KR20200042904A - 종양용해성 바이러스 벡터 및 그의 용도 - Google Patents

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미첼 에이치. 피너
로레나 레르너
크리스토프 쿠에바
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온코루스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 암의 치료 및 예방을 위한 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 종양세포붕괴성 바이러스 벡터는 하기 특징 중 하나 이상을 도입한다: 바이러스 게놈으로의 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열의 삽입에 의한 바이러스 복제 제한; 종양형성 miRNA 기능의 파괴; 암 미세환경 리모델링; 및 바이러스 입자로의 프로테아제-활성화된 항체의 도입에 의해 표적화된 암 세포.

Description

종양용해성 바이러스 벡터 및 그의 용도
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2017년 7월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/537,359호; 및 2018년 6월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/686,802호(이들의 개시내용은 각각 본 명세서에 그 전문이 참조에 의해 원용됨)의 우선권을 주장한다.
서열 목록에 관한 성명
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 카피 대신에 텍스트 포맷으로 제공되고, 본 명세서에서 본 명세서로 참고로 원용된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 ONCR_010_02WO_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 500 KB이고, 2018년 7월 26일에 생성되고, EFS-Web을 통해 전자로 제출된다.
기술분야
본 개시내용은 암의 치료 및 예방을 위한 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 종양세포붕괴성 바이러스 벡터(oncolytic viral vector)에 관한 것이다.
현재의 표적화된 암 치료제는 종양 단백질 발현 프로필의 이종성으로 인해 오직 좁은 범위의 암에서 효율적이다. 더구나, 기존의 바이러스 벡터, 화학요법, 방사선 및 수술을 포함하는 많은 암 치료는 정상 비암성 세포의 건강 및 생존능력을 유지시켜면서 암성 세포를 선택적으로 치료하는 특이성이 결여되고, 원치않는 오프 타깃 효과를 생성할 수 있다. 그러므로, 다수의 암에서 광범위하게 효율적이고 암성 세포를 선택적으로 제거할 수 있는 암 치료제에 대한 수요가 당해 분야에 있다.
종양세포붕괴성 바이러스는 암 세포를 우선적으로 감염시키는 바이러스이고, 암 치료에 대한 다수의 전임상 및 임상 연구에서 사용되었다. 종양세포붕괴성 바이러스의 사용은 건강한 세포의 비특이적 바이러스 감염의 위험을 보유하여서, 비암성 세포 및 조직을 사멸시킨다. 그러나, 정상 조직 대 암성 조직에서 차등적으로 발현되는 경로, 단백질 및 유전자를 이용하기 위한 바이러스의 유전자 조작은 이들 바이러스의 특이성을 증가시키고 오프 타깃 감염 및 세포사를 제한할 수 있다.
마이크로RNA(miRNA 또는 miR)는 분해 또는 번역 억제를 위해 이의 표적 메신저 RNA를 지시함으로써 유전자 발현을 조절하는 작은 비코딩 내인성 RNA이다. miR는 정상 세포 과정과 친밀히 연관되고, 따라서, miRNA의 조절이상은 암을 포함하는 질환의 넓은 어레이에 기여한다. 많은 miR 유전자는 게놈 영역과 연관된 암 또는 취약한 부위에 위치하여서, miR이 암에서 중추적 역할을 한다는 증거를 추가로 강화시킨다. miR은 정상 조직과 비교하여 암 조직에서 차등 발현되고, 종양형성에 원인 관계를 가질 수 있다. 다양한 종양 유형에서 이 차등 miR 발현을 이용함으로써, 본 명세서에 기재된 암 치료제는 광범위 스펙트럼 안전성 및 효율 프로필을 보유하고, 여기서 종양세포붕괴성 바이러스 복제는 특정한 miR 또는 miR의 그룹의 발현에 기초하여 조절된다. 추가로, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스는 또한 종양을 통한 바이러스 전파를 촉진하는 단백질, 예컨대, 세포외 기질을 조절하는 유전자 및 단백질의 발현을 변경하는 것을 발현할 수 있어서, 이의 치료학적 효율을 증가시킨다.
개선된 종양세포붕괴성 바이러스 벡터에 대한 수요가 당해 분야에 있다. 본 개시내용은 이러한 개선된 종양세포붕괴성 바이러스 벡터, 및 더 많은 것을 제공한다.
본 개시내용은 선행 기술과 비교하여 개선된 기술적 효과를 나타내는 종양세포붕괴성 바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명자들은 다양한 종양세포붕괴성 바이러스 벡터를 설계하고, 암의 치료에서의 임상 용도에 대해 훌륭한 특성을 갖는 종양세포붕괴성 바이러스 벡터를 확인하기 위해 본 명세서에 기재된 광범위한 실험을 수행하였다.
본 발명은 암의 치료 및 예방에 유용한 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스 벡터는 바이러스 게놈으로 삽입된 마이크로RNA(miR) 표적 서열 덕분에 암 또는 종양 세포로 바이러스 벡터 복제를 제한할 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 필수 바이러스 유전자로 도입된 miR 표적 서열의 2개, 3개, 4개 또는 초과의 카피를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 산물(들)이 종양형성 miR의 기능을 파괴하고/하거나 세포외 기질을 변경하는 바이러스 게놈으로의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 바이러스 입자로 도입된 프로테아제-활성화된 항체를 포함하여서, 암/종양 세포로의 벡터의 매우 선택적인 표적화를 허용한다. 바이러스 벡터의 조성물 및 암성 세포의 사멸에서의 사용 방법 및 암의 치료는 본 명세서에 추가로 제공된다.
실시형태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 적어도 2개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하는 재조합 종양세포붕괴성 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus: HSV)를 제공하고, 여기서 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 및 UL42로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 재조합 HSV의 복제는 동일한 세포 유형의 암성 세포에서 재조합 HSV의 복제와 비교하여 비암성 세포에서 감소된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 및 UL42로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL8, ICP8 및 UL30으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP27 및 ICP4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP4, ICP27, UL8, UL42 및 ICP34.5로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 근육 세포 및 간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 뉴런 세포는 중추 신경계 세포, 말초 신경계 세포, 뇌 세포 또는 척수 세포이다. 실시형태에서, 근육 세포는 횡문근 세포 또는 평활근 세포이다. 실시형태에서, 비암성 세포 및 암성 세포는 뇌 세포이고, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-137, miR-219a, miR-124, miR-9, miR-487b 및 miR-128로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-137, miR-219a, miR-124 및 miR-128로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 비암성 세포 및 암성 세포는 심장 또는 횡문근 세포이고, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-208b, miR-1, miR-208a, miR-133a, miR-4284, miR-499a, miR-126, miR-30e, miR-378i, miR-30b 및 miR-378로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-208b, miR-1 및 miR-208a로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 비암성 세포 및 암성 세포는 척수 세포이고, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-219a, miR-9, miR-204, miR-577, miR-99a, miR-100, miR-132 및 miR-135로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-219a, miR-9 및 miR-204로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 비암성 세포 및 암성 세포는 말초 신경계 세포이고, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-204, miR-1, miR-206, miR-9, miR-99a, miR-199b, miR-145, miR-100, miR-574로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 비암성 세포 및 암성 세포는 간 세포이고, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-122 및 miR-126으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다. 실시형태에서, 비암성 세포 및 암성 세포는 평활근 세포이고, 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-143 및 miR-145로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열이다.
실시형태에서, 2개 이상의 miR 표적 서열은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비번역된 영역(untranslated region: UTR) 또는 3' UTR에서 삽입된 miR-T 카세트로 도입된다. 실시형태에서, miR-T 카세트는 1000개 미만의 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다. 실시형태에서, miR-T 카세트는 약 25개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다. 실시형태에서, miR-T 카세트는 약 100개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드의 길이를 포함한다.
실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 제1 바이러스 유전자로 삽입되고, miR-124, miR-1 및 miR-143의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열을 포함하는 제1 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열 카세트(miR-TS 카세트); (ii) 제2 바이러스 유전자로 삽입되고, miR-128, miR-219a 및 miR-122의 각각에 대해 적어도 2개의 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) 제3 바이러스 유전자로 삽입되고, miR-219a, miR-204 및 miR-128의 각각에 대해 적어도 2개의 표적 서열을 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 재조합 종양세포붕괴성 단순 포진 바이러스(HSV)를 제공한다. 실시형태에서, 재조합 HSV는 제4 바이러스 유전자로 삽입된 제4 miR-TS 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 제4 miR-TS 카세트는 (a) miR-137, miR-208b-3p 및 miR-126의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열; 또는 (b) miR-137, miR-217 및 miR-126의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열을 포함한다.
실시형태에서, 각각의 miR-TS 카세트는 각자의 miRNA의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 바이러스 유전자는 ICP4이다. 실시형태에서, 제2 바이러스 유전자는 ICP27이다. 실시형태에서, 제3 바이러스 유전자는 ICP34.5이다. 실시형태에서, 제4 바이러스 유전자는 UL8이다. 실시형태에서, 재조합 HSV의 복제는 동일한 세포 유형의 암성 세포에서의 재조합 HSV의 복제와 비교하여 비암성 세포에서 감소되고, 여기서 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 근육 세포 및 간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 서열번호 852와 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 서열번호 852의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 서열번호 853과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 서열번호 853의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 서열번호 854와 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 서열번호 854의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 실시형태에서, 제4 miR-TS 카세트는 서열번호 855와 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 실시형태에서, 제4 miR-TS 카세트는 서열번호 855의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
실시형태에서, 재조합 HSV는 하나 이상의 페이로드 분자를 코딩하는 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 실시형태에서, 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 IL-12, CCL4 및 CXCL10으로 이루어진 군으로부터 선택된 페이로드를 코딩한다. 실시형태에서, 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 IL-12, CCL4 및 CXCL10으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 페이로드를 코딩한다. 실시형태에서, 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 IL-12, CCL4 및 CXCL10을 포함하는 3개의 페이로드를 코딩한다.
실시형태에서, 본 개시내용은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 마이크로-RNA(miR) 표적 서열을 포함하는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스를 제공하고, 여기서 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)이고, 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL8, ICP34.5, UL42, UL19, ICP4 및 ICP27로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 하나 이상의 miR 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' 비번역된 영역(UTR) 또는 3' UTR로 도입된다. 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-122, miR-184, miR-34a, let7a, miR-145-5p, miR-199a-5p, miR-451a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-126-3p, miR-233-3p, miR-143-3p, miR-1-3p, miR-133a-3p, miR-127a-3p, miR-133b, miR-134-3p, miR-124, miR-101, miR-125b, miR-145, miR-559, miR-213, miR-31-5p 및 miR-205p로 이루어진 군으로부터 선택된 miR에 대한 표적 서열이다.
실시형태에서, 하나 이상의 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, 하나 이상의 miR 표적 서열의 2개, 3개, 4개 또는 초과의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, 바이러스의 복제는 제2 세포에서의 바이러스의 복제와 비교하여 제1 세포에서 감소되거나 약독화되고, 여기서 제1 세포는 제2 세포에서의 miR의 발현과 비교하여 하나 이상의 miR 표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 증가된 발현을 갖는다. 실시형태에서, 제1 세포에서의 miR의 발현 수준은 제2 세포에서의 miR의 발현 수준보다 적어도 5% 더 크다. 실시형태에서, 제1 세포는 비암성 세포이다. 실시형태에서, 제2 세포는 제1 세포에서의 miR의 발현과 비교하여 하나 이상의 miR 표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 감소된 발현을 갖는다. 실시형태에서, 제2 세포에서의 miR의 발현 수준은 제1 세포에서의 miR의 발현 수준보다 적어도 5% 더 작다. 실시형태에서, 제2 세포는 암성 세포이다.
실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP27이다. 실시형태에서, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL42이다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 3개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다.
실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 마이크로-RNA(miR) 표적 서열; 및 (b) (i) 하나 이상의 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드(여기서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR, 유전자 또는 금속단백질분해효소의 조직 저해제(tissue inhibitor of metalloproteinase: TIMP)의 발현을 감소시키거나 이의 기능을 저해함); 또는 (ii) 프로테아제-활성화된 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스를 제공하고; 여기서 바이러스는 HSV이고, 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL42, UL19, ICP4 및 ICP27로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, miR은 종양형성 miR 또는 미세환경 리모델링 miR이다. 실시형태에서, 종양형성 miR은 표 4에 수록된 miR로부터 선택된다. 실시형태에서, 유전자는 종양형성 유전자이다. 실시형태에서, 종양형성 유전자는 표 7에 수록된 유전자로부터 선택된다. 실시형태에서, 미세환경 리모델링 miR은 표 5에 수록된 miR로부터 선택된다. 실시형태에서, 하나 이상의 miR 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' 비번역된 영역(UTR) 또는 3' UTR로 도입된다. 실시형태에서, miR 표적 서열은 miR-122, miR-184, miR-34a, let7a, miR-145-5p, miR-199a-5p, miR-451a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-126-3p, miR-233-3p, miR-143-3p, miR-1-3p, miR-133a-3p, miR-127a-3p, miR-133b, miR-134-3p, miR-124, miR-101, miR-125b, miR-145, miR-559, miR-213, miR-31-5p 및 miR-205p로 이루어진 군으로부터 선택된 miR에 대한 표적 서열이다.
실시형태에서, 하나 이상의 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, 하나 이상의 miR 표적 서열의 2개, 3개, 4개 또는 초과의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP27이다. 실시형태에서, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL42이다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 3개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다. 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된다.
실시형태에서, TIMP는 TIMP1, TIMP2, TIMP3 및 TIMP4로부터 선택된다. 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 shRNA 또는 디코이(decoy) 올리고뉴클레오타이드이다. 실시형태에서, 단백질은 뉴클레아제, 이중특이적 T 세포 관여항체(bispecific T-cell engager: BiTE), 항면역억제 단백질 또는 면역원성 항원이다. 실시형태에서, 뉴클레아제는 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복배열(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR) 연관된 엔도뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease: ZFN) 또는 전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN)로부터 선택된다. 실시형태에서, CRISPR 연관된 엔도뉴클레아제는 SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9, C2C1, C2C3, Cpf1, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3 및 Csf4로부터 선택된다. 실시형태에서, 재조합 바이러스는 tracr-RNA(trRNA) 및 crispr-RNA(crRNA)를 코딩하는 비상동성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 여기서 crRNA는 miR 또는 TIMP를 코딩하는 게놈 DNA 서열에 표적화되고, trRNA는 CRISPR 연관된 엔도뉴클레아제의 결합 및 활성화를 촉진한다.
실시형태에서, 항면역억제 단백질은 항-조절 T 세포(regulatory T-cell: Treg) 단백질 또는 항-골수성 유래된 억제자 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC) 단백질이다. 실시형태에서, 항면역억제 단백질은 VHH 유래된 차단제 또는 VHH 유래된 BiTE이다. 실시형태에서, 단백질은 항종양 면역 반응을 유도한다. 실시형태에서, 단백질은 세포 표면에 발현된 항원에 결합하고, 여기서 항원은 EpCAM, CTLA-4, PD1, FGF2, FGFR/FGFR2b, 엔도텔린 B 수용체 및 SEMA4D로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 단백질은 혈소판, IFNβ, A2A, CCL5, CD137, CD200, CD38, CD44, CSF-1R, CXCL10, CXCL13, IL-12, IL-15, IL-2, IL-21, IL-35, ISRE7, LFA-1, NG2(SPEG4로도 공지됨), SMAD 단백질, STING, TGFβ 및 VCAM1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시형태에서, 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체는 바이러스 당단백질 엔벨로프로 도입된다. 실시형태에서, 프로테아제-활성화된 항체는 시스테인 카텝신, 아스파르틱 카텝신, 칼리크레인(hK), 세린 프로테아제, 카스파제, 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase: MMP) 및 디스인테그린 금속단백질분해효소(disintegrin metalloproteinase: ADAM)로부터 선택된 프로테아제에 의해 활성화된다. 실시형태에서, 프로테아제는 카텝신 K, 카텝신 B, 카텝신 L, 카텝신 E, 카텝신 D, hK1, PSA(hK3), hK10, hK15, uPA, uPAR, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23A, MMP-23B, MMP-24, MMP-25, MMP-26, MMP-27, MMP-28, 또는 표 6에 수록된 프로테아제로부터 선택된다. 실시형태에서, 프로테아제-활성화된 항체는 비암 세포에 의해 또는 비암 미세환경에서보다 암 세포에 의해 또는 암 미세환경에서 더 고도로 발현된 단백질에 결합한다. 실시형태에서, 프로테아제-활성화된 항체는 NKG2D, c-met, HGFR, CD8, 황산 헤파란, VSPG4(NG2로도 공지됨), EGFR, EGFRvIII, CD133, CXCR4, 암배아성 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), CLC-3, 아넥신 II, 인간 트랜스페린 수용체 또는 EpCAM에 결합한다.
실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 게놈의 유전자 유전좌위로 삽입되거나, 바이러스 게놈의 2개의 유전자 유전좌위 사이로 삽입된다. 실시형태에서, 바이러스 유전자 유전좌위는 내부 반복 연결 영역(이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT, ICP4 및 ICP47 촉진자의 각각의 1개의 카피를 포함), ICP0, LAT, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, 감마-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 및 US12로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스를 포함하는 바이러스 스톡을 제공한다. 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
실시형태에서, 본 개시내용은 종양세포붕괴성 바이러스가 상기 암성 세포 내에 감염시키고 복제하기에 충분한 조건 하에 암성 세포를 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스 또는 이의 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는 암성 세포를 사멸하는 방법을 제공하고, 여기서 암성 세포 내의 종양세포붕괴성 바이러스의 복제는 세포사를 발생시킨다. 실시형태에서, 암성 세포는 비암성 세포에서의 miR의 발현과 비교하여 하나 이상의 miR-표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 감소된 발현을 갖는다. 실시형태에서, 암성 세포에서의 miR의 발현 수준은 비암성 세포에서의 miR의 발현 수준보다 적어도 5% 적다. 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스의 복제는 하나 이상의 miR-표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 감소된 발현으로 암성 세포에서 증가되거나 유지된다. 실시형태에서, 바이러스 복제는 비암성 세포에서의 바이러스 복제와 비교하여 암성 세포에서 적어도 5% 더 크다. 실시형태에서, 세포는 생체내이다. 실시형태에서, 세포는 종양 내이다.
실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 실시형태에서, 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비인간 영장류 또는 인간이다. 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스 또는 이의 조성물은 정맥내로, 피하로, 종양내로, 근육내로 또는 비강내로 투여된다. 실시형태에서, 암은 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 미만성 대형 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL) 및 변연대 림프종(marginal zone lymphoma: MZL)으로부터 선택된다. 실시형태에서, 폐암은 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암이다. 실시형태에서, 간암은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma: HCC)이다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 페이로드 분자를 추가로 포함하고, 여기서 페이로드 분자 또는 단백질은 항-FAP/항-CD3 이중특이적 T 세포 관여항체이다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 페이로드 분자를 추가로 포함하고, 여기서 페이로드 분자 또는 단백질은 항-PD1-Fc-41BBL 단백질이다.
도 1은 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 암성 및 비암성 뇌 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 2는 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 암성 및 비암성 방광 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 3은 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 암성 및 비암성 유방 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 4는 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 암성 및 비암성 결장 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 5는 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 교모세포종 및 비암성 뇌 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 6은 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 암성 및 비암성 두경부 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 7은 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 암성 및 비암성 폐 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 8은 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 암성 및 비암성 췌장 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 9는 25개의 선택된 miRNA에 상응하는 신경초종 및 비신경초종 조직에서의 miRNA 발현 프로필의 열 지도를 예시한다.
도 10A 내지 도 10C는 실시예 2에 기재된 miRNA 발현 및 약독화 리포터 유전자 시스템을 예시한다. 도 10A는 miRNA 발현 플라스미드의 발현을 유도하는 pTetR tet 억제자 플라스미드의 도식을 나타낸다. 도 10B는 tet-유도성 mCherry 및 miRNA 발현 카세트를 함유하는 pTF-002 miRNA 발현 플라스미드의 도식을 나타낸다. 도 10C는 탈안정화된 GFP(dsGFP)의 리드-아웃이 가능하게 하는 pTF-004 miRNA 약독화 리포터의 도식을 나타낸다.
도 11는 도 10에 도시되고 실시예 2에 기재된 리포터 시스템을 사용한 miR-122 발현 및 약독화를 예시한다.
도 12는 도 10에 도시되고 실시예 2에 기재된 리포터 시스템을 사용한 miR-122, miR-184, miR-34a 및 Let7a 매개된 GFP 약독화를 예시한다. 원형 웰은 감소된 GFP 발현 수준을 나타낸다.
도 13은, 도 10에 도시되고 실시예 2에 기재된 리포터 시스템을 사용한, mCherry 발현으로 표시된, miR-122, miR-184, miR-34a 및 Let7a의 발현을 예시한다.
도 14는, 도 10에 도시되고 실시예 2에 기재된 리포터 시스템을 사용한, miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 및 miR-451 매개된 GFP 약독화를 예시한다. 원형 웰은 감소된 GFP 발현 수준을 나타낸다.
도 15는, 도 10에 도시되고 실시예 2에 기재된 리포터 시스템을 사용한, mCherry 발현으로 표시된, miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 및 miR-451의 발현을 예시한다.
도 16은 miR-122 및 miR-184 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 17은 miR-34a 및 miR-184 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 18은 Let7a 및 miR-184 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 19는 miR-124 및 miR-184 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 20은 miR-145 및 miR-184 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 21은 miR-199 및 miR-451 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 22는 miR-125 및 miR-451 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 23은 miR-126 및 miR-451 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 24는 miR-127 및 miR-451 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 25는 miR-133 및 miR-451 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 26은 miR-223 및 miR-451 약독화된 GFP 형광의 정량화를 나타낸다.
도 27a 내지 도 27d는 비암성 유사분열후 폐 세포 및 암성 A253 세포에서의 miR-125에 의한 HSV 약독화의 형광 기반 정량화를 예시한다. 도 27a는 유사분열후 폐 세포에서의 HSV 약독화의 형광 기반 정량화를 나타낸다. 도 27b는 A253 세포에서의 HSV 약독화의 형광 기반 정량화를 나타낸다. 도 27c는 유사분열후 폐 세포에서의 HSV 약독화의 qPCR 기반 정량화를 나타낸다. 도 27d는 A253 세포에서의 HSV 약독화의 qPCR 기반 정량화를 나타낸다.
도 28a 내지 도 28b는 HCC1395 대 A253 세포에서의 miR-145에 의한 HSV 약독화의 형광 기반(도 28a) 및 qPCR 기반(도 28b) 정량화를 예시한다.
도 29a 내지 도 29b는 정상 폐 세포에서 miR-199a-5p 대 miR-143-3p에 의한 HSV 약독화의 형광 기반(도 29a) 및 qPCR 기반(도 29b) 정량화를 예시한다.
도 30a 내지 도 30c는 A253, Huh7 및 Hep3B 세포주에서 miRNA-125a(도 30a) 및 miRNA-122(도 30b) 발현 및 바이러스 복제에 대한 효과(도 30c)를 예시한다.
도 31은 miR-122 및 miR-125a를 발현하는 세포에서 HSV를 함유하는 miR-T122 및/또는 miR-T125a에 의한 감염 후 감소된 바이러스 전파 및 단백질 발현을 예시하는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 32a 내지 도 32d는 miR 약독화된 HSV 복제에 대한 miRNA 발현의 효과를 예시한다. 도 32a 내지 도 32b는 miR-125a 모방체(도 32a) 또는 miR-122 모방체(도 32b)에 의한 형질주입 후 miR-125a 및 mir-122의 증가된 세포내 발현을 나타낸다. 도 32c는 형광 영상에 의해 표시된 명확한 유전자 유전좌위에서 동족 miR 표적 서열을 갖는 종양세포붕괴성 HSV 벡터의 복제의 약독화 및 GFP 형광의 정량화(도 32d)를 나타낸다.
도 33은 암 또는 양성 과증식성 장애의 치료를 위한 ICP4-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 예시한다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; ICP4:TmiRNA: 남은 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145 등)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 34는 암 또는 양성 과증식성 장애의 치료를 위한 ICP27-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; ICP27:TmiRNA: ICP27 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145 등)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 35는 암 또는 양성 과증식성 장애의 치료를 위한 UL19-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; UL19:TmiRNA: UL19 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145 등)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 36은 암 또는 양성 과증식성 장애의 치료를 위한 UL19-TmiRNA 및 ICP27-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; UL19:TmiRNA 및 ICP27:TmiRNA: UL19 및 ICP27 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145 등)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 37은 암 또는 양성 과증식성 장애의 치료를 위한 UL19-TmiRNA 및 ICP4-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; UL19:TmiRNA 및 ICP4:TmiRNA: UL19 및 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145 등)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 38은 암 또는 양성 과증식성 장애의 치료를 위한 UL19-TmiRNA, ICP27-TmiRNA 및 ICP4-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; UL19:TmiRNA, ICP27:TmiRNA 및 ICP4:TmiRNA: UL19, ICP27 및 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145 등)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 39는 암의 치료를 위한 ICP4-TmiRNA 약독화된, 게놈-편집 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; ICP4:TmiRNA: 남은 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음); Pol II 촉진자: 구성적(CAG, UbC, EF1a, PGK) 또는 세포-특이적(예를 들어, TRPV1, Nav1.7, hSYN); 엔도뉴클레아제: CRISPR 연관된 엔도뉴클레아제(예를 들어, SpCas9, SaCas9, FnCpf1, FnCas9 등); poly(A): 폴리아덴일화 신호(예를 들어, bGH); gRNA: 단일 crRNA-trRNA 융합(DR-crRNA-DR-trRNA); 종양형성 마이크로RNA에 표적화된 crRNA(예를 들어, miR-17, miR-21, miR-155); Pol III 촉진자: 예를 들어, U6, H1, 7SK.
도 40은 암의 치료를 위한 ICP4-TmiRNA 약독화된, 게놈-편집, 미세환경-리모델링 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; ICP4:TmiRNA: 남은 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miRNA 표적 서열(예를 들어, let-7, miR-34a, miR-101, miR-125b, miR-145)의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음); Pol II 촉진자: 구성적(CAG, UbC, EF1a, PGK) 또는 세포-특이적(예를 들어, TRPV1, Nav1.7, hSYN); 엔도뉴클레아제: CRISPR 연관된 엔도뉴클레아제(예를 들어, SpCas9, SaCas9, FnCpf1, FnCas9 등); poly(A): 폴리아덴일화 신호(예를 들어, bGH); gRNA2: 미세환경 리모델링 miRNA에 표적화된 crRNA(예를 들어, miR-143, miR-218) 또는 TIMP(예를 들어, TIMP1, TIMP2); Pol III 촉진자: 예를 들어, U6, H1, 7SK.
도 41은 췌장, 폐 및 결장암의 치료를 위한 ICP4-TmiRNA 및 ICP27-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; ICP4:TmiRNA: 남은 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miR-124 표적 서열 카세트의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음); ICP27:TmiRNA: ICP-27 유전자의 3' UTR로의 miR-451a, miR-143-3p 및 miR-559 표적 서열 카세트의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 42는 다수의 암 유형의 치료를 위한 ICP4-TmiRNA 및 ICP27-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; ICP4:TmiRNA: 남은 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miR-124 표적 서열 카세트의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음); ICP27:TmiRNA: ICP-27 유전자의 3' UTR로의 miR-451a, miR-145-5p 및 miR-559 표적 서열 카세트의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 43은 신경초종의 치료를 위한 ICP4-TmiRNA 및 ICP27-TmiRNA 약독화된 HSV 벡터의 도식을 나타낸다. gB:NT: gB 유전자에서의 바이러스 진입 증대 이중 돌연변이; BAC: loxP 측접된 클로르암페니콜 내성 및 lacZ 서열; Δ조인트: ICP4 유전자의 1개의 카피를 포함하는 완전한 내부 반복 영역의 결실; ICP4:TmiRNA: 남은 ICP4 유전자의 3' UTR로의 miR-124 표적 서열 카세트의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음); ICP27:TmiRNA: ICP-27 유전자의 3' UTR로의 miR-205p, miR-141-5p, 및 miR-31-5p 표적 서열 카세트의 삽입(또한 5' UTR에 배치될 수 있음).
도 44는 miR 약독화된 HSV 바이러스의 도식을 나타내고, 여기서 miR-122, miR-125a, 및/또는 miR-124 표적 부위의 다수의 카피는 ICP27, UL42 및/또는 ICP4로 삽입된다.
도 45는 miR 약독화된 HSV 바이러스(ONCR-157)의 도식을 나타내고, 여기서 miR 표적 부위 카세트는 UL8, ICP12, ICP4 및 ICP34.5로 삽입된다.
