧光报告质粒 回复突变率，具有较好的敏感和广谱特性。
在具体的方案中，所述单核苷酸微卫星序列可以是Cn、An、Tn、 Gn。所述二核苷酸微卫星序列可以是单一型，比如(AT)n、(CA)n、(CG)n、 (AG)n、(CT)n、(GT)n，其中n为非3倍数的自然数。
当所述荧光报告基因为一个，即所述荧光报告基因单独为红色荧 光蛋白(mCherry)、蓝色荧光蛋白(BFP)或绿色荧光蛋白(GFP) 时，致使荧光蛋白产生框移突变的所述微卫星重复片段可以是单核苷 酸微卫星序列或二核苷酸微卫星序列，比如Cn-mCherry、An-BFP、T n-GFP、Gn-mCherry等；和(AT)n-mCherry、(CA)n-BFP、(CG)n-GFP、 (CA)m-mCherry、(CT)n-BFP等。其中n为非3倍数的自然数。
当所述荧光报告基因为两个，则致使荧光蛋白产生框移突变的所 述微卫星重复片段可以是单核苷酸微卫星序列或二核苷酸微卫星序 列，比如Cn-mCherry-Cn-BFP、An-mCherry-An-BFP、An-mCherry-Cn- BFP、Cn-mCherry-An-BFP、An-mCherry-(CA)n-BFP、An-mCherry-(AT) n-BFP、Cn-mCherry-(AT)n-BFP、Cn-mCherry-(CA)n-BFP、An-mCherry -(CA)n-BFP、(AT)n-mCherry-(CA)n-BFP、(CA)n-mCherry-(CA)n-BFP、 An-mCherry-Nn-BFP、Cn-mCherry-Nn-BFP、(CA)n-mCherry-Nn-BFP等， 其中n为非3倍数的自然数。当所述荧光报告基因为两个以上时，同 理则致使荧光蛋白产生框移突变的所述微卫星重复片段可以是单核苷酸微卫星序列或二核苷酸微卫星序列，每个所述荧光报告基因对应 的所述所述微卫星重复片段可以相同或不同。
优选的，所述单核苷酸微卫星序列用以修饰编码红色荧光蛋白的 所述荧光报告基因，所述二核苷酸微卫星序列用以修饰编码蓝色荧光 蛋白的所述荧光报告基因。
在具体的方案中，当所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白或蓝色 荧光蛋白时，所述荧光报告质粒中的荧光元件可以是Cn-mCherry、T n-mCherry、(CA)n-BFP、(CT)n-BFP、Cn-mCherry-(CA)n-BFP、Cn-mC herry-(CT)n-BFP、Tn-mCherry-(CT)n-BFP、Tn-mCherry-(CA)n-BFP、C n-mCherry-Cn-GFP、Cn-mCherry-(CA)n-GFP、(CA)n-BFP-Cn-GFP、(C A)n-BFP-(CA)n-GFP、Cn-mCherry-(CA)n-BFP-Cn-GFP、Cn-mCherry-(C A)n-BFP-(CA)n-GFP等，其中n为非3倍数的自然数。
更有选的，所述单核苷酸微卫星序列为C13，所述二核苷酸微卫 星序列为(CA)13。
在具体的方案中，所述荧光报告质粒中的荧光元件可以是C13-m Cherry、(CA)13-BFP、C13-mCherry-(CA)13-BFP、T13-mCherry-(CT)13- BFP、T13-mCherry-(CA)13-BFP、C13-mCherry-C13-GFP、C13-mCherry- (CA)13-GFP、(CA)13-BFP-C13-GFP、(CA)13-BFP-(CA)13-GFP、C13-mC herry-(CA)13-BFP-C13-GFP、C13-mCherry-(CA)13-BFP-(CA)13-GFP等。
在本实施方案中，当所述荧光报告质粒的编码基因包含两段所述 DNA序列时，该两段所述DNA序列中的所述荧光报告基因分别编码 不同发光颜色的荧光蛋白。通过设置两个所述荧光报告基因，并在所 述荧光报告基因元件中插入所述微卫星重复片段，一方面两段所述荧 光报告基因构成两个发光元件可以增强荧光强度，并互相作为参考， 另一方面两段所述微卫星重复片段也可以互相补充不稳定态，利用微 卫星序列极易突变的不稳定性，通过单核苷选序列和二核苷酸微卫星 序列的互补配合，弥补了单核苷选序列和二核苷酸微卫星序列多态性 的多样性，拓宽了致突变的检测范围，同时对于致突变因子具备较强的敏感性，可以最大程度避免假阴性的检测结果，有助于提高检测的 准确性。
在具体的方案中，两个所述荧光报告基因编码的荧光蛋白可以是mCherry-BFP、mCherry-GFP、BFP-GFP、BFP-mCherry、GFP-mChe rry、GFP-BFP等。
所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白(mCherry)或蓝色荧光蛋 白(BFP)。可以理解的是，其中各组合中的荧光蛋白的编码基因不 存在上下游的位置限制，具体的，当所述荧光报告质粒包含两段所述 荧光报告基因时，两个所述荧光报告基因编码的荧光蛋白可以是 mCherry-BFP或BFP-mCherry。
两段所述DNA序列中处于上游的所述荧光报告基因编码红色荧 光蛋白，处于下游的所述荧光报告基因编码蓝色荧光蛋白。即两个荧 光蛋白组合为mCherry-BFP。
所述所述微卫星重复片段为单核苷酸微卫星序列或二核苷酸微 卫星序列。
在具体的方案中，所述单核苷酸微卫星序列可以是Cn、An、Tn、 Gn。所述二核苷酸微卫星序列可以是单一型，比如(AT)n、(CA)n、(C G)n、(AG)n、(CT)n、(GT)n。则所述荧光报告质粒中的荧光元件可以 是Cn-mCherry-Cn-BFP、Cn-mCherry-(CA)n-BFP、Cn-mCherry-Tn-BFP、(CA)n-mCherry-Cn-BFP、(CA)n-mCherry-Tn-BFP、Cn-mCherry-(CT)n-B FP、Tn-mCherry-(CT)n-BFP、(CT)n-mCherry-Tn-BFP等，其中n为非 3倍数的自然数。
优选的，所述单核苷酸微卫星序列用以修饰编码红色荧光蛋白的 所述荧光报告基因，所述二核苷酸微卫星序列用以修饰编码蓝色荧光 蛋白的所述荧光报告基因。
在具体的方案中，所述荧光报告质粒中的荧光元件可以是Cn-mC herry-(CA)n-BFP、Cn-mCherry-(CT)n-BFP、Tn-mCherry-(CT)n-BFP、T n-mCherry-(CA)n-BFP等，其中n为非3倍数的自然数。
更优选的，所述单核苷酸微卫星序列为C13，所述二核苷酸微卫 星序列为(CA)13。在具体的方案中，所述荧光报告质粒中的荧光元件 可以为C13-mCherry-(CA)13-BFP。
作为本申请的第二个实施方案，提供了一种用于体外检测致突变 因子的细胞模型，所述细胞模型包含上述所述荧光报告质粒。
在本实施方案中，所述细胞模型构建的转染方法可以采用化学转 染、生物转染和物理转染等，化学转染可以是阳离子脂质体、磷酸钙 共沉淀、葡聚糖或其它阳离子聚合物，生物转染即病毒转染，物理转 染可以是电转、离子轰击、显微注射和激光介导转染等。
优选的，本实施方案中采用生物转染法，利用的病毒细胞可以是 腺病毒、逆转录病毒或慢病毒，通过基因克隆方法获得重组病毒表达 所述荧光报告质粒，转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒， 荧光显微镜观察转染得到的重组病毒颗粒的发光强度。
最优选的，本实施方案中采用慢病毒对所述荧光报告质粒进行转 染包装。该方法可将所述荧光报告质粒插入细胞基因组，稳定表达， 持续时间长。
在本实施方案中，所述细胞模型的宿主细胞缺失错配修复基因 (MMR)，所述错配修复基因可以是MLH1、MSH2、MSH3、MSH4、 MSH5或MSH6。
优选的，所述慢病毒细胞为缺失基因MLH1的HCT116细胞系。 基因MLH1的缺失直接导致启动DNA错配修复的能力降低，所述细 胞模型中的所述荧光报告质粒更易发生不稳定性。
作为本申请的第三个实施方案，提供了一种用于体外检测致突变 因子的方法，包括：将所述细胞模型与待测致突变因子充分接触培养， 移除待测致突变因子，测定所述细胞模型的突变率。
作为本申请的第四个实施方案，提供了所述荧光报告质粒、所述 细胞模型在体外检测致突变因子中的应用。
所述致突变因子可以是物理因子、化学因子、生物因子以及遗传 因素等。优选的，所述致突变因子为药用化合物及辅料、食品、烟气、 射线、包装或设备材料、水体等。
本申请的有益效果为：
本申请提供了一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，该 荧光报告质粒通过回复性突变产生发光信号即可实现对致突变因子 的检测，具有操作简单、检测快速的特点。
另外本申请采用微卫星序列作为回复性突变的元件，微卫星序列 极易突变的特性使得本申请荧光报告质粒具有强敏感性，且本申请荧 光报告质粒中的单核苷酸微卫星序列在回复性突变中起主导作用，单 核苷酸微卫星序列相比二核苷酸微卫星序列及随机序列具有更不稳 定，对致突变因子的检测范围具有广泛的适用性，极大程度降低检出 限，使得本申请荧光报告质粒对于致突变因子的检测具有较好的准确 性和稳定性。
附图说明
图1是本申请荧光报告致突变检测原理图；
图2是本申请实验流程图；
图3是本申请实施例Lenti-MCS-Ubi-EGFP-IRES-Puromycin质粒 图谱；
图4是本申请实施例HCT116细胞系和SW480细胞系中的MLH1 表达；
图5是本申请实施例微卫星三荧光报告质粒致突变检测稳转细 胞发光情况；
图6是本申请实施例H2O2致HCT116细胞系和SW480细胞系的 细胞毒性试验；其中，A为使用不同浓度H2O2处理HCT116细胞系， 纵坐标为450nm波长处的吸光度；B为使用不同浓度H2O2处理 SW480细胞系，纵坐标为450nm波长处的吸光度；****p<0.0001；
图7是本申请实施例三荧光报告质粒H2O2致突变检测；其中， A为0.5mM与1mM H2O2与空白对照相比对HCT116致突变检测细 胞系微卫星组和阴性对照组致突变敏感性的差异，纵坐标为突变率， 横坐标为不同浓度H2O2处理组，0mM为空白对照组，PE为红色荧 光细胞数，BV为蓝色荧光细胞数；B为0.5mM与1mM H2O2两浓度 之间对HCT116致突变检测细胞系微卫星组和阴性对照组致突变敏 感性的差异，纵坐标为该浓度突变率减自发突变率(0mM空白对照 组突变率)；C为0.5mM与1mM H2O2与空白对照相比对SW480致 突变检测细胞系微卫星组和阴性对照组致突变敏感性的差异；D为0.5mM与1mM H2O2两浓度之间对HCT116致突变检测细胞系微卫 星组和阴性对照组致突变敏感性的差异；*p<0.05,**p<0.01,***p <0.001，****p<0.0001；
图8是本申请实施例三荧光报告系统H2O2致突变检测稳定性； 其中，A为HCT116细胞系和SW480细胞系经1mM H2O2处理后的 突变率(减自发突变)对比；B为HCT116细胞系和SW480细胞系 经1mM H2O2处理后突变率结果的稳定性研究；*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001，****p<0.0001；
