ES2923782T3 - Oncoterapia dirigida al receptor celular del virus del Valle de Séneca (SVV) - Google Patents

Abstract

Un método para seleccionar pacientes con cáncer para el tratamiento con el virus del valle de Séneca (SVV) mediante la determinación de la expresión de ANTXR1 en un tejido canceroso en un paciente con cáncer; y designar al paciente con cáncer como candidato para el tratamiento con SVV si se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión de ANTXR1 en el tejido canceroso. También se describe un método para tratar a un paciente de cáncer con SVV. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Oncoterapia dirigida al receptor celular del virus del Valle de Séneca (SVV)

Antecedentes de la invención

El virus del Valle de Séneca (SVV, por sus siglas en inglés), un picornavirus oncolítico recientemente descubierto, infecta selectivamente los cánceres con características neuroendocrinas, como el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés) y los tumores sólidos neuroendocrinos pediátricos. Estos cánceres constituyen una de las principales causas de morbilidad y mortalidad; sólo el SCLC es responsable de aproximadamente 30.000 muertes anuales en los Estados Unidos de América. En comparación con otros virus oncolíticos en evaluación clínica, el SVV destaca por su pequeño tamaño, su tiempo de duplicación excepcionalmente rápido, su alta selectividad para las células cancerosas neuroendocrinas y la ausencia de anticuerpos neutralizantes preexistentes en los pacientes. Estudios anteriormente realizados en múltiples modelos preclínicos de ratón confirmaron la capacidad del SVV para albergar al tumor a través de la vasculatura, lo que resulta en una potente eficacia anticancerosa. Los ensayos clínicos de fase I en los que se probó el SVV como viroterapia en pacientes con cánceres neuroendocrinos, incluido el SCLC, mostraron altos niveles de replicación viral sostenida en pacientes con SCLC, incluso después de la producción de anticuerpos neutralizantes contra el SVV, y confirmaron la capacidad del SVV para infectar selectivamente las células cancerosas tras su administración intravenosa. El desarrollo clínico de este agente se ha dificultado, en comparación con el de otros virus oncolíticos, por la falta de comprensión de los determinantes celulares de la infección por este nuevo virus, entre los que destaca la identificación del receptor celular del SVV.

La definición de los determinantes de la permisividad del SVV, incluida la identificación del receptor viral, facilitaría sustancialmente el desarrollo clínico al centrarse en los pacientes que podrían beneficiarse en última instancia de la viroterapia con el SVV. La presente descripción divulga que la proteína del receptor 1 de la toxina del ántrax (ANTXR1) es el receptor del SVV utilizando dos cribados complementarios de pérdida de función en todo el genoma. El ANTXR1 interactúa directa y específicamente con el SVV. Esta interacción es necesaria para la unión del SVV a las células permisivas, y la expresión del ANTXR1 es esencial para la infección por el SVV. La presente descripción define un biomarcador predictivo clínicamente trazable de la permisividad del SVV, e identifica al ANTXR1 como el receptor celular de alta afinidad para el SVV en los cánceres neuroendocrinos.

El WO 2008/112891 A2 describe la identificación del CXCR4 como receptor del SVV, la producción de anticuerpos para bloquear la entrada del virus en las células y el uso de este anticuerpo para predecir la respuesta a la terapia basada en el SVV. La unión del anticuerpo indica la expresión del CXCR4 y, por lo tanto, la susceptibilidad a la infección por el SVV.

Breve descripción de la invención

Un aspecto de la invención es un método para seleccionar un paciente con cáncer para el tratamiento con el virus del Valle de Séneca (SVV), que comprende: determinar el nivel de expresión del ANTXR1 en un tejido canceroso obtenido del paciente con cáncer; y designar al paciente con cáncer como candidato para el tratamiento con SVV si se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso. En una realización particular, el paciente con cáncer es un paciente con cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastoma, retinoblastoma, meduloblastoma, rabdomiosarcoma o tumor sólido neuroendocrino pediátrico. En otra realización, el paciente con cáncer es un paciente con cáncer de pulmón de células pequeñas. En una realización adicional, el nivel de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso se determina a nivel transcripcional. En una realización adicional, el nivel de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso se determina a nivel traduccional.

En otra realización de la invención, el método comprende además la etapa de determinar el nivel de expresión de uno o más biomarcadores en las vías de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso, y designar al paciente con cáncer para el tratamiento con SVV si (1) se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso y si (2) se detectan niveles de expresión disminuidos de uno o más biomarcadores en las vías de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso. En una realización particular, la vía de respuesta inmunitaria innata es la vía del interferón a o interferón p.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el SVV para su uso en el tratamiento del cáncer en pacientes con niveles normales o elevados de expresión del ANTXR1 detectados en su tejido canceroso. El tratamiento del cáncer puede comprender: determinar el nivel de expresión del ANTXR1 en un tejido canceroso de un paciente, y administrar al paciente una cantidad eficaz del SVV si se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso. En un caso particular, el tratamiento comprende además determinar el nivel de expresión de uno o más biomarcadores de la vía de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso; y administrar al paciente una cantidad eficaz del SVV si (1) se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso y si (2) se detectan niveles disminuidos de uno o más biomarcadores de la vía de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso. En una realización particular de la composición farmacéutica, el SVV está en combinación con otro agente terapéutico. En ciertas realizaciones, el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de puntos de control, citocinas, factores de crecimiento, agentes fotosensibilizantes, radionucleidos, toxinas, moléculas de ARNsi, moduladores de señalización, antibióticos anticancerosos, anticuerpos anticancerosos, inhibidores de la angiogénesis, compuestos quimioterapéuticos, compuestos antimetastáticos y una combinación de cualquiera de ellos. En una realización particular, el agente terapéutico es un inhibidor del punto de control. En ciertas realizaciones, la composición está adaptada para su administración por inyección directa en el tejido canceroso.

Otro aspecto de la invención es el uso de un kit en un método de selección de un paciente con cáncer para el tratamiento con SVV como se ha definido anteriormente, el kit comprende: un reactivo para la detección de los niveles de expresión del ANTXR1; y un reactivo para la detección de los niveles de expresión de uno o más biomarcadores de la vía de transducción de señales del interferón a o interferón p o interferón gamma.

Breve descripción de las figuras

Lo anterior y otros objetos y ventajas de la invención serán aparentes al considerar la siguiente descripción detallada, tomada en conjunto con las figuras adjuntas. A continuación se describen brevemente los dibujos que ilustran ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención.

La Fig. 1 muestra la identificación del ANTXR1 como un determinante esencial del huésped para el SVV. Panel a) Representación del diagrama de flujo del cribado de la inactivación por CRISPR de genoma completo (GeCKO). Tras la transducción lentiviral de la genoteca del ARNsg, las células transducidas se seleccionaron con puromicina. Las células fueron puestas a prueba con el SVV para seleccionar las células resistentes. Panel b) El cribado identificó el ANTXR1 (azul) y el TEX2 (rojo) como los resultados más significativos. Los ARNsg de control no dirigidos están resaltados en negro. Panel c) Las células HAP1 fueron transducidas con ARNsg individuales identificados en el cribado HAP1 por GeCKO. La viabilidad de las células se analizó en ausencia (gris claro) o en presencia (negro) del SVV. Cada barra corresponde al promedio de 6 réplicas con barras de error que representan la desviación estándar. Las líneas discontinuas indican la viabilidad de las células HAP1 parentales en ausencia y presencia del SVV. Panel d) Tabla de ARNsg identificados en el cribado de H446 por GeCKO. Se aislaron 25 colonias de H446 y se secuenció el inserto lentiviral mediante secuenciación de Sanger. Se identificaron múltiples ARNsg dirigidos al ANTXR1 del gen. Panel e) Las células H446 fueron transducidas con ARNsg individuales identificados en las 25 colonias del cribado de H446 por GeCKO. La viabilidad de las células se probó en ausencia (gris claro) o en presencia (negro) del SVV. La viabilidad de las células H446 parentales en ausencia y presencia del SVV se indica con líneas discontinuas. Cada barra corresponde al promedio de 6 réplicas con barras de error que representan la desviación estándar.

La Fig. 2 muestra que la inactivación del ANTXR1 conduce a la pérdida de permisividad del SVV. Panel a) Resumen, tabla de los indeles del ANTXR1 en cinco colonias seleccionadas de H446 ^k O ANTXR1 a partir del cribado por GeCKO. Panel b) Tres de las líneas celulares H446 KO ANTXR1 fueron puestas a prueba con MOI crecientes del SVV durante 72 h. La viabilidad celular se determinó mediante AlamarBlue. Las células H446 parentales y la línea celular A549 del NSCLC no permisiva se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Cada punto de datos representa el promedio de 6 réplicas con barras de error que representan la desviación estándar. Panel c) Las líneas celulares pediátricas y del SCLC permisivas fueron transducidas con un ARNsg dirigido a ANTXR1. Las células parentales (gris claro) y la inactivación del ANTXR1 (negro) fueron puestas a prueba con SVV-GFP y analizadas por citometría de flujo. Cada barra representa el promedio de 3 réplicas con barras de error que representan la desviación estándar. Panel d) Células H446 parentales (arriba), células h 446 KO ANTXR1 mCherry (abajo), o una mezcla al 1:1 de células parentales: KO ANTXR1 mCherry (centro) fueron puestas a prueba con el SVV-GFP. Las flechas blancas indican las células H446 parentales infectadas con SVV-GFP y las células KO ANTXR1 mCherry no infectadas. Las barras de escala representan 100 |jm. Panel e) Los tumores H446 parentales (verde claro/verde oscuro), los tumores H446 KO ANTXR1 mCherry (rosa/rojo), y la mezcla al 1:1 de tumores parentales:KO ANTXR1 mCherry (púrpura claro/morado oscuro) fueron puestos a prueba con WT SVV-001 o vehículo de PBS. Los volúmenes de los tumores se midieron cada dos días. Cada punto de datos corresponde al promedio de 4-5 tumores con barras de error que representan la desviación estándar. Panel f) Los tumores se extirparon al final del experimento y se analizaron mediante citometría de flujo. Cada barra representa el promedio de 4-5 tumores con barras de error que representan la desviación estándar.