도 46은 miR 약독화된 HSV 바이러스(ONCR-159)의 도식을 나타내고, 여기서 miR 표적 부위 카세트는 UL8, ICP12, ICP4 및 ICP34.5로 삽입된다.
도 47a는 다양한 바이러스 유전자에 대해 풀링된 siRNA로 치료된 세포에서 GFP를 발현시키도록 조작된 리포터 바이러스에 의해 생성된 GFP 강도를 나타낸다. 도 47b는 개별 siRNA에서의 동일한 검정에서의 결과를 나타낸다.
도 48a 및 도 48b는 HSV 벡터 ONCR-003(왼쪽) 또는 ONCR-010(오른쪽)을 사용하여 다양한 바이러스 유전자에 대해 풀링된 siRNA로 치료된 세포에서 GFP를 발현시키도록 조작된 리포터 바이러스에 의해 생성된 GFP 강도를 나타낸다.
도 49는 표시된 바대로 바이러스 유전자에 대해 HSV 벡터로 감염되고 siRNA로 치료된 세포에서 바이러스 단백질의 발현을 검출하기 위한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 베타-액틴은 웨스턴 블롯에 대한 양성 대조군이다.
도 50a 및 도 50b는 miRNA 발현(도 50a) 및 정규화된 계수치(도 50b)의 비율로서 악성 조직과 비교된 정상 뇌 조직에 대한 Nanostring 검정 데이터를 나타낸다.
도 51a 및 도 51b는 miRNA 발현(도 51a) 및 정규화된 계수치(도 51b)의 비율로서 악성 조직과 비교된 정상 심장 조직에 대한 Nanostring 검정 데이터를 나타낸다.
도 52a는 miRNA 발현의 비율로서 악성 조직과 비교된 정상 척수 조직에 대한 Nanostring 검정 데이터를 나타낸다. 도 52a 및 도 52b는 miRNA 발현(도 52a) 및 정규화된 계수치(도 52c)의 비율로서 악성 조직과 비교된 정상 신경 또는 결절종 조직에 대한 Nanostring 검정 데이터를 나타낸다.
도 53a 및 도 53b는 카세트 1(도 53a) 또는 카세트 2(도 53b)에 대한 miR-TS 카세트의 루시퍼라제 검정 시험을 나타낸다.
도 54a 내지 도 54g는 암 세포주 SW837(도 54a), SKMEL28(도 54b), COLO 205(도 54c), A375(도 54d), H446(도 54e), BXPC3(도 54f) 및 BT549(도 54g)에서의 종양세포붕괴성 HSV 바이러스 벡터 ONCR-125, ONCR-131, ONCR-142 및 ONCR-157의 세포독성을 나타낸다.
도 55는 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다. ONCR-133은 비히클 치료된 대조군과 비교하여 주사된 종양의 종양 성장을 상당히 저해하였다(p < 0.0001). ONCR-133 치료는 또한 비주사된 종양의 종양 성장을 상당히 저해시켜서(p < 0.005), 증대된 압스코팔 효과(abscopal effect)를 나타낸다.
도 56은 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다. ONCR-133 + ONCR-007(ULBP3을 발현하는 HSV 작제물) 또는 ONCR-133 + ONCR-002(임의의 추가 페이로드 분자를 발현하지 않는 HSV 작제물) 둘 다로 치료된 마우스는 비히클 치료된 대조군과 비교하여 종양 성장의 상당한 저해를 입증하였다.
도 57은 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다. ONCR-106 + ONCR-113 치료된 그룹에서의 CXCL10의 추가 발현은 ONCR-031 + ONCR-113으로 치료된 마우스와 비교하여 주사된 또는 비주사된 종양에서 종양 성장의 저해를 증대시키지 않았다.
도 58은 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다. ONCR-106 + ONCR-113 치료된 그룹에서의 CXCL10의 추가 발현은 ONCR-031 + ONCR-113으로 치료된 마우스와 비교하여 주사된 또는 비주사된 종양에서 종양 성장의 저해를 증대시키지 않았다.
도 59a 내지 도 59b는 비주사된 종양에서가 아니라 오직 주사된 종양에서 주사된 바이러스의 복제가 발생한다는 것을 나타내어서, 비주사된 종양에서 관찰된 항종양 효과가 면역 매개된다는 것을 제안한다. 데이터는 마이크로그램 DNA당 원시 게놈 카피(도 59a)로서 또는 정규화된 발현(도 59b)으로서 작도된다. HSV는 비주사된 종양에서가 아니라 주사된 종양에서 검출되어서, 비주사된 종양에서 관찰된 종양 성장 저해가 바이러스 전파로 인하지 않고 오히려 바이러스 투여의 압스코팔 효과로 인한다는 것을 나타낸다.
도 60a 내지 도 60c는 페이로드 발현이 치료후 24시간에 주사된 종양에서 피크이고 이후 감소된다는 것을 나타낸다.
도 61a 내지 도 61c는 ONCR-153으로 치료된 마우스의 혈청에서의 페이로드의 수준을 나타내고, 여기서 오직 CXCL10 발현이 관찰되었다.
도 62a는 주사된 및 비주사된 종양에서의 인터페론 감마의 발현 수준을 나타낸다. ONCR-153에 의한 마우스의 치료는 주사된 및 비주사된 종양 둘 다에서 종양내 IFNγ 반응을 유도하였다. 도 62b는 숙주 동물의 혈장에서의 인터페론 감마의 발현 수준을 나타낸다.
도 63은 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다.
도 64는 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다.
도 65는 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다.
도 66a는 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 도 66b는 폐에 대한 전이의 감소된 사건을 나타낸다. 도 66c는 비히클(PBS) 대조군 또는 벡터 치료된 동물로부터의 폐 조직의 영상을 나타낸다.
도 67은 마우스 이종이식 실험에서 (범례에 표시된 바대로) 바이러스와 비교된 비히클의 종양 성장 저해제 효과를 나타낸다. 주사된 종양의 종양 용적의 증가는 비주사된 종양의 종양 용적의 증가와 비교된다. ONCR-152 및 -139에 의한 치료는 ONCR-139 단독에 의한 치료와 비교하여 종양 성장 저해에서의 증대된 효과를 입증하였다.
몇몇 양상에서, 본 발명은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자로 miR 표적 서열을 도입함으로써 종양 세포에 바이러스 벡터 복제를 효율적으로 제한하도록 차등 miR 발현 프로필을 이용한다. 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 하나 이상의 바이러스 유전자로 도입된 miR 표적 서열의 2개, 3개, 4개 또는 초과의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 또한 감소된 종양 증식, 전이 및/또는 증대된 바이러스 전파가 가능하게 하는 종양 미세환경의 리모델링을 위한 특이적 miRNA의 발현을 파괴한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 종양 세포에 대한 표적화를 수월하게 하도록 바이러스 벡터에서의 표면 분자의 사용을 포함한다. 이들 양상은 잠재적으로 단일 바이러스 벡터로 암 유형의 넓은 어레이를 치료할 수 있는 바이러스 벡터를 개발하도록 개별적으로 또는 조합되어 적용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 질환 및 장애(예를 들어, 암)의 치료 및 예방에서 사용하기 위한 재조합 종양세포붕괴성 바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 암의 광범위한 어레이를 치료하기에 적합한 안전하고 효율적인 재조합 바이러스 벡터가 가능하게 하도록 내인성 마이크로RNA(miR) 발현을 이용한다.
본 명세서에 사용된 제목 부분은 오직 체계적인 목적을 위한 것이고, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특허, 특허 출원, 기사, 책 및 논문(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 본 명세서에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 명확히 원용된다. 원용된 문헌의 하나 이상 또는 문헌의 일부가 본 출원에서 그 용어의 정의를 부정하는 용어를 한정하는 경우에, 본 출원에 나타나는 정의가 지배하다. 그러나, 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌, 기사, 공보, 특허, 특허 공보 및 특허 출원의 언급은, 이들이 세계의 임의의 나라에서의 일반적인 상식의 일부를 형성하거나 유효한 선행 기술을 구성한다는 제안의 임의의 형태 또는 인정으로 해석되지 않고 해석되지 않아야 한다.
정의
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및, 적절한 경우, 이의 분수(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함한다고 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 단수 형태의 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭한다고 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 하나, 둘 다 중 어느 하나, 또는 대안의 임의의 이들의 조합을 의미한다고 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "포함한다" 및 "함유한다"는 동시에 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "복수"는 하나 이상의 성분(예를 들어, 하나 이상의 miRNA 표적 서열)을 지칭할 수 있다.
본 출원에 사용된 바와 같은, 용어 "약" 및 "대략"은 등가물로 사용된다. 약/대략과 함께 또는 이것 없이 본 출원에 사용된 임의의 숫자는 관련 분야의 숙련자에 의해 이해되는 임의의 보통의 변동을 다루는 것으로 의도된다. 소정의 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 기재되지 않는 한 또는 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외), 기재된 기준 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)에서 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 미만 내에 해당하는 값의 범위를 지칭한다.
"감소시킨다" 또는 "감소한다"는 기준 값과 비교하여 적어도 5%, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 특정한 값의 하락 또는 감소를 지칭한다. 특정한 값의 하락 또는 감소는 또한 기준 값과 비교하여 값의 배수 변화, 예를 들어, 기준 값과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 500배, 1000배 또는 초과 감소로 표시될 수 있다.
"증가시킨다"는 기준 값과 비교하여 적어도 5%, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 초과의 특정한 값의 증가를 지칭한다. 특정한 값의 증가는 또한 기준 값과 비교하여 값의 배수 변화, 예를 들어, 기준 값의 수준과 비교하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 500배, 1000배 초과로 표시될 수 있다.
용어 "서열 동일성"은 동일하고 동일한 상대 위치에 있는 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 사이의 염기 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 그러므로 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 또 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 서열 동일성의 소정의 백분율을 갖는다. 서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 용어 "기준 서열"은 시험 서열이 비교되는 분자로서 작용한다.
"상보성"은 천연으로 또는 비천연으로 발생하는(예를 들어, 상기 기재된 변형된) 염기(뉴클레오사이드) 또는 이의 유사체를 포함하는 2개의 서열 사이에 염기 적층 및 특정한 수소 결합 을 통해 짝짓기에 대한 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산의 하나의 위치에서의 염기가 상응하는 표적 위치에서의 염기와 수소 결합할 수 있는 경우, 염기는 그 위치에서 서로에 상보성인 것으로 생각된다. 핵산은 보편적 염기 또는 수소 결합에 양의 또는 음의 기여를 제공하지 않는 비활성 비염기성 스페이서를 포함할 수 있다. 염기 짝짓기는 정규 Watson-Crick 염기 짝짓기 및 비-Watson-Crick 염기 짝짓기(예를 들어, Wobble 염기 짝짓기 및 Hoogsteen 염기 짝짓기) 둘 다를 포함할 수 있다. 상보성 염기 짝짓기에 대해, 아데노신-유형 염기(A)는 타이미딘-유형 염기(T) 또는 유라실-유형 염기(U)에 상보성이고, 사이토신-유형 염기(C)는 구아노신-유형 염기(G)에 상보성이고, 보편적 염기, 예컨대, 3-나이트로피롤 또는 5-나이트로인돌은 임의의 A, C, U 또는 T에 혼성화하고 이것에 상보성인 것으로 생각된다고 이해된다. Nichols et al., Nature, 1994;369:492-493 및 Loakes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043. 이노신(I)은 또한 보편적 염기인 것으로 당해 분야에서 생각되고, 임의의 A, C, U 또는 T에 상보성인 것으로 생각된다. 문헌[Watkins and SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267]을 참조한다.
"작동 가능하게 연결된"은 상기 기재된 성분들이 이의 의도된 방식으로 작용하게 하는 관계에 이들이 있는 병렬을 지칭한다. 예를 들어, 촉진자가 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 촉진자는 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
용어 "대상체"는, 예를 들어, 포유류와 같은 동물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 포유류는 영장류이다. 몇몇 실시형태에서, 포유류는 인간이다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대, 소, 양, 염소, 암소, 돼지 등; 또는 가축 동물, 예컨대, 개 및 고양이이다. 몇몇 실시형태에서(예를 들어, 특히 조사 맥락에서) 대상체는 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류 또는 돼지, 예컨대, 근친교배된 돼지 등이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 교환 가능하게 사용된다.
용어 "유효량"은 특정한 생리학적 효과를 발생시키는 데 필요한 물질 또는 조성물의 최소 양(예를 들어, 특정한 생리학적 효과를 증가시키고/시키거나, 활성화하고/하거나, 증대시키는 데 필요한 양)을 지칭한다. 특정한 물질의 유효량은 질량/용적, 세포의 수/용적, 입자/용적, (물질의 질량)/(대상체의 무게), 세포의 수/(대상체의 무게), 또는 입자/(대상체의 무게)와 같은 물질의 성질에 기초하여 다양한 방식으로 표현될 수 있다. 특정한 물질의 유효량은 또한 최대 절반 유효 농도(EC50)로 표현될 수 있고, 이것은 기준 수준과 최대 반응 수준 사이의 절반인 거대한 특정한 생리학적 반응을 생성시키는 물질의 농도를 지칭한다.
구절 "약제학적으로 허용 가능한"은, 타당한 의학 판단의 범위 내에, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비에 알맞는, 화합물, 재료, 조성물, 및/또는 투여형을 지칭하도록 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는, 인간 및/또는 가축 동물에 대한 사용에 허용 가능한 것으로 미국 식품의약청이 허가한, 제한 없이, 임의의 애쥬번트, 담체, 부형제, 유동화제, 감미료, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향 증대제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장화제, 용매, 계면활성제, 및/또는 유화제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "종양세포붕괴성 바이러스"는 우선적으로 암 세포를 감염시키도록 변형되거나 천연으로 감염시키는 바이러스를 지칭한다.
용어 "마이크로RNA", "miRNA" 및 "miR"은 본 명세서에서 교환 가능하게 사용되고, 분해 또는 번역 억제를 위해 이의 표적 메신저 RNA(mRNA)를 지시함으로써 유전자 발현을 조절하는 약 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이의 작은 비코딩 내인성 RNA를 지칭한다.
"필수 바이러스 유전자"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 하나 이상의 필수 바이러스 기능, 예컨대, 바이러스 복제, 바이러스 패키징 또는 바이러스 감염성에 필요한 바이러스 유전자를 지칭한다.
용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 운반할 수 있거나 운반하는 핵산 분자를 지칭하도록 본 명세서에서 사용된다. 운반된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 이것에 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다.
분자 및 세포 생화학에서 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001 ); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)](이들의 개시내용은 본 명세서에 그 전문이 원용됨)과 같은 표준 교재에서 발견될 수 있다.
종양세포붕괴성 바이러스
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 재조합 종양세포붕괴성 바이러스를 제공하고, 여기서 하나 이상의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열의 1개 이상의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. 종양세포붕괴성 바이러스의 예는 단순 포진 바이러스(HSV), 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파르보바이러스, 마라바 바이러스 또는 콕사키바이러스(이들로 제한되지는 않음)를 포함하여 당해 분야에 공지되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스는 재조합 바이러스 벡터 또는 종양세포붕괴성 벡터로 지칭된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스는 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스(예를 들어, HSV-1 또는 HSV-2)), 아데노바이러스, 폴리오 바이러스, 백시니아 바이러스, 홍역 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파르보바이러스, 마라바 바이러스 또는 콕사키바이러스이다. 특정한 실시형태에서, 재조합 바이러스 벡터는 국제 PCT 공보 WO 제2015/066042호(그 전문이 참고로 원용됨)에 기재된 바대로 종양-선택적 벡터 복제를 할 수 있는 HSV이다.
HSV 기반 벡터 및 이의 작제를 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,078,029호, 제6,261,552호, 제5,998,174호, 제5,879,934호, 제5,849,572호, 제5,849,571호, 제5,837,532호, 제5,804,413호 및 제5,658,724호, 및 국제 특허 출원 WO 제91/02788호, WO 제96/04394호, WO 제98/15637호 및 WO 제99/06583호(이들은 본 명세서에서 그 전문이 참고로 원용됨)에 기재되어 있다. HSV의 서열은 공지되어 있고(NCBI 수탁 번호 NC_001806; 또한 문헌[McGoech et al., J. Gen. Virol, 69 (PT 7), 1531-1574 (1988)]을 참조), 이것은 본 발명의 HSV 기반 벡터의 설계를 수월하게 할 수 있다. 몇몇 경우에, 본 발명의 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)이고, ICP47 유전자에 대한 촉진자와 함께 이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT 및 ICP4의 각각의 1개의 카피를 포함하는 내부 반복(조인트) 영역의 결실을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 직접적인 감염 및/또는 측면 전파를 통해 세포로의 증대된 진입을 나타내는 HSV이다. 일 양상에서, 본 발명의 HSV 벡터는 HSV 감염의 통상적인 매개자(예를 들어, 넥틴-1, HVEM 또는 황산 헤파란/황산 콘드로이틴 프로테오글라이칸) 이외의 세포 단백질과의 상호작용을 통해 세포를 직접적으로 감염시킬 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 HSV이고, 비정규 수용체를 통한 벡터 진입을 촉진하는 gB 또는 gH 유전자의 돌연변이를 추가로 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 통상적으로 HSV 측면 전파에 내성인 세포, 예컨대, gD 수용체가 결여된 세포에서 측면 전파를 나타내는 돌연변이체 gH 당단백질을 추가로 포함하는 HSV 벡터를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 HSV 벡터는 미국 특허 공보 제2013/0096186호(본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)에 기재된 돌연변이체 gB 또는 gH 단백질의 하나 이상을 포함한다. 소정의 양상에서, HSV 벡터 내의 돌연변이체 진입 단백질은 바이러스 진입에 관여된 당단백질, 예컨대, gB, gH이고, 돌연변이체 HSV 벡터는 둘 다의 돌연변이된 버전을 포함할 수 있다. 그러나, 돌연변이체 진입 단백질은 세포로의 HSV 벡터의 진입을 가져오는 임의의 단백질일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이체 진입 단백질은 gD가 아니지만, HSV 벡터는, 예컨대, 리간드 또는 다른 원하는 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 gD를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명 HSV 벡터에서 사용하기 위한 gB 또는 gH 당단백질의 비제한적인 돌연변이는 하기 잔기의 하나 이상에서 발생한다: gB:D285, gB:A549, gB:S668, gH:N753 및 gH:A778. 몇몇 실시형태에서, 본 발명 HSV 벡터는 gB:D285 및 gB:A549 둘 다에서, gH:N753 및 gH:A778 둘 다에서, 및/또는 gB:S668, gH:N753 및 gH:A778의 각각에서 돌연변이를 포함한다. 소정의 실시형태에서, HSV 벡터는 이러한 돌연변이의 2개 이상(예를 들어, 3개 이상, 4개 이상)을 함유하고, HSV 벡터는 이들 잔기의 모든 5개에서 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, HSV 벡터는 gB:285, gB;549, gH:753 및 gH:778에서의 돌연변이를 갖는다. 돌연변이는 HSV-1 균주 KOS 유도체 K26GFP의 gD, gB 및 gH 유전자의 코돈(아미노산) 넘버링에 대해 본 명세서에서 칭해진다. K26GFP의 gB 및 gH에 대한 서열은 유전자은행(GenBank)(#AF311740(본 명세서에 참고로 원용됨))에 개시된 바와 같은 gB 및 하기에 표 9에 반영된 바와 같은 gH(유전자은행 #X03896(본 명세서에 참고로 원용됨))에 대한 서열과 다르다.
Figure pct00001
그러나, K26GFP는 유전자은행 X03896의 뉴클레오타이드 2,079 내지 2,102에 상응하는 유전자의 영역에서 추가 차이를 함유할 수 있다. 따라서, KOS 유도체 K26GFP 또는 유전자은행 수탁 번호 AF311740 중 어느 하나의 서열이 본 명세서에 기재된 gB 돌연변이에 대한 기준 서열로서 작용할 수 있다고 이해될 것이다. 또한, KOS 유도체 K26GFP 또는 유전자은행 수탁 번호 X03896 중 어느 하나의 서열이 본 명세서에 기재된 gH 돌연변이에 대한 기준 서열로서 작용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 HSV 벡터는 임의의 HSV 균주의 gB 및 gH에서 상동성 돌연변이를 포함할 수 있다.
몇몇 양상에서, HSV 벡터에서의 포함을 위한 진입 단백질의 돌연변이는 치환 돌연변이이지만; 돌연변이는 치환 돌연변이체로 제한되지는 않는다. 소정의 실시형태에서, HSV 벡터에서 사용하기 위한 돌연변이체 gB 또는 gH 당단백질은 gB:D285N, gB:A549T, gB:S668N, gH:N753K, gH:A778V로 이루어진 치환 돌연변이의 군으로부터 선택된다. 소정의 양상에서, HSV 벡터는 이들 치환의 조합(예컨대, 이러한 치환의 2개 이상(예를 들어, 3개 이상, 4개 이상 또는 모두))을 포함하고, gB:D285N/gB:A549T 이중 돌연변이체, gH:N753K/gH:A778V 이중 돌연변이체 및 gB:S668N/gH:N753K/gH:A778V 삼중 돌연변이체는 실시형태의 예이다. 일 실시형태에서, HSV 벡터는 gB:D285N/gB:A549T/gH:N753K/gH:A778V를 포함한다.
소정의 양상에서, HSV 벡터는 돌연변이체 gB 및/또는 돌연변이체 gH 당단백질을 포함하고, 여기서 당단백질에서의 돌연변이는 적어도 2개의 잔기에서의 치환 돌연변이이고, 여기서 벡터가 HSV-1 K26GFP일 때, 적어도 2개의 잔기는 gB:D285, gB:A549, gB:S668, gH:N753 및 gH:A778로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 벡터가 상동성 HSV일 때, 적어도 2개의 잔기는 gB:D285, gB:A549, gB:S668, gH:N753 및 gH:A778에 상응하는 아미노산으로부터 선택되고, 여기서 gB:D285 잔기는 VYPYXEFVL(서열번호 838)에서의 X에 상응하고, gB:A549 잔기는 KLNPNXIAS(서열번호 839)에서의 X에 상응하고, gB:S668 잔기는 ITTVXTFID(서열번호 840)에서의 X에 상응하고, gH:N753 잔기는 VDTDXTQQQ(서열번호 841)에서의 X에 상응하고, gH:A778 잔기는 VPSTXLLLF(서열번호 842)에서의 X에 상응하고; HSV 벡터는 HSV-1 또는 HSV-2 벡터이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 HSV 바이러스는 뉴런 세포의 HSV 감염을 감소시키는 UL37 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 국제 PCT 공보 WO 제2016/141320호 및 문헌[Richard et al., Plos Pathogens, 2017, 13(12), e1006741]에 기재된 것을 포함한다.
miRNA 약독화된 종양세포붕괴성 바이러스
miR은 다수의 유형의 암을 포함하는 질환 상태의 광범위한 어레이에서 차등으로 발현된다. 중요하게는, miRNA는 정상 조직과 비교하여 암 조직에서 차등으로 발현되어서, 이들이 광범위한 다양한 암에서 표적화 기전으로서 작용하게 한다. 발암, 악성 형질전환 또는 전이와 (긍정적으로 또는 부정적으로) 연관된 miRNA는 "oncomiR"로 공지되어 있다.
몇몇 양상에서, 특정한 oncomiR의 발현 수준은 특정한 암의 발생 또는 유지와 긍정적으로 연관된다. 이러한 miR은 본 명세서에서 "종양형성 miR"이라 칭해진다. 몇몇 실시형태에서, 종양형성 miR의 발현은 비암성 대조군 세포(즉, 정상 또는 건강한 대조군)에서 관찰된 발현 수준과 비교하여 암성 세포 또는 조직에 증가되거나, 상이한 암 유형으로부터 유래된 암성 세포에서 관찰된 발현 수준과 비교하여 증가된다. 몇몇 실시형태에서, 종양형성 miR의 발현은 비암성 대조군 세포 또는 상이한 암 유형으로부터 유래된 암성 세포에서의 종양형성 miR의 발현과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 또는 초과만큼 증가된다. 몇몇 양상에서, 암성 세포 또는 조직은 비암성 대조군 세포 또는 조직에서 발현되지 않는 종양형성 miR을 발현할 수 있다. 암 조직에서 흔히 과발현되는 종양형성 miRNA의 예는 miR-21, miR-155 및 miR-17-92를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 종양형성 miR의 추가 예는 표 4에 기재된다.
몇몇 실시형태에서, 특정한 oncomiR의 발현은 특정한 암 및/또는 전이의 발생 또는 유지와 부정적으로 연관된다. 이러한 oncomiR은, 이의 발현이 암의 발생을 방지하거나 억제하므로, 본 명세서에서 "종양-억제자 miR" 또는 "종양-억제 miR"이라 칭해진다. 몇몇 실시형태에서, 종양-억제자 miRNA의 발현은 비암성 대조군 세포(즉, 정상 또는 건강한 대조군)에서 관찰된 발현 수준과 비교하여 암성 세포 또는 조직에 감소되거나, 상이한 암 유형으로부터 유래된 암성 세포에서 관찰된 종양-억제자 miRNA의 발현 수준과 비교하여 감소된다. 예를 들어, 암성 세포에서의 종양-억제자 miRNA의 발현은 비암성 대조군 세포 또는 상이한 암 유형으로부터 유래된 암성 세포에서의 종양-억제자의 발현과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 감소될 수 있다. 몇몇 양상에서, 비암성 대조군 세포는 암성 세포에서 발현되지 않는 종양-억제자 miRNA를 발현할 수 있다. 종양-억제 miRNA의 예는 miR-122, miR-184, miR-34a, let7a, miR-145-5p, miR-199a-5p, miR-451a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-126-3p, miR-233-3p, miR-143-3p, miR-1-3p, miR-133a-3p, miR-127a-3p, miR-133b, miR-134-3p, miR-124, miR-101, miR-125b, miR-145, miR-559, miR-213, miR-31-5p, miR-205p, miR-15a, miR-16-1, miR-34, 및 let-7 패밀리의 miRNA를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 종양-억제 miR의 추가 예는 표 3 및 표 8에 기재되어 있다.
암 발병은 이종성 및 다유전자 과정이다. 그러므로, 특정한 경로의 활성화 및 특정한 유전자의 발현은 하나의 맥락에서 암 발생을 이끌고, 상이한 맥락에서 활성화되거나 발현될 때 명확한 또는 반대의 결과를 발생시킬 수 있다. 따라서, "종양유전자" 또는 "종양형성 miR" 또는 "종양-억제자" 또는 "종양-억제 miR"로서의 특정한 유전자 또는 miR의 규명은 바이너리 차이가 아니고, 암의 유형에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 하나의 miRNA의 발현은 특정한 암에서 증가하고, 그 암의 발생과 연관될 수 있지만, 동일한 miRNA의 발현은 상이한 암에서 감소하고, 그 암의 발생의 예방과 연관될 수 있다. 그러나, 몇몇 miRNA는 암의 유형과 독립적인 종양형성 miRNA로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 miRNA는 분해를 위해 종양 억제자 유전자의 mRNA 전사체를 표적화하여서, 종양 억제자 단백질의 발현을 감소시킨다. 예를 들어, miR-152b는 매우 대부분의 혈액학적 악성종양에서 종양형성 miR로서 작용하지만, 많은 고형 종양에서 종양-억제 miR로서 작용한다. 추가로, 특정한 miR은 암성 및 비암성 세포 둘 다에서 고도로 발현될 수 있다. 예를 들어, miR-155는 정상 세포에서 고도로 발현되어서, 대식세포 분극화에서 중요한 역할을 하고, 암 세포에서 또한 고도로 발현된다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 miR 약독화된, 게놈-편집, 및 미세환경-리모델링 종양세포붕괴성 바이러스의 발생은 또 다른 세포 집단 또는 조직과 비교하여 하나의 세포 집단 또는 조직에서의 특정한 miR 또는 miR의 그룹의 차등 발현에 기초한다. 당업자는 용어 종양-억제 miR이 일반적으로 암성 세포 또는 조직과 비교하여 비암성 세포 또는 조직에서 더 고도로 발현되는 miR을 지칭하고, 용어 종양형성 miR이 일반적으로 비암성 세포 또는 조직과 비교하여 암성 세포 또는 조직에서 더 고도로 발현되는 miR을 지칭한다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 암의 하나의 유형에서의 종양-억제 miR로서 규명된 miR이 암의 상이한 유형에서 종양-억제 miR로서 작용하거나 작용하지 않을 수 있고, 암의 하나의 유형에서의 종양형성 miR로서 규명된 miR이 암의 상이한 유형에서 종양형성 miR로서 작용하거나 작용하지 않을 수 있다는 것을 추가로 이해할 것이다.