图9是本申请实施例HCT116-C13-(CA)13微卫星三荧光报告细胞 系致突变检测准确性；其中，A为HCT116-C13-(CA)13细胞PBS处理 的空白对照组C13序列STR检测结果和HCT116-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处理后红色荧光的细胞C13序列STR检测结果；B为 HCT116-C13-(CA)13细胞PBS处理的空白对照组(CA)13序列STR分析 检测结果和HCT116-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处理后蓝色荧光细胞 (CA)13序列STR分析检测结果；C为HCT116-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处理后分选出红色荧光细胞与空白对照组C13序列一代测序结果 对比；D为HCT116-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处理后蓝色荧光细胞与 空白对照组(CA)13序列测序结果对比；
图10是本申请实施例SW480-C13-(CA)13微卫星三荧光报告细胞 系致突变检测准确性；其中，A为SW480-C13-(CA)13细胞H2O2溶液 未处理的空白对照组C13序列STR分析检测结果和SW480-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处理后分选出红色荧光的细胞C13序列STR分析检测 结果；B为SW480-C13-(CA)13细胞H2O2溶液未处理的空白对照组 (CA)13序列STR分析检测结果和SW480-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处 理后分选出蓝色荧光的细胞(CA)13序列STR分析检测结果；C为 SW480-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处理后分选出红色荧光细胞与空白 对照组C13序列一代测序结果对比；D为SW480-C13-(CA)13细胞H2O2溶液处理后分选出蓝色荧光细胞与空白对照组(CA)13序列一代测序 结果对比；
图11是本申请实施例H2O2处理下的TA97a菌株和 WP2uvrApKM101菌株平板掺入试验；
图12是本申请实施例H2O2处理下的1535菌株、TA98菌株和 TA100菌株平板掺入实验；
图13是本申请实施例Ames试验检测H2O2的致突变作用；其中， A-B为TA97a菌株在不同浓度H2O2处理下的检测结果，纵坐标为回 复突变菌落数，★表示阳性结果；C-D为WP2uvrApKM101菌株在不 同浓度H2O2处理下的检测结果；E-F为TA1535菌株在不同浓度H2O2处理下的检测结果；G-H为TA98菌株在不同浓度H2O2处理下的检 测结果；I-J为TA100菌株在不同浓度H2O2处理下的检测结果；
图14是本申请实施例三荧光报告系统60Coγ射线致突变检测；其 中，A为0.1Gy和0.25Gy60Coγ射线与空白对照相比对HCT116致突 变检测细胞系微卫星组和阴性对照组致突变敏感性的差异，纵坐标为 突变率，横坐标为不同剂量60Coγ射线处理组，0Gy为空白对照组， PE为红色荧光细胞数，BV为蓝色荧光细胞数；B为0.1Gy和0.25Gy 60Coγ射线两种剂量之间对HCT116致突变检测细胞系微卫星组和阴 性对照组致突变敏感性的差异，纵坐标为该浓度突变率减自发突变率 (0Gy空白对照组突变率)；
图15是本申请实施例微卫星三荧光报告细胞系60Coγ射线致突变 分析；其中，A为HCT116-C13-(CA)13细胞空白对照组与60Coγ射 线处理处理后分选出红色荧光的细胞C13序列STR分析检测结果； B为HCT116-C13-(CA)13细胞空白对照组与60Coγ射线处理后分选出蓝色荧光的细胞(CA)13序列STR分析检测结果；C为 HCT116-C13-(CA)13细胞60Coγ射线处理后分选出红色荧光细胞与 空白对照组C13序列一代测序结果对比；D为HCT116-C13-(CA)13 细胞60Coγ射线处理后分选出蓝色荧光细胞与空白对照组(CA)13序 列一代测序结果对比；
图16是本申请实施例60Coγ射线处理下的Ames平板掺入实验；
图17是本申请实施例Ames试验检测60Coγ射线的致突变作用； 其中，A为TA98菌株在不同剂量60Coγ射线处理下的检测结果，纵 坐标为回复突变菌落数，★表示阳性结果；B为TA100菌株在不同 剂量60Coγ射线处理下的检测结果；C为TA97菌株在不同剂量60Coγ射线处理下的检测结果；D为TA1535菌株在不同剂量60Coγ射线处 理下的检测结果；E为WP2uvrApKM101菌株在不同剂量60Coγ射线 处理下的检测结果；**p<0.01,***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
下面将结合本申请具体的实施例，对本申请技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在 没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请 保护的范围。
如图2所示，本申请实施例选用错配修复系统缺陷的HCT116结 直肠癌细胞系，同时选择错配修复系统完整的SW480(Human Colon Adenocarcinoma Cells)结直肠癌细胞系作为对照组，将经过单核苷酸 C13和二核苷酸(CA)13两种微卫星序列或随机序列修饰的含有不同颜 色荧光蛋白编码基因的3种质粒同时导入两种细胞系，同时在质粒中 均插入含有正常的绿色荧光蛋白编码序列，绿色荧光蛋白的正常发光 用以指示细胞是否成功转染该质粒。建立了微卫星三荧光报告致突变 检测细胞模型，根据常用的化学致突变剂H2O2导致的基因突变检测， 经测序验证建立了微卫星三荧光报告致突变检测系统，通过重复试验对检测体系进行稳定性测试。通过流式细胞术分选、PCR扩增及STR 检测技术和一代测序对检测体系进行准确性验证。使用相同H2O2处 理条件与Ames试验结果进行对比，进行微卫星三荧光报告致突变检 测系统的敏感性评价。进一步，利用建立好的微卫星三荧光报告致突变检测体系对60Coγ射线的致突变作用进行检测验证，对突变细胞进 行准确性分析，最后与Ames试验检测结果进行比对，评价其敏感性。
实施例1微卫星三荧光报告质粒的设计和制备
采用Lenti-MCS-Ubi-EGFP-IRES-Puromycin质粒(图3)设计了 用于诱变检测的微卫星三荧光报告质粒。在该质粒的多克隆位点(M CS)中插入红色荧光蛋白(mCherry)的编码序列和蓝色荧光蛋白(B FP)的编码序列以及其启动子EF1A，即得到的质粒为CMV-mcherry-EF1A-BFP-Ubi-EGFP-IRES-Puromycin。接下来将单核苷酸重复微 卫星序列C13和二核苷酸重复微卫星序列(CA)13分别插入到修饰后质 粒的红色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白起始密码子(ATG)后，得到微卫 星三荧光质粒：CMV-C13-mcherry-EF1A-(CA)13-BFP-Ubi-EGFP-IRES- Puromycin(其中插入元件CMV-C13-mcherry-EF1A-(CA)13-BFP的核 苷酸序列如SEQID NO.1所示)。
由于修饰过的质粒当中插入的单核苷酸重复微卫星序列C13和二 核苷酸重复微卫星序列(CA)13均不是3的倍数，导致了起始密码子下 游的荧光蛋白序列的蛋白质翻译阅读框发生了框移，即荧光蛋白的编 码序列发生了移码突变，导致荧光蛋白不能正常转录翻译，从而使得 导入质粒的细胞不能正常发光。当细胞受到诱变剂的诱导突变，导致 质粒中DNA序列发生改变。当DNA序列中插入的微卫星序列变为3 的倍数，可使荧光蛋白编码序列恢复正常，荧光蛋白正常转录翻译并 发出荧光。此外，还将该质粒中插入含有正常的绿色荧光蛋白(GFP) 编码序列，绿色荧光蛋白的正常发光可以指示细胞是否成功转染该质 粒。
使用相同的方法，创建微卫星三荧光报告质粒的阴性对照，在C MV-mcherry-EF1A-BFP-Ubi-EGFP-IRES-Puromycin质粒中红色荧光 蛋白和蓝色荧光蛋白起始密码子后分别插入核苷酸数量为13的乱码 序列N13和核苷酸数量为26的乱码序列N26，即得到CMV-N13-mcher ry-EF1A-N26-BFP-Ubi-EGFP-IRES-Puromycin(其中插入元件CMV-N 13-mcherry-EF1A-N26-BFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
由于插入的乱码序列核苷酸个数均不是3的倍数，下游的荧光蛋 白编码序列不能正常转录翻译，所以导入该质粒的阴性对照细胞中红 色和蓝色荧光蛋白不能正常发光。
创建微卫星三荧光报告质粒的阳性对照组，在CMV-mcherry-EF 1A-BFP-Ubi-EGFP-IRES-Puromycin质粒中红色荧光蛋白和蓝色荧光 蛋白起始密码子后分别插入核苷酸数量为12的乱码序列N12和核苷 酸数量为24的乱码序列N24，即得到CMV-N12-mcherry-EF1A-N24-BF P-Ubi-EGFP-IRES-Puromycin(其中插入元件CMV-N12-mcherry-EF1A -N24-BFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。
由于插入的乱码序列均是3的倍数，下游的荧光蛋白编码序列可 以正常转录翻译，所以导入该质粒的阳性对照细胞中红色和蓝色荧光 蛋白都能够正常发光。阴性对照组和阳性对照组的质粒中均插入含有 正常的绿色荧光蛋白编码序列，绿色荧光蛋白的正常发光可以指示细 胞是否成功转染该质粒。
将构建好的质粒序列提供给爱必梦生物科技有限公司，并由爱必 梦生物科技有限公司负责合成实验所需3种序列的质粒。
实施例2细胞模型的构建
通过Western blot实验对HCT116细胞系和SW480细胞系的错 配修复系统蛋白MLH1表达进行了验证，如图4所示。在HCT116 细胞系中没有检测到MLH1的表达，表明HCT116细胞系是MLH1 缺失的结直肠癌细胞株，对其错配修复系统有较大影响。而与之比较，SW480细胞系MLH1蛋白是正常表达的。
将构建的三种荧光报告质粒分别插入到HCT116细胞系和SW48 0细胞系中，经过慢病毒转染，得到了六种稳转的细胞系(表1)。 具体慢病毒转染步骤如下：
表1微卫星三荧光报告质粒致突变检测稳转细胞系
Figure BDA0003724894850000181
1)细胞准备：使用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的1640 细胞培养液培养野生型HCT116细胞(iCell-h071，购于赛百慷(上 海)生物技术股份有限公司)。使用含10％胎牛血清和1％青霉素- 链霉素的DMEM细胞培养液培养野生型SW480细胞(iCell-h204， 购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)，观察细胞生长情况和 细胞活力。