La Fig. 3 muestra que la expresión del ANTXR1 está significativamente asociada con la permisividad. Panel a) Expresión génica del ANTXR1 escalada a log2 de las líneas celulares permisivas (arriba), no permisivas (centro) y de todas las líneas celulares en la CCLE (abajo). La expresión del ANTXR1 se asoció significativamente con la permisividad (p = 0,0023; prueba exacta de Fisher). Panel b) Un gráfico de código de barras de enriquecimiento que muestra el enriquecimiento negativo de los genes de señalización del interferón tipo I en las líneas celulares permisivas (q=,0046). Panel c) Se calcularon las puntuaciones de enriquecimiento por muestra para el conjunto de genes más enriquecidos y se graficaron en función de la histología del tumor de origen. El SCLC y el neuroblastoma destacan por carecer de genes implicados en la señalización del interferón tipo I. Panel d) Las células H446, H82 y H1618 (azul claro) fueron pretratadas con IFNp durante 24 horas antes de ponerlas a prueba con SVV-GFP y el posterior análisis por citometría de flujo. Las células no tratadas (azul oscuro) se utilizaron como controles. Cada barra en d-f representa el promedio de 3 réplicas con barras de error que representan la desviación estándar. Panel e) las H1618 y DMS79, Panel f) fueron pretratadas con inhibidores de la HDAC, SAHA (azul claro) o MS-275 (azul oscuro), IFNa/p (rojo), o IFNa/p con los correspondientes anticuerpos monoclonales IFNa/p (rosa) durante 24 h antes de ponerlas a prueba con SVV-GFP y el posterior análisis mediante citometría de flujo. Las células no infectadas (negro) y no tratadas (verde) se utilizaron como controles.

La Fig.4 muestra que la reexpresión del ANTXR1 reconstituye la permisividad del SVV. Las células fueron cotransfectadas con los plásmidos de expresión del ANTXR1-HA y mCherry (A,D,F). Panel a) Tres líneas celulares H446 KO ANTXR1 fueron transfectadas y luego puestas a prueba con SVV-GFP. La barra de escala representa 100 |jm. Panel b) Las líneas celulares H446 y LX22cl KO ANTXR1 fueron transfectadas, puestas a prueba con SVV-GFP y analizadas por citometría de flujo. Las células parentales y KO ANTXR1 transfectadas con mCherry se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente. Cada barra representa el promedio de 3 réplicas con barras de error que representan la desviación estándar. Panel c) Las células H69 y H146 fueron transducidas con un lentivirus de expresión del ANTXR1-HA inducible por Dox. Las células parentales y las que expresan el ANTXR1 se incubaron en ausencia o presencia de 1 jg/m L de doxiciclina durante 72 h, se pusieron a prueba con SVV-GFP y se analizaron por citometría de flujo. Cada barra representa el promedio de 3 réplicas con barras de error que representan la desviación estándar.

La Fig. 5 muestra que el SVV interactúa directamente con el ANTXR1. Panel a) el SVV fue coinmunoprecipitado con cantidades decrecientes de una quimera del ANTXR1-Fc. Las proteínas unidas se eluyeron y se analizaron por Western blot utilizando un anticuerpo anti-SVV El SVV de entrada fue inmunotransferido como control positivo. Panel b) El SVV fue coinmunoprecipitado con la quimera del ANTXR1-Fc. Los lavados se realizaron con concentraciones crecientes de NaCl hasta 2 M. Las proteínas de unión se eluyeron y se analizaron como se describe en A. Panel c) El SVV se coinmunoprecipitó con la quimera del ANTXR1-Fc o con cantidades decrecientes de la quimera del ANTXR2-Fc y se analizó como se describe en A. Panel d) El SVV-GFP se preincubó con la quimera del ANTXR1-Fc, la quimera del ANTXR2-Fc o el control de isotipo de IgG-Fc antes de una incubación de 8 horas con células H446 parentales. Los núcleos celulares se tiñeron con una sonda NucBlue LiveReady. La barra de escala representa 100 jm . Panel e) Las células KO ANTXR1 (azul) y con inactivación del TEX2 (rojo) fueron incubadas con SVV-Cy5 y analizadas por citometría de flujo. Las células H446 parentales (negro) y DMS114 (gris) se utilizaron como controles positivos y negativos para la unión al SVV, respectivamente. Panel f) Mapa de densidad crio-EM de la cápside del SVV (azul) unida a la quimera del ANTXR1-Fc (verde).

Descripción detallada de la invención

Algunos modos de llevar a cabo la presente invención se presentan en términos de sus aspectos, que se discuten a continuación.

Los encabezados utilizados en la presente tienen únicamente fines organizativos y no pretenden ser utilizados para limitar el alcance de la descripción o de los párrafos adjuntos. Tal y como se utiliza a lo largo de esta descripción, la palabra “puede” se emplea en un sentido permisivo (es decir, que significa tener la posibilidad de hacerlo), en lugar de en un sentido obligatorio (es decir, que significa que debe hacerlo). Los términos “un” y “una” en la presente no denotan una limitación de cantidad, sino la presencia de al menos uno de los elementos mencionados.

El ANTXRI es un receptor celular objetivo del SVV en los tumores

El ANTXR1 funciona como uno de los dos receptores para la toxina del Bacillus anthracis. El SVV es único entre los virus conocidos por utilizar el ANTXR1 como receptor primario. A diferencia de varios receptores previamente identificados de otros picornavirus, el ANTXR1 no es un miembro de la superfamilia de receptores de inmunoglobulina (IgSF). Aunque el ANTXR1 comparte características comunes con los receptores de IgSF al ser una glicoproteína transmembrana de paso único, puede ser único en su papel como receptor tanto de un virus de mamífero como de una toxina bacteriana.

Como se ha divulgado en la presente, el ANTXR1 se expresa frecuentemente en la superficie de las células tumorales en comparación con las células normales. Los esfuerzos por desarrollar un anticuerpo terapéutico dirigido al ANTXR1 expresado en el endotelio tumoral se han dificultado por la reactividad cruzada del anticuerpo con el ANTXR2. La exquisita selectividad del SVV para el ANTXR1 y la estructura crio-EM de resolución media descrita en la presente permitirán el futuro desarrollo terapéutico en el espacio de los anticuerpos tanto con fines antiangiogénicos como con un objetivo potencialmente novedoso para determinados cánceres neuroendocrinos. Los datos de expresión génica expuestos en la presente muestran que, además de la expresión del ANTXR1, los defectos de las células cancerosas en la respuesta inmunitaria innata son determinantes para el éxito de la replicación del SVV. Esta característica no es exclusiva del SVV y puede ser un requisito compartido para el éxito de muchos virus oncolíticos. Los defectos en las vías de respuesta inmunitaria innata son comunes en los cánceres; se ha demostrado que el SCLC, en particular, carece con frecuencia de componentes clave de la presentación de antígenos de clase I del m Hc , así como de una menor expresión de citoquinas inmunoestimulantes. Ambas cosas dan lugar a un menor reconocimiento y eliminación de las células tumorales por parte del sistema inmune. Estas características, junto con la expresión del ANTXR1, pueden definir una categoría de cánceres especialmente susceptibles de ser tratados con el SVV. Una mejor comprensión de cómo las vías de respuesta inmunitaria innata celular dictan la permisividad puede identificar estrategias de combinación sinérgicas con agentes terapéuticos dirigidos a estas vías en las células cancerosas.

En el caso del SVV, la expresión del ANTXR1 puede servir como biomarcador predictivo para el futuro desarrollo clínico, facilitando la identificación de los pacientes con mayor probabilidad de beneficiarse de la viroterapia con el SVV. Los biomarcadores predictivos para guiar futuros ensayos clínicos son una necesidad especialmente acuciante para los pacientes con SCLC. Se trata de un cáncer muy agresivo y casi universalmente letal, para el que se han identificado pocas objetivos terapéuticos tratables. Muchos ensayos clínicos a gran escala, llevados a cabo sin selección de biomarcadores, han fracasado a la hora de avanzar en el tratamiento estándar de esta enfermedad. Marcadores cuidadosamente definidos que centraran los nuevos estudios terapéuticos en el subconjunto de pacientes que responden podrían cambiar este campo. La identificación del ANTXR1, y posiblemente de la inmunidad innata suprimida, como criterios de selección ayudará a definir la estructura de nuestros posteriores ensayos clínicos.