표 1은 12개의 선택 oncomiR(9개의 종양 억제자 및 3개의 종양형성 miRNA)과 다수의 암 사이의 관계를 보여준다. 3,410개의 oncomiR-암 관계의 목록은 표 2에 기재되어 있다. miRNA는 세포 증식 및 아폽토시스의 제어에 관여된 단백질의 많은 전사체를 조절한다. 조절된 단백질은 관습적인 원발암단백질 및 종양 억제자, 예컨대, Ras, Myc, Bcl2, PTEN 및 p53을 포함한다. miRNA의 비정상 발현은 따라서 대개 암의 발생에 관여되고, 종양형성 miRNA를 저해하거나 고갈된 종양 억제자 miRNA를 대체함으로써 치료학적으로 수정될 수 있다. 추가로, 암성 세포 대 비암성 세포에서의 특정한 oncomiR의 차등 발현은 특이적으로 암 세포에 암 치료제를 표적화하는 수단으로서 이용될 수 있다. 그러므로, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스 벡터는 개별적으로 또는 조합되어 하기 특성을 포함할 수 있다: 바이러스 게놈의 miRNA 표적 서열의 삽입(이로써, 암 또는 종양 세포로의 바이러스 벡터 복제를 제한함); 산물(들)이 종양형성 miRNA의 기능을 파괴하고/하거나, 암 세포외 기질을 조절하고/하거나, 항암 면역 반응을 증대시키거나 활성화하는, 바이러스 게놈으로 도입된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 암 및/또는 종양 세포에 벡터를 선택적으로 표적화하도록 바이러스 입자로 도입된 프로테아제-활성화된 항체.
본 발명의 일 양상은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함하는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스(또는 바이러스 벡터)를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 정상(비암성) 세포에서 발현된 miRNA는 이러한 표적 서열에 결합하고 miRNA 표적 서열을 함유하는 바이러스 유전자의 발현을 억제할 수 있어서, 건강한 비암성 세포에서 바이러스 복제를 제한한다. 이러한 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는, miR를 발현하지 않거나 이의 감소된 발현을 갖는 세포와 비교하여 도입된 miR 표적 서열에 결합할 수 있는 하나 이상의 miRNA를 발현하는 세포에서 감소된 또는 약독화된 바이러스 복제를 나타내므로, 본 명세서에서 "miR 약독화된" 또는 "복제 제한된"이라 칭해진다. 바이러스 복제에 필요한 중요한 유전자로 miRNA 표적 서열을 도입함으로써, 바이러스 복제는 miRNA를 발현하는 정상 이배체 세포에서 조건적으로 억제될 수 있고, miRNA를 발현하지 않는 세포에서 보통 진행할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 건강한, 비암성 세포는 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염의 용해 효과로부터 정상 세포로부터 보호된다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비번역된 영역(UTR) 및/또는 3' UTR로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)이고, 바이러스 복제에 필요한 바이러스 유전자는 임의의 UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP34.5, ICP47, 감마-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11, 및/또는 US12를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 HSV이고, 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 또는 3' UTR로 도입된 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 HSV이고, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 ICP4, ICP27, UL8, UL42, UL19 및 ICP34.5 중 하나 이상으로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 HSV이고, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 ICP4, ICP27, UL8, UL42, UL19 및 ICP34.5 중 하나 이상의 5' 또는 3' UTR로 도입된다.
miRNA 표적 서열 카세트
동물에서, miRNA에 대한 유전자는 1차 miRNA(pri-miRNA)로 전사되고, 이것은 이어서 클래스 2 RNase III 효소인 Drosha에 의해 핵에서 처리되어서, 전구체 miRNA(pre-miRNA) 헤어핀을 형성한다. 프리-miRNA 헤어핀은 세포질로 운반되고, 여기서 이들은 RNase III 효소 Dicer에 의해 절단된다. 이 엔도리보뉴클레아제는 헤어핀의 5' 및 3' 말단과 상호작용하고, 3' 및 5' 암을 연결하는 루프를 절단하여서, 약 22개의 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 RNA 분자를 생성한다. 듀플렉스의 가닥 중 어느 하나가 잠재적으로 기능적 miRNA로서 작용할 수 있지만, 통상적으로 miRNA의 하나의 가닥은 분해되고, 오직 하나의 가닥은 아르고나우트(Ago) 단백질로 로딩되어서, 효과기 RNA 유도된 침묵화 복합체(RNA-induced silencing complex: RISC)를 생성하고, 여기서 miRNA 및 이의 mRNA 표적은 상호작용한다(Wahid et al., 1803:11, 2010, 1231-1243).
여기서, 특정한 miRNA를 코딩하는 유전자는 "MIR"에 이어서 miRNA 번호로 언급된다. 중간 헤어핀 프리-miRNA 분자는 "mir-", 이어서 miRNA 번호로 말해지는 한편, 성숙 단일 가닥 miRNA 분자는 "miR-", 이어서 miRNA 번호로 말해진다. 예를 들어, "MIR122"는 헤어핀 mir-122 프리-miRNA 분자를 코딩하는 유전자를 지칭하고, 이어서 이 분자는 성숙 miR-122 분자로 처리된다. 프리-miRNA의 헤어핀 구조로 인해, 2개의 성숙 마이크로RNA가 동일한 pre-miRNA의 반대의 아암으로부터 기원할 수 있다. 몇몇 경우에, 발현 데이터는 하나의 가닥을 주로 발현된 miRNA로서 확인하고 다른 가닥을 소수 산물로서 명확히 확인한다. 이러한 경우에, 성숙 miRNA 서열은 형태 miR-##(주요 산물) 및 miR-##*(전구체의 반대의 아암으로부터의 소수 산물)의 명칭이 배정된다. 예를 들어, mir-56의 주요 및 소수 산물은 각각 miR-56 및 miR-56*로 표시된다. 기존의 데이터가 어떠한 서열이 주요 것인지를 결정하기에 충분하지 않을 때, 또는 이들이 거의 유사한 양으로 발견될 때, 2개의 성숙 miRNA 산물은 (pre-miRNA 헤어핀의 5' 아암으로부터의) miR-##-5p 및 (pre-miRNA 헤어핀의 3' 아암으로부터의) miR-##-3p로 표시된다. 예를 들어, mir-142의 2개의 성숙 miRNA 산물은 miR-142-5p 및 miR-142-3p로 표시된다. 이들이 pre-miRNA 헤어핀의 반대의 말단으로부터 기원하므로, 특정한 miRNA의 -3p 및 -5p 산물이 상이한 RNA 서열을 포함하고, 따라서 상이한 표적 서열을 인식할 것이다.
여기서, miRNA 표적 서열은 "miR 표적 서열 카세트" 또는 "miR-TS 카세트"의 형태로 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된다. miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 바이러스 유전자의 특정한 유전좌위로 삽입될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 전사될 때, miR-TS 카세트를 포함하는 바이러스 유전자의 mRNA 전사체는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 초과의 miRNA 표적 서열을 포함한다. miR-TS 카세트가 2개 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는, 이러한 실시형태에서, miR-TS 카세트의 전체 길이(m)는, miRNA 표적 서열의 평균 길이(n)를 카세트에서의 miRNA 표적 서열의 전체 수(y)로 곱하고, 링커 서열의 평균 길이(l)를 카세트에서의 miRNA 표적 서열의 전체 수와 1(y + 1)로 곱한 것과 동일하거나 작도록, 2개 이상의 표적 서열은 배열된다. 따라서, miR-TS 카세트(m)의 길이는 식 m = (n * y) + (l * (y + 1))(여기서, n = miRNA 표적 서열의 평균 길이, l = 링커 서열의 평균 길이, 및 y = miR-TS 카세트에서 표적 서열의 전체 수)로 표시될 수 있다. 예시적인 예로서, miR-TS 카세트가 21 nt의 평균 길이(n)를 갖는 4개의 miRNA 표적 서열(y)을 포함하고, 링커 서열의 평균 길이가 4 내지 25 nt(l)이면, miR-TS 카세트(m)의 길이는 약 104 nt 내지 약 205 nt이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, miR-TS 카세트의 "길이"는, 임의의 개재하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드에서 처음의 miR-TS의 5' 뉴클레오타이드로부터 마지막 miR-TS의 3' 뉴클레오타이드로의 뉴클레오타이드(이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에 대한 염기쌍)의 전체 수로서 정의된다. 비중첩 miR-TS에 대해, miR-TS 카세트의 최소 길이는 miR-TS의 길이의 합일 것이다. 스페이서는 길이를 증가시킨다. 스페이서 길이의 선택은 카세트에서 추가 뉴클레오타이드의 수를 결정한다. 더 긴 스페이서는 더 짧은 스페이서보다 카세트의 길이를 증가시킨다. miR-TS가 끼워질 때(서로에 인접한 동일한 miRNA에 대한 mi-TS의 수를 최소화) 더 짧은(0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 nt만큼 짧은) 스페이서가 사용될 수 있다는 것을 인식함으로써(끼워진 miR-TS는 다른 miR-TS 사이의 공간을 증가시키도록 작용함), 본 발명자들은 miR-TS 카세트에서 가능한 것보다 더 짧은 miR-TS 카세트를 생성할 수 있다고 결정하였고, 여기서 동일한 miRNA에 대한 miR-TS는 탠덤으로, 예를 들어, 하나의 유형 중 4개, 이어서 다음의 유형 중 4개로 배열된다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트의 길이는 1000 nt 미만이다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트의 길이는 900 nt 미만, 800 nt 미만, 700 nt 미만, 600 nt 미만, 500 nt 미만, 400 nt 미만, 300 nt 미만, 200 nt 미만, 100 nt 미만 또는 50 nt 미만이다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트의 길이는 miR-TS 부위의 수의 26, 27, 28, 29 또는 30 nt 배 미만, miR-TS 부위의 수의 약 30 nt 배 미만, miR-TS 부위의 수의 약 35 nt 배 미만, 또는 miR-TS 부위의 수의 약 40 nt 배 미만이다.
몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 복수에서의 각각의 miRNA 표적 서열은 동일한 miRNA에 대한 표적 서열이다. 예를 들어, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 2개 내지 6개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 3개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 동일한 miR 표적 서열의 4개의 카피를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 여기서 복수는 적어도 2개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 1개 이상의 카피 및 제2 miRNA 표적 서열의 1개 이상의 카피일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피 및 제2 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피 및 제2 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 적어도 3개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피, 제2 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피 및 제3 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피, 제2 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피 및 제3 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피, 제2 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피 및 제3 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 적어도 4개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피, 제2 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피, 제3 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피 및 제4 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피, 제2 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피, 제3 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피 및 제4 miR 표적 서열의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피, 제2 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피, 제3 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피 및 제4 miR 표적 서열의 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고,
miR-TS 카세트가 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 몇몇 양상에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 임의의 개재하는 핵산 서열이 없이 탠덤으로 배열될 수 있다. 몇몇 양상에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 링커 서열에 의해 분리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 링커 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 초과의 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 링커 서열은 약 4개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 링커 서열은 약 4개 내지 약 16개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 예시적인 실시형태로서, miR-TS 카세트는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 하기 하위단위를 포함할 수 있다: (a) 제1 miRNA 표적 서열 - 링커 - 제2 miRNA 표적 서열(여기서, 인접한 하위단위는 추가 링커 서열에 의해 분리됨). 몇몇 실시형태에서, 제1 및 제2 miRNA 표적 서열은 동일한 miRNA의 표적이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 및 제2 miRNA 표적 서열은 상이한 miRNA의 표적이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 서열번호 1 내지 803으로부터 선택된 서열의 역보체와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 서열번호 1 내지 803으로부터 선택된 서열의 역보체를 포함하거나 이것으로 이루어진 miRNA 표적 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-122-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-122-5p 표적 서열은 서열번호 804와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-122-5p 표적 서열은 서열번호 804를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-124-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-124-3p 표적 서열은 서열번호 805와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-124-3p 표적 서열은 서열번호 805를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-125a-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-125a-5p 표적 서열은 서열번호 806와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-125a-5p 표적 서열은 서열번호 806을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-126-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-126-3p 표적 서열은 서열번호 807 또는 서열번호 808과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-126-3p 표적 서열은 서열번호 807 또는 서열번호 808을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-127a-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-127a-3p 표적 서열은 서열번호 809와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-127a-3p 표적 서열은 서열번호 809를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-128-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-128-3p 표적 서열은 서열번호 810 또는 서열번호 811과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-128-3p 표적 서열은 서열번호 810 또는 서열번호 811을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-129-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-129-3p 표적 서열은 서열번호 812와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-129-3p 표적 서열은 서열번호 812를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-129-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-129-5p 표적 서열은 서열번호 813과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-129-5p 표적 서열은 서열번호 813을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-130b-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-130b-3p 표적 서열은 서열번호 814와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-130b-3p 표적 서열은 서열번호 814를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-130b-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-130b-5p 표적 서열은 서열번호 815과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-130b-5p 표적 서열은 서열번호 815를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-133a-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-133a-3p 표적 서열은 서열번호 816과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-133a-3p 표적 서열은 서열번호 816을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-133b-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-133b-3p 표적 서열은 서열번호 817과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-133b-3p 표적 서열은 서열번호 817을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-134-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-134-3p 표적 서열은 서열번호 818과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-134-3p 표적 서열은 서열번호 818을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-137-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-137-3p 표적 서열은 서열번호 819와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-137-3p 표적 서열은 서열번호 819를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-1-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-1-3p 표적 서열은 서열번호 820과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-1-3p 표적 서열은 서열번호 820을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-143-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-143-3p 표적 서열은 서열번호 821과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-143-3p 표적 서열은 서열번호 821을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-145-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-145-3p 표적 서열은 서열번호 822와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-145-3p 표적 서열은 서열번호 822를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-145-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-145-5p 표적 서열은 서열번호 823과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-145-5p 표적 서열은 서열번호 823을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-184-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-184-3p 표적 서열은 서열번호 824와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-184-3p 표적 서열은 서열번호 824를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-199a-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-199a-3p 표적 서열은 서열번호 825와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-199a-3p 표적 서열은 서열번호 825를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-199a-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-199a-5p 표적 서열은 서열번호 826과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-199a-5p 표적 서열은 서열번호 826을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-204-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-204-5p 표적 서열은 서열번호 827과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-204-5p 표적 서열은 서열번호 827을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-208b-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-208b-3p 표적 서열은 서열번호 828과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-208b-3p 표적 서열은 서열번호 828을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-214-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-214-3p 표적 서열은 서열번호 829와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-214-3p 표적 서열은 서열번호 829를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-217-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-217-5p 표적 서열은 서열번호 830과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-217-5p 표적 서열은 서열번호 830을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-219a-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-219a-5p 표적 서열은 서열번호 831과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-219a-5p 표적 서열은 서열번호 831을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-223-3p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-223-3p 표적 서열은 서열번호 832와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-223-3p 표적 서열은 서열번호 832를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-34a-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-34a-5p 표적 서열은 서열번호 833과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-34a-5p 표적 서열은 서열번호 833을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-451a 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-451a 표적 서열은 서열번호 834와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-451a 표적 서열은 서열번호 834를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-559-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-559-5p 표적 서열은 서열번호 835와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-559-5p 표적 서열은 서열번호 835를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-Let-7a-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-Let-7a-5p 표적 서열은 서열번호 836과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-Let-7a-5p 표적 서열은 서열번호 836을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR-TS 카세트는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-9-5p 표적 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, miR-9-5p 표적 서열은 서열번호 837과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, miR-9-5p 표적 서열은 서열번호 837을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
하기에 표 10은 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스에서 miRNA 표적 서열에 결합할 수 있는 예시적인 miRNA의 서열을 제공한다. 추가 miRNA 서열은 서열번호 33 내지 803에 제공된다.
Figure pct00002
몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 카세트가 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입되게 하는 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, miR-TS 카세트는 바이러스 게놈에서 원하는 위치에서 핵산 서열에 상보성인 5' 및 3' 말단에서 짧은 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열은 본 명세서에서 "상동성 아암"이라고 칭해지고, 바이러스 게놈에서 특정한 위치로의 miR-TS 카세트의 삽입을 수월하게 한다.
몇몇 실시형태에서, 개시된 miR-TS 카세트는 각각 상이한 miRNA에 상응하는 miR-TS의 2개 이상의 복수를 포함하고, miR-TS는 종양세포붕괴성 바이러스로부터의 다양한 세포 유형 또는 기관을 보호하도록 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 miR-TS는 서로에 탠덤이라기보다 끼워진다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 짧은(예를 들어, 4 내지 15 nt 길이) 스페이서를 가져서, 더 컴팩트한 카세트를 생성시킨다. 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 miR-TS의 활성을 저해하는 RNA 2차 구조가 없다(또는 감소된다). 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 발암, 악성 형질전환 또는 전이와 연관된 miRNA(즉, "oncomiR")에 대한 시드 서열이 없다(또는 감소된다). 몇몇 실시형태에서, miR-TS 카세트는 폴리아덴일화 부위가 없다(또는 감소된다).
miR -TS 카세트를 포함하는 종양세포붕괴성 바이러스
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 하나의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 도입된 하나의 miR-TS 카세트(여기서 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함함)를 포함할 수 있어서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 하나의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 도입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 몇몇 양상에서, miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열(여기서 복수의 각각의 miRNA 표적 서열은 동일한 miRNA에 대한 표적임)을 포함할 수 있어서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 도입된 동일한 miRNA 표적 서열의 복수(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과)의 카피를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 초과의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 2개, 3개, 4개 또는 초과의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 초과의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다.
몇몇 양상에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 적어도 2개의 상이한 miRNA 표적 서열, 적어도 3개의 상이한 miRNA 표적 서열 또는 적어도 4개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함하여서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 도입된 적어도 2개, 3개 또는 4개의 상이한 miRNA 표적 서열의 1개 이상의 카피를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-122-5p, miR-34a-5p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-122-5p, miR-34a-5p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-122-5p, miR-34a-5p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-122-5p, miR-184-3p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-122-5p, miR-184-3p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-122-5p, miR-184-3p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-122-5p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-122-5p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-122-5p 및 miR-Let-7a-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-145-5p, miR-199a-5p 및 miR-599-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-145-5p, miR-199a-5p 및 miR-599-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-145-5p, miR-199a-5p 및 miR-599-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-124-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-124-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-124-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-137-3p, miR-208b-3p 및 miR-126-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-137-3p, miR-208b-3p 및 miR-126-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-137-3p, miR-208b-3p 및 miR-126-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-137-3p, miR-217-3p 및 miR-126-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-137-3p, miR-217-3p 및 miR-126-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-137-3p, miR-217-3p 및 miR-126-3p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-128-3p, miR-204-5p 및 miR-219-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42 중 하나로 삽입된 miR-128-3p, miR-204-5p 및 miR-219-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 HSV는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9 중 하나로 삽입된 miR-128-3p, miR-204-5p 및 miR-219-5p에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 게놈의 3' 또는 5' 비번역된 영역(UTR)으로 도입된 하나의 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, miR-TS 카세트는 miRNA 표적 서열의 1개의 카피를 포함할 수 있어서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR로 도입된 miRNA 표적 서열의 1개의 카피를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 재조합 폴리오 바이러스, SVV 또는 콕사키바이러스는 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR로 도입된 표 10에 기재된 miRNA 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR로 도입된 하나의 miR-TS 카세트를 포함할 수 있고, 여기서 miR-TS 카세트는 표 10에 기재된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하여서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR로 도입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
몇몇 양상에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 적어도 2개의 상이한 miRNA 표적 서열, 적어도 3개의 상이한 miRNA 표적 서열 또는 적어도 4개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함하여서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR로 도입된 적어도 2개, 3개 또는 4개의 상이한 miRNA 표적 서열의 1개 이상의 카피를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 재조합 폴리오 바이러스, SVV 또는 콕사키바이러스는 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR로 삽입된 표 10으로부터 선택된 적어도 2개, 3개 또는 4개의 상이한 miRNA 표적 서열의 1개 이상의 카피를 포함하는 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 2개 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 도입된 miR-TS 카세트를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 HSV 바이러스이고, 2개 이상의 필수 바이러스 유전자는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 HSV 바이러스이고, 2개 이상의 필수 바이러스 유전자는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 또는 UL42로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 HSV 바이러스이고, 2개 이상의 필수 바이러스 유전자는 ICP4, ICP27, ICP34.5, UL8 또는 UL9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 HSV 바이러스이고, 2개 이상의 필수 바이러스 유전자는 ICP27, ICP4, ICP34.5, UL8 및 UL42로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제1 miR-TS 카세트 및 ICP27의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피; miR-1-3p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피; 및 miR-143-3p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(124-3p);
(b) (124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p).
몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-1-3p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피; miR-145-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피; miR-199-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피; 및 miR-559에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피; miR-122-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피; 및 miR-128에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 miR-124에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하고, 제2 miR-TS 카세트는 각각의 1-3p, 145-5p, 199a-5p 및 559의 각각에 대한 표적 서열의 2개, 3개 또는 초과의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 miR-124에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하고, 제2 miR-TS 카세트는 219a-5p, 122-5p, 128T의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제1 miR-TS 카세트; 및 (ii) UL42의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(124-3p).
몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 UL42의 유전좌위로 삽입되고, miR-122-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (122-5p)-(122-5p)-(122-5p).
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입된 miR-124에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; 및 (ii) UL42의 유전좌위로 삽입된 miR-122-5p에 대한 표적 서열의 3개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL42의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(124-3p).
몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-122에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기 중 하나에 따라 배열된다:
(a) (122-5p);
(b) (122-5p)-(122-5p)-(122-5p)-(122-5p);
(c) (122-5p)-(122-5p) -(122-5p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL42의 유전좌위로 삽입되고, miR-125-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기 중 하나에 따라 배열된다:
(a) (122-5p);
(b) (122-5p)-(122-5p)-(122-5p)-(122-5p);
(c) (122-5p)-(122-5p)-(122-5p).
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miRNA-124-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-122-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL42의 유전좌위로 삽입되고, miR-125-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miRNA-124에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-122에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL42의 유전좌위로 삽입되고, miR-125-5p에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miRNA-124에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-122-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL42의 유전좌위로 삽입되고, miR-125-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miRNA-124-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-122-3p에 대한 표적 서열의 3개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL42의 유전좌위로 삽입되고, miR-125-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) UL8의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (124-3p) -(124-3p) -(124-3p) -(124-3p).
몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-208b-3p 및 miR-126의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (208b-3p)-(126-3p)-(137-3p)-(208b-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(208b-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(208b-3p).
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) UL8의 유전좌위로 삽입되고 iR-137 표적 서열의 4개의 카피, miR-208b-3p 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-126-3p 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL8의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p).
몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (219a-5p)-(122-5p)-(128-3p)-(122-5p)-(219a-5p)-(128-3p)-(122-5p)-(128-3p)-(219a-5p)-(128-3p)-(122-5p)-(219a-5p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-208a 및 miR-126의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (208b-3p)-(126-3p)-(137-3p)-(208b-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(208b-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(208b-3p).
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-122-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-208a에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-126에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트; (iii) UL8의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제3 miR-TS 카세트; 및 (iv) ICP34.5의 유전좌위로 삽입된 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트는 ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(124-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p)-(1-3p)-(143-3p).
몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miRNA 219a-5p, miRNA 122-5p 및 miRNA 128의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (219a-5p)-(122-5p)-(128-3p)-(122-5p)-(219a-5p)-(128-3p)-(122-5p)-(128-3p)-(219a-5p)-(128-3p)-(122-5p)-(219a-5p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-208a 및 miR-126의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (208b-3p)-(126-3p)-(137-3p)-(208b-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(208b-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(208b-3p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR137, miR-217-5p 및 miR-126의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (137-3p)-(126-3p)-(217-5p)-(126-3p)-(217-5p)-(137-3p)-(217-5p)-(126-3p)-(137-3p)-(126-3p)-(217-5p)-(137-3p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-217-5p 및 miR-127의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (137-3p)-(127-3p)-(217-5p)-(127-3p)-(217-5p)-(137-3p)-(217-5p)-(127-3p)-(137-3p)-(127-3p)-(217-5p)-(137-3p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, 각각의 miR-137, miR-217-5p 및 miR-128에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (137-3p)-(128-3p)-(217-5p)-(128-3p)-(217-5p)-(137-3p)-(217-5p)-(128-3p)-(137-3p)-(128-3p)-(217-5p)-(137-3p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-217-5p 및 miR-129의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (137-3p)-(129-3p)-(217-5p)-(129-3p)-(217-5p)-(137-3p)-(217-5p)-(129-3p)-(137-3p)-(129-3p)-(219-5p)-(137-3p).
몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트는 UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-217-5p 및 miR-130의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제3 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (137-3p)-(130-3p)-(217-5p)-(130-3p)-(217-5p)-(130-3p)-(217-5p)-(127-3p)-(137-3p)-(130-3p)-(217-5p)-(137-3p).
몇몇 실시형태에서, 제4 miR-TS 카세트는 ICP34.5의 유전좌위로 삽입되고, miRNA 128M, miRNA 204 및 miRNA 219-3p의 각각에 대한 표적 서열의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 제4 miR-TS 카세트에서의 복수의 miRNA 표적 서열은 하기와 같이 배열된다:
(a) (128-3p)-(219a-5p)-(204-5p)-(128-3p)-(219a-5p)-(204-5p)-(128-3p)-(219a-5p)-(204-5p)-(128-3p)-(219a-5p)-(204-5p).
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-14의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-208b-3p 및 miR-126의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트; 및 (iv) ICP34.5의 유전좌위로 삽입되고, miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-204에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-219-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-14의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및 (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137, miR-208a 및 miR-126의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-14의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-217-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-126-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트; 및 (iv) ICP34.5의 유전좌위로 삽입되고, miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-204에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-219-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-14의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-217-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-127에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트; 및 (iv) ICP34.5의 유전좌위로 삽입되고, miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-204에 대한 표적 서열의 3개의 카피 및 miR-219-5p에 대한 표적 서열의 3개의 카피를 포함하는 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-14의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-217-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트; 및 (iv) ICP34.5의 유전좌위로 삽입되고, miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-204에 대한 표적 서열의 3개의 카피 및 miR-219-5p에 대한 표적 서열의 3개의 카피를 포함하는 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-14의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-217-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-129에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트; 및 (iv) ICP34.5의 유전좌위로 삽입되고, miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-204에 대한 표적 서열의 3개의 카피 및 miR-219-5p에 대한 표적 서열의 3개의 카피를 포함하는 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 (i) ICP4의 유전좌위로 삽입되고, miR-124, miR-1-3p 및 miR-14의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제1 miR-TS 카세트; (ii) ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR-128의 각각에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제2 miR-TS 카세트; (iii) UL8의 유전좌위로 삽입되고, miR-137-3p에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-217-5p에 대한 표적 서열의 4개의 카피 및 miR-130에 대한 표적 서열의 4개의 카피를 포함하는 제3 miR-TS 카세트; 및 (iv) ICP34.5의 유전좌위로 삽입되고, miR-128에 대한 표적 서열의 4개의 카피, miR-204에 대한 표적 서열의 3개의 카피 및 miR-219-5p에 대한 표적 서열의 3개의 카피를 포함하는 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 하나의 필수 바이러스 유전자로 도입된 miR-125a 표적 서열의 1개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 UL42 유전좌위로 도입된 miR-125a 표적 서열의 1개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 하나의 필수 바이러스 유전자로 도입된 miR-122 표적 서열의 1개의 카피를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 ICP27 유전좌위(예를 들어, ONCR-036)로 도입된 miR-122 표적 서열의 1개의 카피를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 바이러스 복제에 필요한 바이러스 유전자로 도입된 miR-125a 표적 서열의 3개의 카피를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 UL42 유전좌위로 도입된 miR-125a 표적 서열의 3개의 카피를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, miR 표적 서열의 4개의 카피는 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입된다. 추가의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 필수 바이러스 유전자로 도입된 miR-125a 표적 서열의 4개의 카피를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 UL42 유전좌위로 도입된 miR-125a 표적 서열의 4개의 카피를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 필수 바이러스 유전자로 도입된 miR-122 표적 서열의 4개의 카피를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 ICP27 유전좌위(예를 들어, ONCR-063)로 도입된 miR-122 표적 서열의 4개의 카피를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 제1 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 제2 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27 유전좌위의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42 유전좌위(예를 들어, ONCR-094)의 3' UTR로 도입된다.
몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 제1 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 3개의 카피는 제2 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27 유전좌위의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 3개의 카피는 UL42 유전좌위(예를 들어, ONCR-095)의 3' UTR로 도입된다.
몇몇 실시형태에서, 제1 miR 표적 서열의 4개의 카피는 제1 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입되고, 제2 miR 표적 서열의 1개의 카피는 제2 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 제1 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 제2 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27 유전좌위의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42 유전좌위(예를 들어, ONCR-093)의 3' UTR로 도입된다.