2)细胞铺板：将生长状况良好、细胞活力旺盛的野生型HCT116 细胞和野生型SW480细胞铺种到6孔板中，置于培养箱中避光培养。 铺置前使用细胞计数板计数。
3)配制最适病毒滴度的慢病毒稀释液：根据前期中获得的慢病 毒数与细胞数比值以及铺种细胞数量计算转染所需慢病毒数，取含相 应数量的慢病毒原液，将3种置于-80℃冰箱中的病毒液(微卫星实 验组，阴性对照组及阳性对照组)取出冰水浴融化，短暂离心，将病 毒液收集于离心管底部。加入到2mL不含胎牛血清的细胞培养液中。
4)慢病毒转染：待6孔板中细胞完全贴壁后，弃原细胞培养液， 将配制好的慢病毒稀释液加入到6孔板中，记录每孔中加入病毒的类 型，置于培养箱中避光培养。
5)观察慢病毒感染细胞的情况：在细胞培养24h和36h时，取 出6孔板使用荧光显微镜观察发出绿色荧光的细胞的比例和绿色荧 光的强度。
6)配制最适浓度的嘌呤霉素的细胞培养液：根据前期获得的嘌 呤霉素最适浓度使用嘌呤霉素原液配制含嘌呤霉素的含10％胎牛血 清和1％青霉素-链霉素的1640细胞培养液(0.5g/mL嘌呤霉素)和含 10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM细胞培养液(1.0g/mL嘌 呤霉素)。
7)药物筛选转染细胞：弃掉6孔板中的原培养液，加入含嘌呤 霉素的药筛培养液，继续培养细胞。观察细胞生长情况及发出绿色荧 光的细胞的比例和绿色荧光的强度。在荧光显微镜下观察细胞，最终 药物筛选至所有细胞均发出绿色荧光。
8)得到稳转细胞后，我们使用高速流式细胞分选仪进行细胞分 选，建立6种稳定的单克隆细胞系。
9)稳转细胞系培养：筛选后的细胞使用含低浓度嘌呤霉素的含 10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的1640细胞培养液和DMEM细胞 培养液继续培养并传代。
各组细胞系在荧光显微镜下的发光情况如图5所示。微卫星组 HCT116-C13-(CA)13和SW480-C13-(CA)13细胞只发出绿色荧光(GFP)； 阴性对照组HCT116-N13-N26和SW480-N13-N26仅可发出绿色荧光；阳 性对照组HCT116-N12-N24和SW480-N12-N24可发出绿、红和蓝三种荧 光。
根据荧光显微镜下的发光情况结果可以看出，各组细胞系的发光 情况与实验设计一致，说明细胞模型的建立是符合预期的，并证明微 卫星三荧光报告质粒致突变检测体系的设计是合理且可行的。
实施例3微卫星三荧光报告质粒检测过氧化氢致突变性
1)细胞毒性
使用cck8细胞增殖实验检测了不同浓度H2O2对于HCT116细胞 系和SW480细胞系的细胞毒性。
cck8细胞增殖实验步骤如下：
①细胞准备：使用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的1640细 胞培养液培养HCT116细胞。使用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉 素的DMEM细胞培养液培养SW480细胞，选取生长情况和活力良好 的细胞进行实验。
②细胞铺板：将生长状况良好、细胞活力旺盛的HCT116细胞和 SW480细胞用胰蛋白酶消化，吹散成单个细胞充分混匀。使用细胞 计数器进行细胞计数，使用相应培养液将细胞稀释，浓度为1.5×104个/mL(3000个/200μL)。将细胞悬液用移液枪铺种在96孔板中，每孔200μL即3000个细胞，每个浓度3个重复孔，并设立好对照组 和空白对照组。在96孔板上记录细胞种类，时间以及待加入试剂浓 度，消毒后置于培养箱中避光培养。
③加入过氧化氢试剂：待细胞贴壁后，使用移液枪将培养液吸出， 向每孔加入不同浓度过氧化氢试剂200μL，置于培养箱中避光培养1h。
④加入CCK8溶液：过氧化氢试剂处理1h后，将每孔的试剂用移 液枪吸出，向每孔加入10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的1640细 胞培养液或DMEM细胞培养液200μL，再向每孔中加入CCK8溶液 20μL，注意避光操作。之后在37℃细胞培养箱中避光孵育2h。
⑤吸光度检测：使用酶标仪测定450nm处的吸光值，将检测数 据保存，使用SPSS统计学软件对吸光度值结果进行统计分析，使用 GraphPad Prism 8绘制曲线图。
设定H2O2的浓度梯度为0.25mM，0.5mM，1mM，2mM，4mM， 6mM，每组数据三次重复。以450nm波长处的吸光度代表活细胞数 目，以H2O2浓度梯度为横坐标，450nm波长处的吸光度为纵坐标作 图。
结果如图6可以看出随H2O2浓度增加，HCT116和SW480细胞 系的吸光度均显著降低。HCT116细胞的吸光度在0.25mM，0.5mM， 1mM，2mM，4mM，6mM H2O2过氧化氢作用下分别降低了17％，2 5％，32％，39％，38％和44％(图6中A)。SW480细胞的吸光度在 0.25mM，0.5mM，1mM，2mM，4mM，6mM H2O2过氧化氢作用下 分别降低了28％，42％，47％，50％，49％和53％(图6中B)。根 据趋势图后续实验选取0.5mM和1mM作为H2O2处理的最佳浓度。
2)过氧化氢致突变性
本实验选用4种三荧光报告细胞系进行实验，微卫星组HCT116 -C13-(CA)13、SW480-C13-(CA)13，阴性对照组HCT116-N13-N26，SW4 80-N13-N26，建立H2O2微卫星三荧光报告质粒致突变检测体系。每组 细胞系又分为两个组别：实验组和空白对照组。实验组使用0.5mM 或1mM的H2O2溶液处理1h后恢复72h，空白对照组使用相同剂量 PBS处理1h后恢复72h。将细胞消化、过筛并移液至流式管中，进 行流式细胞分选，每组每个浓度重复3次实验，每次检测记录2×105个细胞的荧光情况。
流式细胞仪分析微卫星突变率步骤：
①细胞收集：将细胞按1×105个/mL接种于培养瓶中，置于37℃ 培养箱中直至细胞贴壁。吸出培养瓶中的培养液后，加入PBS稀释 后不同浓度的H2O2溶液(射线照射实验则不吸出培养液，直接照射 不同剂量的60Coγ射线)，在每组中每个浓度至少重复3次。在培养 箱中处理1小时后，吸出H2O2溶液，用PBS溶液洗涤细胞3次，加 入含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的1640细胞培养液继续培养。 恢复3天后，用0.25％胰蛋白酶分离细胞，吸取全部液体至15mL离 心管内，3000rpm离心5min。弃上清液，用PBS重悬细胞进行细胞 计数，使每个重复组收集2×105个细胞于1.5mLEP管中。
②样品分析：将每组细胞悬液缓慢打入带有细胞筛的流式管中， 使细胞打散成单细胞悬液，做好标记后进行上机检测。本实验需要未 经过过氧化氢溶液处理的细胞作为空白对照组。调整流式细胞仪的激 发波长，在FITC通道检测GFP荧光，在PE-A通道检测mCheery荧 光，在BV421-A通道检测BFP荧光。每个样本采集2×105events。将 实验结果保存，实验FlowJo软件分析数据，设置PE-A为纵坐标，BV421-A为横坐标，根据两种荧光的荧光值来进行十字门划定。
通过流式分选计数数据计算各组荧光细胞突变率。通过以下公式 计算各浓度组的突变率：
自发突变率＝(空白对照组红色荧光+蓝色荧光细胞数)/空白对 照组绿色荧光细胞数；
单核苷酸突变率＝给药组红色荧光细胞数/给药组绿色荧光细胞 数；
二核苷酸突变率＝给药组蓝色荧光细胞数/给药组绿色荧光细胞 数；
总突变率＝(给药组红色荧光+蓝色荧光细胞数)/给药组绿色荧 光细胞数。
以H2O2的浓度为横坐标，突变率为纵坐标绘制实验结果图。运 用t检验对每个浓度的不同组(空白对照组和实验组)突变率进行统 计分析。通过与空白对照组相比，确定能够显著诱导突变的H2O2浓 度。分析不同结肠癌细胞系、不同微卫星类型对H2O2致突变敏感性的差异。
如图7所示，根据实验结果可以看出0.5mM和1mM的H2O2溶 液处理HCT116-C13-(CA)13组细胞后与0mM H2O2溶液处理的空白对 照组相比，红色荧光(PE)和蓝色荧光(BV)突变率有显著升高(P E：p<0.0001，BV：p<0.01)(图7中A)。HCT116-N13-N26与HCT 116-C13-(CA)13组有相似的结果(PE：p<0.0001，BV：p<0.01)。当 减去自发突变率后，HCT116-N13-N26(PE：p<0.0001，BV：p<0.000 1)和HCT116-C13-(CA)13(PE：p<0.0001，BV：p<0.01)两组中1m MH2O2溶液处理后细胞突变率显著高于0.5mM H2O2溶液处理后细 胞突变率(图7中B)。证明HCT116-C13-(CA)13和HCT116-N13-N26三荧光报告细胞系可以检测出0.5mM和1mM的H2O2溶液对细胞有 致突变作用，且对于两种浓度H2O2溶液对细胞的致突变作用检出效 果显著。
将图7中B中HCT116-N13-N26和HCT116-C13-(CA)13组红色荧光 突变率(PE)进行对比。1mM的H2O2溶液处理细胞，HCT116-C13- (CA)13微卫星组细胞红色荧光细胞突变率显著高于HCT116-N13-N26阴性对照组。由此可见插入微卫星序列C13的细胞受到H2O2溶液处 理后的突变率比插入乱码序列N13的更高。将图7中B中HCT116-N 13-N26和HCT116-C13-(CA)13两组细胞的蓝色荧光细胞突变率(BV) 进行对比，0.5mM和1mM H2O2溶液处理下，HCT116-C13-(CA)13微 卫星组细胞蓝色荧光细胞突变率均显著高于HCT116-N13-N26阴性对 照组。可见插入微卫星序列(CA)13的细胞系受到H2O2溶液处理后突 变率比插入乱码序列N26的细胞系更高。
图7中B中观察到HCT116-N13-N26和HCT116-C13-(CA)13两组细 胞系受H2O2溶液处理后的红色荧光细胞突变率均显著高于各自细胞 系的蓝色荧光细胞突变率(p<0.0001)。这代表插入单核苷酸序列C 13后对DNA造成移码突变的概率远远高于相同细胞系插入二核苷酸 序列(CA)13后对DNA造成移码突变的概率。
图7中C、D是与HCT116细胞系作为对照的SW480细胞系中 实验结果，可以看出，0.5mM和1mM的H2O2溶液处理后，SW480- C13-(CA)13细胞系红色荧光细胞突变率(PE)比0mMH2O2溶液处理 的空白对照组有显著升高(1mM PE：p<0.0001，0.5mM PE：p<0.0 001)，而SW480-N13-N26细胞系的红色荧光细胞突变率并没有显著 的升高(图7中C)。SW480-C13-(CA)13和SW480-N13-N26细胞系的 0.5mM和1mM的H2O2溶液处理的蓝色荧光细胞突变率(BV)与空 白对照组相比并没有显著的升高(图7中C)。减去自发突变率后， 只有SW480微卫星组红色荧光(PE)细胞突变率在1mM H2O2溶液 处理后高于0.5mM H2O2溶液处理后细胞突变率(PE：p<0.0001)(图 7中D)，其余组别没有显著差异。由此可见SW480-C13-(CA)13细胞 系能检测0.5mM和1mM的H2O2溶液处理后对细胞的致突变作用， 但0.5mM与1mM处理后突变率之间差异没有HCT116细胞系更为显 著。而SW480阴性对照细胞不能检测出0.5mM与1mM H2O2溶液处理后的致突变作用。