Entre los cánceres que podrían tratarse con el SVV se encuentran el cáncer de pulmón de células pequeñas, el neuroblastoma, el retinoblastoma, el meduloblastoma, el rabdomiosarcoma y otros tumores sólidos neuroendocrinos pediátricos.

Definiciones

En la presente, los siguientes términos tendrán el siguiente significado:

Tal como se utilizan en la presente, los términos “cáncer”, “tumor” y “células tumorales” se emplean indistintamente y se refieren a células que presentan un crecimiento relativamente autónomo, de modo que muestran un fenotipo de crecimiento aberrante caracterizado por una pérdida significativa del control de la proliferación celular. Las células neoplásicas pueden ser malignas o benignas. De acuerdo con la presente invención, un tipo de células tumorales preferidas son aquellas con propiedades neurotrópicas.

Tal como se utiliza en la presente, el término “virus” debe entenderse en sentido amplio, por ejemplo, como las partículas virales infecciosas que se forman cuando, por ejemplo, un vector viral se transduce o transfecta en una célula o línea celular apropiada para la generación de partículas infecciosas, o en particular el SVV se utiliza para infectar a un sujeto que necesita tratamiento.

Tal como se utiliza en la presente, los términos “derivado”, “mutante”, “variante” y “modificado” se utilizan indistintamente para indicar en general que un virus derivado, mutante, variante o modificado puede tener una diferencia de secuencia de ácido nucleico o aminoácido con respecto a una secuencia de ácido nucleico o aminoácido viral modelo. Por ejemplo, un SVV derivado, mutante, variante o modificado puede referirse a un SVV que tiene una diferencia de secuencia de ácido nucleico o aminoácido con respecto a la secuencia de ácido nucleico o aminoácido del SVV de tipo silvestre del Depósito de Patentes ATCC número PTA-5343.

Como se utiliza en la presente, la “terapia combinada” se refiere a un tratamiento en el que un sujeto recibe dos o más agentes terapéuticos, como al menos dos o al menos tres agentes terapéuticos, para tratar una única enfermedad. A efectos de la presente, una terapia combinada puede incluir un régimen de tratamiento que incluya la administración de un virus oncolítico y otro agente anticanceroso, cada uno para tratar la misma enfermedad o condiciones hiperproliferativas, como el mismo tumor o cáncer.

Tal como se utiliza en la presente, los términos “biomarcador” y “biomarcador asociado al agente infeccioso” se utilizan indistintamente con referencia a cualquier entidad molecular que pueda utilizarse como indicador de la sensibilidad al SVV (el “agente infeccioso”), en particular esto se refiere al aumento de la expresión en las células tumorales del ANTXR1, y a la disminución correlativa en dichas células tumorales de las vías de respuesta inmunitaria innata, como las asociadas al interferón gamma. El biomarcador puede ser cualquier proteína detectable, ácido nucleico, como un ARNm o microARN, lípido, o cualquier producto presente y/o diferencialmente expresado en muestras de biopsia tumoral cuya presencia y/o concentración refleje la sensibilidad al SVV de un tumor en un sujeto. En términos moleculares, los biomarcadores pueden detectarse y cuantificarse en un sujeto mediante tecnologías genómicas, proteómicas o de imagen.

Tal y como se utiliza en la presente, el término “SVV” abarca el SVV de tipo silvestre, los derivados del SVV, los mutantes, las variantes o el SVV modificado en la discusión que se realiza a continuación.

Métodos para el cribado de pacientes

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para seleccionar a un paciente con cáncer para el tratamiento con SVV. El método comprende las etapas de determinar el nivel de expresión del ANTXR1 en un tejido canceroso de un paciente y designar al paciente como candidato para el tratamiento con SVV si se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso.

El análisis puede basarse en la identificación de la presencia, la ausencia y/o los perfiles de expresión alterados del ANTXR1 en las muestras de tejido canceroso aisladas. El análisis puede llevarse a cabo comparando los perfiles de expresión del ANTXR1 en una muestra de tejido canceroso con un perfil de expresión normal del ANTXR1 almacenado en una base de datos.

En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de determinar el perfil de expresión de uno o más biomarcadores en la muestra de tejido canceroso. En una realización, el otro u otros biomarcadores son biomarcadores implicados en las vías de respuesta inmunitaria innata, incluyendo las vías del interferón a o interferón p. En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de designar al paciente como candidato a tratamiento con el SVV si (1) se detectan niveles normales o elevados de expresión del ANTXRl en el tejido canceroso y (2) si se detectan niveles reducidos de uno o más biomarcadores en las vías de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso.

El término “nivel aumentado” se refiere a un nivel de expresión que es superior a un nivel normal o de control habitualmente definido o utilizado en la técnica correspondiente. Por ejemplo, un nivel aumentado de inmunotinción de una preparación de una muestra de biopsia tumoral es un nivel de inmunotinción que se consideraría más alto que el nivel de inmunotinción de una preparación de control por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. Tal como se utiliza en la presente, el biomarcador descrito puede mostrar niveles de expresión aumentados de al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 80 %, al menos el 100 %, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces de aumento o más en relación con un nivel de referencia adecuado.

El término “nivel disminuido” se refiere a un nivel de expresión que es inferior a un nivel normal o de control habitualmente definido o utilizado en la técnica correspondiente. Como se utiliza en la presente, los biomarcadores descritos pueden mostrar niveles de expresión disminuidos de al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 80 %, al menos el 100 %, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces de disminución o más en relación con un nivel de referencia adecuado.

El término “nivel de expresión del biomarcador” puede medirse a nivel de transcripción, en cuyo caso se determina la presencia y/o la cantidad de un polinucleótido, o a nivel de traducción, en cuyo caso se determina la presencia y/o la cantidad de un polipéptido.

La detección de la expresión del ANTXR1 u otros biomarcadores puede llevarse a cabo a nivel de transcripción o de traducción utilizando cualquier metodología adecuada para identificar un biomarcador asociado a un agente infeccioso, incluyendo inmunohistoquímica, Western blot, ELISA, HPLC, FPLC, espectrometría de masas (MS), secuenciación de proteínas, matriz de anticuerpos, RTPCR, RTPCR cuantitativa, secuenciación de nucleótidos, micromatrices de oligonucleótidos y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la expresión del ANTXR1 y/u otros biomarcadores se detecta mediante inmunohistoquímica. Brevemente, una muestra de biopsia de un sujeto se pone en contacto con un anticuerpo que se une específicamente al ANTXR1 y/u otros biomarcadores. Después de incubar la muestra con los anticuerpos, se lava la muestra y se puede detectar el complejo anticuerpo-biomarcador formado. Esto puede lograrse incubando la muestra lavada con un reactivo de detección. Por ejemplo, este reactivo de detección puede ser un segundo anticuerpo etiquetado con una etiqueta detectable. Las etiquetas detectables ejemplares incluyen perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS™), tintes fluorescentes, radioetiquetas, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras comúnmente utilizadas en un ELISA), y etiquetas colorimétricas tales como oro coloidal o perlas de vidrio o plástico coloreadas.

En ciertas realizaciones, el ANTXR1 y/u otros biomarcadores se detectan mediante un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) que suele llevarse a cabo utilizando una placa o pocillos de ensayo revestidos de anticuerpos. El análisis ELISA comúnmente utilizado emplea un inmunoensayo en sándwich o un inmunoensayo de unión competitiva.

Un ELISA tipo sándwich puede utilizarse para capturar, detectar, caracterizar y cuantificar células tisulares a partir de pequeñas cantidades de muestras de biopsias tumorales. Un ELISA tipo sándwich emplea dos anticuerpos, que se unen a diferentes sitios en el antígeno o ligando. El anticuerpo primario, que es altamente específico para el antígeno, se adhiere a una superficie sólida. A continuación, se añade el antígeno y luego un segundo anticuerpo, denominado anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección se une al antígeno con un epítopo diferente al del anticuerpo primario. Cada uno de estos anticuerpos puede estar dirigido a un epítopo marcador diferente en la misma o en diferentes proteínas, por lo que el anticuerpo primario captura la proteína de la misma a través de la primera proteína y el anticuerpo de detección facilita la cuantificación de una proteína unida a la misma. Como resultado, la proteína de la misma está “emparedada” entre los dos anticuerpos.