몇몇 실시형태에서, 제1 miR 표적 서열의 4개의 카피는 제1 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입되고, 제2 miR 표적 서열의 4개의 카피는 제2 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 제1 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 제2 필수 바이러스 유전자의 3' UTR로 도입된다. 몇몇 실시형태에서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27 유전좌위의 3' UTR로 도입되고, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 UL42 유전좌위(예를 들어, ONCR-096)의 3' UTR로 도입된다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 miR 약독화된 종양세포붕괴성 바이러스는 하나 이상의 도입된 miR-표적 서열에 결합할 수 있는 miR을 발현하는 세포에서 감소된 바이러스 복제를 발생시킨다. "바이러스 복제"는 주어진 시간 동안 특정한 세포 또는 세포 집단에서 발생하는 바이러스 복제 사이클의 전체 수를 지칭한다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 복제는 주어진 시간의 과정에 걸쳐 존재하는 전체 바이러스 역가를 평가함으로써 또는 (예를 들어, 서열분석에 의해) 존재하는 바이러스 게놈 카피의 수를 평가함으로써 직접적으로 측정될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 벡터는 검출 가능한 표지, 예컨대, 형광 리포터를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 바이러스 복제는 리포터의 형광 강도 또는 리포터를 발현하는 세포의 수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 복제는 주어진 시간의 과정에 걸쳐 생존가능 세포의 수를 평가함으로써 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 복제의 수준은 시간에 걸친 생존가능 세포의 수와 역으로 상관되는 것으로 예상될 것이다.
"감소된 바이러스 복제"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 제2 세포 또는 제2 세포 집단과 비교하여 제1 세포 또는 제1 세포 집단에서 더 낮은 바이러스 복제의 수준을 지칭한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 세포 또는 제1 세포 집단에서의 바이러스 복제의 수준은 제2 세포 또는 세포 집단에서의 바이러스 복제의 수준과 비교하여 적어도 5%만큼 감소한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 세포 또는 제1 세포 집단에서의 바이러스 복제의 수준은 제2 세포 또는 세포 집단에서의 바이러스 복제의 수준과 비교하여 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 초과만큼 감소한다. 몇몇 실시형태에서, 제1 세포 또는 제1 세포 집단에서의 바이러스 복제는 제2 세포 또는 세포 집단에서의 바이러스 복제와 비교하여 완전히 저해된다.
몇몇 실시형태에서, 제1 세포 또는 제1 세포 집단에서의 감소된 바이러스 복제는 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자로 도입된 하나 이상의 miR-표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 발현과 상관된다. 몇몇 실시형태에서, 도입된 miR-표적 서열에 상응하는 miR의 발현은 따라서 복제 유전자의 발현을 저해하거나 감소시켜서, 바이러스 복제를 저해하거나 감소시킨다. 몇몇 실시형태에서, 제2 세포 또는 제2 세포 집단은 t miR의 감소된 발현 수준을 나타내거나 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 도입된 miR-표적 서열에 상응하는 (예를 들어, 암 세포에서의) miR의 부재한 또는 감소된 발현은 바이러스 복제가 진행되게 허용한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 세포 또는 세포 집단에서의 miR의 발현 수준은 제1 세포 또는 집단에서의 miR의 발현 수준보다 적어도 5% 더 낮다. 몇몇 실시형태에서, 제2 세포 또는 세포 집단에서의 miR의 발현 수준은 제1 세포 또는 집단에서의 miR의 발현 수준과 비교하여 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 초과 감소한다. 몇몇 실시형태에서, 제2 세포는 miR을 나타내지 않는다. 특정한 실시형태에서, 제1 세포는 비암성 세포이고, 제2 세포는 암성 세포이다.
몇몇 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터(예를 들어, miR 약독화된 바이러스 벡터)는 적어도 하나의 let-7 표적 서열을 포함하고, 폐암을 치료하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-15a 및/또는 적어도 하나의 miR-16A 표적 서열을 포함하고, B 세포 만성 림프구성 백혈병을 치료하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-125b, 적어도 하나의 miR-145, 적어도 하나의 miR-21 및/또는 적어도 하나의 miR-155 표적 서열을 포함하고, 유방암을 치료하도록 사용된다. 다른 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-143 및/또는 적어도 하나의 miR-145 표적 서열을 포함하고, 결장직장암을 치료하도록 사용된다. 소정의 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-181a, 적어도 하나의 miR-181b 및/또는 적어도 하나의 miR-181c 표적 서열을 포함하고, 교모세포종을 치료하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-199a*, 적어도 하나의 miR-195, 적어도 하나의 miR-199a, 적어도 하나의 miR-200a 및/또는 적어도 하나의 miR-125a 표적 서열을 포함하고, 간암(예를 들어, 간세포 암종)을 치료하도록 사용된다.
특정한 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-451a 표적 서열, 적어도 하나의 miR-143-3p 표적 서열, 적어도 하나의 miR-559 표적 서열 및 적어도 하나의 miR-124 표적 서열을 포함하고, 췌장암, 폐암, 및/또는 결장암의 치료에 사용된다. 이러한 실시형태에서, miR-451a, miR-143-3p, miR-559 및 miR-124에 대한 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 2개 이상의 유전자(예를 들어, ICP4 및 ICP27)로 도입된다. 추가의 특정한 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-451a 표적 서열, 적어도 하나의 miR-145-5p 표적 서열, 적어도 하나의 miR-559 표적 서열 및 적어도 하나의 miR-124 표적 서열을 포함하고, 본 명세서에 기재된 임의의 유형의 암의 치료에 사용된다. 이러한 실시형태에서, miR-451a, miR-145-5p, miR-559 및 miR-124에 대한 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 2개 이상의 유전자(예를 들어, ICP4 및 ICP27)로 도입된다. 추가의 특정한 실시형태에서, 복제 제한된 바이러스 벡터는 적어도 하나의 miR-205p 표적 서열, 적어도 하나의 miR-141-5p 표적 서열, 적어도 하나의 miR-31-5p 표적 서열 및 적어도 하나의 miR-124 표적 서열을 포함하고, 신경초종의 치료에 사용된다. 이러한 실시형태에서, miR-205p, miR-141-5p, miR-31-5p 및 miR-124에 대한 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 2개 이상의 유전자(예를 들어, ICP4 및 ICP27)로 도입된다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-136-3p, miR-432-5p, miR-1-3p, miR-127-3p, miR-379-5p, miR-493-5p, miR-223-5p, miR-223-5p, miR-136-5p, miR-451a, miR-487b-3p, miR-370-3p, miR-410-3p, miR-431-3p, miR-4485-3p, miR-4485-5p, miR-127-5p, miR-409-3p, miR-338-3p, miR-559, miR-411-5p, miR-133a-5p, miR-143-3p, miR-376b-3p, miR-758-3p, miR-1, miR-101, miR-1180, miR-1236, miR-124-3p, miR-125b, miR-126, miR-1280, miR-133a, miR-133b, miR-141, miR-143, miR-144, miR-145, miR-155, miR-16, miR-18a, miR-192, miR-195, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-218, miR-23b, miR-26a, miR-29c, miR-320c, miR-34a, miR-370, miR-409-3p, miR-429, miR-451, miR-490-5p, miR-493, miR-576-3p, 및/또는 miR-99a에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 방광암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-1251-5p, miR-219a-5p, miR-219a-2-3p, miR-124-3p, miR-448, miR-138-2-3p, miR-490-5p, miR-129-1-3p, miR-1264, miR-3943, miR-490-3p, miR-383-5p, miR-133b, miR-129-2-3p, miR-128-2-5p, miR-133a-3p, miR-129-5p, miR-1-3p, miR-885-3p, miR-124-5p, miR-759, miR-7158-3p, miR-770-5p, miR-135a-5p, miR-885-5p, let-7g-5p, miR-100, miR-101, miR-106a, miR-124, miR-124a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-125b, miR-127-3p, miR-128, miR-129, miR-136, miR-137, miR-139-5p, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-146b-5p, miR-149, miR-152, miR-153, miR-195, miR-21, miR-212-3p, miR-219-5p, miR-222, miR-29b, miR-31, miR-3189-3p, miR-320, miR-320a, miR-326, miR-330, miR-331-3p, miR-340, miR-342, miR-34a, miR-376a, miR-449a, miR-483-5p, miR-503, miR-577, miR-663, miR-7, miR-7-5p, miR-873, let-7a, let-7f, miR-107, miR-122, miR-124-5p, miR-139, miR-146a, miR-146b, miR-15b, miR-16, miR-181a, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-185, miR-199a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-203, miR-204, miR-205, miR-218, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-29c, miR-328, miR-34c-3p, miR-34c-5p, miR-375, miR-383, miR-451, miR-452, miR-495, miR-584, miR-622, miR-656, miR-98, miR-124-3p, miR-181b-5p, miR-200b, 및/또는 miR-3189-3p에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 뇌암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 뇌암은 성상세포종, 교모세포종 또는 신경교종이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-10b-5p, miR-126-3p, miR-145-3p, miR-451a, miR-199b-5p, miR-5683, miR-3195, miR-3182, miR-1271-5p, miR-204-5p, miR-409-5p, miR-136-5p, miR-514a-5p, miR-559, miR-483-3p, miR-1-3p, miR-6080, miR-144-3p, miR-10b-3p, miR-6130, miR-6089, miR-203b-5p, miR-4266, miR-4327, miR-5694, miR-193b, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-100, miR-107, miR-10a, miR-10b, miR-122, miR-124, miR-1258, miR-125a-5p, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-129, miR-130a, miR-132, miR-133a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-146b, miR-147, miR-148a, miR-149, miR-152, miR-153, miR-15a, miR-16, miR-17-5p, miR-181a, miR-1826, miR-183, miR-185, miR-191, miR-193a-3p, miR-195, miR-199b-5p, miR-19a-3p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-205, miR-206, miR-211, miR-216b, miR-218, miR-22, miR-26a, miR-26b, miR-300, miR-30a, miR-31, miR-335, miR-339-5p, miR-33b, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374a, miR-379, miR-381, miR-383, miR-425, miR-429, miR-450b-3p, miR-494, miR-495, miR-497, miR-502-5p, miR-517a, miR-574-3p, miR-638, miR-7, miR-720, miR-873, miR-874, miR-92a, miR-98, miR-99a, mmu-miR-290-3p, 및/또는 mmu-miR-290-5p에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 유방암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-143, miR-145, miR-17-5p, miR-203, miR-214, miR-218, miR-335, miR-342-3p, miR-372, miR-424, miR-491-5p, miR-497, miR-7, miR-99a, miR-99b, miR-100, miR-101, miR-15a, miR-16, miR-34a, miR-886-5p, miR-106a, miR-124, miR-148a, miR-29a, 및/또는 miR-375에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 자궁경부암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-133a-5p, miR-490-5p, miR-124-3p, miR-137, miR-655-3p, miR-376c-3p, miR-369-5p, miR-490-3p, miR-432-5p, miR-487b-3p, miR-342-3p, miR-223-3p, miR-136-3p, miR-136-3p, miR-143-5p, miR-1-3p, miR-214-3p, miR-143-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-127-3p, miR-133a-3p, miR-145-5p, miR-145-3p, miR-199a-5p, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-100, miR-101, miR-126, miR-142-3p, miR-143, miR-145, miR-192, miR-200c, miR-21, miR-214, miR-215, miR-22, miR-25, miR-302a, miR-320, miR-320a, miR-34a, miR-34c, miR-365, miR-373, miR-424, miR-429, miR-455, miR-484, miR-502, miR-503, miR-93, miR-98, miR-186, miR-30a-5p, miR-627, let-7a, miR-1, miR-124, miR-125a, miR-129, miR-1295b-3p, miR-1307, miR-130b, miR-132, miR-133a, miR-133b, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-150-5p, miR-154, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-18a, miR-191, miR-193a-5p, miR-194, miR-195, miR-196a, miR-198, miR-199a-5p, miR-203, miR-204-5p, miR-206, miR-212, miR-218, miR-224, miR-24-3p, miR-26b, miR-27a, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-29b, miR-30a-3p, miR-30b, miR-328, miR-338-3p, miR-342, miR-345, miR-34a-5p, miR-361-5p, miR-375, miR-378, miR-378a-3p, miR-378a-5p, miR-409-3p, miR-422a, miR-4487, miR-483, miR-497, miR-498, miR-518a-3p, miR-551a, miR-574-5p, miR-625, miR-638, miR-7, miR-96-5p, miR-202-3p, miR-30a, 및/또는 miR-451에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 결장 또는 결장직장암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-101, miR-130a, miR-130b, miR-134, miR-143, miR-145, miR-152, miR-205, miR-223, miR-301a, miR-301b, miR-30c, miR-34a, miR-34c, miR-424, miR-449a, miR-543, 및/또는 miR-34b에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 자궁내막암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-125b, miR-138, miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-16-1, miR-16-1-3p, miR-16-2, miR-181a, miR-181b, miR-195, miR-223, miR-29b, miR-34b, miR-34c, miR-424, miR-10a, miR-146a, miR-150, miR-151, miR-155, miR-2278, miR-26a, miR-30e, miR-31, miR-326, miR-564, miR-27a, let-7b, miR-124a, miR-142-3p, let-7c, miR-17, miR-20a, miR-29a, miR-30c, miR-720, miR-107, miR-342, miR-34a, miR-202, miR-142-5p, miR-29c, miR-145, miR-193b, miR-199a, miR-214, miR-22, miR-137, 및/또는 miR-197에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 혈액학적 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 혈액학적 암은 백혈병, 림프종 또는 골수종이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-1, miR-145, miR-1826, miR-199a, miR-199a-3p, miR-203, miR-205, miR-497, miR-508-3p, miR-509-3p, let-7a, let-7d, miR-106a*, miR-126, miR-1285, miR-129-3p, miR-1291, miR-133a, miR-135a, miR-138, miR-141, miR-143, miR-182-5p, miR-200a, miR-218, miR-28-5p, miR-30a, miR-30c, miR-30d, miR-34a, miR-378, miR-429, miR-509-5p, miR-646, miR-133b, let-7b, let-7c, miR-200c, miR-204, miR-335, miR-377, 및/또는 miR-506에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 신장암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-1, miR-100, miR-101, miR-105, miR-122, miR-122a, miR-1236, miR-124, miR-125b, miR-126, miR-127, miR-1271, miR-128-3p, miR-129-5p, miR-130a, miR-130b, miR-133a, miR-134, miR-137, miR-138, miR-139, miR-139-5p, miR-140-5p, miR-141, miR-142-3p, miR-143, miR-144, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150-5p, miR-15b, miR-16, miR-181a-5p, miR-185, miR-188-5p, miR-193b, miR-195, miR-195-5p, miR-197, miR-198, miR-199a, miR-199a-5p, miR-199b, miR-199b-5p, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-202, miR-203, miR-204-3p, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-21, miR-21-3p, miR-211, miR-212, miR-214, miR-217, miR-218, miR-219-5p, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-29b-1, miR-29b-2, miR-29c, miR-302b, miR-302c, miR-30a, miR-30a-3p, miR-335, miR-338-3p, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-365, miR-370, miR-372, miR-375, miR-376a, miR-377, miR-422a, miR-424, miR-424-5p, miR-433, miR-4458, miR-448, miR-450a, miR-451, miR-485-5p, miR-486-5p, miR-497, miR-503, miR-506, miR-519d, miR-520a, miR-520b, miR-520c-3p, miR-582-5p, miR-590-5p, miR-610, miR-612, miR-625, miR-637, miR-675, miR-7, miR-877, miR-940, miR-941, miR-98, miR-99a, miR-132, 및/또는 miR-31에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 간암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 간암은 간세포 암종이다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-143-3p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1266-3p, miR-6130, miR-6080, miR-511-5p, miR-143-5p, miR-223-5p, miR-199b-5p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-451a, miR-142-5p, miR-144, miR-150-5p, miR-142-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-199a-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-1297, miR-141, miR-145, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-29b, miR-381, miR-409-3p, miR-429, miR-451, miR-511, miR-99a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-1, miR-101, miR-133b, miR-138, miR-142-5p, miR-144, miR-1469, miR-146a, miR-153, miR-15a, miR-15b, miR-16-1, miR-16-2, miR-182, miR-192, miR-193a-3p, miR-194, miR-195, miR-198, miR-203, miR-217, miR-218, miR-22, miR-223, miR-26a, miR-26b, miR-29c, miR-33a, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-365, miR-449a, miR-449b, miR-486-5p, miR-545, miR-610, miR-614, miR-630, miR-660, miR-7515, miR-9500, miR-98, miR-99b, miR-133a, let-7a, miR-100, miR-106a, miR-107, miR-124, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-126, miR-126*, miR-129, miR-137, miR-140, miR-143, miR-146b, miR-148a, miR-148b, miR-149, miR-152, miR-154, miR-155, miR-17-5p, miR-181a-1, miR-181a-2, miR-181b, miR-181b-1, miR-181b-2, miR-181c, miR-181d, miR-184, miR-186, miR-193b, miR-199a, miR-204, miR-212, miR-221, miR-224, miR-27a, miR-27b, miR-29a, miR-30a, miR-30b, miR-30c, miR-30d, miR-30d-5p, miR-30e-5p, miR-32, miR-335, miR-338-3p, miR-340, miR-342-3p, miR-361-3p, miR-373, miR-375, miR-4500, miR-4782-3p, miR-497, miR-503, miR-512-3p, miR-520a-3p, miR-526b, miR-625*, 및/또는 miR-96에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 폐암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 let-7b, miR-101, miR-125b, miR-1280, miR-143, miR-146a, miR-146b, miR-155, miR-17, miR-184, miR-185, miR-18b, miR-193b, miR-200c, miR-203, miR-204, miR-205, miR-206, miR-20a, miR-211, miR-218, miR-26a, miR-31, miR-33a, miR-34a, miR-34c, miR-376a, miR-376c, miR-573, miR-7-5p, miR-9, 및/또는 miR-98에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 흑색종을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 let-7d, miR-218, miR-34a, miR-375, miR-494, miR-100, miR-124, miR-1250, miR-125b, miR-126, miR-1271, miR-136, miR-138, miR-145, miR-147, miR-148a, miR-181a, miR-206, miR-220a, miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-32, miR-323-5p, miR-329, miR-338, miR-370, miR-410, miR-429, miR-433, miR-499a-5p, miR-503, miR-506, miR-632, miR-646, miR-668, miR-877, 및/또는 miR-9에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 구강암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 let-7i, miR-100, miR-124, miR-125b, miR-129-5p, miR-130b, miR-133a, miR-137, miR-138, miR-141, miR-145, miR-148a, miR-152, miR-153, miR-155, miR-199a, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-212, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-409-3p, miR-411, miR-429, miR-432, miR-449a, miR-494, miR-497, miR-498, miR-519d, miR-655, miR-9, miR-98, miR-101, miR-532-5p, miR-124a, miR-192, miR-193a, 및/또는 miR-7에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 난소암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-216a-5p, miR-802, miR-217, miR-145-3p, miR-143-3p, miR-451a, miR-375, miR-214-3p, miR-216b-3p, miR-432-5p, miR-216a-3p, miR-199b-5p, miR-199a-5p, miR-136-3p, miR-216b-5p, miR-136-5p, miR-145-5p, miR-127-3p, miR-199a-3p, miR-199b-3p, miR-559, miR-129-2-3p, miR-4507, miR-1-3p, miR-148a-3p, miR-101, miR-1181, miR-124, miR-1247, miR-133a, miR-141, miR-145, miR-146a, miR-148a, miR-148b, miR-150*, miR-150-5p, miR-152, miR-15a, miR-198, miR-203, miR-214, miR-216a, miR-29c, miR-335, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-373, miR-375, miR-410, miR-497, miR-615-5p, miR-630, miR-96, miR-132, let-7a, let-7a-1, let-7a-2, let-7a-3, let-7b, let-7c, let-7d, let-7e, let-7f-1, let-7f-2, let-7g, let-7i, miR-126, miR-135a, miR-143, miR-144, miR-150, miR-16, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-217, miR-218, miR-337, miR-494, 및/또는 miR-98에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 췌장암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 let-7a-3p, let-7c, miR-100, miR-101, miR-105, miR-124, miR-128, miR-1296, miR-130b, miR-133a-1, miR-133a-2, miR-133b, miR-135a, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-154, miR-15a, miR-187, miR-188-5p, miR-199b, miR-200b, miR-203, miR-205, miR-212, miR-218, miR-221, miR-224, miR-23a, miR-23b, miR-25, miR-26a, miR-26b, miR-29b, miR-302a, miR-30a, miR-30b, miR-30c-1, miR-30c-2, miR-30d, miR-30e, miR-31, miR-330, miR-331-3p, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-374b, miR-449a, miR-4723-5p, miR-497, miR-628-5p, miR-642a-5p, miR-765, 및/또는 miR-940에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 전립선암을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' UTR 또는 3' UTR로 삽입된 miR-101, miR-183, miR-204, miR-34a, miR-365b-3p, miR-486-3p, 및/또는 miR-532-5p에 대한 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피를 포함한다. 이 종양세포붕괴성 바이러스는 망막모세포종을 치료하기 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스이고, 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, 감마-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 및 US12로 이루어진 군으로부터 선택된다.
페이로드 분자
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스는 페이로드 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "페이로드 분자"는 바이러스의 치료학적 효율을 추가로 증대시킬 수 있는 분자를 지칭한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 페이로드 분자는 항원 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 사이토킨, 케모카인, 가용성 수용체, 세포 표면 수용체 리간드, 2부분 펩타이드, 효소 및 핵산(예를 들어, shRNA, siRNA, 안티센스 RNA, 안타고머, 리보자임, 압타머, 디코이 올리고뉴클레오타이드 또는 안타고머)을 포함한다. 페이로드 분자의 성질은 질환 유형 및 원하는 치료학적 결과에 따라 변할 것이다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 페이로드 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 3' 또는 5' UTR로 도입된다. 이러한 실시형태에서, 페이로드의 번역 및 후속하는 발현은 세포에서 발생하지 않거나 실질적으로 감소되고, 여기서 상응하는 miRNA는 발현된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA 표적 서열은 치료학적 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 3' 및/또는 5' UTR로 삽입된다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 내인성 miRNA, 유전자 또는 금속단백질분해효소의 조직 저해제(TIMP)의 발현을 감소시키거나 이의 기능을 저해하는 페이로드 분자를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 본 명세서에서 "게놈 편집" 또는 "미세환경 리모델링" 바이러스 또는 벡터라 칭해진다. 코딩된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 분해에 대한(예를 들어, 유비퀴틴화 및 단백분해 분해 또는 라이소좀 분해에 대한 표적화에 의해) 단백질(예를 들어, TIMP)의 표적화, 동족 수용체와의 상호작용의 차단(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 펩타이드 저해제의 차단), 메신저 RNA 전사체(예를 들어, 짧은 간섭 RNA 또는 짧은 헤어핀 RNA)의 분해, 및/또는 (예를 들어, 엔도뉴클레아제에 의한) 특정한 miRNA, 유전자 또는 단백질을 코딩하는 게놈 DNA 서열의 변경을 포함하는 임의의 수의 방식으로 miRNA, 유전자 또는 TIMP의 발현을 감소시키거나 이의 기능을 저해할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 발암 또는 전이에 관여된 miR 또는 유전자(예를 들어, 종양형성 miR 또는 종양유전자)의 발현을 감소시킨다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 종양형성 miRNA(예를 들어, 표 4에 수록된 miRNA 중 하나 이상)인 miRNA의 발현 또는 기능을 감소시키는 페이로드 분자를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 종양형성 miRNA의 발현 또는 기능을 감소시키는 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 적어도 1, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 복수의 종양형성 miRNA의 발현 또는 기능을 감소시키는 복수의 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 적어도 1, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR-17-92의 발현을 감소시키고, 폐암(예를 들어, 소세포 폐암)을 치료하도록 사용된다. 다른 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR-221 및/또는 miR-21의 발현을 감소시키고, 교모세포종을 치료하도록 사용된다. 소정의 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR-155 및/또는 miR-17-92의 발현을 감소시키고, 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 미만성 대형 B 세포 림프종, 변연대 림프종 또는 만성 림프구성 백혈병)을 치료하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR-221, miR-222, 및/또는 miR-146의 발현을 감소시키고, 갑상선암을 치료하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR-372 및/또는 miR-373의 발현을 감소시키고, 고환암(예를 들어, 고환 생식 세포 종양)을 치료하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR-18 및/또는 miR-224의 발현을 감소시키고, 간암(예를 들어, 간세포 암종)을 치료하도록 사용된다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 바이러스 벡터는 종양 세포외 기질(ECM)을 분해하는 페이로드 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 이것은 몇몇 양상에서 증대된 바이러스 전파를 발생시킨다. 기질 금속단백질분해효소(MMP)는 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로메리신 및 마트리라이신으로 이의 활성에 기초하여 분류되는 아연 의존적 프로테아제이다. 이들 프로테아제는 일반적으로 전효소(치모겐)로서 분비되고, 프로-펩타이드 프로-도메인의 단백질분해 제거에 의해 활성화된다. MMP가 암에서 작용하는 1차 역할은 종양 침윤 및 전이를 촉진하는 ECM의 분해이다. MMP는 종양 진행, 중배엽으로의 상피 이행(EMT) 및 혈관신생에 또한 관여된다. MMP는 miR, 및 4개의 프로테아제 저해제(TIMP1, TIMP2, TIMP3 및 TIMP4)의 패밀리를 포함하는 TIMP에 의해 조절된다. 종양 미세환경의 넓은 어레이는 본 발명의 재조합 바이러스 벡터로 MMP 패밀리를 부정적으로 조절하는 miRNA 또는 TIMP를 파괴함으로써 분해될 수 있다. miR/MMP 상호작용의 예는 표 5에 기재되어 있다. 많은 이들 상호작용은 다수의 MMP가 단일 miRNA에 의해 조절된다는 것을 보여준다: 예를 들어, let-7은 MMP-2, MMP-9 및 MMP-14를 조절하고; miR-143은 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13을 조절하고; miR-218은 MMP-2, MMP-7 및 MMP-9를 조절한다. 더구나, 아주 대부분의 MMP는 단일 TIMP 마스터 스위치에 의해 조절될 수 있다: 예를 들어, TIMP1은 대부분의 모든 공지된 MMP를 저해한다고 공지되어 있고, 또한 넓은 범위의 세포 유형에서 세포 증식을 촉진하고; TIMP2는 MMP-14 및 MMP-2와 상호작용한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 특히 종양 미세환경(예를 들어, 표 5에 수록된 miRNA 중 하나 이상)에서 세포외 기질을 변경할 수 있는 또는 세포외 기질을 변경하는 경로를 조절할 수 있는 miRNA의 발현 또는 기능을 감소시키는 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 미세환경 리모델링 miR은 miR을 지칭한다. 몇몇 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 하나의 미세환경 리모델링 miR의 발현 또는 기능을 감소시킨다. 몇몇 실시형태에서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 또는 초과의 미세환경 리모델링 miR의 발현 또는 기능을 감소시킨다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 복수의 미세환경 리모델링 miR의 발현 또는 기능을 감소시키는 복수의 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 전략은 MMP를 부정적으로 조절하는 miR 또는 TIMP의 발현 또는 기능을 넉아웃 또는 파괴시키도록 본 발명의 재조합 바이러스 벡터에 의해 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 TIMP1, TIMP2, TIMP3 및 TIMP4로부터 선택된 TIMP의 발현을 감소시킨다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 숙주 세포 게놈에서 유전자의 발현 또는 기능을 감소시키는 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 양상에서, 유전자는 종양형성 유전자(예를 들어, 표 7에 기재된 유전자로부터 선택된 유전자)이다. 몇몇 양상에서, 유전자는 종양형성 miR(예를 들어, 표 4에 수록된 miRNA), 미세환경 리모델링 miR(예를 들어, 표 5에 수록된 miRNA), 또는 ECM-분해의 음성 조절자(예를 들어, TIMP)를 코딩한다. 유전자 발현 및/또는 기능의 감소는 전사의 수준에서(예를 들어, 게놈 DNA 서열의 돌연변이, 결실 또는 침묵화) 또는 번역의 수준에서(예를 들어, mRNA 분해를 통한 유전자 산물의 제조를 저해함으로써) 달성될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 유전자 서열의 전사의 돌연변이, 결실 또는 억제가 가능하게 함으로써 유전자의 발현 또는 기능을 감소시키는 뉴클레아제를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 뉴클레아제는 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복배열(CRISPR) 연관된 엔도뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)로부터 선택된다. 비제한적인 예에서, CRISPR 연관된 엔도뉴클레아제는 SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9, C2C1, C2C3, Cpf1, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csnl 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3 및 Csf4로부터 선택된다.