图7中D中SW480细胞系中插入微卫星序列C13的细胞系受到 H2O2溶液处理后细胞突变率比插入乱码序列N13的突变率更高。但插 入微卫星序列(CA)13经H2O2溶液处理后细胞突变率与插入乱码序列 N26的突变率之间没有显著差异，可能是由于蓝色荧光突变率普遍较 低。由此得出插入微卫星序列C13和插入乱码序列N13的SW480细胞 系的突变率均高于插入微卫星序列(CA)13和插入乱码序列N26的突变 率。
根据以上所有结果得出结论，HCT116三荧光报告细胞系可以检 测出0.5mM和1mM的H2O2溶液对细胞有致突变作用，且0.5mM和 1mM两种浓度H2O2溶液对细胞的致突变作用检出效果显著。SW48 0-C13-(CA)13细胞系同样能检测0.5mM和1mM的H2O2溶液处理后对 细胞的致突变作用，但0.5mM与1mM处理后突变率之间差异不显著。 且发现两种细胞系中插入单核苷酸序列C13后对DNA造成移码突变 的概率远远高于插入二核苷酸序列(CA)13和插入乱码序列N13和N26。
因此HCT116-C13-(CA)13细胞系作为HCT116微卫星三荧光致突 变检测细胞系，可以检测出0.5mM与1mM H2O2对细胞的致突变作 用，与HCT116-N13-N26、SW480-C13-(CA)13和SW480-N13-N26相比灵 敏度最高。由此我们初步建立了过氧化氢微卫星三荧光报告质粒致突 变检测体系。
实施例4微卫星三荧光报告致突变检测体系稳定性研究
为了验证检测系统的稳定性，使用相同培养条件和相同浓度的H 2O2溶液对HCT116-C13-(CA)13、SW480-C13-(CA)13、HCT116-N13-N26和SW480-N13-N26细胞分别进行处理，将细胞消化、过筛并移液至流 式管中，进行流式细胞分选。通过流式分选计数数据计算各组荧光细 胞突变率，每组每个浓度重复3次实验，每次检测记录2×105个细胞 的荧光情况，得到以下实验结果(图8)。
数据显示HCT116-C13-(CA)13细胞系可以检测出0.5mM与1mM H2O2对细胞的致突变作用，与HCT116-N13-N26、SW480-C13-(CA)13和SW480-N13-N26相比灵敏度最高，与前期的实验结果相符合，由此 可证明微卫星三荧光报告致突变检测体系是具有稳定性的。
实施例5微卫星三荧光报告致突变检测体系准确性研究
将实施例4中1mM H2O2溶液处理后的HCT116-C13-(CA)13、S W480-C13-(CA)13分别细胞进行流式分选，将发出红色荧光和蓝色荧 光的细胞分选出来进行单细胞培养后提取DNA。根据最初的实验设 计，发出红色荧光的细胞是由于插入微卫星序列C13发生移码突变从 而导致微卫星序列后的mCherry蛋白编码序列恢复转录和翻译，从而 发出红色荧光。发出蓝色荧光的细胞是由于插入微卫星序列(CA)13发 生移码突变从而导致微卫星序列后的BFP蛋白编码序列恢复转录和 翻译，从而发出蓝色荧光。为了探究H2O2溶液处理后红色和蓝色荧 光的发生是否由于插入的微卫星序列发生移码突变从而导致微卫星 序列后荧光蛋白编码序列恢复转录和翻译，导致细胞发光，进行短串 联重复序列(short tandemrepeat，STR)分析检测技术和一代测序。
微卫星三荧光报告细胞系DNA序列的鉴定方法如下：
1)细胞DNA提取：
①细胞的收集：本实验共六种建立的细胞系，HCT116-N13-N26, HCT116-N12-N24,HCT116-C13-(CA)13,SW480-N13-N26,SW480-N12-N24, SW480-C13-(CA)13。将六种细胞分别培养在细胞培养皿中，取培养于 10cm细胞培养皿中的细胞，待细胞生长至汇合率90％以上时，弃掉 培养皿中的细胞培养液，使用PBS清洗细胞3次。使用胰蛋白酶将 细胞消化至1.5ml离心管中，3000rpm离心1min，弃上清液。本实验 采用离心柱型微量样品基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。
②细胞降解消化：将1.5mL离心管中的细胞沉淀加入180μL缓 冲液GA，室温放置，使离心管温度平衡到室温。1.5mL离心管中加 入20μLProteinase K溶液，涡旋混匀10sec。
③在56℃孵育直到样本充分降解消化，需要时间大约30min到 1h，期间每15min需要涡旋混匀；或者置于水浴震荡仪中消化，简短 离心以收集附着在管壁及管盖上的液体。
④加入200μL的缓冲液GB和1μLCarrier RNA储蓄液，浓度为 1μg/μL，充分颠倒混匀，70℃放置10min，期间每3min涡旋混匀10sec， 溶液应变清亮后简短离心以除去附着在管壁及管盖上的液滴。
⑤将乙醇置于冰上预冷，1.5mL离心管中加入200μL的乙醇，轻 轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以除去附着在管壁及管 盖上的液滴。
⑥取上一步中的溶液全部转入吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管 中)，12000rpm离心30sec，弃掉废液，将吸附柱CR2放回收集管 中。
⑦向吸附柱CR2中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec， 弃掉废液，将吸附柱CR2放回收集管中。
⑧向吸附柱CR2中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec， 弃掉废液，将吸附柱CR2放回收集管中。重复此步骤的操作1～2次。
⑨12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR2置于室温放置 2～5min，以彻底晾干吸附材料中的漂洗液。漂洗液中乙醇的残留会影 响后续的酶反应(酶切、PCT等)实验。
⑩将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置 悬空滴加20～50μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5min，12000rpm离 心2min，将溶液收集到离心管中。用分光光度计测量DNA的浓度和 OD值。之后将DNA产物保存在-20℃冰箱中，以防DNA降解。
2)PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳：
PCR扩增：将样品和试剂按以下体系(表2)进行PCR体系上 样：
表2普通PCR扩增体系
Figure BDA0003724894850000291
每种细胞系DNA样本均按以上体系进行PCR，每种细胞系基因 测序引物见表3。PCR反应条件为95℃预变性5min，34个循环的 扩增体系：95℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min，72℃延 伸7min。
表3 DNA测序引物序列
Figure BDA0003724894850000292
琼脂糖凝胶电泳：待测样品降温至4℃后，取5μLPCR产物用 于琼脂糖凝胶电泳。使用配置2％琼脂糖凝胶在80V电压下电泳3h， 观察是否存在双条带。
3)荧光标记PCR扩增：
将样品和试剂按以下体系(表4)进行PCR体系上样：
表4荧光标记PCR扩增体系
Figure BDA0003724894850000301
每种细胞系DNA样本均按以上体系进行PCR，每种细胞系基因 测序引物见表5。PCR反应条件为95℃预变性5min，34个循环的扩 增体系：95℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min，72℃延伸7 min。实验时注意避光操作。
表5荧光标记引物序列
Figure BDA0003724894850000302
HCT116-C13-(CA)13发出红色荧光的细胞微卫星STR分析结果和 一代测序结果如图9中A、C所示。STR分析检测结果显示，与PB S处理的空白对照组相比单核苷微卫星酸重复序列C13序列所在的最 高峰值由235.2bp转变为234.2bp，提示微卫星序列发生了1bp移码突变(图9中A)。测序结果显示单核苷酸微卫星重复序列C13序列 确实发生1bp缺失(图9中C)。除此之外，插入微卫星C13序列的 侧翼序列也发生了颠换和转换突变。HCT116-C13-(CA)13发出蓝色荧 光的细胞STR分析检测技术结果和一代测序结果如图9中B、D所 示。STR分析检测结果显示，核苷微卫星酸重复序列(CA)13序列所在 的227bp位置峰值发生变化，提示微卫星序列可能发生了2bp移码突 变(图9中B)。测序结果显示二核苷微卫星酸重复序列(CA)13序列 确实发生2bp缺失即一个微卫星核心序列的缺失，但同时微卫星序列 发生插入和颠换突变，插入微卫星(CA)13序列侧翼序列也发生了较多 颠换和转换突变(图9中D)。
根据以上结果得出结论，在HCT116细胞系中，发出红色荧光的 细胞确实在单核苷微卫星酸重复序列C13序列发生移码突变，发出蓝 色荧光的细胞确实在二核苷微卫星酸重复序列(CA)13序列发生移码 突变。但除了微卫星序列之外，其他编码序列也有突变发生，因此， 细胞发出荧光可能是由于插入微卫星序列和其他编码序列的突变共 同导致的。
SW480-C13-(CA)13发出红色荧光的细胞微卫星STR分析结果和 一代测序结果如图10中A、C所示。STR分析结果显示，与PBS处 理的空白对照组相比，最高峰值片段大小没有变化，提示插入微卫星 序列没有MSI(微卫星不稳定性)发生(图10中A)。测序结果显 示单核苷微卫星酸重复序列C13序列没有发生MSI，但插入的微卫星 C13序列后蛋白编码序列发生了颠换、转换和缺失的突变(图10中C)。 SW480-C13-(CA)13发出蓝色荧光的细胞微卫星STR分析结果和一代 测序结果如图10中B、D所示。STR分析检测结果显示，最高峰值 所在的229bp位置没有发生变化，提示插入微卫星序列没有MSI发 生(图10中B)。测序结果显示二核苷微卫星酸重复序列(CA)13序 列没有发生MSI，但微卫星序列后的蛋白编码序列发生了转换突变 (图10中D)。
根据以上结果得出结论，SW480细胞系受到H2O2溶液处理后发 出荧光的细胞微卫星序列没有发生移码突变，可能是由于SW480细 胞系作为错配修复系统完整的细胞系，对于微卫星发生的插入缺失突 变的修复较为及时，而错配修复系统缺陷的HCT116细胞系对于微卫 星发生突变的识别和修复功能缺陷，不易进行修复从而更容易发生M SI。因此，SW480细胞发出荧光不是由于插入微卫星序列而是其他编 码序列发生移码突变导致的。
实施例6微卫星三荧光报告致突变检测体系敏感性研究
Ames试验是目前公认的对受试物进行致突变性鉴定的方法，因 其简便、快速、经济、试验周期短而得到广泛应用，是目前药物安全 性评价中化合物致基因突变检测的金标准。在Ames试验中，被测物 的致突变性通常以样品组回复菌落数为溶剂对照组2倍以上为标准。 本研究Ames test试验对TA97a、TA98、TA100、TA1535和WP2uvr ApKM101菌株在有和没有大鼠肝微粒体制剂(S9)的系统中检测H2 O2的致突变性。通过与Ames实验结果对比来探究过氧化氢微卫星三 荧光报告致突变检测系统的敏感性。