La afinidad de unión al antígeno (a través de los anticuerpos) suele ser el principal determinante de la sensibilidad del inmunoensayo. A medida que aumenta la concentración de antígeno, aumenta la cantidad de agente de unión, lo que conduce a una mayor respuesta medida. La curva estándar de un ensayo de unión de tipo sándwich tiene una pendiente positiva. Para cuantificar el grado de unión se pueden utilizar diferentes indicadores. Habitualmente se une una enzima al anticuerpo secundario, que debe generarse en una especie diferente a la de los anticuerpos primarios (es decir, si el anticuerpo primario es un anticuerpo de conejo, el anticuerpo secundario sería un anticonejo de cabra, de pollo, etc., pero no de conejo). El sustrato para la enzima se añade a la reacción que forma una lectura colorimétrica como señal de detección. La señal generada es proporcional a la cantidad de antígeno objetivo presente en la muestra. El indicador vinculado al anticuerpo utilizado para medir el evento de unión determina el modo de detección. Para la detección colorimétrica puede utilizarse un lector de placas espectrofotométrico. Se han desarrollado varios tipos de indicadores para aumentar la sensibilidad en un inmunoensayo. Por ejemplo, se han desarrollado sustratos quimioluminiscentes que amplifican aún más la señal y pueden leerse en un lector de placas luminiscente. También puede obtenerse una lectura fluorescente cuando la etapa enzimática del ensayo se sustituye por un anticuerpo marcado con un fluoróforo. Esta lectura se mide entonces utilizando un lector de placas fluorescente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo está unido a un soporte sólido para facilitar el lavado y el posterior aislamiento del complejo antígeno-anticuerpo, antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen vidrio o plástico en forma de una placa de microtitulación, una barra, una perla o una microperla. Entre los ejemplos de soportes sólidos englobados en la documento se incluyen los formados parcial o totalmente por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, siliconas y plásticos como poliestireno, polipropileno y alcohol polivinílico.

En algunas realizaciones, el ANTXR1 y/u otros biomarcadores se detectan utilizando un panel de micromatriz de anticuerpos que contiene anticuerpos específicos del ANTXR1 y/u otros específicos de biomarcadores inmovilizados en una superficie de sustrato. La micromatriz puede utilizarse en un ensayo “tipo sándwich” en el que el anticuerpo de la micromatriz captura el ANTXR1 y/u otros biomarcadores en la muestra de prueba y el marcador capturado se detecta mediante un anticuerpo secundario etiquetado que se une específicamente al marcador capturado. En una realización preferida, el anticuerpo secundario está biotinilado o etiquetado con enzimas. La detección se consigue mediante la incubación posterior con un conjugado de estreptavidina y fluoróforo (para la detección por fluorescencia) o un sustrato enzimático (para la detección colorimétrica).

En otra realización, la micromatriz de anticuerpos proporciona un inmunoensayo competitivo. Brevemente, una micromatriz que comprende anticuerpos antimarcadores inmovilizados se incuba con una muestra de prueba en presencia de un ANTXR1 etiquetado y/u otro estándar de biomarcador. El ANTXR1 etiquetado y/u otros biomarcadores compiten con el ANTXR1 no etiquetado y/u otros biomarcadores en la muestra de prueba para la unión al anticuerpo específico de antígeno inmovilizado. En tal escenario competitivo, una mayor concentración de ANTXR1 y/u otros biomarcadores en la muestra de prueba conduciría a una menor unión del estándar del ANTXR1 etiquetado y/u otro biomarcador al anticuerpo inmovilizado y, de esta manera, a una menor intensidad de la señal de la etiqueta.

En ciertas realizaciones, el ANTXR1 y/u otros biomarcadores se detectan utilizando una micromatriz de oligonucleótidos para detectar y cuantificar el(los) nivel(es) de expresión del ARNm. Una micromatriz de oligonucleótidos consiste en una serie desplegada de una pluralidad de puntos microscópicos de oligonucleótidos, llamados características, cada uno de los cuales contiene una pequeña cantidad (habitualmente en el intervalo de picomoles) de una secuencia específica de oligonucleótidos. La secuencia de oligonucleótidos específica puede ser una sección corta de un gen u otro elemento oligonucleótido que se utiliza como sonda para hibridar una muestra de ADNc o ARNc en condiciones de alto rigor. La hibridación sonda-destino suele detectarse y cuantificarse mediante la detección basada en la fluorescencia de los objetivos etiquetados con fluoróforos para determinar la abundancia relativa de las secuencias de ácido nucleico en el objetivo. Las sondas de oligonucleótidos suelen estar unidas a una superficie sólida mediante un enlace covalente a una matriz química (mediante epoxisilano, aminosilano, lisina, poliacrilamida u otros). La superficie sólida puede ser de vidrio o un chip de silicio o perlas microscópicas. Las matrices de oligonucleótidos se diferencian de otros tipos de micromatrices únicamente en que miden nucleótidos o utilizan oligonucleótidos como parte de su sistema de detección.

Un panel de micromatrices puede procesarse en modo manual, semiautomático o automático. El modo manual se refiere a las operaciones manuales para todas las etapas del ensayo, incluyendo la entrega de reactivos y muestras en las micromatrices, la incubación de las muestras y el lavado de las micromatrices. Los modos semiautomáticos se refieren a la operación manual para la entrega de muestras y reactivos en la micromatriz, mientras que las etapas de incubación y lavado funcionan automáticamente. En el modo automático, las tres etapas (entrega de la muestra/reactivo, incubación y lavado) pueden ser controladas por un ordenador o una unidad integrada en el tablero con un teclado. Por ejemplo, la micromatriz puede procesarse con una estación de trabajo ProteinArray (PerkinElmer Life Sciences, Boston, Mass.) o una estación de trabajo Assay 1200™ (Zyomyx, Hayward, Calif.). Pueden utilizarse escáneres de fluorescencia, colorimétricos y de quimioluminiscencia para detectar las señales de las micromatrices y capturar las imágenes de las mismas. La cuantificación de los ensayos basados en micromatrices también puede lograrse por otros medios, como la espectrometría de masas y la resonancia de plasma superficial. Las imágenes de micromatrices capturadas pueden analizarse mediante un software de análisis de imágenes independiente o con un paquete de software de adquisición y análisis de imágenes. Por ejemplo, la cuantificación de una micromatriz de antígenos puede lograrse con un escáner fluorescente basado en PMT, ScanArray 3000 (General Scanning, Watertown, Mass.) o un escáner colorimétrico basado en CCD, VisionSpot (Allied Biotech, Ijamsville, Md.). Habitualmente, el análisis de imágenes incluye la adquisición de datos y la preparación del informe del ensayo con paquetes de software independientes. Para acelerar todo el proceso de ensayo, desde la captura de una imagen hasta la generación de un informe de ensayo, todas las etapas analíticas, incluyendo la captura de imágenes, el análisis de imágenes y la generación de informes, pueden estar confinados en y/o controlados por un paquete de software. Este sistema de control unificado proporcionaría el análisis de la imagen y la generación del informe del ensayo de una manera fácil de usar.

Métodos de tratamiento

Un método para tratar el cáncer que incorpora el método para seleccionar un paciente con cáncer para el tratamiento de acuerdo con la presente invención comprende las etapas de realizar el método para seleccionar un paciente con cáncer para el tratamiento como se define en las reivindicaciones, y administrar al paciente una cantidad efectiva del SVV si se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso. El método de tratamiento puede comprender además la etapa de determinar el nivel de expresión de uno o más biomarcadores de las vías de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso y administrar al paciente una cantidad eficaz del SVV si (1) se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso y si (2) se detectan niveles reducidos de uno o más biomarcadores de las vías de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso.

Administración

Una realización de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el SVV para su uso en el tratamiento del cáncer en pacientes con niveles normales o elevados de expresión del ANTXR1 detectados en su tejido canceroso. El SVV se administra a un huésped o sujeto en una cantidad que es eficaz para inhibir, prevenir o destruir el crecimiento de las células tumorales mediante la replicación del virus en las células tumorales. Los métodos que utilizan el SVV para la terapia del cáncer incluyen la administración sistémica, regional o local del virus en dosis seguras, desarrollables y tolerables para provocar una destrucción terapéuticamente útil de las células tumorales. Incluso tras la administración sistémica, el índice terapéutico del SVV es de al menos 10, preferiblemente de al menos 100 o más preferiblemente de al menos 1000. En general, el SVV se administra en una cantidad de entre 10⁷ y 1x10¹¹ vp/kg. La dosis exacta a administrar depende de diversos factores, como la edad, el peso y el sexo del paciente, y el tamaño y la gravedad del tumor que se está tratando. Los virus pueden administrarse una o más veces, lo que puede depender del potencial de respuesta inmunitaria del huésped. Pueden realizarse administraciones únicas o múltiples de las composiciones, con niveles de dosis y patrones seleccionados por el médico tratante. Si es necesario, la respuesta inmunitaria puede disminuirse empleando una variedad de inmunosupresores, para permitir la administración repetitiva y/o mejorar la replicación reduciendo la respuesta inmunitaria a los virus. La terapia viral anticancerosa puede combinarse con otros protocolos anticancerosos. La administración puede realizarse de diversas maneras, empleando liposomas, inyección directa, catéteres, aplicación tópica, inhalación, administración intravenosa, etc. Además, una copia de ADN del ARN genómico del SVV, o porciones del mismo, también puede ser un método de administración, en el que el ADN es transcrito posteriormente por las células para producir partículas del virus del SVV o polipéptidos particulares del SVV.

El SVV suele administrarse a una dosis terapéuticamente eficaz. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de virus que produce una mejora de los síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de los virus pueden determinarse mediante procedimientos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL⁵⁰ (la dosis letal para el 50 % de la población de animales o células; en el caso de los virus, la dosis está en unidades de vp/kg) y la DE⁵⁰ (la dosis, vp/kg, terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población de animales o células) o la CE⁵⁰ (la concentración eficaz, vp/célula (véase la Tabla 1, por ejemplo) en el 50 % de la población de animales o células). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación entre la DL⁵⁰ y la ED⁵⁰ o la CE⁵⁰. Se prefieren los virus que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivos celulares y estudios en animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosis para su uso en humanos. La dosificación de los virus se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED⁵⁰ o la EC⁵⁰ con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada.