본 발명의 재조합 바이러스 벡터는, 포유류 게놈 조작에 사용될 수 있는 박테리아 시스템에 기초한 조작된 뉴클레아제 시스템인, CRISPR(규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복배열)/Cas(CRISPR 연관된) 뉴클레아제 시스템을 사용할 수 있다. 일반적으로, 상기 시스템은 Cas 뉴클레아제 및 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. gRNA는 2개의 부분으로 이루어진다; 표적 게놈 DNA 서열에 특이적인 crispr-RNA(crRNA), 및 Cas 결합을 수월하게 하는 tracr RNA(trRNA). crRNA 및 trRNA는 별개의 RNA 올리고뉴클레오타이드로 존재할 수 있거나, 단일 가이드-RNA(sgRNA)라 칭하는 동일한 RNA 올리고뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 개별 trRNA 및 개별 crRNA 또는 sgRNA의 조합을 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Cong et al. (2013) Science 339:819-823; Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Qi et al. (2013) Cell 152:1173-1183; Jinek et al. (2013), eLife 2:e00471; David Segal (2013) eLife 2:e00563; Ran et al. (2013) Nature Protocols 8(11):2281-2308; Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771]; PCT 공보 WO 제2007/025097호, WO 제2008/021207호, WO 제2010/011961호, WO 제2010/054108호, WO 제2010/054154호, WO 제2012/054726호, WO 제2012/149470호, WO 제2012/164565호, WO 제2013/098244호, WO 제2013/126794호, WO 제2013/141680호 및 WO 제2013/142578; 미국 특허 공보 제2010-0093617호, 제2013-0011828호, 제2010-0257638호, 제2010-0076057호, 제2011-0217739호, 제2011-0300538호, 제2013-0288251호 및 제2012-0277120; 및 미국 특허 제8,546,553호(이들의 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)를 참조한다.
I형 및 III형 시스템을 포함하는 다수의 종류 1 CRISPR-Cas 시스템은 확인되었고 상세히 기능적으로 규명되어서, 복합체 구성 및 효과기 복합체의 역할을 밝혀냈다(Brouns et al., 2008, Marraffini and Sontheimer, 2008, Hale et al., 2009, Sinkunas et al., 2013, Jackson et al., 2014, Mulepati et al., 2014). 또한, 효과기로서 Cas9 패밀리의 상동성 RNA-가이드 엔도뉴클레아제를 사용하는 여러 종류 2-II형 CRISPR-Cas 시스템은 또한 확인되었고 실험적으로 규명되었다(Barrangou et al., 2007, Garneau et al., 2010, Deltcheva et al., 2011, Sapranauskas et al., 2011, Jinek et al., 2012, Gasiunas et al., 2012). 둘째로, 추정상 종류 2-V형 CRISPR-Cas 시스템은 몇몇 박테리아 게놈에서 최근에 확인되었다. 추정상 V형 CRISPR-Cas 시스템은 Cpf1이라 불리는 큰 약 1,300개의 아미노산 단백질(프레보텔라 및 프란시셀라 1로부터의 CRISPR)을 함유한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스는 miRNA 또는 TIMP에 표적화된 trRNA 및 crRNA를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 몇몇 경우에, trRNA 및 crRNA를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 게놈에서 유전좌위로 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 절연체 또는 네이티브 바이러스(예를 들어, HSV) 절연체를 포함하는 절연된 서열이다. 소정의 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스이고, RNA 결합 부위를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 (이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT, ICP4 및 ICP47 촉진자의 각각의 1개의 카피를 포함하는) 내부 반복 연결 영역, ICP0, LAT, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, 감마-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 및 US12를 포함하는 하나 이상의 유전좌위로 또는 이들 사이로 삽입된다. 일 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)이고, RNA 결합 부위를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 UL3 및 UL4 오픈 리딩 프레임 사이의 유전좌위로 삽입된다(예를 들어, 도 39 및 도 40).
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 항종양 면역 반응을 활성화하거나 증대시키는 페이로드 분자를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 페이로드 분자는 사이토킨, 케모카인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중특이적 T 세포 관여항체(BiTE)이다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 페이로드 분자는 면역 관문 수용체(예를 들어, CTLA4, LAG3, PD1, PDL1 및 기타)에 결합하고 이를 저해하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 페이로드 분자는 항-PD1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-PDL1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
몇몇 실시형태에서, 페이로드 분자는 세포 표면 수용체에 결합하고 이를 활성화하는 단백질이다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 페이로드 분자는 내인성 세포 표면 리간드, 예컨대, 41BBL의 세포외 도메인, CD40L, FLT3L의 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 페이로드 분자는 사이토킨(예를 들어, IFNγ, IFNα, IFNβ, TNFα, IL-12, IL-2, IL-6, IL-8, IL-15, GM-CSF, IL-21, IL-35, TGFβ 및 기타) 또는 케모카인(예를 들어, CCL4, CXCL10, CCL5, CXCL13 또는 XCL1)이다.
몇몇 실시형태에서, 페이로드 분자는 활성화 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγIIa, FcγIIIa, 동시자극 수용체 및 기타)에 결합하고 이를 활성화하는 단백질이다. 특정한 실시형태에서, 단백질은 EpCAM, 폴레이트, A2A, 항-FGF2, 항-FGFR/FGFR2b, 항-SEMA4D, CD137, CD200, CD38, CD44, CSF-1R, 엔도텔린 B 수용체, ISRE7, LFA-1, NG2(SPEG4로도 공지됨), SMAD, STING 및 VCAM1로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, miRNA, 유전자 또는 TIMP의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스의 바이러스 게놈에서 유전좌위로 삽입된다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 합성 절연체 또는 네이티브 바이러스(예를 들어, HSV) 절연체를 포함하는 절연된 서열이다. 소정의 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스이고, RNA 결합 부위를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 내부 반복 연결 영역(이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT, ICP4 및 ICP47 촉진자의 각각의 1개의 카피를 포함), ICP0, LAT, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, 감마-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 및 US12를 포함하는 하나 이상의 유전좌위로 또는 이들 사이로 삽입된다. 일 실시형태에서, 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)이고, 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 UL3 및 UL4 오픈 리딩 프레임 사이의 유전좌위로 삽입된다(예를 들어, 도 39 및 도 40 참조).
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 프로테아제-활성화된 항체, 예컨대, 문헌[Metz et al. (Protein Eng Des Sel, 25(10):571-80, 2012]에 의해 기재된 것은 활성화되고, 보호 캡의 프로테아제 절단 이후에 표적에 오직 결합한다. 몇몇 경우에, 종양 미세환경은 둘러싼 건강한 조직으로부터 잘 분화된 프로테아제의 어레이를 보유한다. 예를 들어, 프로테아제 카텝신 B는 많은 암, 예를 들어, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 위암, 두경부암, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 갑상선암에서 과발현된다. 인간 세포에 의해 합성된 프로테아제의 완전한 목록으로 이루어진 인간 단백질 분해 효소체(degradome)는 (가장 큰 수부터 가장 작은 수의 순서로) 5개의 광범위한 종류로 분포된 적어도 569개의 프로테아제로 이루어진다: 금속단백질분해효소(MMP), 세린, 시스테인, 트레오닌 및 아스파르틱 프로테아제(Lopez-Otin et al., Nat Rev Cancer, 7(10):800-8, 2007). 특히, MMP가 세포의 세포외 및 세포주변 구역에서 발견되면서, MMP에 의해 특이적으로 절단된 프로테아제 항체는 종양 미세환경으로 본 명세서에 기재된 재조합 바이러스 벡터를 표적화하는 것의 훌륭한 수단을 제공할 수 있다. 표 6은 프로테아제-활성화된 항체와 위형화된 재조합 바이러스 벡터의 특이적 결합이 가능하도록 이용될 수 있는 암에서 과발현된 프로테아제를 요약한다.
소정의 실시형태에서, 프로테아제-활성화된 항체는 바이러스 당단백질 엔벨로프로 도입된다. 프로테아제-활성화된 항체는 치료학적 지수를 증가시키고 오프 타깃 감염을 감소시키도록 본 발명의 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, HSV 벡터)의 당단백질 엔벨로프로 도입될 수 있다. HSV 벡터의 경우에, 몇몇 실시형태에서, 당단백질은 gC 또는 gD일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 프로테아제-활성화된 항체를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 프로테아제-활성화된 항체는 시스테인 카텝신, 아스파르틱 카텝신, 칼리크레인(hK), 세린 프로테아제, 카스파제, 기질 금속단백질분해효소(MMP) 및 디스인테그린 및 금속단백질분해효소(ADAM)로부터 선택된 프로테아제에 의해 활성화된다. 몇몇 실시형태에서, 프로테아제는 카텝신 K, 카텝신 B, 카텝신 L, 카텝신 E, 카텝신 D, hK1, PSA(hK3), hK10, hK15, uPA, uPAR, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23A, MMP-23B, MMP-24, MMP-25, MMP-26, MMP-27, MMP-28, 또는 표 6에 수록된 프로테아제로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 프로테아제-활성화된 항체는 비암 세포에 의해 또는 비암 미세환경에서보다 암 세포에 의해 또는 암 미세환경에서 매우 고도로 발현된 단백질에 결합한다. 소정의 양상에서, 프로테아제-활성화된 항체는 NKG2D, c-met, HGFR, CD8, 황산 헤파란, VSPG4(NG2로도 공지됨), EGFR, EGFRvIII, CD133, CXCR4, 암배아성 항원(CEA), CLC-3, 아넥신 II, 인간 트랜스페린 수용체 또는 EpCAM에 결합한다. 소정의 경우에, 다수의 프로테아제 활성화된 항체는 다양한 종양 히스토형태가 표적화되게 보장하도록 단일 바이러스 벡터 입자로 도입될 수 있다. 예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 프로테아제 활성화된 항체는 바이러스 당단백질 엔벨로프로 도입될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 프로테아제 활성화된 항체를 코딩하는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 초과의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 비암 세포에 의해 또는 비암 미세환경에서보다 암 세포에 의해 또는 암 미세환경에서 더 고도로 발현된 제1 단백질에 결합하는 제1 프로테아제-활성화된 항체 및 비암 세포에 의해 또는 비암 미세환경에서보다 암 세포에 의해 또는 암 미세환경에서 더 고도로 발현된 제2 단백질에 결합하는 제2 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 비암 세포에 의해 또는 비암 미세환경에서보다 암 세포에 의해 또는 암 미세환경에서 더 고도로 발현된 복수의 단백질에 결합하는 복수의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 종양세포붕괴성 바이러스는, 예를 들어, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체인 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 전장 면역글로불린, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 다이아바디, 트리아바디, 미니바디, 단일 도메인 항체 또는 이중특이적 항체인 항체를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 마이크로-RNA(miR) 표적 서열; 하나 이상의 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(여기서, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR, 유전자 또는 TIMP의 발현을 감소시키거나 이의 기능을 저해함); 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체; 및/또는 적어도 하나의 프로테아제 활성화된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 비암성 세포에서 바이러스 복제에 필요한 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피; 및/또는 종양형성 miRNA 또는 종양형성 유전자의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 미세환경 리모델링 miRNA 또는 TIMP의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 비암성 세포에서 바이러스 복제에 필요한 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피; 및/또는 종양형성 miRNA 또는 종양형성 유전자의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 비암성 세포에서 바이러스 복제에 필요한 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피; 및/또는 미세환경 리모델링 miRNA 또는 TIMP의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 비암성 세포에서 바이러스 복제에 필요한 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 miRNA 표적 서열의 복수의 카피; 및/또는 종양형성 miRNA 또는 종양형성 유전자의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 미세환경 리모델링 miRNA 또는 TIMP의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 몇몇 구체적인 실시형태에서, 이 문단에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스이고, 비암성 세포에서 바이러스 복제에 필요한 바이러스 유전자는 UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, 감마-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 및 US12이다.
소정의 양상에서, 본 발명은 종양형성 miRNA 또는 종양형성 유전자의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및 미세환경 리모델링 miRNA 또는 TIMP의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 종양형성 miRNA 또는 종양형성 유전자의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 미세환경 리모델링 miRNA 또는 TIMP의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 재조합 종양세포붕괴성 바이러스는 종양형성 miRNA 또는 종양형성 유전자의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 미세환경 리모델링 miRNA 또는 TIMP의 발현을 감소시키도록 표적화된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP4의 3' UTR로 삽입된 제1 miR-TS 카세트; miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR128-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP27의 3' UTR로 삽입된 제2 miR-TS 카세트; 및 miR-137-3p, miR-208b-3p 및 miR-126-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 UL8의 3' UTR로 삽입된 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 XCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 CCL4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 FLT3L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 41BBL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 41BBL 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 843, 844, 847 또는 848의 하나와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 843, 844, 847 또는 848의 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP4의 3' UTR로 삽입된 제1 miR-TS 카세트; miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR128-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP27의 3' UTR로 삽입된 제2 miR-TS 카세트; miR-137-3p, miR-208b-3p 및 miR-126-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 UL8의 3' UTR로 삽입된 제3 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 XCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 CCL4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 FLT3L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 41BBL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 41BBL 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 845 또는 846과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 845 또는 846의 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP4의 3' UTR로 삽입된 제1 miR-TS 카세트; miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR128-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP27의 3' UTR로 삽입된 제2 miR-TS 카세트; miR-137-3p, miR-208b-3p 및 miR-126-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 UL8의 3' UTR로 삽입된 제3 miR-TS 카세트; 및 miR-128-3p, miR-204-5p 및 miR-219a-5p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP34.5의 3' UTR로 삽입된 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 XCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 CCL4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 FLT3L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 41BBL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 41BBL 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 850과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 850의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP4의 3' UTR로 삽입된 제1 miR-TS 카세트; miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR128-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP27의 3' UTR로 삽입된 제2 miR-TS 카세트; miR-137-3p, miR-217-5p 및 miR-126-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 UL8의 3' UTR로 삽입된 제3 miR-TS 카세트; 및 miR-128-3p, miR-204-5p 및 miR-219a-5p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP34.5의 3' UTR로 삽입된 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 XCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 CCL4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 FLT3L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 41BBL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 41BBL 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 849와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 849의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 miR-124-3p, miR-1-3p 및 miR-143-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP4의 3' UTR로 삽입된 제1 miR-TS 카세트; miR-219a-5p, miR-122-5p 및 miR128-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP27의 3' UTR로 삽입된 제2 miR-TS 카세트; miR-137-3p, miR-217-5p 및 miR-126-3p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 UL8의 3' UTR로 삽입된 제3 miR-TS 카세트; 및 miR-128-3p, miR-204-5p 및 miR-219a-5p의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는 ICP34.5의 3' UTR로 삽입된 제4 miR-TS 카세트를 포함하는 HSV 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CXCL10을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 CXCL10 및 MMP9를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 XCL1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 CCL4를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12, CXCL10 및 FLT3L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 41BBL을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 IL-12 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 41BBL 및 CD40L을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 항-PD1 또는 항-PDL1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 851과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 종양세포붕괴성 바이러스는 서열번호 851의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
조성물 및 사용 방법
본 발명의 소정의 양상은 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스를 포함하는 스톡 및 조성물에 관한 것이다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스를 포함하는 바이러스 스톡에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 스톡은 균질한 스톡이다. 바이러스 스톡의 제조 및 분석은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 바이러스 스톡은 바이러스 벡터로 형질도입된 세포를 함유하는 롤러 병에서 제조될 수 있다. 바이러스 스톡은 이어서 연속 니코덴즈(nycodenze) 구배에서 정제되고, 분취되고, 필요한 바대로 저장될 수 있다. 바이러스 스톡은 주로 바이러스 유전자형 및 프로토콜 및 이들을 제조하기 위해 사용된 세포주에 따라 역가에서 상당히 변한다.
특정한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 바이러스 스톡(예를 들어, HSV 기반 벡터 바이러스 스톡)의 역가는 적어도 약 105 플라크 형성 단위(pfu), 예컨대, 적어도 약 106 pfu 또는 심지어 더 바람직하게는 적어도 약 107 pfu이다. 소정의 실시형태에서, 역가는 적어도 약 108 pfu 또는 적어도 약 109 pfu일 수 있고, 적어도 약 1010 pfu 또는 적어도 약 1011 pfu의 높은 역가 스톡이 가장 바람직하다.
본 발명은 추가로 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스 또는 핵산 분자 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 고려한다. 구절 "약제학적으로 허용 가능한"은 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 집합체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바대로 용어 "조성물"은 대상체 및/또는 세포에 투여되거나 전달될 수 있는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 종양세포붕괴성 바이러스 또는 핵산 분자의 제형을 지칭한다. 통상적으로, 제형은 이의 유도체 및/또는 프로드럭, 용매화물, 입체이성질체, 라세메이트 또는 호변이성질체와 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함하는 모든 생리학적으로 허용 가능한 조성물을 포함한다. (본 명세서에서 교환 가능하게 사용되는) "치료학적 조성물" 또는 "약제학적 조성물"은 특정한 질환 또는 장애의 치료를 위해 환자 및/또는 대상체 및/또는 세포에게 투여되거나 전달될 수 있는 하나 이상의 물질의 조성물이다.
본 명세서에 개시된 조성물은 천연 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한 염"은 산 및 염기 부가염 둘 다를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 (단백질의 유리 아미노기로부터 형성된) 산 첨가 염을 포함하고, 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예컨대, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄퍼산, 캄퍼-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 폼산, 퓨마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글라이세로인산, 글라이콜산, 히푸르산, 아이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피류브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산, 운데사이클렌산 등(이들로 제한되지는 않음)으로 형성된다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등으로부터 유래될 수 있다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민의 염, 치환된 아민, 예를 들어, 천연 발생 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대, 암모니아, 아이소프로필아민, 트리메틸아민, 다이에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 다이에탄올아민, 에탄올아민, 데안올(deanol), 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 베네타민, 벤자틴, 에틸렌다이아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특히 바람직한 유기 염기는 아이소프로필아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 다이사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다. 제형화 시, 용액은 치료학적 유효량으로 투약량 제형과 알맞는 방식으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여형, 예컨대, 주사용 용액, 약물 방출 캡슐 등에서 쉽게 투여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제, 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 관습적인 매질 또는 물질이 활성 성분과 맞지 않는 한을 제외하고, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고안된다. 보충 활성 성분은 또한 조성물로 혼입될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는, 제한 없이, 생리학적으로 상용성인 임의의 애쥬번트, 담체, 부형제, 유동화제, 감미료, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향 증대제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장화제, 용매, 계면활성제, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제, 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지 및/또는 인간 및/또는 가축 동물에서의 사용에 허용 가능한 것으로 미국 식품의약청이 허가한 유화제를 포함한다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글라이콜, 예컨대, 프로필렌 글라이콜; 폴리올, 예컨대, 글라이세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글라이콜; 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원 비함유 물; 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알코올; 포스페이트 완충제 용액; 및 약제학적 제형에서 사용되는 임의의 다른 상용성 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 임의의 관습적인 매질 및/또는 물질이 본 개시내용의 물질과 맞지 않는 한을 제외하고, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고안된다. 보충 활성 성분은 또한 조성물로 혼입될 수 있다.
습윤제, 유화제 및 윤활유, 예컨대, 황산 라우릴 나트륨 및 스테아르산마그네슘, 및 착색제, 방출제, 코팅제, 감미료, 향료 및 향수, 보존제 및 항산화제는 또한 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설파이트, 나트륨 메타설파이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 뷰틸화 하이드록시아니솔(BHA), 뷰틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
일 실시형태에서, 담체를 포함하는 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 혈관내(정맥내 또는 동맥내), 복강내 또는 근육내 투여에 적합하다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 무균 수성 용액 또는 분산액 및 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 무균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 물질의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 관습적인 매질 또는 물질이 바이러스 벡터 또는 핵산 분자와 맞지 않는 한을 제외하고, 본 발명의 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고안된다.
본 발명의 조성물은, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양상과 조합되어, 세포 또는 동물에 대한 투여를 위해, 약제학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액에서 제형화된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 감염된 세포 등을 포함할 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 조성물이 또한 다른 물질, 예를 들어, 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 작은 분자 또는 다양한 약제학적 활성제와 조합되어 투여될 수 있다고 또한 이해될 것이다. 조성물에 또한 포함될 수 있는 다른 성분에 실제로 제한이 없고, 단 추가 물질은 의도된 치료제를 전달하는 조성물의 능력에 불리하게 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은, 다양한 치료 요법에서 본 명세서에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투약 및 치료 요법의 발생이 있으면서, 당업자에게 널리 공지되어 있다. 제형화 시, 용액은 증상의 개선 또는 교정을 발생시키기에 치료학적 유효량으로 투약량 제형과 알맞는 방식으로 투여된다. 제형은 다양한 투여형, 예컨대, 섭취 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등에서 쉽게 투여된다. 투약량의 약간의 변동은 치료되는 대상체의 컨디션에 따라 발생할 수 있다. 투여를 책임지는 사람은 임의의 경우에 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 수 있다. 게다가, 인간 투여를 위해, 제조는 FDA 생물학 평가 연구 센터(Center for Biologics Evaluation and Research) 기준이 요구하는 바대로 무균성, 일반 안전성 및 순도 기준을 만족시킨다. 투여 경로는 자연적으로 치료되는 질환의 위치 및 성질에 따라 변할 것이고, 예를 들어, 진피내, 진피경유, 진피하, 비경구, 비강, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 피부주위, 기관내, 복강내, 종양내, 점적주사, 세척, 직접 주사 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
소정의 상황에서, 본 명세서에 개시된 조성물, 재조합 바이러스 벡터 및 핵산 분자를, 예를 들어, 미국 특허 제5,543,158호; 미국 특허 제5,641,515호 및 미국 특허 제5,399,363호(각각은 구체적으로 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)에 기재된 바대로 비경구로, 정맥내로, 근육내로 또는 심지어 복강내로 전달하는 것이 바람직할 것이다. 유리 염기 또는 약물학적으로 허용 가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대, 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에 제조될 수 있다. 분산액은 글라이세롤, 액체 폴리에틸렌 글라이콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에 또한 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일상의 조건하에, 이 조제는 미생물의 성장을 막는 보존제를 함유한다.
주사용 사용에 적합한 약제학적 형태는 무균 수성 용액 또는 분산액 및 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 무균 분말을 포함한다(미국 특허 제5,466,468호, 구체적으로 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨). 모든 경우에, 형태는 무균이어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 이것은 제조 및 저장의 조건하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 그리고 계면활성제의 사용에 의해 필요한 입자 크기의 유지에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 수월해질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물의 사용에 의해 생길 수 있다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당해 분야에서 널리 이해된다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사용으로 제조되고; 주사 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 조제는 또한 유화될 수 있다.
수성 용액에서의 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요한 경우 적합하게 완충되고 액체 희석제는 처음에 충분한 식염수 또는 글루코스와 등장성이 되어야 한다. 이들 특정한 수성 용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 연결되어, 사용될 수 있는 무균 수성 매질은 본 개시내용의 견지에서 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투약량은 1㎖의 등장성 NaCl 용액 중에 용해되고, 1000㎖의 피하주입 유체에 첨가되거나 점적주사의 제안된 부위에서 주사될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000] 참조). 투약량의 약간의 변동은 반드시 치료되는 대상체의 컨디션에 따라 발생할 수 있다. 투여를 책임지는 사람은 임의의 경우에 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 게다가, 인간 투여를 위해, 제조는 FDA 생물학 평가 연구 센터기준이 요구하는 바대로 무균성, 발열성 및 일반 안전성 및 순도 기준을 만족시킨다.
무균 주사용 용액은 필요한 바대로 열거된 다양한 다른 성분을 갖는 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입하고, 이후 무균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 무균화된 활성 성분을 상기 열거된 것으로부터 염기성 분산액 매질 및 필요한 다른 성분을 함유하는 무균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 무균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가 원하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다.
소정의 실시형태에서, 조성물은 비강내 스프레이, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 펩타이드 조성물을 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐에 직접적으로 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,756,353호 및 미국 특허 제5,804,212호(각각은 구체적으로 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)에 기재되어 있다. 마찬가지로, 비강내 마이크로입자 수지(Takenaga et al., 1998) 및 라이소포스파티딜-글라이세롤 화합물(미국 특허 제5,725,871호, 구체적으로 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)을 사용한 약물의 전달은 약제학적 분야에 또한 널리 공지되어 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스의 형태의 점막경유 약물 전달은 미국 특허 제5,780,045호(구체적으로 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)에 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, 전달은, 적합한 숙주 세포로의 본 발명의 조성물의 도입을 위해, 선택적으로 CPP 폴리펩타이드 등과 혼합하여, 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로구, 지질 입자, 베시클의 사용에 의해 생길 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포솜, 베시클, 나노구, 나노입자 등에서 캡슐화된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 제형 및 이러한 전달 비히클의 사용은 공지된 및 관습적인 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 제형 및 조성물은, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양상과 조합되어, 세포 또는 동물에 대한 투여를 위해, 약제학적으로 허용 가능한 또는 생리학적으로 허용 가능한 용액(예를 들어, 배양 배지)에서 제형화된, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 하나 이상의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 작은 분자를 포함할 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 조성물이 또한 다른 물질, 예를 들어, 세포, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다양한 약제학적 활성제와 조합되어 투여될 수 있다고 또한 이해될 것이다.
특정한 실시형태에서, 본 발명에 따른 제형 또는 조성물은, 본 명세서에 고려되는 바와 같은, 임의의 수의 폴리뉴클레오타이드 또는 바이러스 벡터의 조합과 접촉된 세포를 포함한다.
소정의 양상에서, 본 발명은 바이러스 벡터 시스템의 전달에 적합한 제형 또는 조성물을 제공한다.
생체외 전달에 예시적인 제형은 또한 당해 분야에 공지된 다양한 형질주입 물질, 예컨대, 인산칼슘, 전기천공, 열 쇼크 및 다양한 리포솜 제형(즉, 지질 매개된 형질주입)의 사용을 포함할 수 있다. 리포솜은 수성 유체의 분획을 포획하는 지질 이중층이다. DNA는 (이의 전하에 의해) 양이온성 리포솜의 외부 표면에 저절로 회합하고, 이 리포솜은 세포막과 상호작용할 것이다.
본 발명의 특정한 실시형태는 다른 제형, 예컨대, 약제학적 분야에 널리 공지되고, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000]에 기재된 것을 포함할 수 있다.
소정의 양상에서, 본 발명은, 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지)와 함께 제형화된, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 치료학적 유효량의 하나 이상의 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 조성물을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "치료학적 유효량"은 원하는 생리학적 및/또는 생물학적 결과를 달성하는 데 필요한 본 명세서에 기재된 조성물 또는 재조합 바이러스의 양을 지칭한다. 바이러스, 바이러스 스톡 또는 조성물의 "치료학적 유효량"은 개인의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개인에서 원하는 반응을 유발하는 줄기 및 선구체 세포의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 치료학적으로 유리한 효과가 바이러스 또는 형질도입된 치료학적 세포의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 것이다. 용어 "치료학적 유효량"은 대상체(예를 들어, 환자)를 "치료"하기에 효과적인 양을 포함한다. 치료학적 유효량은 플라크 형성 단위(pfu)의 전체 수(예를 들어, 적어도 1e1 내지 적어도 1e20, 특히 약 1e4 내지 약 1e15, 더 특히 약 1e6 내지 약 1e12 pfu), 또는 바이러스 게놈의 수(예를 들어, 적어도 1e1 내지 적어도 1e20, 특히 약 1e4 내지 약 1e15, 더 특히 약 1e6 내지 약 1e12 바이러스 게놈)에 의해 정량화될 수 있다. 당업자는 치료학적 유효량이 투여되는 바이러스의 유형, 제형의 성질, 투여 경로, 치료되는 질환의 성질 및/또는 중증도, 및/또는 대상체의 일반 건강 및 웰빙에 기초하여 변할 것이라는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 몇몇 양상은 종양세포붕괴성 바이러스가 상기 암성 세포 내에 감염시키고 복제하기에 충분한 조건 하에 암성 세포를 본 명세서에 기재된 종양세포붕괴성 바이러스 또는 이의 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는 암성 세포를 사멸하는 방법을 포함하고, 여기서 암성 세포 내의 종양세포붕괴성 바이러스의 복제는 세포사를 발생시킨다. 소정의 실시형태에서, 암성 세포는 비암성 세포와 비교하여 miR의 감소된 발현을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 이 방법에 의해 사멸된 암성 세포는 생체내이다. 소정의 실시형태에서, 이 방법에 의해 사멸된 암성 세포는 종양 내이다.