Ames实验平板掺入法
鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏 组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；大肠杆菌色氨 酸营养缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培养基上，仅 少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型 的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是 否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故 需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。
本实验所使用的北京汇智泰康医药技术有限公司遗传毒性Ames 实验试剂盒，使用的五种菌株为沙门氏菌株TA97a、TA98、TA100、 TA1535和大肠杆菌WP2uvrApKM101。
1)试剂材料准备：
①底层琼脂培养基：准备琼脂粉6g，混合蒸馏水400mL于锥形 瓶中，121℃下高压灭菌20min，冷却至70℃左右时迅速加入VS溶 液8mL混匀后加入GSmL溶液，充分混匀，现用现配。
②顶层琼脂培养基：准备琼脂粉1.2g，氯化钠1.0g，混合蒸馏水 200mL于锥形瓶中，121℃下高压灭菌20min。冷却至60～70℃左右 时加入HBT溶液1.0mL，充分混匀，每2mL分装至5mL无菌离心 管中，45～48℃水浴中保温至使用前，现用现配。
③准备S9反应液7mL，S9复合物溶液4mL,现用现配，使用时 保存于冰浴中。实验结束后，剩余溶液应丢弃，不可重复使用。
④准备S9反应液7mL，灭菌蒸馏水4mL,现用现配，使用时保存 于冰浴中。实验结束后，剩余溶液应丢弃，不可重复使用。
2)实验步骤：
①取高压灭菌好的底层培养基，导入培养皿中，转动平皿使底层 培养基均匀分布，培养箱中凝固备用。
②加入融化顶层培养基，每2mL分装至5mL无菌离心管中， 45～48℃水浴中保温。向保温的顶层培养基中依次加入：0.1mL测试 菌液、0.1mL受试物、+S9:加入0.5mL S9混合液(10％)，-S9：加入 0.5mL S9空白溶液，充分混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布，平放固化，37℃倒置培养48h，观察结果。
③试验需同时设定阳性对照、溶剂对照和未处理对照：阳性对照 为标准诱变剂(2-氨基芴、甲基磺酸甲酯等，详情见表6)；溶剂对 照使用用于溶解受试物或标准诱变剂的试剂，如水或PBS等作为对 照；未处理对照指仅向培养基中加入菌液，不加入受试物或标准诱变 剂。根据实验需求可进行添加S9试剂(活化)和添加S9(非活化) 两种情况的实验(表6)。
表6各菌株阳性对照试剂
Figure BDA0003724894850000341
④结果判定：
阴性结果：试验菌株在加S9或未加S9条件下，受试物组回变菌 落数是溶剂对照组的2倍以内。
阳性结果：在加S9或未加S9条件下TA97a、TA98、TA100、 WP2uvrApKM101受试物组回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的2 倍或2倍以上，TA1535受试物组回变菌落数是溶剂对照回变菌落数 的3倍或3倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的、 并有统计学意义的阳性。
设定H2O2浓度为0.5mM、1mM、2mM、4mM和6mM的五个实 验组，同时设定了空白对照组、溶剂对照组(0mM H2O2)和阳性对 照组，共8组，每种菌株重复实验三次。
对于TA97a菌株的平板掺入试验如图11所示，进行菌落计数统 计后的结果如图13中A、B所示，在+S96mM H2O2处理下检测到有 阳性结果，0-4mM未检测到阳性结果；在-S90-6mM H2O2处理下未 检测到阳性结果。对于WP2uvrApKM101菌株的平板掺入试验如图 11所示，进行菌落计数统计后的结果如图13C、D所示，±S90-6mM 均未检测到阳性结果。对于TA1535菌株的平板掺入试验如图12所 示，进行菌落计数统计后的结果如图13中E、F所示，在+S94mM 和6mM H2O2处理下检测到有阳性结果；-S96mM H2O2处理下检测 到有阳性结果。对于TA98菌株的平板掺入试验如图12所示，进行 菌落计数统计后的结果如图13中G、H所示，±S96mM均检测到有 阳性结果，±S90-4mM未检测到阳性结果。对于TA100菌株的平板掺入试验如图12所示，进行菌落计数统计后的结果如图13中I、J 所示，在+S94mM和6mM H2O2处理下检测到有阳性结果；-S96mM H2O2处理下检测到有阳性结果。
综上所述，Ames实验在+S94mM H2O2条件下TA100和TA1535 菌株检测出具有致突变性。-S9 6mM条件下TA98、TA100和TA1535 菌株检测出具有致突变性。因此，Ames实验检测出的H2O2具有致突 变作用的最低浓度为4mM。同时结果也证明本研究中使用的PBS剂 量(溶剂)不会引起致突变性。
通过与Ames实验的结果对比，微卫星三荧光报告质粒最低可检 测到0.5mM H2O2的致突变性，是Ames实验最低检测剂量(4mM) 的1/8，换言之，微卫星三荧光报告质粒在H2O2致突变检测中的敏感 性是Ames实验的8倍。由此可见，微卫星三荧光报告质粒对于过氧 化氢致突变性检测的灵敏度远高于Ames实验。
实施例7微卫星三荧光报告质粒检测60Coγ射线致突变性
在建立了过氧化氢微卫星三荧光报告致突变检测体系后，继续探 究除了化学试剂刺激可以导致细胞基因发生突变外，微卫星三荧光报 告质粒是否能够检测出物理因素所导致的突变产生，检测的敏感如何。
细胞对辐射的反应是较为复杂的。大多辐射会直接造成DNA损 伤，发生细胞周期停滞，此时细胞的错配修复系统会在有丝分裂发生 之前进行DNA修复。本实验选用2种三荧光报告细胞系进行实验， 微卫星组HCT116-C13-(CA)13，阴性对照组HCT116-N13-N26，建立60Coγ 射线微卫星三荧光报告质粒致突变检测体系。每组细胞系又分为两个 组别：实验组和空白对照组。本实施例选用了0.1Gy和0.25Gy60Coγ 射线对细胞进行刺激，之后在5％CO2培养箱中培养72h。将细胞消 化、过筛并移液至流式管中，进行流式细胞分选，每组每个浓度重复 3次实验，每次检测记录2×105个细胞的荧光情况。通过流式分选计 数数据计算各组荧光细胞突变率，方法同实施例3。
以60Coγ射线剂量为横坐标，突变率为纵坐标绘制实验结果图。 运用t检验对每个浓度的不同组(空白对照组和实验组)突变率进行 统计分析。通过与空白对照组相比，确定能够显著诱导突变射线剂量。
根据实验结果可以看出0.1Gy和0.25Gy60Coγ射线作用HCT116 -C13-(CA)13组细胞后，红色荧光细胞突变率(PE)与0Gy处理的空 白对照组有显著差异(p<0.0001)(图14中A)。HCT116-N13-N26组0.1Gy剂量的红色荧光细胞突变率与空白对照组相比有差异(p<0. 05)，但0.25Gy剂量的红色荧光细胞突变率与空白对照组相比差异 较大(p<0.0001)。当减去自发突变率后，HCT116-N13-N26和HCT1 16-C13-(CA)13两组中0.25Gy60Coγ射线作用的红色荧光细胞突变率显 著高于0.1Gy处理后的突变率(p<0.0001)(图14中B)。在HCT 116-C13-(CA)13组中，0.1Gy和0.25Gy60Coγ射线作用细胞后，蓝色荧 光细胞突变率(BV)与0Gy处理的空白对照组有显著差异(0.25Gy： p<0.0001；0.1Gy：p<0.05)(图14中A)。而HCT116-N13-N26组中 仅0.25Gy60Coγ射线0Gy处理的空白对照组相比有差异(p<0.05)。 总体来看，红色荧光细胞突变率显著高于蓝色荧光突变率。
以上结果可以证明HCT116-C13-(CA)13三荧光报告细胞系可以检 测出0.1Gy和0.25Gy60Coγ射线对细胞有致突变作用，且检出效率和 敏感度均高于HCT116-N13-N26对照组。插入单核苷酸微卫星的序列 突变率高于插入二核苷酸微卫星的序列。
实施例8微卫星三荧光报告质粒检测60Coγ射线致突变验证
将实施例7中0.25Gy60Coγ射线处理后的HCT116-C13-(CA)13细 胞进行流式分选，将发出红色荧光和蓝色荧光的细胞分选出来进行单 细胞培养后提取DNA。使用实施例5中方法进行微卫星STR分析和 一代测序分析。
HCT116-C13-(CA)13发出红色荧光的细胞微卫星STR分析结果和 一代测序结果如图15中A、C所示。STR分析检测结果显示，与60Coγ 射线未处理的空白对照组相比单核苷微卫星酸重复序列C13序列所在 的最高峰值由235.2bp转变为234.2bp，微卫星序列发生了1bp移码 突变(图15中A)，测序结果显示单核苷微卫星酸重复序列C13序 列确实发生1bp缺失(图15中C)。但插入的微卫星C13序列侧翼序 列发生了不同程度的突变。HCT116-C13-(CA)13发出蓝色荧光的细胞 STR分析检测技结果和一代测序结果如图15中B、D所示。STR分 析检测结果显示，二核苷微卫星酸重复序列(CA)13序列所在的229bp 位置峰值没有发生变化(图15中B)。测序结果显示二核苷微卫星 酸重复序列(CA)13序列虽然没有发生缺失，但发生5次颠换和1次转 换，同时插入的微卫星(CA)13序列侧翼序列也发生了较多突变(图15 中D)。
根据以上结果得出结论，在HCT116细胞系中，60Coγ射线照射 后，发出红色荧光的细胞确实在单核苷微卫星酸重复序列C13序列发 生移码突变，并且侧翼序列也发生了突变。发出蓝色荧光的细胞通过 一代测序检测出微卫星酸重复序列(CA)13序列和侧翼序列也均发生 突变。
实施例9 Ames试验60Coγ射线致突变敏感性
通过与Ames实验结果对比来探究60Coγ射线微卫星三荧光报告 致突变检测系统的敏感性，方法同实施例6，使用的菌株分别为TA98、 TA100、TA97、TA1535和大肠杆菌WP2uvrApKM101。
设定60Coγ射线剂量梯度为0.1Gy、0.25Gy、0.5Gy、2Gy、8Gy、 16Gy，共六组实验组。还设定了空白对照组、溶剂对照组(0Gy)和 阳性对照组，每种菌株三次重复实验。
对于TA98菌株的平板掺入试验如图16中A所示，进行菌落计 数统计后的结果如图17中A所示，在16Gy60Coγ射线处理下检测到 有阳性结果，0～8Gy未检测到阳性结果。对于TA100菌株的平板掺 入试验如图16中B所示，进行菌落计数统计后的结果如图17中B 所示，在8Gy60Coγ射线处理下检测到有阳性结果，0～2Gy和16Gy均 未检测到阳性结果。对于TA97a菌株的平板掺入试验如图16中C所 示，进行菌落计数统计后的结果如图17中C所示，在0～16Gy60Coγ 射线处理下均未检测到有阳性结果。对于TA1535菌株的平板掺入试 验如图16中D所示，进行菌落计数统计后的结果如图17中D所示， 在0～16Gy60Coγ射线处理下均未检测到有阳性结果。对于 WP2uvrApKM101菌株的平板掺入试验如图16中E所示，进行菌落计数统计后的结果如图17中E所示，在16Gy60Coγ射线处理下检测 到有阳性结果，0～8Gy未检测到阳性结果。