Formulación

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende el virus y un portador farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones, que pueden comprender una cantidad eficaz del SVV en un portador farmacéuticamente aceptable, son adecuadas para la administración local o sistémica a individuos en formas de dosificación unitarias, soluciones o suspensiones parenterales estériles, soluciones no parenterales estériles o soluciones o suspensiones orales, y aceite en agua o agua en emulsiones de aceite. Las formulaciones para la administración de fármacos por vía parenteral y no parenteral son conocidas en la técnica. Las composiciones también incluyen formas liofilizadas y/o reconstituidas del ^s V^v . Los portadores farmacéuticos aceptables son, por ejemplo, solución salina, sulfato de protamina (Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ), agua, amortiguadores acuosos, como amortiguadores de fosfato y amortiguadores de Tris, o polibreno (Sigma Chemical, St. Louis, MO) y solución salina amortiguada con fosfato y sacarosa. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de partículas que no sean del SVV. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste del pH y de amortiguación, y agentes de ajuste de la toxicidad, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio. Pueden incluirse excipientes que potencien la infección de las células por el SVV.

El SVV puede, estar presente en la composición en cantidades multidosis y monodosis, incluyendo entre o aproximadamente 1 x 105 y 1 x 1012 ufp, 1 x 106 a 1 x 1010 ufp, o 1 x 107 a 1 x 1010 ufp, cada una inclusive, como al menos o aproximadamente al menos 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 3 x 109, 4 x 109, 5 x 109 ufp, 1 x 1010 ufp.

El volumen de la composición puede ser cualquier volumen, y puede ser para la administración de una o varias dosis, incluyendo desde o desde aproximadamente 0,01 mL a 100 mL, 0,1 mL a 100 mL, 1 mL a 100 mL, 10 mL a 100 mL, 0,01 mL a 10 mL, 0,1 mL a 10 mL, 1 mL a 10 mL, 0,02 mL a 20 mL, 0,05 mL a 5 mL, 0,5 mL a 50 mL, o 0,5 mL a 5 mL, cada uno inclusivo. La infectividad del SVV puede manifestarse, por ejemplo, mediante un aumento del título o de la vida media del virus oncolítico cuando se expone a un fluido corporal, como la sangre o el suero. La infectividad puede aumentar en cualquier cantidad, incluyendo al menos 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces.

Terapia combinada

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención que comprende el SVV se utiliza en combinación con inmunoterapia. Las inmunoterapias adecuadas que pueden utilizarse en combinación con el SVV incluyen inhibidores del punto de control, como Nivolumab, Pembrolizumab e Ipilimumab. El SVV puede administrarse en combinación con una inmunoterapia o en secuencia con ella (por ejemplo, antes o después). Las combinaciones también pueden incluir composiciones adicionales, que incluyen agentes adicionales en una o ambas composiciones, como otro agente activo, como un compuesto anticanceroso o agente terapéutico u otro virus oncolítico diferente, y/o un agente de diagnóstico. Las terapias adjuntas también se contemplan en la presente descripción como una forma de terapia en la que la composición farmacéutica que comprende el SVV puede utilizarse en combinación con otros agentes. Tal como se utiliza en la presente, “terapia adjunta” se refiere a un tratamiento en el que se utiliza otro tratamiento con un tratamiento primario para ayudar o mejorar el tratamiento primario. Por lo tanto, es un tratamiento que se administra además del tratamiento primario, principal o inicial. El tratamiento complementario aumenta la eficacia del tratamiento primario para tratar una enfermedad. A efectos de la presente, el tratamiento con un virus oncolítico es el tratamiento primario o principal, y se emplean uno o más tratamientos diferentes para aumentar la eficacia de la terapia con el virus oncolítico, por ejemplo, aumentando la infectividad. Ejemplos de tales agentes son un compuesto terapéutico, un agente que aumenta la infectividad del virus, un virus terapéutico o de diagnóstico, un agente antiviral o quimioterapéutico, o un agente o compuesto para la modulación de la expresión génica de los genes endógenos o heterólogos codificados por el virus.

También se proporcionan combinaciones de las composiciones que contienen el virus formulado para su entrega como una composición, y una segunda composición que contiene un agente activo adicional, como un compuesto terapéutico, un agente que aumenta la infectividad del virus, un virus terapéutico o de diagnóstico, un agente antiviral o quimioterapéutico, o un agente o compuesto para la modulación de la expresión génica de los genes endógenos o heterólogos codificados por el virus. Los agentes activos adicionales incluyen agentes anticancerosos, y también agentes que modulan o alteran o mejoran las propiedades del virus. Los compuestos terapéuticos incluyen, por ejemplo, cualquiera seleccionado entre una citoquina, un factor de crecimiento, un agente fotosensibilizador, un radionucleido, una toxina, una molécula de ARNsi, un par de enzima/profármaco E, un antimetabolito, un modulador de la señalización, un antibiótico anticanceroso, un anticuerpo anticanceroso, un inhibidor de la angiogénesis, un compuesto quimioterapéutico, un compuesto antimetastático y una combinación de cualquiera de ellos.

En particular, el agente adicional para incluir en la combinación y también en cualquier composición proporcionada en la presente o como parte de cualquier combinación proporcionada en la presente, es un agente que modula o altera o mejora una propiedad del virus, tal como un agente que aumenta la infectividad del virus. Entre ellos se incluyen agentes que alteran la respuesta inmunitaria al virus para que se elimine menos tras su administración. Los agentes adicionales incluyen agentes como, por ejemplo, inhibidores del complemento, agentes que inhiben la activación del complemento o la actividad de cualquier proteína en una vía del complemento, como la inhibición de la actividad de cualquiera de las proteínas del complemento C1, C2, C3, C4, CS, C5a, C5aR, C3aR, Factor B, Factor P, Clq y MBP. Tales agentes son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos específicos para una o más de estas proteínas. Los inhibidores ejemplares incluyen, por ejemplo, el factor de veneno de cobra (CVF), heparina, TA 106, TNX-234, antiproperdina, C1-INH, una compstatina o un derivado o análogo de la misma, CR1 soluble, K76COOH, eculizumab, pexelizumab, TSA12/22, MSA12/22, ARC 1005, TNX-558, NOX-D19, PMX-53, PMX-201, PMX-205, neutrazumab, y sus variantes, análogos o derivados que inhiben una actividad del complemento.

Kit

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de un kit en un método para seleccionar pacientes con cáncer que probablemente respondan al tratamiento con el SVV. Dicho kit incluye un reactivo para la detección de los niveles de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso, y uno o más reactivos para la detección de la expresión de uno o más biomarcadores en las vías de respuesta inmunitaria innata, incluyendo las vías del interferón a o interferón p. En algunas realizaciones, el reactivo para la detección de los niveles de expresión del ANTXR1 es un anticuerpo anti-ANTXR1 o un par de cebadores oligonucleótidos específicos del ANTXR1.

A continuación se divulgan métodos, materiales y procedimientos para la práctica de una realización de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Reactivos y cepas bacterianas

Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se llevaron a cabo utilizando un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Los fragmentos de PCR se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QlAquick (Qiagen). El ADN genómico se extrajo utilizando el DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen). Las células DH10B y Stbl3 competentes se compraron a Invitrogen. Los plásmidos se aislaron y purificaron de las bacterias utilizando el QIAquick Spin Miniprep Kit (Qiagen). La secuenciación de Sanger para clones y plásmidos individuales fue realizada por Genewiz, Inc. Las alineaciones de secuencias de nucleótidos y proteínas se realizaron en Geneious Pro 4.7.6.

Líneas celulares y virus

Todos los medios y soluciones de cultivo celular fueron producidos por el centro de preparación de medios del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC). Las células HAP1 se compraron a Haplogen GmbH y se mantuvieron en el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM, por sus siglas en inglés) suplementado con 10 % de suero fetal de ternera. Las células TC-71 se obtuvieron del Children's Oncology Group (COG) Cell Culture Repository y se mantuvieron en IMDM suplementado con un 10 % de suero fetal bovino y 1 x suplemento ITS. Todas las demás líneas celulares utilizadas en este estudio se adquirieron de ATCC. Las células HEK 293T/17 se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido en glucosa (DMEM HG, por sus siglas en inglés) suplementado con 10 % de suero fetal de ternera y 1 mM de piruvato de sodio. Todas las líneas adicionales se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero fetal de ternera y 10 mM de HEPES. Todas las líneas celulares se confirmaron de forma rutinaria mediante análisis de STR y se confirmó que eran negativas para micoplasma mediante DDC Medical. El SVV y el SVV-GFP fueron cultivados, purificados y titulados como se describió previamente (Reddy, P.S., et al. Seneca Valley virus, a systemically deliverable oncolytic picornavirus, and the treatment of neuroendocrine cancers. J Natl Cancer Inst 99, 1623-1633 (2007); Poirier, J.T., et al. Characterization of a full-length infectious cDNA clone and a GFP reporter derivative of the oncolytic picornavirus SVV-001. J Gen Virol 93, 2606-2613 (2012)).