본 발명은 예방학적 유효량 또는 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양세포붕괴성 바이러스, 바이러스 스톡 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "대상체"는 본 명세서에 개시된 재조합 바이러스 벡터, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험실 동물(예컨대, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그), 농장 동물(예컨대, 말 또는 소), 및 가축 동물 또는 애완동물(예컨대, 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는, 인간 환자가 포함된다.
"투여"는 본 명세서에서 대상체로 종양세포붕괴성 바이러스, 바이러스 스톡 또는 이의 조성물을 도입하거나, 종양세포붕괴성 바이러스, 바이러스 스톡 또는 이의 조성물을 세포 및/또는 조직과 접촉시키는 것을 지칭한다. 투여는 주사, 세정(irrigation), 흡입, 소비, 전기침투, 혈액투석, 이온영동법, 및 당해 분야에 공지된 다른 방법에 의해 발생할 수 있다. 투여 경로는 자연적으로 치료되는 질환의 위치 및 성질에 따라 변할 것이고, 예를 들어, 귀, 협측, 결막, 피부, 이, 자궁경부내, 동내, 기관내, 장, 경막외, 간질성, 관절내, 동맥내, 복부내, 귀내, 담도내, 기관지내, 혈액낭내, 해면체내, 대뇌내, 수조내, 각막내, 치관내, 관상동맥내, 두개내, 진피내, 디스크내, 관내, 십이지장내, 십이지장내, 경막내, 심외막내, 표피내, 식도내, 위내, 치은내, 간내, 회장내, 병변내, 설내, 강내, 림프내, 유방내, 수질내, 뇌막내, 근육내, 비강내, 결절내, 눈내, 장맥내, 난소내, 복강내, 심낭내, 흉강내, 전립선내, 폐내, 공간내, 부비강내, 척수내, 윤활막내, 힘줄내, 고환내, 기관내, 척추강내, 흉곽내, 관내, 종양내, 고실내, 자궁내, 복강내, 혈관내, 심실내, 방광내, 전정내, 정맥내, 유리체내, 후두, 비강, 비위, 경구, 눈, 구강인두, 장관외, 피부주위, 관절주위, 경막주위, 신경주위, 치주, 호흡기, 관뒤, 직장, 척추, 지주막, 결막하, 피하, 진피하, 치은연하, 설하, 점막하, 망막하, 국소, 진피경유, 심장내경유, 점막경유, 태반경유, 기관경유, 고실경유, 요관, 요도, 및/또는 질 관류, 세척, 직접적인 주사, 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
용어 "치료하는" 및 "치료"는 본 명세서에 사용된 바대로 대상체가 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 개선을 갖도록 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 바이러스 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 개선은 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 임의의 개선 또는 교정이다. 개선은 관찰 가능한 또는 측정 가능한 개선이거나, 대상체의 일반적인 웰빙 느낌의 개선일 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질환 병태를 개선할 수 있지만, 질환의 완전한 치유가 아닐 수 있다는 것을 인식한다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 달성하기에 효과적인 바이러스, 바이러스 스톡 또는 조성물의 양을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "예방"은 질환의 증상의 완전한 예방, 질환의 증상의 발생의 지연, 또는 후속하여 발생하는 질환 증상의 중증도의 약화를 의미할 수 있다. 반드시는 아니지만, 통상적으로, 질환의 초기 단계에서 또는 그 전에 대상체에서 예방학적 용량이 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 작다.
"암"은 본 명세서에서 조절되지 않는 세포 성장을 통상적으로 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 조건을 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방육종, 골원성 육종, 혈관육종, 내피육종, 평활근육종, 척색종, 림프관육종, 림프관내피육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종, 연골육종 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 윤활막종, 신경초종, 뇌수막종, 선암, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프구 악성종양을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 암의 더 특정한 예는 편평 세포 암(예를 들어, 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평 암종, 소세포 폐 암종, 복막의 암, 간세포암, 위(gastric cancer) 또는 위암(stomach cancer), 예를 들어, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장장(kidney cancer) 또는 신장암(renal cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담도의 종양, 유잉 종양, 기저 세포 암종, 선암, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두암종, 유두상 선암, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간세포암, 담도 암종, 융모암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 고환 종양, 폐 암종, 방광암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종양, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 골수이형성 질환, 중쇄 질환, 신경내분비 종양, 신경초종 및 다른 암종, 및 두경부암을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 종양세포붕괴성 바이러스(예를 들어, HSV), 바이러스 스톡 또는 조성물은 폐암(예를 들어, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암), 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암(예를 들어, 간세포 암종(HCC)), 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 미만성 대형 B 세포 림프종(DLBCL) 및 변연대 림프종(MZL)으로부터 선택된 암을 치료하기 위해 사용된다.
소정의 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 도면 또는 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 종양세포붕괴성 바이러스 벡터에 관한 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 예시하는 것의 목적을 위한 것이고, 본 발명을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 본 실시예는 예시적이고, 본 발명의 범위에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 청구항의 범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 정신 내에 포함된 기재된 실시형태에 대한 변경, 변형 및 다른 변화는 구체적으로 고려된다.
실시예 1 - 정상 및 악성 세포의 miR 서열 분석
차등 miR 발현은 많은 암의 특징이다(Lu et al, Nature, 2005). 8개의 상이한 암 세포주에서 아주 고도로 차등으로 발현된 miR을 결정하도록 실험이 수행되었다. 비암성 대조군 조직과의 비교에 의해 차등 발현은 결정되었다. 전체로서, 108개의 샘플이 서열분석되었다. 샘플 상세내용은 표 11에 제공된다.
Figure pct00003
세포 유형을 선택하기 위해 HSV 약독화에 적합한 적절한 miRNA 표적 서열의 확인을 수월하게 하도록, 암 세포주 및 비암 대조군 조직의 miRNA 서열 프로파일링이 수행되었다. 다이서-처리된 RNA의 시퀀싱 라이브러리는 암 및 비암 세포, 예를 들어, 방광, 결장, 유방, 췌장, 폐, 두경부, 신경초종, 교모세포종, 뇌, 간 및 골수에 대해 생성되었다. 이들 miRNA 시퀀싱 라이브러리는 전체 RNA로 정규화되고, 3e8 판독/실행까지의 시퀀싱 판독에 대해 HiSeq V4 화학 시약을 갖는 HiSeq 2500 초고속(ultra-high throughput) 시퀀싱 시스템(Illumina)을 사용하여 서열분석되었다. 시퀀싱 실행으로부터의 FASTQ 파일은 Basespace에서의 miRNA 분석 도구(Illumina)를 사용하여 분석되었다. 정상의 평균, 암의 평균은 계산되고 정상/암의 비율을 고로부터 저로 분류화함으로써 순위화되었다. 열 지도는 0 및 0으로 전환된 값을 갖는 대수 값으로 생성되었다(스케일: 검정은 높은 발현이고, 백색은 낮은 발현이다). 샘플에 걸친 정규화된 데이터는 주어진 샘플에서 정규화된 miRNA 판독 계수치로서 표시되었다. 정규화는 비교에서 다른 샘플에 대한 주어진 샘플에서의 판독의 전체 수와 관련된다.
도 1은 25개의 miRNA의 비암성 및 암성 뇌 조직에서의 miRNA 발현 프로필 열 지도를 예시한다. miRNA 발현 프로필 열 지도의 추가 예는 각각의 실시예에서 25개의 miRNA에 상응하는 비암성 및 암성 방광(도 2), 유방(도 3), 결장(도 4), 뇌(도 5), 두경부(도 6), 폐(도 7), 췌장(도 8) 및 신경초종(도 9) 조직에 대해 도시되어 있다. 표 12는 암성 조직과 비암성 조직 사이에 특정한 miR의 발현 수준의 요약을 나타낸다. 기재된 바대로, miR-451a 수준은 비암성 조직과 비교하여 모든 종양 유형에서 하향조절되어서, 잠재적인 pan-종양 억제자 miRNA를 나타낸다. miR-1-3p는 시험된 모든 종양 유형에서 하향조절되고, 비암성 조직에서 보통의 수준으로 존재하고, 두경부 조직에서 높은 수준으로 존재한다. miR-559는 시험된 모든 종양 유형에서 하향조절되고, 일반적으로 비암성 조직에서 낮은 수준으로 존재하고, 비암성 폐 조직에서 높은 수준으로 존재한다. miR-145-5p는 시험된 모든 종양 유형에서 하향조절되고, 일반적으로 시험된 대부분의 비암성 조직 유형에서 높은 수준으로 존재한다. miR-143-3p는 결장, 폐 및 췌장 종양에서 하향조절되고, 모든 정상 조직 유형 및 몇몇 유방 종양 세포주에서 높은 수준으로 존재한다. miRNA 데이터 분석은 문헌에서 이전에 확인되지 않은 신규하고 예상치 못한 miRNA 발현 프로필을 나타내는 적어도 11개의 miRNA를 밝혀냈다.
Figure pct00004
많은 이들 확인된 miRNA는 pan- 또는 멀티-종양 특이적이다. 예를 들어, miR-451a, miR-559, miR-1-3p, miR-145-3p 및 miR143-3p의 발현은 일반적으로 대조군 조직과 비교하여 시험된 모든 암 세포주에 걸쳐 하향조절되었다. 이것은 특히 miR-451a에 중요하고, 이것은 모든 정상 조직 유형에서 고도로 발현되고 모든 암 유형에서 실질적으로 하향조절되어서, pan-특이적 종양-억제 miRNA를 나타낸다. miR-559의 발현은 정상 폐 조직을 제외하고 정상 조직 유형에서 더 낮고, 정상 조직에서의 miR-1-3p 및 mir-145-3p의 발현은 가변적이었다. 절대 발현 수준 및 차이의 규모에서의 가변성에도 불구하고, 암 세포주에서의 각각의 miR의 평균 발현은 상응하는 정상 조직에서의 수준과 비교하여 실질적으로 더 낮았다. 이들 miRNA는 다양한 암 유형을 광범위하게 치료할 수 있는 pan-종양 HSV 비리온을 생성하기 위한 후보이다. miR-451a, miR-559, miR-1-3p, miR-145-3p 및 miR143-3p에 대한 평균 발현이 정상 대조군과 비교하여 암 세포주에서 더 낮지만, 감소된 발현은 모든 암 세포주에 걸쳐 완전히 침투성이 아니었다. 예를 들어, 시험된 정상 방광 샘플의 2/3는 miR-145-3p의 증가된 발현을 나타내지만, 남은 샘플에서의 발현은 암 세포주에서 관찰된 평균과 실질적으로 유사하였다. 유방암 세포주에서 유사한 결과가 관찰되었다. 모든 유방암 샘플에 대한 평균 판독 계수치가 106이지만, 5/12 샘플은 1000 초과 계수치의 정규화된 판독 계수치를 갖고, 이들 중 2개는 40,000 초과 계수치였다.
이들 데이터는 종양 유형의 넓은 어레이를 표적화할 수 있는 단일 miR 약독화된 종양세포붕괴성 바이러스를 생성할 가능성을 나타낸다. 예를 들어, miR-124, miR-451a, miR-559, miR-1 및 miR-145-3p에 대한 표적 서열을 포함하는 작제물은 시험된 모든 종양 유형(예를 들어, 방광, 결장, 유방, 췌장, 폐, 두경부, 신경초종 및 교모세포종)의 치료에 사용될 수 있다. 상이한 암 유형에서의 miR의 발현 수준의 가변성은 miR 발현에 의해 또는 추가 바이오마커의 사용을 통해 환자를 계층화할 잠재적인 필요성을 나타낸다.
암성 조직과 비암성 조직 사이의 추가 miRNA 프로파일링은 Nanostring으로부터의 정량적 발현 검정을 이용하여 수행되었다. 이들 실험의 결과는 뇌 샘플에 도시되어 있고(도 50), 상기 기재된 이전의 연구에 의해 이전에 확인되지 않은 암성 및 비암성 뇌 조직에서 차등 발현을 나타내는 추가 miRNA, 즉 miR-9-5p, miR-128-3p, miR-137, miR-129-2-3p 및 miR-487b-3p의 확인을 입증한다. 추가 결과는 심장 샘플에 도시되어 있고(도 51), 이는 암성 심장 조직과 비암성 심장 조직 사이에 miR-208b-3p, miR-1-3p, miR-208a-3p, miR133-3p, miR-4284 및 miR-499a-5p의 차등 발현을 입증한다. 추가 결과는 말초 신경계 샘플에 도시되어 있고(도 52a-B), 이는 miR-204-5p, miR-1-3p, miR-206, miR-9-5p, miR-199b-5p, miR-145-5p, miR-100-5p, miR-574-3p의 차등 발현을 입증한다. 구체적으로, miR-219a-2-3p, miR-9-5, miR-219a-5p 및 miR-204-5p는 척수에서 차등으로 발현된다.
실시예 2 - miR-T 약독화에 대한 바이러스 유전자의 확인
siRNA 스크린은 약독화 표현형 HSV 유전자를 시험하도록 수행되었다. siRNA 스크린은 즉시 초기 유전자 및 선택 초기 유전자의 RISC 약독화 표현형을 시험하기 위한 이상적인 양상이다. HSV 유전자 ICP27, ICP4, ICP0, UL5, UL8, UL9, ICP8, ULC39/40, ICP22, UL30, UL42 및 VP19를 표적화하는 siRNA는 개별적으로 및 A253 세포에서 풀에서 형질주입되었다. siRNA 형질주입 후 24시간에, 세포는 (하기에 표 13에 기재된) ONCR-003 또는 ONCR-010으로 감염되고, 이들의 각각은 GFP 카세트를 포함한다. 바이러스 전파는 GFP 강도를 정량화함으로써 감염후 48시간에 측정되었다. 가능한 히트로서 확인된 HSV 유전자는 웨스턴 블롯, 바이러스 역가 측정 및 RT-PCR에 의해 검증되었다.
이들 스크린의 결과는 도 47a 및 도 47b에 도시되어 있다. 상응하는 HSV 유전자의 75% 초과의 넉아웃을 매개하는 개별 siRNA는 도 47a에서 화살표로 표시되고, siRNA의 선택 하위집합에 대한 GFP 강도는 도 47b에 도시되어 있다. 도 48에 도시된 바대로, ICP4, UL5, UL8, ICP8, ICP22 및 UL30의 siRNA 매개된 넉아웃은 GFP 강도의 감소로 표시된 바대로 ONCR-003의 바이러스 복제를 실질적으로 감소시켰다. 추가로, ICP27, ICP4, UL5, UL8, UL9, ICP8, ICP22 및 ICP30의 siRNA 매개된 넉아웃은 GFP 강도의 감소로 표시된 바대로 ONCR-010의 바이러스 복제를 실질적으로 감소시켰다. ONCR-010으로 감염된 세포는 특정한 바이러스 단백질의 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 추가로 분석되었다. 도 49에 도시된 바대로, 이들 HSV 유전자의 상당한 감소는 단백질 수준에서 또한 관찰되었다.
실시예 3 - miRNA-기반 유전자 약독화를 신속히 평가하기 위한 리포터 시스템의 작제 및 사용
리포터 시스템은 사실상 임의의 miRNA 표적 서열 및 동족 miRNA를 사용하여 miRNA-기반 유전자 약독화를 평가하도록 개발되었다. (도 10에 도시된) 이 시스템에서, miRNA에 의해 인식된 표적 서열(즉, hsa-miR-122)은 탈안정화된 녹색 형광 단백질(dsGFP)의 3' UTR로 삽입되었다. 동족 miRNA는 이어서 miRNA 발현에 대한 대조군으로서 mCherry를 사용하여 테트라사이클린(tet) 유도성 촉진자를 통해 발현되었다. 모든 발현 벡터는 mCherry(pTF002)를 또한 발현하는 tet 억제성 벡터 pcDNA5 Frt/To로 클로닝되었다. 발현을 위한 모든 miRNA는 인간 게놈 DNA로부터 유전자 합성에 의해 생성되고, pTF002로 클로닝되었다. 약독화 리포터 벡터를 생성하기 위해, dsGFP는 cDNA3.1+로 클로닝되어서, 벡터 pTF004를 생성하였다. 약독화 벡터는 8개 내지 16개의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 관심 대상의 miRNA 서열의 역보체의 4개의 탠덤 반복을 함유한다. 플라스미드는 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 pTF004의 dsGFP 유전자의 3 'UTR로 합성으로 생성된 올리고뉴클레오타이드의 삽입에 의해 작제되었다. 첫날에, HEK293TetR 세포는 제조사의 프로토콜(Invitrogen)에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 miRNA 약독화 및 리포터 발현 플라스미드(전체 0.3㎍의 CMV 촉진자 함유 플라스미드에 대해 각각 0.15㎍)로 형질주입되었다. 둘째날에, 세포는 5ng/㎖에서 테트라사이클린으로 처리되고, 72시간까지 동안 항온처리에 허용되었다. 항온처리 후, GFP 및 mCherry 형광 신호는 SpectraMax(등록상표) i3x Minimax 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 매일 검출되고, Softmax Pro 또는 Metamorph 영상화 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 분석되었다. 위상 영상은 5 내지 6ms의 노출로 획득되었다. 형광 영상은 10ms의 GFP(541㎚ 채널) 및 200 내지 1500ms의 mCherry(713㎚ 채널)로 획득되었다.
도 11은 24시간에 tet를 통한 miR-122 발현의 도입 시 GFP 발현의 miR-122 매개된 약독화를 예시한다. miR-184, miR-34a 및 Let7a인 대조군 모방체는 GFP 수준을 약독화하지 않고, tet의 부재하에 GFP 약독화가 관찰되지 않는다. 도 12는 개별적으로 및 miR-122/Let7a, miR-122/Let7a/miR-34a, 또는 miR-122/Let7a/miR-184의 카세트 조합에서 각각의 miR 표적 서열을 함유하는 miR-TS 카세트와 함께 GFP 카세트의 약독화에 대한 miR-122, miR-184, miR-34a 및 Let7a 모방체의 효과를 나타낸다. 감소된 GFP는 적절한 miR 및 동족 표적 서열이 함께 존재할 때(원형 웰) 오직 관찰된다. 도 13은 비약독화된 대조군으로서 작용하고, miR-122, miR-184, miR-34a 및 Let7a 모방체의 발현의 측정치로서 mCherry 발현을 나타낸다. 도 14는 개별적으로 각각의 miR 표적 서열을 포함하는 miR-TS 카세트와 함께 약독화된-GFP 카세트에 대한 miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 및 miR-451 모방체 발현의 효과(원형 웰)를 나타낸다. 비약독화된 대조군은 도 15에 도시되어 있고, 개별적으로 각각의 표적 서열을 사용하여 miR-122, miR-124, miR-145, miR-199 및 miR-451 발현 및 mCherry 발현을 나타낸다.
동족 miR 모방체의 존재하에 GFP 발현을 약독화시키는 miR 표적 서열의 추가 조합의 능력은 도 16 내지 도 26에 도시되어 있다. 각각의 도면에서, GFP 형광은 형질주입후 72시간에 측정된다. 각각의 경우에, 표시된 miR 표적 서열의 삽입은 동족 miR이 또한 발현일 때 약독화된 GFP 발현을 발생시켰다. miR-122 및 miR-184 표적 서열(도 16), miR-34a 및 miR-184 표적 서열(도 17), Let-7a 및 miR-184 표적 서열(도 18), miR-124 및 miR-184 표적 서열(도 19), miR-145 및 miR-184 표적 서열(도 20), miR-199 및 miR-451 표적 서열(도 21), miR-125 및 miR-451 표적 서열(도 22), miR-126 및 miR-451 표적 서열(도 23), miR-127 및 miR-451 표적 서열(도 24), miR-133 및 miR-451 표적 서열(도 25), 및 miR-223 및 miR-451 표적 서열(도 26)의 삽입의 효과는 각각 도시되어 있다.
그러므로, 이들 데이터는 miR 발현이 동족 miR 표적 서열을 발현하는 유전자의 특정한 약독화를 발생시킬 수 있다는 것을 나타난다.
실시예 4 - miRNA 약독화된 HSV의 생성
miRNA 표적 서열 및 동족 miRNA 쌍의 리포터 유전자-기반 검증 이후에, miR-TS 카세트를 포함하는 HSV-기반 바이러스는 생성되었다. 기재된 바대로 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome: BAC)에서 HSV-1의 KOS 균주의 전장 게놈 클론인 KOS-37 BAC에서 일련의 변형이 이루어졌다(Mazzacurati et al., Mol Ther., 2015). 제품, KGBAC는 ICP47 유전자에 대한 촉진자와 함께 이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT 및 ICP4의 각각의 1개의 카피를 함유하는 내부 반복(조인트) 영역에 대해 결실되었다. 이 결실은 4개의 결실된 유전자의 남은 카피의 조작을 수월하게 하고, 바이러스의 종양세포붕괴성 활성을 증대시키는 전이유전자의 잠재적인 도입에 대한 풍부한 공간을 제공하고, 신경병원성 인자 ICP34.5의 발현을 감소시킴으로써 종양 특이성을 증가시키고; ICP47 발현의 제거는 바이러스-특이적 T 세포에 의한 감염된 암 세포의 면역 인식에 이익이다. KGBAC는 또한 후기(복제후) 바이러스 유전자 발현의 모니터링을 허용하도록 2A 펩타이드 서열을 사용하여 당단백질 C(gC) ORF에 융합된 GFP 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유한다. 마지막으로, KGBAC는 비정규 수용체를 통해 HSV 진입을 증대시키는 것으로 나타난 gB 유전자에서의 한 쌍의 돌연변이를 함유한다(예를 들어, 국제 PCT 공보 WO 제2011/130749호 참조). miR-124-3p에 대한 표적 서열의 4 반복부를 포함하는 miR-TS 카세트는 2A5B 벡터를 생성하도록 ICP4의 3' UTR로 재조합되고(예를 들어, 국제 PCT 공보 WO 제2015/066042호 참조), MMP9에 대한 발현 카세트는 2A5B-MMP9 벡터(ONCR-003)를 생성하도록 UL3 및 UL4 유전자 사이의 유전자간 영역으로 삽입되었다. 추가 miRNA 표적 서열 카세트는 하기에 표 13에 도시된 작제물을 생성하도록 ONCR-003의 ICP4, ICP27, UL8, UL42, 및/또는 ICP34.5 유전자의 3' UTR로 재조합되었다. 모든 BAC 작제물은 Vero-Cre 세포의 형질주입에 의해 loxP 부위 사이에 위치한 BAC 서열의 제거와 동시에 바이러스 입자로 전환되었다. 플라크 정제 후, 바이러스 스톡은 제조되고, Vero 세포에서 적정되었다.
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실시예 5 - miRNA 약독화된 HSV를 사용한 바이러스 감염성 검정
정상 및 암성 세포에서 바이러스 감염성 및 복제를 평가하기 위해, miRNA 약독화된 HSV 입자는 하기 시험관내 검정에서 시험되었다. 첫날에, 감염된 각각의 세포 유형에 대해, HSV 입자는 0.01의 다중 감염도(moi)를 달성하도록 도입되었다. 둘째날에, 2개 내지 5개의 바이러스 감염성은 SpectraMax(등록상표) i3x Minimax 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 GFP 검출에 의해 평가되고, Softmax Pro 또는 Metamorph 영상화 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 분석되었다. 위상 영상은 5 내지 6ms의 노출로 획득되었다. 형광 영상은 임의의 가능한 비특이적 자가형광 신호를 평가하도록 10ms의 GFP(541㎚ 채널) 노출 및 200 내지 1500ms의 mCherry(713㎚ 채널) 노출로 획득되었다.
ONCR-011 복제는, 도 27a(GFP 양성 세포 정량화에 의한 판독) 및 도 27c(정량적 PCR에 의한 판독)에 도시된 바대로, 이들 세포에서 ICP27 유전자에서의 miR-T125 카세트의 존재 및 miR-125a의 높은 수준(3000 초과 계수치, 하기에 표 14)으로 인해 유사분열후 폐 조직에서 상당히 약독화되었다. ONCR-011 및 대조군 바이러스, ONCR-003이 ICP4 유전자에서 miR-124 표적 서열을 함유하지만, miR-124는 낮은 수준(100 미만 계수치, 하기에 표 14)으로 존재하고, 이것은 바이러스 복제를 약독화시키는 데 불충분하였다(도 27b 및 도 27d). ONCR-011 및 ONCR-003 둘 다는, 이들 세포가 miR-125a 및 miR-124 둘 다의 낮은 수준(100 미만 계수치)을 함유하므로(표 14), 두경부암 세포(A253)에서 새로 복제되었다.
Figure pct00007
도 28은 HCC1395 및 A253 세포에서 ONCR-013인 miR-145 약독화된 작제물의 복제를 나타낸다. 도 28a(GFP 양성 세포 정량화에 의한 판독) 및 도 28b(정량적 PCR에 의한 판독)에 도시된 바대로, ONCR-013의 복제는 A253에서의 miR-145의 높은 발현 및 HCC1395 세포에서의 발현의 부재로 인해 A253 세포에서가 아니라 HCC1395 세포에서 상당히 약독화되었다(표 15).
Figure pct00008
도 29는 정상 BEAS-2B 폐 세포에서 miR-143-3p 약독화된 작제물(ONCR-012) 및 miR-199a-5p 약독화된 작제물(ONCR-014)의 약독화를 나타낸다. 도시된 바대로, ONCR-014의 복제는 비암성 폐 조직(도 29a, GFP 양성 세포 정량화에 의한 판독 및 도 29b, 정량적 PCR에 의한 판독)에서 상당히 약독화되었고, 이는 miR-199a-5p 표적 서열이 정상 폐 세포에서 바이러스 복제를 약독화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6 - 다수의 유전자 유전좌위에서 다수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 oHSV의 약독화된 복제
다수의 유전자 유전좌위에서 miR-TS 카세트를 포함하는 작제물의 바이러스 감염성 및 복제는 A253, Hep3B 및 Huh7 세포에서 평가되었다. ONCR-036, ONCR-063, ONCR-093, ONCR-094, ONCR-095 및 ONCR-096 miR 약독화된 HSV 작제물에 대한 결과는 본 명세서에 제공된다. 이들 바이러스의 각각은 하나 이상의 miR-124 표적 서열, 하나 이상의 miR-122 표적 서열, 및/또는 ICP4, ICP27 및/또는 UL42 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 miR-125a 표적 서열을 포함하였다. 각각의 세포주에서의 miR-122 및 miR-125a의 발현은 TaqMan 검정에 의해 평가되었다. 간단히, 작은 RNA 분획을 포함하는 전체 RNA는 miRNeasy 칼럼으로 성장하는 세포로부터 단리되었다. RNA는 이어서 miR-122 및 miR-125 특이적 TaqMan 검정에 대한 기질로서 사용되고, U6 snRNA에 대한 동시의 TaqMan 검정은 ΔΔCT 방법에 따라 세포 유형마다 발현 수준을 정규화시키도록 수행되었다. 데이터는 각각의 검정(A253 세포, 도 30a; Hep3B, 도 30b)에서 논의 중인 가장 낮은 세포주에 대해 배수 변화로 표시된다. 도시된 바대로, A253 세포는 miR-122 또는 miR-125a를 발현하지 않는다. Hep3B 세포는 miR-125의 높은 수준 및 miR-122의 낮은 수준을 발현하고, Huh7 세포는 miR-125a 및 miR-122의 높은 수준을 발현한다.
바이러스 감염성 및 복제는 시험관내 검정에서 평가되었다. 간단히, 세포는 48웰 접시에서 45,000개 세포/웰로 플레이팅되고, 밤새 배양되었다. 첫날에 1개의 HSV 입자는 0.01의 감염 다중도(moi)를 달성하도록 각각의 세포 유형으로 도입되었다. 감염후 48시간에, 바이러스 감염성은 형광 현미경관찰에 의해 평가되었다. 이 실험의 결과는 도 30c에 도시되어 있고, 바이러스 복제는 eGFP 수준으로 표시된다. 이들 데이터는 동족 miR 중 오직 하나를 발현하는 세포(miR-125a의 높은 수준을 발현하는 Hep3B)에서 관찰된 약독화와 비교하여 또는 동족 miR을 발현하지 않는 세포(miR-125a도 miR-122도 발현하지 않는 A253 세포)와 비교하여 miR-122 및 miR-125a 둘 다의 중간 내지 높은 수준을 발현하는 세포(Huh7 세포)에서 바이러스 복제의 증대된 약독화를 입증한다.