因此，Ames试验在8Gy60Coγ射线条件下TA100菌株检测出具有 致突变性。16Gy60Coγ射线条件下TA98和WP2uvrApKM101菌株检 测出具有致突变性。Ames实验检测出60Coγ射线具有致突变作用的最 低剂量为8Gy。
尽管已经示出和描述了本申请的实施例，对于本领域的普通技术 人员而言，可以理解在不脱离本申请的原理和精神的情况下可以对这 些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由所附权利 要求及其等同物限定。
序列表
<110> 斯贝福（北京）生物技术有限公司
首都医科大学
<120> 一种用于体外检测致突变因子的报告质粒、细胞模型及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3544
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggt 60
taattaatag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 120
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 180
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 240
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 300
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 360
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 420
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 480
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 540
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 600
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 660
agcgctaccg gacgccacca tgcccccccc cccccgtgag caagggcgag gaggataaca 720
tggccatcat caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc 780
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agctgaaggt gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt 900
tcatgtacgg ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc 960
tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg 1020
tgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc 1080
gcggcaccaa cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg 1140
cctcctccga gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc 1200
tgaagctgaa ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga 1260
agcccgtgca gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca 1320
acgaggacta caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg 1380
gcatggacga gctgtacaag taaaccggtc tcgagaagct ttgcaaagat ggataaagtt 1440
ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat 1500
tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 1560
gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 1620
tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 1680
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 1740
cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 1800
tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg 1860
ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 1920
gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc 1980
tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 2040
gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 2100
cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 2160
agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc 2220
tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc 2280
agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 2340
gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 2400
gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 2460
ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 2520
ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 2580
attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac 2640
agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga gaagcttggg ctgcaggtcg 2700
actctagagg atcccgccac catgcacaca cacacacaca cacacacaca gtgagcaagg 2760
gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 2820
gccacaagtt cagcgtgagg ggcgagggcg agggcgatgc caccaacggc aagctgaccc 2880
tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 2940
tgagccacgg cgtgcagtgc ttcgcccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 3000
tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 3060
gcacctacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 3120
agctgaaggg cgtcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 3180
acttcaacag ccacaacatc tatatcatgg ccgtcaagca gaagaacggc atcaaggtga 3240
acttcaagat ccgccacaac gtggaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 3300
agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga cagccactac ctgagcaccc 3360
agtccgtgct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcc 3420
gcaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaatta attaacccgt 3480
gtcggctcca gatctggcct ccgcgccggg ttttggcgcc tcccgcgggc gcccccctcc 3540
tcac 3544
<210> 2
<211> 3544
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggt 60
taattaatag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 120
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 180
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 240
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 300
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 360
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 420