Genoteca GeCKO v2 humana

La genoteca GeCKO v2 humana se obtuvo como dos genotecas medias (genoteca A y B) en la cadena principal del plásmido lentiGuide-Puro (plásmido Addgene #52962) como una transferencia entre laboratorios. El centro de ^a R^ní del MSKCC amplificó las genotecas combinadas mediante la electroporación de células electrocompetentes Endura (Lucigen), como se ha descrito anteriormente (Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 343, 84- 87 (2014); Sanjana, N.E., Shalem, O. & Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature methods 11,783-784 (2014)). Las genotecas de ADN plasmídico se utilizaron como plantilla en una PCR anidada para amplificar primero la sección del plásmido que contiene el ARNsg (Tabla 1 (lista de oligonucleótidos para los cebadores utilizados en la clonación y secuenciación para los constructos CRISPR y los constructos de expresión del ANTXR1. Los números corresponden a la identidad del oligonucleótido en el texto principal. El nombre del cebador describe el objetivo del ARNsg del gen o el producto que los cebadores crearán finalmente. Oligonucleótidos mostrados de 5' a 3'); SEQ ID NOS. #1-2) y posteriormente añadir adaptadores de secuenciación y códigos de barras de Illumina (SEQ ID NOS. #3-18). Los productos de la PCR anidada se secuenciaron entonces para confirmar la representación del ARNsg utilizando un HiSeq2500 de Illumina (SEQ ID NO. #19).

Plásmidos de ARNsg individuales

El plásmido lentiCRISPR v2, que expresa un único ARNsg bajo el promotor hU6 y la nucleasa WT Cas9 bajo el promotor EFS, fue un regalo de Feng Zhang (plásmido Addgene #52961). Los oligos que contenían el ARNsg dirigido al gen con sitios de digestión BsmBI de 5' salientes fueron sintetizados por Sigma Aldrich (SEQ ID NOS. #22-53). Los oligos fueron recocidos e insertados en la cadena principal de lentiCRISPR v2 como se ha descrito anteriormente. Las secuencias de ARNsg y los plásmidos fueron confirmados por secuenciación de Sanger.

Construcción del plásmido de expresión inducible del ANTXR1

Para crear un plásmido lentiviral de expresión inducible del ANTXR1, se obtuvo un plásmido que expresaba un ADNc de ANTXR1 de longitud completa como transferencia entre laboratorios. El plásmido (ANTXR1-HA), que expresa de forma constitutiva el ADNc del ANTXR1 fusionado con una etiqueta C-terminal de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza, se utilizó como plantilla en la PCR con cebadores que incorporaban las secuencias de clonación attB1 y attB2 de Gateway (SEQ ID NOS.# 57-58). El producto de la PCR se purificó y posteriormente se utilizó en una reacción de PA con el vector de destino de Gateway, pDONR221 (Invitrogen), se transformó en células DH10B y se seleccionó en placas de agar LB suplementadas con 50 |jg/mL de kanamicina (Sigma Aldrich). El plásmido que contenía el fragmento de la PCR se purificó y se utilizó en una reacción LR con pInducer20, otra transferencia entre laboratorios (plásmido Addgene #44012). El plásmido recombinante se transformó en células Stbl3 y se seleccionó en placas de agar LB suplementadas con 100 jg/m L de carbenicilina (Sigma). El plásmido purificado, que contiene un ADNc del ANTXR1 inducible por doxiciclina (Dox) con la etiqueta de fusión HA, se confirmó mediante secuenciación de Sanger y se utilizó para producir lentivirus para la creación de líneas celulares estables.

Clonación del plásmido de expresión del ANTXR1-HA

El plásmido de expresión del ANTXR1-HA de longitud completa descrito anteriormente se utilizó como plantilla en la PCR con cebadores para eliminar secuencialmente regiones de la secuencia de ADNc N-terminal (SEQ ID NOS.# 59-66). Los cebadores se diseñaron como se ha descrito anteriormente (Hansson, M.D., Rzeznicka, K., Rosenback, M., Hansson, M. & Sirijovski, N. PCR-mediated deletion of plasmid DNA. Anal Biochem 375, 373-375 (2008)). Para garantizar la correcta localización de la proteína ANTXR1-HA resultante, se mantuvo en el plásmido de expresión la secuencia de ADNc que codifica la secuencia completa del péptido señal. Las reacciones de PCR se incubaron con DpnI (New England Biolabs) para eliminar el plásmido plantilla, se transformaron en células Stbl3 y se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con 100 jg/m L de carbenicilina (Sigma). Los plásmidos purificados, que contenían truncamientos del terminal N del ANTXR1, se confirmaron mediante secuenciación de Sanger.

Producción de lentivirus

Los plásmidos de empaquetamiento lentiviral pMD2.G (plásmido Addgene #12259) y psPAX2 (plásmido Addgene #12260) fueron regalos de Didier Trono. Todas las transfecciones de plásmidos lentivirales se realizaron de la siguiente manera, a menos que se indique lo contrario: Los plásmidos lentivirales se transfectaron en una proporción 3:2:1 de ADN del plásmido lentiviral:psPAX2:pMD2.G en 1 mg/mL de polietilinimina (PEI; Sigma Aldrich) en una proporción 2:1 de PEI:ADN en OptiMEM (Gibco). El medio se cambió 16 horas después de la transfección. Setenta y dos horas después de la transfección, se recogió el medio que contenía el virus y se filtró a través de un filtro de jeringa PDVF de 0,45 jm (Millipore) para eliminar los residuos celulares. Las alícuotas de lentivirus se almacenaron a -80 °C.

Para la genoteca GeCKO humana, se sembraron 20 placas de cultivo de 15 cm2 (Corning) con células HEK 293T/17 (7,0 x 106 por placa). Las genotecas GeCKO A y B se combinaron 1:1 (54 jg cada genoteca) y se transfectaron conjuntamente con psPAX2 (72 jg ) y pMD2.G (36 jg ) con 432 jL de 1 mg/mL de p Ei en 36 mL de OptiMEM. La mezcla de transfección se dividió por igual entre las placas de cultivo de 15 cm2. Dieciséis horas después de la transfección, se cambiaron los medios en cada placa de cultivo y se suplementaron con 1 U/mL de DNasa I (New England Biolabs). El sobrenadante lentiviral de los medios se recogió 72 horas después de la transfección y se filtró a través de un filtro Stericup PVDF de 0,45 jm (Millipore). A continuación, se formó un pélet del virus por ultracentrifugación a 24.000 rpm durante 2 h a 4 °C. El pélet del virus se resuspendió en DMEM fresco y se incubó durante la noche a 4°C. Las alícuotas de lentivirus se almacenaron a -80°C.

Transducciones lentivirales

Todas las transducciones lentivirales se realizaron de la siguiente manera, a menos que se indique lo contrario: Las células (1,0 x 106) que se iban a transducir se sembraron en placas en un matraz de 75 cm2 el día anterior a la transducción. El lentivirus se descongeló en frío y se añadió a OptiMEM suplementado con 32 |jg/mL de polibreno. Después de añadir la mezcla de virus y OptiMEM a las células, se añadió medio adicional para llevar la concentración final de polbreno a 8 jg/mL. Los medios se cambiaron 24 h después de la transducción para eliminar el polibreno. Los medios suplementados con 0,5 jg/m L de puromicina (Sigma Aldrich) o 6 jg/m L de blasticidina (Fisher Scientific) se cambiaron 48 h después de la transducción para seleccionar las células transducidas con lentiCRISPRv2 o lentiCas9-Blast, respectivamente. Las células transducidas se mantuvieron en medios que contenían puromicina o blasticidina. Para el lentivirus ANTXR1 inducible por Dox (pInducer20- ANTXR1), las líneas celulares SCLC H69 y H146 fueron transducidas y mantenidas en medios libres de tetraciclina (libre de tet) suplementados con 500 jg/m L de G-418 (Thermo Fisher).