바이러스 전파 및 단백질 발현은 또한 평가되었다. 간단히, 세포 용해물은 감염후 72시간에 수확되고, PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 처리되었다. 항-HSV1 캡시드(VP5) 항체는 바이러스 전파/단백질 발현을 모니터링하도록 사용되고, B-액틴 항체는 로딩 대조군으로서 사용되었다. miR-125a 또는 miR-122 발현이 없는 A253 세포에서, 높은 바이러스 복제의 수준은 비약독화된 대조군(도 31, 비약독화된 대조군으로서 ONCR-003)과 비교하여 모든 miR 약독화된 바이러스에서 관찰되었다(도 31, 레인 3 내지 6). 그러나, 바이러스 복제는 동족 miRNA 및 특히 높은 수준의 miR-122 둘 다를 발현하는 Huh7 세포에서 감소되었다. 이들 데이터는 대조군 바이러스에 대해 특이적 miR에 의한 바이러스 약독화를 예시한다.
miR 약독화된 HSV 바이러스의 감소된 바이러스 복제가 특이적 miR의 발현에 의해 매개된다는 것을 더 확인하기 위해, 내인성 miR-122 또는 miR-125a를 발현하지 않는 A253 세포는 miR-122 및 miR-125a 모방체로 형질주입되었다. 간단히, A253 세포는 48웰 접시에서 35,000개 세포/웰로 플레이팅되고, 밤새 배양되었다. 세포는 이어서 Lipofectamine RNAiMAX로 2.5pM/웰에서 Ambion miRNA 모방체로 형질주입되었다. 작은 RNA 분획을 포함하는 전체 RNA는 miRNeasy 칼럼으로 성장하는 세포로 분리되었다. 이들 RNA 샘플은 miR-122 및 miR-125 특이적 TaqMan 검정에 대한 기질로서 사용되고, U6 snRNA에 대한 동시의 TaqMan 검정은 ΔΔCT 방법에 따라 세포 유형마다 발현 수준을 정규화하도록 수행되었다. 결과는 도 32에 도시되어 있다. 도 32a 및 도 32b에 도시된 바대로, miR-122 및 miR-125 모방체는 규모의 차수로 A253 세포에서 세포내 miR-122 및 miR-125 발현 수준을 특이적으로 증가시켰다.
다음날에, 세포는 개별적으로 계수되고, 0.01의 MOI에서 ONCR-036, ONCR-063, ONCR-093, ONCR-094, ONCR-095 또는 ONCR-096 miR 약독화된 HSV 입자 및 ONCR-003 비약독화된 대조군으로 감염되고; 각각의 oHSV 바이러스는 1시간 동안 50㎕ 중에 첨가된 후, 완전한 배지를 첨가하였다. 생산적 바이러스 감염에 의해 발현된 eGFP는 감염후 48시간에 취해진 형광 현미경관찰 이미지에 의해 평가되었다. 모든 영상은 동일하게 노출되고 처리되었다. 이 실험의 결과는 도 32c에 도시되어 있고, SpectraMax(등록상표) i3x Minimax 다중 모드 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 GFP 검출에 의해 정량화되고, 도 32d에서 Softmax Pro를 사용하여 분석되었다. 이들 데이터는 ONCR-003(WT)의 배제로 모든 바이러스에 대해 miR-122 모방체의 존재하에 약독화된 바이러스 복제를 예시한다. 추가로, 약독화의 수준은, ICP27 유전자에서 4개의 miR-122 표적 서열 반복부를 각각 포함하는, ONCR-063, ONCR-093, ONCR-096에서 가장 큰 GFP의 감소로, HSV 작제물에 존재하는 miR 표적 서열의 카피수에 비례하였다. 추가로, 이들 데이터는 ONCR-003(WT) 및 ONCR-036/ONCR-063(각각 오직 하나의 miR-122 표적 서열을 포함)에 대해 ONCR-093, -094, -095 및 -096에 대한 miR-125a 모방체의 존재하에 약독화된 바이러스 복제를 예시한다.
유사한 실험은 2개 이상의 바이러스 유전자(예를 들어, ONCR-129, ONCR-131, ONCR-125, ONCR-126, ONCR-128, ONCR-130)에서 다수의 miR-TS 카세트를 포함하는 추가 작제물의 바이러스 복제를 평가하도록 수행되었다. 각각의 경우에, 하나 이상의 miRNA의 발현은 발현된 miRNA에 상응하는 표적 서열을 포함하는 특정한 작제물의 바이러스 복제를 약독화시킬 수 있었다(데이터 비도시).
실시예 7 - miR-TS 카세트를 생성하기 위한 컴퓨터 방법
이전의 실시예에 기재된 데이터에 기초하여, miR-표적 서열(miR-TS) 카세트는 특정한 HSV 유전자로의 삽입을 위해 생성되었다. 상이한 조직 유형의 암성 세포와 비암성 세포 사이의 차등 발현을 나타내는 miR 표적 서열은 동족 miR의 발현이 감소된 암성 세포에서의 바이러스 복제를 허용하면서 광범위한 다양한 건강한 세포에서 바이러스 복제를 약독화시킬 수 있는 카세트를 생성하도록 선택되었다.
이 실시예는 목록으로부터 후보 miR-TS 카세트 및 선택된 바람직한 후보를 생성하는 방법을 예시한다. 컴퓨터 언어 Python에 실행된 방법은 도 1에 도시되어 있다. 방법에 대한 입력은 배제를 위한 시드의 목록(이 실시예에서, 암에서 발현된 miRNA에 대한 시드 서열은 배제됨) 및 카세트에 포함하기 위한 miR-TS의 목록을 포함한다. 이 실시예에 사용된 포함된 miR-TS는 각각의 뉴클레오타이드(nt)에서의 길이 및 모 miRNA 서열과 함께 표 10에 제공된다. miR-TS는 마이크로RNA와 miR-TS 사이의 불완전한 일치를 관용하여서, 카세트가 불완전한 miR-TS로 제조될 수 있다고 이해될 것이다. miR-TS 카세트는 다른 miR-TS로 제조될 수 있고, 당해 분야에 공지된 임의의 마이크로RNA에 기초하여 miR-TS를 포함하거나 장래에 발견되었다.
이 실시예에 대해, 본 발명자들은, 표 16에 도시된 바와 같은 ICP4, ICP27, ICP34.5 및 UL8의 4개의 필수 바이러스 유전자의 각각에 대해 1개인, 4개의 miR-TS 카세트를 설계하였다. 그러나 원칙적으로 이 카세트는 다른 바이러스(또는 비바이러스) 유전자와 사용될 수 있었다. 바이러스 유전자가 본 발명자들이 선호한 벡터에서 역상보성 배향으로 있으므로, 각각의 경우에 역상보성 서열을 사용하였다. 약어 "miR-126m"은 oncomiR miR-155에 대한 시드 매치를 제거함으로써 miR-126 부위를 개선하도록 돌연변이된 이 부위의 버전을 지칭한다. 약어 "miR-128m"은 oncomiR miR-27a-3p에 대한 시드 매치를 제거함으로써 miR-128 부위를 개선하도록 돌연변이된 이 부위의 버전을 지칭한다.
Figure pct00009
ICP4에 대해 설계된 카세트는 임의의 유전자를 하향조절하도록 사용될 수 있고, 이것은 (miR-143 표적 부위 때문에) 평활근 및 (miR-1 표적 부위 때문에) 횡문근에서 작동 가능하게 이것에 연결된다. ICP27에 대해 설계된 카세트는 임의의 유전자를 하향조절하도록 사용될 수 있고, 이것은 (피질 뉴런에서 발현된) miR-128m, (간에서 발현된) miR-122 및 (뇌, 척추 및 신경에서 발현된) miR-219 표적 부위 때문에 건강한 조직에서 작동 가능하게 이것에 연결된다. ICP27에 대해 설계된 카세트는 임의의 유전자를 하향조절하도록 사용될 수 있고, 이것은 miR-128m, miR-204 및 miR-219 표적 부위 때문에 건강한 조직에서 작동 가능하게 이것에 연결된다. UL8에 대해 설계된 카세트는 임의의 유전자를 하향조절하도록 사용될 수 있고, 이것은 miR-217, miR-137 및 miR-126m의 mRNA 표적 부위 때문에 비종양 조직에서 작동 가능하게 이것에 연결된다.
탠덤 방식으로 배열된 목록 예(이들의 각각은 임의적)에 사용된 기준과 일치하는, 각각의 조합에 대해 10,000 내지 100,000개의 카세트를 산출하는, 프로그램을 실행하였다: (1) 탠덤 방식으로 배열된 (역상보성 배향의) 각각의 miR-TS 부위의 4개의 카피; (2) 동일한 miR-TS를 제외하고 자신에 인접하여 반복할 수 없음; (3) 탠덤 서열을 갖는 4개의 뉴클레오타이드 스페이서로 분리됨; (4) 배제된 시드 목록으로부터 시드 없음; 그리고 (4) 폴리아덴일화 서열(AATAAA) 없음. 프로그램은 또한 Gibson 어셈블리 클로닝에 대해 선택적으로 5' 아암(CATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGC) 및 3' 아암(GCGACCGGCTAGCGTACTAGCTTAG) 서열을 선택적으로 추가할 수 있다(Nat Methods 2009;6(5):343-5).
프로그램은 40 nt 슬라이딩 윈도우로 ViennaRNA 패키지(Lorenz et al. Algorithms for Molecular Biology, 6:1 26, 2011; https://www.tbi.univie.ac.at/RNA/에서 이용 가능)의 "폴드" 서브루틴을 이용하여 후보 서열의 폴딩에 대한 델타-G는 다음에 계산되었다. 이 슬라이딩 윈도우 계산에 대한 값은 각각의 후보 서열에 대해 목록으로 저장되고, 후보 서열은 목록에서 (즉, RNA에서 가장 강한 2차-구조 요소의 폴딩 에너지에 의해) 모든 델타-G 값의 절대 값의 최대 값으로 분류된다. 서열은 다수의 하부 에너지 최소로 후보 서열을 제거하도록 수동으로 더 검토되었다. 가능할 때마다, 국소 최소를 갖지 않는 후보 서열이 선택되었다. 이러한 방식으로, 후보 서열은 확인되었고, 여기서 예측된 2차-구조 폴딩 에너지에서 강한 RNA 2차 구조(델타-G의 ab의 낮은 최대)가 없고 또한 국소 최소가 없거나, 국소 최소가 아주 적었다.
마지막으로, 마이크로RNA 표적 스캐닝 알고리즘(miranda v3.3a)은 원하는 miR-TS가 존재하고, 원치않는 miR-TS가 프로그램에 의해 삽입되지 않는다는 것을 보장하도록 각각의 후보 서열에서 실행되었다.
이 방법에 의해 생성된 예시적인 서열은 표 17에 제공된다. 카세트의 길이는, 처음 및 마지막 miR-TS를 포함하는, 처음의 miR-TS로부터 마지막의 miR-TS의 뉴클레오타이드의 수로 정의된다. 프로그램이 4 nt의 5' 제1 스페이서 및 본 명세서에 사용된 길이의 정의를 포함하지 않는 3' 마지막 공간을 추가하므로, 카세트의 길이는 프로그램에 의해 출력된 서열의 길이 빼기 8 nt(= 2 * 4 nt 제1 및 마지막 스페이서)이다.
Figure pct00010
바이러스 복제를 약독화시키는 표 17에 기재된 miR-TS 카세트의 능력은 도 53a 내지 도 53b에 도시되어 있다.
표 18에 기재된 이 방법으로 설계된 miR-TS 카세트를 포함하는 추가 작제물은 작제되었다.
Figure pct00011
실시예 8 - miR 약독화된 HSV 작제물의 세포독성
실험은 ONCR-125, ONCR-131, ONCR-142 및 ONCR-157인 선택 miR 약독화된 HSV 작제물의 시험관내 세포독성을 평가하도록 수행되었다. 다양한 암 세포주는 30, 10, 3.33, 1.11, 0.37, 0.12, 0.04, 0.13, 0.0045 및 0.0015의 MOI에서 표시된 작제물로 감염되고, 세포 생존능력은 감염후 72시간에 평가되었다. 사용된 세포주는 결장직장 선암 세포주 SW837 및 COLO205, 흑색종 세포주 SKMEL28 및 A375, 소세포 폐암 세포주 H446, 췌장 선암 세포주 BXPC3 및 유방암 세포주 BT 549를 포함한다. 각각의 작제물의 IC50은 계산되고, 하기에 표 19에 기재되어 있다. 이들 실험의 각각의 결과는 도 54a 내지 도 54e에 도시되어 있다.
Figure pct00012
실시예 9 - IL-12는 HSV의 압스코팔 효율을 증대시킨다
실험은 종양세포붕괴성 HSV의 압스코팔 효과에 대한 IL-12의 효과를 평가하도록 수행되었다. 간단히, miR-124-3p의 4 반복부를 포함하는 ICP4 miR-TS 카세트 및 쥣과 IL-12를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 ONCR-133 작제물은 MC38 종양 모델에서 마우스에 투여되었다. 도 55에 도시된 바대로, ONCR-133은 비히클 치료된 대조군과 비교하여 주사된 종양의 종양 성장을 상당히 저해하였다(p < 0.0001). ONCR-133 치료는 또한 비주사된 종양의 종양 성장을 상당히 저해시켜서(p < 0.005), 증대된 압스코팔 효과를 나타낸다.
놀랍게도, ULBP3인 추가 면역-활성화 페이로드의 발현은 IL-12를 발현하는 HSV의 종양 성장 저해 효과를 더 증대시키지 않았다. 도 56에 도시된 바대로, ONCR-133 + ONCR-007(ULBP3을 발현하는 HSV 작제물) 또는 ONCR-133 + ONCR-002(임의의 추가 페이로드 분자를 발현하지 않는 HSV 작제물) 둘 다로 치료된 마우스는 비히클 치료된 대조군과 비교하여 종양 성장의 상당한 저해를 입증하였다. 그러나, 주사된 또는 비주사된 종양의 성장의 저해에서 ULBP3 발현의 추가 이익이 없었다. 사실, 도 56에서 표에 기재된 바대로, ULBP3의 추가 발현은 IL-12 발현 단독에 의해 관찰된 종양 성장 저해를 상당히 감소시켰다.
유사하게, CXCL10의 추가 발현은 IL-12를 발현하는 HSV의 항종양 효율을 더 증대시키지 않았다. 마우스는 ONCR-113(IL-12 및 MMP9를 발현하는 HSV 작제물) + ONCR-106(CXCL10 및 MMP9를 발현하는 HSV 작제물) 또는 ONCR-113 + ONCR-031(MMP9를 발현하는 HSV 작제물)로 치료되었다. 도 57에 도시된 바대로, ONCR-106 + ONCR-113 치료된 그룹에서 CXCL10의 추가 발현은 ONCR-031 + ONCR-113으로 치료된 마우스와 비교하여 주사된 또는 비주사된 종양에서 종양 성장의 저해를 증대시키지 않았다. 사실, 도 57에서 표에 기재된 바대로, CXCL10의 추가 발현은 주사된 및 비주사된 종양 둘 다에서 종양 성장 저해를 상당히 감소시켰다.
실시예 10 - CCL4 발현은 HSV의 압스코팔 효율을 추가로 증대시킨다
실시예 F에 기재된 MC38 모델에서 종양 성장 저해에서 CCL4의 효과를 평가하도록 실험은 수행되었다. 이 실험의 결과는 도 58 및 하기에 표 20에 기재되어 있다. 마우스는 ONCR-133(IL-12를 발현하는), (IL-12, CXCL10 및 XCL1을 발현하는) ONCR-151, (IL-12, CXCL10 및 FLT3 리간드를 발현하는) ONCR-152, 또는 (IL-12, CXCL10 및 CCL4를 발현하는) ONCR-153의 4개 중 1개의 작제물로 치료되었다. 도 58에 도시된 바대로, ONCR-133, -151, -152 및 -153의 모두에 의한 치료는 비히클 대조군과 비교하여 주사된 및 비주사된 종양의 종양 성장을 상당히 저해하였다. 그러나, ONCR-153으로 치료된 마우스는 ONCR-133으로 치료된 치료와 비교하여 주사된 종양 및 비주사된 종양에서 종양 성장 저해의 증가를 입증하는 한편, ONCR-151 또는 -152는 ONCR-133에 의한 치료와 비교하여 약간의 효율 감소를 입증하였다. 이들 결과는 CCL4 발현이 IL-12 발현 단독에 의해 관찰된 효과를 넘어 종양세포붕괴성 HSV의 종양 성장 저해 및 압스코팔 효과를 증가시킬 수 있다는 것을 입증하였다.
Figure pct00013
ONCR-153으로 치료된 마우스로부터의 종양은 gD 유전자의 RT-PCR 분석에 의해 HSV의 존재에 대해 수확되고 평가되었다. 도 59a 및 도 59b에 도시된 바대로, HSV는 비주사된 종양에서가 아니라 주사된 종양에서 검출되어서, 비주사된 종양에서 관찰된 종양 성장 저해가 바이러스 전파가 아니라 바이러스 투여의 압스코팔 효과로 인한다는 것을 나타낸다. 종양은 IL-12, CXCL10 및 CCL4의 3개의 페이로드의 존재에 대해 또한 평가되었다. 도 60a 내지 도 60c에 도시된 바대로, 페이로드 발현은 치료후 24시간에 주사된 종양에서 피크였고 이후 감소하였다. 페이로드의 수준은 ONCR-153으로 치료된 마우스의 혈청에서 또한 평가되었고(도 61a 내지 도 61c), 여기서 CXCL10 발현이 오직 관찰되었다. 그러나, 도 62에 도시된 바대로, ONCR-153에 의한 마우스의 치료는 주사된 및 비주사된 종양 둘 다에서 종양내 IFNγ 반응을 유도하였다(왼쪽 패널). 유사하게, IFNγ의 증가된 발현은 ONCR-153 치료된 마우스의 혈청에서 관찰되었다. 이들 데이터는 HSV에 의한 IL-12 및 CCL4 발현의 조합이 ONCR-153에 의해 관찰된 압스코팔 효과에 기여할 수 있는 국재화된 면역 반응을 유도한다는 것을 추가로 나타낸다.
실시예 11 - FLT3 발현은 HSV의 압스코팔 효율을 추가로 증대시킨다
실시예 F에 기재된 MC38 모델에서 종양 성장 저해에서 FLT3의 효과를 평가하도록 실험은 수행되었다. 이 실험의 결과는 도 63 및 하기에 표 21에 기재되어 있다. 마우스는 표 21에 기재된 바와 같은 상이한 페이로드를 발현하는 작제물의 3 조합 중 하나로 치료되었다. 도 63에 도시된 바대로, ONCR-152 및 ONCR-140의 조합에 의한 치료는 비주사된 종양에서 종양 성장 저해를 증대시키고, 이것은 FLT3L 발현이 IL-12, CXL10 및 CCL4에 의해 관찰된 것에 비해 압스코팔 효과를 증대시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00014
실시예 13 - CD40L 발현은 HSV의 압스코팔 효율을 추가로 증대시킨다
실시예 F에 기재된 MC38 모델에서 종양 성장 저해에서 CD40L의 효과를 평가하도록 실험은 수행되었다. 이 실험의 결과는 도 64 및 하기에 표 22에 기재되어 있다. 마우스는 표 22에 기재된 바와 같은 상이한 페이로드를 발현하는 작제물로 치료되었다. 도 64에 도시된 바대로, ONCR-153 및 ONCR-147의 조합에 의한 치료는 비주사된 종양에서 종양 성장 저해를 증대시키고, 이것은 CD40L 발현이 IL-12, CXL10 및 CCL4에 의해 관찰된 것에 비해 압스코팔 효과를 증대시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00015
실시예 12 - 항-CTLA4 발현은 HSV의 압스코팔 효율을 추가로 증대시킨다
실시예 F에 기재된 MC38 모델에서 종양 성장 저해에서 CTLA4의 효과를 평가하도록 실험은 수행되었다. 이 실험의 결과는 도 66a 내지 도 66c 및 하기에 표 23에 기재되어 있다. 마우스는 표 23에 기재된 바와 같은 상이한 페이로드를 발현하는 작제물로 치료되었다. 도 66a 내지 도 66c에 도시된 바대로, ONCR-149 및 ONCR-139의 조합에 의한 치료는 ONCR-149 단독에 의한 치료와 비교하여 주사된 및 비주사된 종양에서 종양 성장 저해를 증대시키고, 이것은 항-CTLA4 발현이 IL-12에 의해 관찰된 것에 비해 항종양 효과 및 압스코팔 효과를 증대시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pct00016
4T1-luc 모델에서 IL-12, CXCL10, FLT3L 및 CCL4 발현에 걸쳐 항-CTLA4의 효과를 평가하도록 유사한 실험은 수행되었다. 간단히, 100㎕의 DPBS 중의 1 x 106 4T1-luc 세포는 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리로 피하로 주사되었다. 종양 용적이 100㎣의 평균에 도달할 때, 마우스는 3e6 PFU/주사의 용량으로 HSV-1로 종양내로 주사되었다. 투약은 3 용량의 전체 수에 대해 3일마다 2회(Q3Dx3) 반복되었다. 종양 성장 및 체중은 주마다 2회 모니터링되었다. 전이성 질환의 제1 임상 증상이 관찰될 때 22일에 실험은 종료되었다. 폐 전이는 IVIS Lumina LT 시스템을 사용하여 생체외 가시화되고, Living Image Software로 분석되었다. 마우스는 표 24에 기재된 바와 같은 작제물의 조합으로 치료되었다. 이 실험의 결과는 도 67에 도시되어 있다. 도시된 바대로, ONCR-152 및 -139에 의한 치료는 ONCR-139 단독에 의한 치료와 비교하여 종양 성장 저해에서 증대된 효과를 입증하였다.
Figure pct00017
실시예 13 - 항-PD1 발현에 의한 치료는 HSV의 효율을 추가로 증대시킨다
실시예 F에 기재된 MC38 모델에서 HSV 매개된 종양 성장 저해에 대한 항-PD1 치료의 효과를 평가하도록 실험은 수행되었다. 이 실험의 결과는 도 68 및 하기에 표 25에 기재되어 있다. 마우스는 표 25에 기재된 바와 같은 상이한 페이로드를 발현하는 작제물로 치료되었다. 도 68에 도시된 바대로, ONCR-153 및 항-PD1의 조합에 의한 치료는 ONCR-152 또는 항-PD1 단독으로 관찰된 것과 비교하여 주사된 종양에서 종양 성장 저해를 증대시켰다.
Figure pct00018
실시예 14 - 췌장암, 폐암 또는 결장암을 앓는 환자의 치료
췌장암, 폐암 또는 결장암을 앓는 환자는 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 이용하여 치료된다. 도 39 내지 도 50에 도시된 바와 같은 UL19, ICP4, ICP27, 또는 UL42(또는 다른 바이러스 유전자)로 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 도입함으로써 약독화된 HSV-기반 바이러스 스톡이 생성될 수 있다. 몇몇 경우에, 종양 파괴 및/또는 미세환경 리모델링에 대한 게놈-편집은 도 45-46에 도시된 바와 같이 miRNA 표적 서열 이외에 바이러스로 조작된다. 구체적인 예에서, ICP4 및 ICP27로 도입된 miR-124, miR-451a, miR-143-3p 및 miR-559 약독화 카세트를 함유하는 HSV-기반 스톡은 사용된다. 또 다른 예에서, HSV-기반 스톡은 ICP27 및/또는 UL42 유전자로 도입된 miR-122 및 miR-125a 표적 서열의 1개 이상의 카피를 갖는 약독화 카세트를 함유한다. 임의의 이들 조성물에 대해, 실시예 3에 기재된 방법에 따라 HSV-기반 스톡이 생성된다. miRNA 표적 서열 카세트는 ICP4, ICP27UL19, 및/또는 UL42 유전자의 3' UTR로 도입된다. BAC 작제물은 Vero-Cre 세포의 형질주입에 의한 loxP 부위 사이에 위치한 BAC 서열의 동시의 제거로 바이러스 입자로 전환되었다. 플라크 정제 이후에, 바이러스 스톡은 추가로 정제되고, 완충제 교환되고, Vero 세포에서 적정되었다. 췌장암, 폐암 또는 결장암을 앓는 환자에 대한 생체내 투여에 대해, HSV 입자는 약제학적으로 허용 가능한 안정화제와 함께 포스페이트 완충 용액(PBS) 중에 제조된다. 치료일에, 1.0㎖의 약제학적으로 허용 가능한 담체의 용적 중의 109 벡터 게놈은 종양내 점적주사를 통해 투여된다. 환자는 그 환자의 특정한 예후에 기초하여 적절한 시간 간격에서 표준 관리 절차를 이용하여 종양 회귀에 대해 모니터링된다.
실시예 15 - 뇌암, 방광암, 유방암 또는 두경부암을 앓는 환자의 치료
뇌암, 방광암, 유방암 또는 두경부암을 앓는 환자는 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 이용하여 치료된다. 실시예 3에 기재된 방법에 따라 miR-124, miR-451a, miR-145-3p 및 miR-559 약독화 카세트를 함유하는 HSV-기반 바이러스 스톡이 생성된다. miRNA 표적 서열 카세트는 도 48에 도시된 바와 같은 ICP4(miR-124) 및 ICP27(miR-451a, miR-145-3p, miR-559) 유전자의 3' UTR로 재조합되었다. BAC 작제물은 Vero-Cre 세포의 형질주입에 의한 loxP 부위 사이에 위치한 BAC 서열의 동시의 제거로 바이러스 입자로 전환되었다. 플라크 정제 이후에, 바이러스 스톡은 추가로 정제되고, 완충제 교환되고, Vero 세포에서 적정되었다. 뇌암, 방광암, 유방암 또는 두경부암을 앓는 환자에 대한 생체내 투여에 대해, HSV 입자는 약제학적으로 허용 가능한 안정화제와 함께 포스페이트 완충 용액(PBS) 중에 제조된다. 치료일에, 1.0㎖의 약제학적으로 허용 가능한 담체의 용적 중의 109 벡터 게놈은 종양내 점적주사를 통해 투여된다. 환자는 그 환자의 특정한 예후에 기초하여 적절한 시간 간격에서 표준 관리 절차를 이용하여 모니터링된다. 이들 실험의 잠재적인 결과는 표준 관리 치료와 비교하여 종양 성장의 부분 또는 완전 저해, 종양 전이의 저해, 연장된 방출 시간, 및/또는 재발율의 감소를 포함한다.
실시예 16 - 신경초종을 앓는 환자의 치료
신경초종을 앓는 환자는 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 이용하여 치료된다. 실시예 3에 기재된 방법에 따라 miR-124-3p, miR-205-5p, miR-141-5p 및 miR-31-5p 약독화 카세트를 함유하는 HSV-기반 바이러스 스톡이 생성된다. miRNA 표적 서열 카세트는 도 49에 도시된 바와 같은 ICP4(miR-124) 및 ICP27(miR-205-5p, miR-141-5p, miR-31-5p) 유전자의 3' UTR로 재조합되었다. BAC 작제물은 Vero-Cre 세포의 형질주입에 의한 loxP 부위 사이에 위치한 BAC 서열의 동시의 제거로 바이러스 입자로 전환되었다. 플라크 정제 이후에, 바이러스 스톡은 추가로 정제되고, 완충제 교환되고, Vero 세포에서 적정되었다. 신경초종을 앓는 환자에 대한 생체내 투여에 대해, HSV 입자는 약제학적으로 허용 가능한 안정화제와 함께 포스페이트 완충 용액(PBS) 중에 제조된다. 치료일에, 1.0㎖의 약제학적으로 허용 가능한 담체의 용적 중의 109 벡터 게놈은 종양내 점적주사를 통해 투여된다. 환자는 그 환자의 특정한 예후에 기초하여 적절한 시간 간격에서 표준 관리 절차를 이용하여 모니터링된다. 이들 실험의 잠재적인 결과는 표준 관리 치료와 비교하여 종양 성장의 부분 또는 완전 저해, 종양 전이의 저해, 연장된 방출 시간, 및/또는 재발율의 감소를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 도시되고 기재되어 있지만, 이러한 실시형태가 오직 예로 제공된다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 많은 변형, 변경 및 치환은 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 실행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행하는 데 이용될 수 있다고 이해되어야 한다. 하기 청구항이 본 발명의 범위를 정의하고 이 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 이의 균등물이 이로써 다뤄지는 것으로 의도된다.
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참고에 의한 포함
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 공보, 특허, 특허 공보 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 원용된다. 그러나, 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌, 기사, 공보, 특허, 특허 공보 및 특허 출원의 언급은, 이들이 세계의 임의의 나라에서의 일반적인 상식의 일부를 형성하거나 유효한 선행 기술을 구성한다는 제안의 임의의 형태 또는 인정으로 해석되지 않고 해석되지 않아야 한다.