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 480
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 540
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 600
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 660
agcgctaccg gacgccacca tgnnnnnnnn nnnnngtgag caagggcgag gaggataaca 720
tggccatcat caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc 780
acgagttcga gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca 840
agctgaaggt gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt 900
tcatgtacgg ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc 960
tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg 1020
tgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc 1080
gcggcaccaa cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg 1140
cctcctccga gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc 1200
tgaagctgaa ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga 1260
agcccgtgca gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca 1320
acgaggacta caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg 1380
gcatggacga gctgtacaag taaaccggtc tcgagaagct ttgcaaagat ggataaagtt 1440
ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat 1500
tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 1560
gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 1620
tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 1680
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 1740
cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 1800
tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg 1860
ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 1920
gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc 1980
tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 2040
gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 2100
cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 2160
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agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 2340
gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 2400
gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 2460
ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 2520
ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 2580
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actctagagg atcccgccac catgnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtgagcaagg 2760
gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 2820
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tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 2940
tgagccacgg cgtgcagtgc ttcgcccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 3000
tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 3060
gcacctacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 3120
agctgaaggg cgtcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 3180
acttcaacag ccacaacatc tatatcatgg ccgtcaagca gaagaacggc atcaaggtga 3240
acttcaagat ccgccacaac gtggaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 3300
agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga cagccactac ctgagcaccc 3360
agtccgtgct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcc 3420
gcaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaatta attaacccgt 3480
gtcggctcca gatctggcct ccgcgccggg ttttggcgcc tcccgcgggc gcccccctcc 3540
tcac 3544
<210> 3
<211> 3541
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggt 60
taattaatag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 120
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 180
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 240
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 300
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 360
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 420
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 480
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gctgaaggtg accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt 900
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ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 1620
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gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 1740
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ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 2280
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tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 2460
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ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 2640
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag aagcttgggc tgcaggtcga 2700
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aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 2820
acaagttcag cgtgaggggc gagggcgagg gcgatgccac caacggcaag ctgaccctga 2880
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agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 3060
cctacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc 3120