Cribado de la genoteca GeCKO

El lentivirus de la genoteca GeCKO v2 humana se tituló en las células parentales HAP1 y H446 como se ha descrito anteriormente. Las células parentales fueron transducidas con el lentivirus lentiCas9-Blast, que permite la expresión constitutiva de la nucleasa de ADN, Cas9. El plásmido lentiCas9-Blast fue un regalo de Feng Zhang (plásmido Addgene #52962). Las células transducidas se seleccionaron con 6 jg/m L de blasticidina. Las células HAP1-Cas9 (2,0 x 108) se sembraron por igual en 70 placas de cultivo de 15 cm2. Las células H446-Cas9 (1,5 x 108) se sembraron en 50 placas de cultivo de 15 cm2. El lentivirus GeCKO se descongeló en frío, se mezcló en un volumen total de 375 mL de OptiMEM suplementado con 32 jg/m L de polibreno y se dividió por igual entre las placas de HAP1-Cas9 o H446-Cas9. El lentivirus se añadió a una MOI=0,4 unidades de transducción/célula (UT/célula) para ambos cribados. Se añadió medio adicional a cada placa para llevar la concentración final de polibreno a 8 jg/mL. El medio se cambió 24 h después de la transducción para eliminar el polibreno. El medio se cambió 48 h después de la transducción para seleccionar las células H446-Cas9 o HAP1-Cas9 transducidas con 0,5 jg/m L o 1,0 jg/m L de puromicina, respectivamente. Las células transducidas se dejaron crecer durante 4 días más para permitir la inactivación completa de los genes dirigidos al ARNsg. El día 7 después de la transducción en el cribado HAP1, se sembraron 2,0 x 108 células con la misma densidad celular en 40 placas de cultivo de 15 cm2 y se infectaron con el SVV a una MOI=1.000 vp/célula al día siguiente. En el día 7 después de la transducción en el cribado H446, se sembraron en placa 1,5 x 108 células a igual densidad celular en 50 placas de cultivo de 15 cm2 y se infectaron con el SVV a una MOI=1,0 vp/célula al día siguiente. Las células restantes de cada línea celular se combinaron, se formaron en un pelet por centrifugación y se almacenaron a -80 °C como la muestra correspondiente al día 7 después de la transducción. Durante una semana después de la infección con el SVV durante el cribado de HAP1, se cambiaron 15 mL de medio en las placas infectadas cada 3 días para reabastecer las células con medio fresco. Las células que sobrevivieron se combinaron, se formaron en un pelet por centrifugación y se almacenaron a -80 °C como la muestra resistente al SVV. Durante las dos semanas posteriores a la infección por el SVV durante el cribado de H446, se cambiaron 10 mL de medio en las placas infectadas cada 3 días para reabastecer las células con medio fresco. Las colonias visibles de células supervivientes se recolectaron mediante tripsinización aislada en cilindros de clonación y se sembraron en 1 pocillo de una placa de 24 pocillos (Corning). Todas las colonias demasiado pequeñas para el aislamiento se recolectaron por tripsinización y se combinaron antes de la expansión. Cada colonia aislada se expandió finalmente de un pocillo de 24 a un matraz de 75 cm2 a medida que se propagaban las células. Se formó un pelet con las células de cada colonia por centrifugación y se almacenó a -80°C.

Identificación del ARNsg

Para el cribado de HAP1, el ADN genómico extraído del día 7 posterior a la transducción y de la población resistente al SVV se utilizó como plantilla para la PCR anidada de la genoteca GeCKO v2 y se analizó para la representación de ARNsg mediante Illumina HiSeq como se ha descrito anteriormente. Los ARNsg secuenciados se importaron de los archivos FASTQ sin procesar, se normalizaron según el tamaño de la genoteca y se convirtieron en recuentos logarítmicos por millón de lecturas (logCPM). A continuación, se calculó el nivel de cambio entre las muestras de control y las resistentes. Con base en la distribución de los ARNsg no dirigidos, los inventores se centraron en los genes para los que > 2 ARNsg únicos tenían un promedio de logCPM>6 y logFC>5. La prueba de los genes se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney.

Para el cribado de H446, el ADN genómico extraído de cada colonia resistente al SVV se utilizó como plantilla de la PCR para amplificar el inserto lentiviral que contenía el ARNsg dirigido al gen (SEQ ID NO. # 54). El producto de la PCR se purificó y luego se secuenció mediante la secuenciación de Sanger. Los productos de la PCR que contenían múltiples ARNsg, tal y como determinó la secuenciación de Sanger, se ligaron al plásmido linealizado pCR2.1 utilizando el TA Cloning Kit (Invitrogen). La reacción de ligación se transformó en células DH10B (Invitrogen) y se seleccionó en placas de agar LB suplementadas con 100 jg/m L de carbenicilina (Fisher). Las colonias de cada placa de transformación se aislaron, se amplificaron y se secuenciaron mediante secuenciación de Sanger.

Cribado secundario de CRISPR

Los ARNsg individuales se clonaron en el plásmido lentiCRISPRv2 como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos de ARNsg se transfectaron individualmente en células HEK 293T/17 y se transdujeron en células H446 o HAP1 parentales como se ha descrito anteriormente. Las células H446 transducidas se seleccionaron con 0,5 jg /mL de puromicina. Las células HAP1 transducidas se seleccionaron con 1,0 jg/m L de puromicina. Se dejó que las células crecieran durante al menos 7 días posterior a la transducción para permitir la eliminación completa del gen. La viabilidad celular se evaluó con el colorante fluorescente de viabilidad celular AlamarBIue (ThermoFisher Scientific) como se describe a continuación.

Ensayos y análisis de viabilidad celular

Veinticuatro horas antes de la infección, se sembraron células (5,0 x 103) en placas negras opacas de 96 pocillos (Corning) en 100 |^jL de medio. Las placas se infectaron con diluciones seriadas del ^s V^v desde una MOI=5.000 vp/célula hasta una MOI= 5,0 x 10-5 vp/célula y se incubaron durante 24-72 h. Cada MOI se analizó en 3-6 pocillos repetidos con células no infectadas como controles. Se añadió una solución de viabilidad celular AlamarBlue a cada pocillo y se incubó a 37°C. La emisión de fluorescencia a 590 nm se obtuvo después de la excitación a 565 nm utilizando un lector de placas Synergy Neo (BioTek) usando pocillos que contenían sólo medio como controles de fondo. Se restaron los valores de fluorescencia de fondo y se promediaron los pocillos de réplica para determinar la fluorescencia promedio y la desviación estándar para cada MOI del SVV. El valor promedio de fluorescencia en cada MOI se dividió por el valor promedio de fluorescencia de los pocillos de control para calcular el porcentaje de viabilidad celular. Los valores de viabilidad celular y las desviaciones estándar se graficaron contra la MOI del SVV utilizando el software GraphPad Prism 6.

Identificación de indeles del ANTXR1 en líneas KO ANTXR1

El ADN genómico extraído de las células H446 parentales y de los clones mutantes KO ANTXR1 se utilizó como plantilla de la PCR para amplificar el objetivo del ARNsg del ANTXR1, el exón 2 del gen ANTXR1, utilizando cebadores específicos de la secuencia (SEQ ID NOS. #55-56). El producto de la PCR se ligó al plásmido linealizado pCR2.1 utilizando el TA Cloning Kit (Invitrogen). La reacción de ligación se transformó en células DH10B (Invitrogen) y se seleccionó en placas de agar LB suplementadas con 100 jg/m L de carbenicilina (FisherScientific).

Las colonias de cada placa de transformación se aislaron, se amplificaron y se secuenciaron mediante secuenciación de Sanger. Las secuencias del exón 2 de las líneas KO ANTXR1 se compararon con las secuencias del exón 2 del WT H446 y con la secuencia de referencia del gen ANTXR1 (NG_012649.1; Pubmed) para identificar los indeles en cada línea celular.

Líneas KO ANTXR1

Todas las líneas celulares fueron transducidas con lentivirus ANTXR1.3 lentiCRISPRv2 ARNsg como se ha descrito anteriormente. Las células transducidas de cada línea celular se seleccionaron con 1,0 jg/m L de puromicina. Se dejó que las células crecieran durante al menos 7 días después de la transducción para permitir la inactivación completa del gen. Como línea celular de control negativo, las células H446 parentales fueron transducidas de forma similar con lentivirus lentiCRISPRv2 que contenía un ARNsg dirigido a EGFP, una transferencia entre laboratorios (plásmido Addgene #51764), y seleccionadas con puromicina.

Línea celular H446 KO ANTXR1 mCherry

Se utilizó un plásmido de expresión lentiviral pLenti6 W118-mCherry que contenía el ADNc de la proteína fluorescente mCherry para producir lentivirus como se ha descrito anteriormente. El clon 4 de H446 KO ANTXR1 aislado del cribado de H446 de GeCKO fue transducido con el lentivirus mCherry como se ha descrito anteriormente. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, las células transducidas se aislaron por fluorescencia positiva de mCherry utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) con un BD FACSAria (Becton Dickinson) y posteriormente se cultivaron como una línea celular estable (H446 KO ANTXR1 mCherry).

Eficacia in vivo del SVV-001

Todos los experimentos y procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Se adquirieron ratones desnudos atímicos hembra, de 6 a 8 semanas de edad, de Envigo, Inc. Los ratones fueron injertados por vía subcutánea con una mezcla 1:1 de matrigel (Corning) y células H446 parentales, células H446 KO ANTXR1 mCherry, o una mezcla 1:1 de células parentales: con inactivación mCherry en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Una vez que los tumores alcanzaron volúmenes de ~100 mm3, los ratones de cada cohorte se distribuyeron aleatoriamente y se les administró el SVV-001 (1 x 1013 vp/kg) mediante inyección intraperitoneal o PBS, pH 7,4 como vehículo de control. Las dimensiones del tumor se midieron con calibradores externos cada 48 horas. Los volúmenes tumorales se estimaron mediante la fórmula V = (L x W2)/2, donde L es la longitud o el diámetro y W es la anchura. Los promedios de los tumores calculados para cada cohorte y las desviaciones estándar se representaron mediante el software GraphPad Prism 6. Al final del estudio, se practicó la eutanasia a los ratones, se extirparon los tumores y se analizaron por citometría de flujo.