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SEQUENCE LISTING <110> Oncorus, Inc. Finer, Mitchell H Kennedy, Edward Lerner, Lorena Queva, Christophe <120> ONCOLYTIC VIRAL VECTORS AND USES THEREOF <130> ONCR-010/02WO 324865-2078 <150> 62/537,359 <151> 2017-07-26 <150> 62/686,802 <151> 2018-06-19 <160> 855 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 1 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Human <400> 2 uaaggcacgc ggugaaugcc 20 <210> 3 <211> 24 <212> RNA <213> Human <400> 3 ucccugagac ccuuuaaccu guga 24 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 4 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 5 ucggauccgu cugagcuugg cu 22 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 6 ucacagugaa ccggucucuu u 21 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 7 aagcccuuac cccaaaaagu au 22 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 8 cuuuuugcgg ucugggcuug c 21 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 9 cagugcaaug augaaagggc au 22 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 10 acucuuuccc uguugcacua c 21 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22 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 24 acagcaggca cagacaggca gu 22 <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 25 uacugcauca ggaacugauu gga 23 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 26 ugauugucca aacgcaauuc u 21 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 27 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 28 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 28 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 29 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 29 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 30 uaaaguaaau augcaccaaa a 21 <210> 31 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 31 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 32 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 32 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 33 ugagguagua gguugugugg uu 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 34 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 35 agagguagua gguugcauag uu 22 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 36 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 37 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 38 ugagguagua guuuguacag uu 22 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 39 ugagguagua guuugugcug uu 22 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 40 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 41 uacaguacug ugauaacuga a 21 <210> 42 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 42 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 43 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 43 ucaaaugcuc agacuccugu ggu 23 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 44 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 45 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 46 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 46 agcagcauug uacagggcua uca 23 <210> 47 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 47 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 48 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 48 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 49 uugcucacug 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<213> Human <400> 724 uuuaggauaa gcuugacuuu ug 22 <210> 725 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 725 aauggcgcca cuaggguugu g 21 <210> 726 <211> 25 <212> RNA <213> Human <400> 726 caacccuagg agagggugcc auuca 25 <210> 727 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 727 uaugucugcu gaccaucacc uu 22 <210> 728 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 728 uggugggccg cagaacaugu gc 22 <210> 729 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 729 auaauacaug guuaaccucu uu 22 <210> 730 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 730 aauauuauac agucaaccuc u 21 <210> 731 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 731 accuccugug ugcauggauu a 21 <210> 732 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 732 uacccauugc auaucggagu ug 22 <210> 733 <211> 24 <212> RNA <213> Human <400> 733 ugccuggguc ucuggccugc gcgu 24 <210> 734 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 734 aggcggggcg ccgcgggacc gc 22 <210> 735 <211> 23 <212> RNA <213> Human <400> 735 uauucauuua uccccagccu aca 23 <210> 736 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 736 uucauuugcc ucccagccua ca 22 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<212> PRT <213> Artifical <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 838 Val Tyr Pro Tyr Xaa Glu Phe Val Leu 1 5 <210> 839 <211> 9 <212> PRT <213> Artifical <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 839 Lys Leu Asn Pro Asn Xaa Ile Ala Ser 1 5 <210> 840 <211> 9 <212> PRT <213> Artifical <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 840 Ile Thr Thr Val Xaa Thr Phe Ile Asp 1 5 <210> 841 <211> 9 <212> PRT <213> Artifical <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 841 Val Asp Thr Asp Xaa Thr Gln Gln Gln 1 5 <210> 842 <211> 9 <212> PRT <213> Artifical <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 842 Val Pro Ser Thr Xaa Leu Leu Leu Phe 1 5 <210> 843 <211> 32767 <212> DNA <213> Artifical <400> 843 aaaaaagctg aacgagaaac gtaaaatgat ataaatatca atatattaaa ttagattttg 60 cataaaaaac agactacata atactgtaaa acacaacata tccagtcact atgaatcaac 120 tacttagatg gtattagtga cctgtagtcg accgacagcc ttccaaatgt tcttcgggtg 180 atgctgccaa cttagtcgac cgacagcctt ccaaatgttc ttctcaaacg gaatcgtcgt 240 atccagccta ctcgctattg tcctcaatgc cgtattaaat cataaaaaga aataagaaaa 300 agaggtgcga gcctcttttt tgtgtgacaa aataaaaaca tctacctatt catatacgct 360 agtgtcatag tcctgaaaat catctgcatc aagaacaatt tcacaactct tatacttttc 420 tcttacaagt cgttcggctt catctggatt ttcagcctct atacttacta aacgtgataa 480 agtttctgta atttctactg tatcgacctg cagactggct gtgtataagg gagcctgaca 540 tttatattcc ccagaacatc aggttaatgg cgtttttgat gtcattttcg cggtggctga 600 gatcagccac ttcttccccg ataacggaga ccggcacact ggccatatcg gtggtcatca 660 tgcgccagct ttcatccccg atatgcacca ccgggtaaag ttcacgggag actttatctg 720 acagcagacg tgcactggcc agggggatca ccatccgtcg cccgggcgtg tcaataatat 780 cactctgtac atccacaaac agacgataac ggctctctct tttataggtg taaaccttaa 840 actgcatttc accagcccct gttctcgtca gcaaaagagc 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gttccctccg tgatcgagta aaccatgtta 25920 aggaccagcg atcgcagctc ggcgtttacg ggaccgagtt gttggacgtc cgccagcagc 25980 gagaggcgac tcccgttgta gtacagcacg ttgaggtctg gcagccctcc ggggtttctg 26040 gggctggggt tcaggtcccg gatgcccctg gccacgagcc gcgccacgat ttcgcgcgcc 26100 aggggcgatg gaagcggaac gggaaaccgc aacgtgaggt ccagcgaatc caggcgcacg 26160 tccgtcgctt ggccctcgaa cacgggcggg acgaggctga tggggtcccc gttacagaga 26220 tctacggggg aggtgttgcg aaggttaacg gtgccggcgt gggtgaggcc cacgtccagg 26280 gggcaggcga cgattcgcgt gggaagcacc cgggtgatga ccgcggggaa gcgccttcgg 26340 tacgccagca acaaccccaa cgtgtcggga ctgacgcctc cggagacgaa ggattcgtgc 26400 gccacgtcgg ccagcgtcag ttgccggcgg atggtcggca ggaataccac ccgcccttcg 26460 cagcgctgca gcgccgccgc atcggggcgc gagatgcccg agggtatcgc gatgtcagtt 26520 tcaaagccgt ccgccagcat ggcgccgatc cacgcggcag ggagtgcagt ggtggttcgg 26580 gtggcgggag gagcgcggtg ggggtcagcg gcgtagcaga gacgggcgac caacctcgca 26640 taggacgggg ggtgggtctt agggggttgg gaggcgacag ggaccccaga gcatgcgcgg 26700 ggaggtctgt cgggcccaga 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caggctgttt gcatcggagc gcacgcggga 30900 aaaaaaatca aacaggcgtc gatgcgacgc cacctcgatc gtgctaagga gggacccggt 30960 cggcaccatg gccgcggcat accggtatcc cggagggtcg cggttgggag cggccatggg 31020 gtcgcgtgga gatcggctgt ctctagcgat attggcccgg ggaggctaag atccacccca 31080 acgcccggcc acccgtgtac gtgcccgacg gcccaaggtc caccgaaaga cacgacgggc 31140 ccggacccaa aaaggcgggg gatgctgtgt gagaggccgg gtgccggtcg ggggggaaag 31200 gcaccgggag aaggctgcgg cctcgttcca ggagaaccca gtgtccccaa cagacccggg 31260 gacgtgggat cccaggcctt atataccccc ccccccgccc cacccccgtt agaacgcgac 31320 gggtgcattc aagatggccc tggtccaaaa gcgtgccagg aagaaattgg cagaggcggc 31380 aaagctgtcc gccgccgcca cccacatcga ggccccggcc gcgcaggcta tccccagggc 31440 ccgtgtgcgc aggggatcgg tgggcggcag catttggttg gtggcgataa agtggaaaag 31500 cccgtccgga ctgaaggtct cgtgggcggc ggcgaacaag gcacacaggg ccgtgcctcc 31560 caaaaacacg gacatccccc aaaacacggg cgccgacaac ggcagacgat ccctcttgat 31620 gttaacgtac aggaggagcg cccgcaccgc ccacgtaacg tagtagccga cgatggcggc 31680 caggatacag gccggcgcca ccacccttcc ggtcagcccg taatacatgc ccgctgccac 31740 catctccaac ggcttcagga ccaaaaacga ccaaaggaac agaatcacgc gctttgaaaa 31800 gaccggctgg gtatggggcg gaagacgcga gtatgccgaa ctgacaaaaa aatcagaggt 31860 gccgtacgag gacaatgaaa actgttcctc cagcggcagt tctccctcct cccccccgaa 31920 ggcggcctcg tcgaccagat ctcgatccac cagaggaagg tcatcccgca tggtcatggg 31980 gtgtgcggtg gaggtgggga gaccgaaacc gcaaagggtc gcttacgtca gcaggatccc 32040 gagatcaaag acacccgggt tcttgcacaa acaccacccg ggttgcatcc gcggaggcga 32100 gtgttttgat aaggccgttc cgcgccttga tataaccttt gatgttgacc acaaaacccg 32160 gaatttacgc ctacgcccca atgcccacgc aagatgaggt aggtaacccc cccgtgggtg 32220 tgacgttgcg tttagttcat tggaggccaa ggggaaaaat ggggtgggga ggaaacggaa 32280 aacccagtag gccgtgtcgg gaacacgccc ggggttgtcc tcaaaaggca gggtccatac 32340 tacggaagcc gtcgttgtat tcgagacctg cctgtgcaac gcacgtcggg gttgcctgtg 32400 tccggttcgg cccccaccgc gtgcggcacg cacgaggacg agtccgcgtg ctttattggc 32460 gttccaagcg ttgccctcca gtttctgttg tcggtgttcc cccataccca cgcccacatc 32520 caccgtaggg ggcctctggg ccgtgttacg tcgccgcccg cgatggagct tagctacgcc 32580 accaccatgc actaccggga cgttgtgttt tacgtcacaa cggaccgaaa ccgggcctac 32640 tttgtgtgcg gggggtgtgt ttattccgtg gggcggccgt gtgcctcgca gcccggggag 32700 attgccaagt ttggtctggt cgttcgaggg acaggcccag acgaccgcgt ggtcgccaac 32760 tatgtac 32767 <210> 852 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRT-1-143_1736 <400> 852 ccatatacat acttctttac attccatcct gagctacagt gcttcatctc attgcataca 60 tacttcttta cattccaacg tgagctacag tgcttcatct catccgatac atacttcttt 120 acattccacg gcgagctaca gtgcttcatc tcaccttata catacttctt tacattccaa 180 aaagagctac agtgcttcat ctcaccat 208 <210> 853 <211> 308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRT-128m-122-219_6793 <400> 853 cacgagaatt gcgtttggac aatcagacac aaacaccatt gtcacactcc atcttaaaga 60 gaccggttca ctgtggatgt caaacaccat tgtcacactc caacttagaa ttgcgtttgg 120 acaatcaagg gaaagagacc ggttcactgt ggccagcaaa caccattgtc acactccaaa 180 acaaagagac cggttcactg tggtacgaga attgcgtttg gacaatcaga 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cgatcaacta 300 cgcgtattct taagcaataa ccaa 324

Claims (118)

  1. 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 적어도 2개의 마이크로-RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하는 재조합 종양세포붕괴성(oncolytic) 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus: HSV)로서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP4, ICP27, ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 및 UL42로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 재조합 HSV의 복제는 동일한 세포 유형의 암성 세포에서 상기 재조합 HSV의 복제와 비교하여 비암성 세포에서 감소된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP8, ICP22, ICP34.5, UL5, UL8, UL9, UL30, UL39/40 및 UL42로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL8, ICP8 및 UL30으로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP27 및 ICP4로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP4, ICP27, UL8, UL42 및 ICP34.5로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 근육 세포 및 간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  7. 제6항에 있어서, 상기 뉴런 세포는 중추 신경계 세포, 말초 신경계 세포, 뇌 세포 또는 척수 세포인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  8. 제6항에 있어서, 상기 근육 세포는 횡문근 세포 또는 평활근 세포인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 비암성 세포 및 상기 암성 세포는 뇌 세포이고, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-137, miR-219a, miR-124, miR-9, miR-487b 및 miR-128로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  10. 제9항에 있어서, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-137, miR-219a, miR-124 및 miR-128로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  11. 제1항에 있어서, 상기 비암성 세포 및 상기 암성 세포는 심장 또는 횡문근 세포이고, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-208b, miR-1, miR-208a, miR-133a, miR-4284, miR-499a, miR-126, miR-30e, miR-378i, miR-30b 및 miR-378로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-208b, miR-1 및 miR-208a로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  13. 제1항에 있어서, 상기 비암성 세포 및 상기 암성 세포는 척수 세포이고, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-219a, miR-9, miR-204, miR-577, miR-99a, miR-100, miR-132 및 miR-135로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-219a, miR-9 및 miR-204로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  15. 제1항에 있어서, 상기 비암성 세포 및 상기 암성 세포는 말초 신경계 세포이고, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-204, miR-1, miR-206, miR-9, miR-99a, miR-199b, miR-145, miR-100, miR-574로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  16. 제1항에 있어서, 상기 비암성 세포 및 상기 암성 세포는 간 세포이고, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-122 및 miR-126으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  17. 제1항에 있어서, 상기 비암성 세포 및 상기 암성 세포는 평활근 세포이고, 상기 적어도 2개의 miRNA 표적 서열은 miR-143 및 miR-145로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 miR 표적 서열은 상기 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 비번역된 영역(untranslated region: UTR) 또는 3' UTR로 삽입된 miR-T 카세트로 도입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  19. 제18항에 있어서, 상기 miR-T 카세트는 1000개 미만의 뉴클레오타이드의 길이를 포함하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  20. 제19항에 있어서, 상기 miR-T 카세트는 약 25개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드의 길이를 포함하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  21. 제18항에 있어서, 상기 miR-T 카세트는 약 100개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드의 길이를 포함하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  22. 재조합 종양세포붕괴성 단순 포진 바이러스(HSV)로서,
    (i) 제1 바이러스 유전자로 삽입되고, miR-124, miR-1 및 miR-143의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열을 포함하는 제1 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열 카세트(miR-TS 카세트);
    (ii) 제2 바이러스 유전자로 삽입되고, miR-128, miR-219a 및 miR-122의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열을 포함하는 제2 miR-TS 카세트; 및
    (iii) 제3 바이러스 유전자로 삽입되고, miR-219a, miR-204 및 miR-128의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열을 포함하는 제3 miR-TS 카세트를 포함하는, 재조합 HSV.
  23. 제22항에 있어서, 제3 바이러스 유전자로 삽입된 제3 miR-TS 카세트를 추가로 포함하고, 제3 miR-TS 카세트는,
    (a) miR-137, miR-208b-3p 및 miR-126의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열; 또는
    (b) miR-137, miR-217 및 miR-126의 각각에 대한 적어도 2개의 표적 서열을 포함하는, 재조합 HSV.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 miR-TS 카세트의 각각은 각자의 miRNA의 각각에 대한 4개의 표적 서열을 포함하는, 재조합 HSV.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 제1 바이러스 유전자는 ICP4인, 재조합 HSV.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 제2 바이러스 유전자는 ICP27인, 재조합 HSV.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 제3 바이러스 유전자는 ICP34.5인, 재조합 HSV.
  28. 제23항에 있어서, 상기 제4 바이러스 유전자는 UL8인, 재조합 HSV.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 HSV의 복제는 동일한 세포 유형의 암성 세포에서 상기 재조합 HSV의 복제와 비교하여 비암성 세포에서 감소되고, 상기 세포는 뉴런 세포, 심장 세포, 근육 세포 및 간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 HSV.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 miR-TS 카세트는 서열번호 852와 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 HSV.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제1 miR-TS 카세트는 서열번호 852의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 재조합 HSV.
  32. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 miR-TS 카세트는 서열번호 853과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 HSV.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제2 miR-TS 카세트는 서열번호 853의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 재조합 HSV.
  34. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 miR-TS 카세트는 서열번호 854와 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 HSV.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제3 miR-TS 카세트는 서열번호 854의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 재조합 HSV.
  36. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 miR-TS 카세트는 서열번호 855와 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 HSV.
  37. 제36항에 있어서, 상기 제4 miR-TS 카세트는 서열번호 855의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 재조합 HSV.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 페이로드(payload) 분자를 코딩하는 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 재조합 HSV.
  39. 제38항에 있어서, 상기 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 IL-12, CCL4 및 CXCL10으로 이루어진 군으로부터 선택된 페이로드를 코딩하는, 재조합 HSV.
  40. 제38항에 있어서, 상기 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 IL-12, CCL4 및 CXCL10으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 페이로드를 코딩하는, 재조합 HSV.
  41. 제38항에 있어서, 상기 비상동성 폴리뉴클레오타이드 서열은 IL-12, CCL4 및 CXCL10을 포함하는 3개의 페이로드를 코딩하는, 재조합 HSV.
  42. 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 마이크로-RNA(miR) 표적 서열을 포함하는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스로서, 상기 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)이고, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL8, ICP34.5, UL42, UL19, ICP4 및 ICP27로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  43. 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' 비번역된 영역(UTR) 또는 3' UTR로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 miR 표적 서열은 miR-122, miR-184, miR-34a, let7a, miR-145-5p, miR-199a-5p, miR-451a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-126-3p, miR-233-3p, miR-143-3p, miR-1-3p, miR-133a-3p, miR-127a-3p, miR-133b, miR-134-3p, miR-124, miR-101, miR-125b, miR-145, miR-559, miR-213, miR-31-5p 및 miR-205p로 이루어진 군으로부터 선택된 miR에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  46. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR 표적 서열의 2개, 3개, 4개 또는 초과의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스의 복제는 제2 세포에서의 상기 바이러스의 복제와 비교하여 제1 세포에서 감소되거나 약화되고, 상기 제1 세포는 상기 제2 세포에서의 상기 miR의 발현과 비교하여 하나 이상의 miR 표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 증가된 발현을 갖는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  48. 제47항에 있어서, 상기 제1 세포에서의 상기 miR의 발현 수준은 상기 제2 세포에서의 상기 miR의 발현 수준보다 적어도 5% 큰, 종양세포붕괴성 바이러스.
  49. 제47항에 있어서, 상기 제1 세포는 비암성 세포인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  50. 제47항에 있어서, 상기 제2 세포는 상기 제1 세포에서의 상기 miR의 발현과 비교하여 상기 하나 이상의 miR 표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 감소된 발현을 갖는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제2 세포에서의 상기 miR의 발현 수준은 상기 제1 세포에서의 상기 miR의 발현 수준보다 적어도 5% 적은, 종양세포붕괴성 바이러스.
  52. 제47항에 있어서, 상기 제2 세포는 암성 세포인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  53. 제42항에 있어서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  54. 제53항에 있어서, 상기 miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP27인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  56. 제53항에 있어서, 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 miR-125a 표적 서열의 1개의 카피를 추가로 포함하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  57. 제56항에 있어서, 상기 miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  58. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL42인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  59. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  60. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  61. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 3개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  62. 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  63. 재조합 종양세포붕괴성 바이러스로서,
    (a) 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된 하나 이상의 마이크로-RNA(miR) 표적 서열; 및
    (b) (i) 하나 이상의 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 miR, 유전자 또는 금속단백질분해효소(tissue inhibitor of metalloproteinase: TIMP)의 조직 저해제의 발현을 감소시키거나 기능을 저해하는, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드; 또는
    (ii) 프로테아제-활성화된 항체
    를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고;
    상기 바이러스는 HSV이고, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL42, UL19, ICP4 및 ICP27로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  64. 제63항에 있어서, 상기 miR은 종양형성 miR 또는 미세환경 리모델링 miR인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  65. 제64항에 있어서, 상기 종양형성 miR은 표 4에 기재된 miR로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  66. 제63항에 있어서, 상기 유전자는 종양형성 유전자인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  67. 제66항에 있어서, 상기 종양형성 유전자는 표 7에 기재된 유전자로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  68. 제63항에 있어서, 상기 미세환경 리모델링 miR은 표 5에 기재된 miR로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  69. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR 표적 서열은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 5' 비번역된 영역(UTR) 또는 3' UTR로 도입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  70. 제69항에 있어서, 상기 miR 표적 서열은 miR-122, miR-184, miR-34a, let7a, miR-145-5p, miR-199a-5p, miR-451a, miR-125a, miR-125a-5p, miR-126-3p, miR-233-3p, miR-143-3p, miR-1-3p, miR-133a-3p, miR-127a-3p, miR-133b, miR-134-3p, miR-124, miR-101, miR-125b, miR-145, miR-559, miR-213, miR-31-5p 및 miR-205p로 이루어진 군으로부터 선택된 miR에 대한 표적 서열인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  71. 제63항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR 표적 서열의 1개 이상의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  72. 제71항에 있어서, 상기 하나 이상의 miR 표적 서열의 2개, 3개, 4개 또는 초과의 카피는 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  73. 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  74. 제73항에 있어서, 상기 miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 ICP27인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  76. 제73항에 있어서, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피를 추가로 포함하는 것은 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  77. 제76항에 있어서, 상기 miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 유전자는 UL42인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  79. 제63항에 있어서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  80. 제63항에 있어서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 1개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  81. 제63항에 있어서, miR-122 표적 서열의 1개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 3개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  82. 제63항에 있어서, miR-122 표적 서열의 4개의 카피는 ICP27의 유전좌위로 삽입되고, miR-125a 표적 서열의 4개의 카피는 UL42의 유전좌위로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  83. 제63항에 있어서, 상기 TIMP는 TIMP1, TIMP2, TIMP3 및 TIMP4로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  84. 제63항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 shRNA 또는 디코이(decoy) 올리고뉴클레오타이드인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  85. 제63항에 있어서, 상기 단백질은 뉴클레아제, 이중특이적 T 세포 관여항체(bispecific T-cell engager: BiTE), 항면역억제 단백질 또는 면역원성 항원인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  86. 제85항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 규칙적인 간격의 짧은 회문구조 반복배열(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR) 연관된 엔도뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease: ZFN) 또는 전사 활성자 유사 효과기 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease: TALEN)로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  87. 제86항에 있어서, 상기 CRISPR 연관된 엔도뉴클레아제는 SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9, C2C1, C2C3, Cpf1, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3 및 Csf4로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  88. 제87항에 있어서, tracr-RNA(trRNA) 및 crispr-RNA(crRNA)를 코딩하는 비상동성 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 crRNA는 miR 또는 TIMP를 코딩하는 게놈 DNA 서열에 표적화되고, 상기 trRNA는 CRISPR 연관된 엔도뉴클레아제의 결합 및 활성화를 촉진하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  89. 제85항에 있어서, 상기 항면역억제 단백질은 항-조절 T 세포(regulatory T-cell: Treg) 단백질 또는 항-골수성 유래된 억제자 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC) 단백질인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  90. 제85항에 있어서, 상기 항면역억제 단백질은 VHH 유래된 차단제 또는 VHH 유래된 BiTE인, 종양세포붕괴성 바이러스.
  91. 제63항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 항종양 면역 반응을 유도하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  92. 제91항에 있어서, 상기 단백질은 세포 표면에서 발현된 항원에 결합하고, 상기 항원은 EpCAM, CTLA-4, PD1, FGF2, FGFR/FGFR2b, 엔도텔린 B 수용체 및 SEMA4D로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  93. 제91항에 있어서, 상기 단백질은 혈소판, IFNβ, A2A, CCL5, CD137, CD200, CD38, CD44, CSF-1R, CXCL10, CXCL13, IL-12, IL-15, IL-2, IL-21, IL-35, ISRE7, LFA-1, NG2(SPEG4로도 공지됨), SMAD 단백질, STING, TGFβ 및 VCAM1로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  94. 제63항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프로테아제-활성화된 항체는 바이러스 당단백질 엔벨로프로 도입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  95. 제63항 또는 제94항에 있어서, 상기 프로테아제-활성화된 항체는 시스테인 카텝신, 아스파르틱 카텝신, 칼리크레인(hK), 세린 프로테아제, 카스파제, 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase: MMP) 및 디스인테그린 금속단백질분해효소(disintegrin metalloproteinase: ADAM)로부터 선택된 프로테아제에 의해 활성화된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  96. 제95항에 있어서, 상기 프로테아제는 카텝신 K, 카텝신 B, 카텝신 L, 카텝신 E, 카텝신 D, hK1, PSA(hK3), hK10, hK15, uPA, uPAR, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23A, MMP-23B, MMP-24, MMP-25, MMP-26, MMP-27, MMP-28, 또는 표 6에 기재된 프로테아제로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  97. 제63항 또는 제94항에 있어서, 상기 프로테아제-활성화된 항체는 암 세포에 의해 또는 비암 세포에서보다 암 미세환경에 의해 또는 비암 미세환경에서 더 고도로 발현된 단백질에 결합하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  98. 제97항에 있어서, 상기 프로테아제-활성화된 항체는 NKG2D, c-met, HGFR, CD8, 황산 헤파란, VSPG4(NG2로도 공지됨), EGFR, EGFRvIII, CD133, CXCR4, 암배아성 항원(carcinoembryonic antigen: CEA), CLC-3, 아넥신 II, 인간 트랜스페린 수용체 또는 EpCAM에 결합하는, 종양세포붕괴성 바이러스.
  99. 제63항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상기 바이러스 게놈의 유전자 유전좌위로 삽입되거나, 상기 바이러스 게놈의 2개의 유전자 유전좌위 사이로 삽입된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  100. 제99항에 있어서, 상기 바이러스 유전자 유전좌위는 내부 반복 연결 영역(이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT, ICP4 및 ICP47 촉진자의 각각의 1개의 카피를 포함), ICP0, LAT, UL1, UL5, UL6, UL7, UL8, UL9, UL11, UL12, UL14, UL15, UL17, UL18, UL19, UL20, UL22, UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30, UL31, UL32, UL33, UL34, UL35, UL36, UL37, UL38, UL39, UL40, UL42, UL48, UL49, UL52, UL53, UL54, ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, 감마-34.5, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 및 US12로 이루어진 군으로부터 선택된, 종양세포붕괴성 바이러스.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항의 종양세포붕괴성 바이러스를 코딩하는 핵산 분자.
  102. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항의 종양세포붕괴성 바이러스를 포함하는 바이러스 스톡.
  103. 제42항 내지 제100항 중 어느 한 항의 종양세포붕괴성 바이러스 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
  104. 암성 세포를 사멸하는 방법으로서, 종양세포붕괴성 바이러스가 상기 암성 세포 내에 감염시키고 복제하기에 충분한 조건 하에 상기 암성 세포를 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항의 종양세포붕괴성 바이러스 또는 이의 조성물에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 암성 세포 내의 상기 종양세포붕괴성 바이러스의 복제는 세포사를 발생시키는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 암성 세포는 비암성 세포에서의 miR의 발현과 비교하여 하나 이상의 miR-표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 감소된 발현을 갖는, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 암성 세포에서의 miR의 발현 수준은 상기 비암성 세포에서의 miR의 발현 수준보다 적어도 5% 적은, 방법.
  107. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양세포붕괴성 바이러스의 복제는 상기 하나 이상의 miR-표적 서열에 결합할 수 있는 miR의 감소된 발현을 갖는 암성 세포에서 증가되거나 유지되는, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 바이러스 복제는 상기 비암성 세포에서의 바이러스 복제와 비교하여 상기 암성 세포에서 적어도 5% 큰, 방법.
  109. 제104항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 생체내인, 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 세포는 종양 내인, 방법.
  111. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항의 종양세포붕괴성 바이러스 또는 이의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 말, 비인간 영장류 또는 인간인, 방법.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 상기 종양세포붕괴성 바이러스 또는 이의 조성물은 정맥내로, 피하로, 종양내로, 근육내로 또는 비강내로 투여되는, 방법.
  114. 제111항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 결장직장암, 결장암, 췌장암, 간암, 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 미만성 대형 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma: DLBCL) 및 변연대 림프종(marginal zone lymphoma: MZL)으로부터 선택된, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 폐암은 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암인, 방법.
  116. 제114항에 있어서, 상기 간암은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma: HCC)인, 방법.
  117. 제38항의 재조합 HSV 또는 제63항 내지 제90항 중 어느 한 항의 재조합 종양세포붕괴성 바이러스로서, 페이로드 분자 또는 단백질은 항-FAP/항-CD3 이중특이적 T 세포 관여항체인, 재조합 HSV 또는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스.
  118. 제38항의 재조합 HSV 또는 제63항 내지 제90항 중 어느 한 항의 재조합 종양세포붕괴성 바이러스로서, 페이로드 분자 또는 단백질은 항-PD1-Fc-41BBL 단백질인, 재조합 HSV 또는 재조합 종양세포붕괴성 바이러스.
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