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tcaacagcca caacatctat atcatggccg tcaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact 3240
tcaagatccg ccacaacgtg gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga 3300
acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacag ccactacctg agcacccagt 3360
ccgtgctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttccgca 3420
ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaattaatt aacccgtgtc 3480
ggctccagat ctggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgcgggcgcc cccctcctca 3540
c 3541

Claims (10)

1.一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，其特征在于，所述荧光报告质粒的编码基因包含至少一段由荧光报告基因和控制所述荧光报告基因表达的启动子以及长度为非3倍数的微卫星重复片段构成的DNA序列，所述启动子位于所述荧光报告基因的起始密码子的上游，所述微卫星重复片段插入在所述荧光报告基因的起始密码子和第一个氨基酸密码子之间，所述微卫星重复片段使所述荧光报告基因的密码子发生框移而不能表达，所述微卫星重复片段在所述致突变因子的诱导作用下能产生突变而使所述荧光报告质粒正常表达所述荧光报告基因。
2.根据权利要求1所述的一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，其特征在于，当所述荧光报告质粒的编码基因包含两段所述DNA序列时，该两段所述DNA序列中的所述荧光报告基因分别编码不同发光颜色的荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，其特征在于，所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，其特征在于，两段所述DNA序列中处于上游的所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白，处于下游的所述荧光报告基因编码蓝色荧光蛋白。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，其特征在于，所述微卫星重复片段为单核苷酸微卫星序列或二核苷酸微卫星序列。
6.根据权利要求5所述的一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，其特征在于，所述单核苷酸微卫星序列用以修饰编码红色荧光蛋白的所述荧光报告基因，所述二核苷酸微卫星序列用以修饰编码蓝色荧光蛋白的所述荧光报告基因。
7.根据权利要求6所述的一种用于体外检测致突变因子的荧光报告质粒，其特征在于，所述单核苷酸微卫星序列为C13，所述二核苷酸微卫星序列为(CA)13。
8.一种用于体外检测致突变因子的细胞模型，其特征在于，所述细胞模型包含权利要求1～7中任一项所述荧光报告质粒。
9.根据权利要求8所述的一种用于体外检测致突变因子的细胞模型，其特征在于，所述细胞模型的宿主细胞为缺失基因MLH1的HCT116细胞系。
10.权利要求1～7中任一项所述荧光报告质粒或权利要求8所述细胞模型在体外检测致突变因子中的应用。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2184763A1 (en) * 1996-05-08 1997-11-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services Mutant aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence
US20050064419A1 (en) * 2001-10-26 2005-03-24 Abdelmajid Belouchi Method for genotyping microsatellite dna markers by mass spectrometry
US20060088874A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Promega Corporation Methods and kits for detecting mutations
CN102816854A (zh) * 2012-08-31 2012-12-12 北京天辰空间生物医药研发有限公司 一种空间诱变机制的研究方法及其所使用生物遗传突变分子报告模型
US20130031644A1 (en) * 2011-05-23 2013-01-31 University Of Tennessee Research Foundation Autonomous lux reporter system and methods of use
US20160022605A1 (en) * 2014-07-22 2016-01-28 Christina Ling CHANG Methods for reducing microsatellite instability induced by chemotherapy and methods for screening antioxidants that suppress drug-induced microsatellite instability while enhancing the cytotoxicity of chemotherapeutic agents
CN107267505A (zh) * 2017-07-21 2017-10-20 首都医科大学 微卫星标记及其在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预测中的应用
WO2018174318A1 (ko) * 2017-03-24 2018-09-27 주식회사 시선바이오머티리얼스 양기능성 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성 진단용 키트
CN108913763A (zh) * 2018-07-03 2018-11-30 张罗 检测鼻腔脱落细胞中saa2基因表达量的方法及应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2184763A1 (en) * 1996-05-08 1997-11-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary Of The Department Of Health And Human Services Mutant aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence
US20050064419A1 (en) * 2001-10-26 2005-03-24 Abdelmajid Belouchi Method for genotyping microsatellite dna markers by mass spectrometry
US20060088874A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Promega Corporation Methods and kits for detecting mutations
US20130031644A1 (en) * 2011-05-23 2013-01-31 University Of Tennessee Research Foundation Autonomous lux reporter system and methods of use
CN102816854A (zh) * 2012-08-31 2012-12-12 北京天辰空间生物医药研发有限公司 一种空间诱变机制的研究方法及其所使用生物遗传突变分子报告模型
US20160022605A1 (en) * 2014-07-22 2016-01-28 Christina Ling CHANG Methods for reducing microsatellite instability induced by chemotherapy and methods for screening antioxidants that suppress drug-induced microsatellite instability while enhancing the cytotoxicity of chemotherapeutic agents
WO2018174318A1 (ko) * 2017-03-24 2018-09-27 주식회사 시선바이오머티리얼스 양기능성 pna 프로브를 이용한 융해곡선 분석방법, 및 이를 이용한 현미부수체 불안정성의 진단방법 및 현미부수체 불안정성 진단용 키트
CN107267505A (zh) * 2017-07-21 2017-10-20 首都医科大学 微卫星标记及其在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预测中的应用
CN108913763A (zh) * 2018-07-03 2018-11-30 张罗 检测鼻腔脱落细胞中saa2基因表达量的方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTOPH CAMPREGHER等: "The nucleotide composition of microsatellites impacts both replication fidelity and mismatch repair in human colorectal cells" *
I-CHENLI等: "A dual-fluorescent reporter facilitates identification of thiol compounds that suppress microsatellite instability induced by oxidative stress" *
杜小燕等: "小鼠微卫星检测突变体系的建立和初步应用" *
牟韶娇: "细胞错配修复活性定量检测体系的建立及雌激素对结肠细胞错配修复活性的影响" *

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