Experimentos de expresión del ANTXR1

A menos que se indique lo contrario, las células se transfectaron y analizaron de la siguiente manera: Los experimentos de rescate del ANTXR1 se realizaron con el plásmido de expresión del ANTXR1-HA. Las células se colocaron en placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos 24 horas antes de la transfección. Las células se transfectaron transitoriamente con ANTXR1-HA y pLenti6 W118-mCherry, que expresa constitutivamente la proteína fluorescente mCherry, en 1 mg/mL de PEI en OptiMEM con células no transfectadas como controles. El medio se cambió 16 horas después de la transfección. A continuación, las células se recolectaron para el análisis de Western blot o se pusieron a prueba con el SVV-GFP para el análisis de citometría de flujo, como se describe a continuación. Para los lisados de Western blot, las células transfectadas se recolectaron 48 h después de la transfección y se formó un pelet por centrifugación. Los dispersados celulares se lisaron en amortiguador (Pierce) de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con el cóctel inhibidor de proteasas y fosfatasas IX Halt (Pierce) y posteriormente se clarificaron por centrifugación. Los lisados de proteínas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce) y se prepararon para el análisis de Western blot hirviéndolos durante 10 minutos a 90°C en el agente reductor de muestras NuPAGE y el amortiguador de muestras LDS (Invitrogen). Los análisis de Western blot se realizaron como se describe a continuación.

Para los experimentos de reexpresión en las líneas de SCLC KO ANTXR1, las células se transfectaron transitoriamente con los plásmidos de expresión ANTXR1-HA y pLenti6 W118-mCherry en una proporción molar de 10:1 en 1 mg/mL de PEI en OptiMEM con células transfectadas con mCherry solo como controles. Las células fueron puestas a prueba con SVV-GFP al TCID⁵⁰ para cada línea celular 48 h después de la transfección y cosechadas para el análisis 6 h después de la infección con el SVV-GFP. Para los experimentos de expresión en líneas celulares SCL^c no permisivas, las células H69 o H146 transducidas con pInducer20-ANTXR1 se sembraron en placas de 6 pocillos 16 h antes del inicio del experimento. Las células se mantuvieron en medio libre de tet solo o suplementado con 1 |jg/mL de doxiciclina durante 72 h antes de la adición del SVV-GFP. Las células se incubaron con el SVV-GFP durante 6 horas y luego se recolectaron para análisis. Para los experimentos de reexpresión en los que se probaron los truncamientos N-terminales del ANTXR1, las células fueron transitoriamente cotransfectadas con plásmidos de expresión del ANTXR1-HA de longitud completa o truncada y pLenti6 W118-mCherry en una proporción molar de 10:1 en 1 mg/mL de PEI en OptiMEM con células no transfectadas como controles. Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron desafiadas con el SVV-GFP a una MOI= 0,5 vp/célula durante 16 horas y se obtuvieron imágenes como se describe a continuación. Se recolectaron muestras paralelas de células transfectadas y se analizaron mediante Western blot.

Infecciones con el SVV-GFP

A menos que se indique lo contrario, las células se sembraron en una placa de pocillos tratada con cultivo de tejidos (Corning) 24 h antes de la infección. Las placas se infectaron con el SVV-GFP a una MOI=5,0 vp/célula y se incubaron a 37°C durante 8 o 16 h. Se añadió el reactivo NucBlue Live ReadyProbe (Invitrogen) a cada pocillo y se incubó a 37°C durante 20 min. Se obtuvieron imágenes de las células utilizando un microscopio de fluorescencia EVOS FL Auto (Invitrogen). Para los experimentos in vitro de cultivo mixto, las células parentales H446 y H446 KO ANTXR1 mCherry se sembraron como cultivo puro o se sembraron como cultivo mixto con una proporción 1:1. A continuación, las células fueron puestas a prueba con SVV-GFP (MOI= 0,1 vp/célula) durante 16 h a 37 °C y posteriormente se obtuvieron imágenes. Para los ensayos de actividad de respuesta al IFN, las células DMS79 y H1618 se trataron con medios solos, medios complementados con 4 jM del inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) MS-275 (Selleck) o Vorinostat (SAHA; LC labs), 25 unidades/mL de IFN-a (Thermo) o IFN-p (R&D Systems), o 25 U/mL de IFN-a/p y los correspondientes 5 jg/m L de IFN-a (Thermo) o el anticuerpo IFN-a (R&D Systems) durante 24 h a 37°C. Las células H446, H82 y H1618 se trataron con medios solos o medios complementados con 25 U/mL de IFN-p durante 24 h a 37°C. Después, las células fueron puestas a prueba con el SVV-^g F^p (H1618: MOI= 0,5 vp/célula; DMS79, H446, H82: MOI=0,1 vp/célula) durante 16 h a 37°C y posteriormente se analizaron por citometría de flujo. Para los experimentos de bloqueo, el SVV-GFP (MOI=5) se incubó con 5 jg/m L de quimera del ANTXR1-Fc o ANTXR2-Fc, IgG-Fc (Sino Biological), o control (R&D Systems) en hielo durante 1 h y posteriormente se añadió a las células durante 16 h a 37°C.

Experimento de unión del SVV-Cy5

El SVV se incubó con el colorante Cy5 reactivo a las aminas (GE Healthcare) en amortiguador de carbonato de sodio (pH 9,3) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). El exceso de colorante se eliminó por filtración a través de columnas de filtración de gel (GE Healthcare) en amortiguador HEPES. Las alícuotas del virus se almacenaron a -80°C. Las células H446 parentales KO ANTXR1 y KO TEX2 se incubaron con el SVV-Cy5 durante 30 minutos a 37°C en OptiMEM. La línea celular SCLC no permisiva, DMS114, se utilizó como control negativo. A continuación, las células se lavaron con amortiguador FACS tres veces antes de teñirlas con el kit de tinción de células muertas LIVE/DEAD Fixable Aqua y se fijaron como se ha descrito anteriormente. Las muestras se ejecutaron en un citómetro de flujo BD LSR II (Becton Dickinson) utilizando células sin teñir y células incubadas sólo con OptiMEM como controles. Todas las compensaciones y la activación se realizaron con el software de análisis FlowJo (TreeStar), como se describe a continuación.

Coinmunoprecipitaciones (Co-IP)

Para todos los experimentos de inmunoprecipitación se utilizaron Dynabeads de proteína G magnética (Invitrogen). A menos que se indique lo contrario, las Dynabeads y los complejos Dynabead-proteína se lavaron tres veces con PBS, pH 7,4 suplementado con 0,02 % de Tween-20 (Sigma Aldrich). Las Dynabeads se inmovilizaron para su manipulación y lavado utilizando un imán DynaMag (Life Technologies). Las proteínas se eluyeron hirviendo los complejos Dynabeadproteína durante 10 minutos a 90°C utilizando el amortiguador RIPA complementado con el agente reductor de muestras NuPAGE y el amortiguador de muestras LDS. Para los experimentos iniciales de co-IP del ANTXR1-Fc y ANTXR2-Fc, se incubaron diluciones seriadas de proteínas quimeras de Fe (0,25 jg ) en PBS, pH 7,4 con 1 jL de 30 mg/mL de Dynabeads durante 10 min a temperatura ambiente. Los complejos Dynabead-Fc se lavaron y posteriormente se incubaron con SVV (2,0 x 10¹⁰ vp) durante 2 h a 4°C. Se repitieron los lavados por triplicado y los complejos dinabead-proteína se sometieron a la elución de proteínas. Para la co-IP utilizando lavados de alta rigurosidad, se utilizó PBS, pH 7,4 suplementado con 0,02 % de Tween-20 y cantidades crecientes de NaCl de 125 mM a 2 M para lavar los complejos dinabead-proteína tras la adición de SVV.

Análisis por Western Blot

Se hizo la resolución de las proteínas Dynabead eluidas o los extractos de proteínas en un gel de poliacrilamida Bis-Tris al 4-12 % con amortiguador de funcionamiento MOPS (Life Technologies) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore). Para los experimentos de co-IP, las membranas se secaron con antisueros de conejo contra el SVV (Neotropix). Para los lisados celulares de transfección del ANTXR1, las membranas se secaron con anticuerpos primarios comerciales contra la etiqueta HA (Cell Signaling cat. No. 3724S) o gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH; Santa Cruz cat. no. sc-25778) o vinculina (Cell Signaling cat. No. 13901S) como controles de carga. La inmunotransferencia se realizó utilizando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (Cell Signaling) y detección por quimioluminiscencia (GE Life Sciences).

Análisis de citometría de flujo

Las líneas celulares parentales y KO ANTXR1 se sembraron en placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos 24 h antes de la infección con el SVV-GFP. Las células se infectaron con el SVV-GFP al TCID⁵⁰ para cada línea celular y se incubaron a 37°C durante 6-16 h con células no infectadas como controles. Posteriormente, las células se cosecharon utilizando el medio de desprendimiento celular enzimático Accutase (Gibco), se formaron en pélet por centrifugación y se lavaron con PBS estéril, pH 7,4 suplementado con 2 % de FCS y 0,5 mM de EDTA (amortiguador FACS). Las células se tiñeron con un kit de tinción de células muertas LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen) durante 30 minutos a 4°C, se lavaron con amortiguador FACS y se fijaron en solución de paraformaldehído al 4 % durante 10 minutos a 4°C. Para las muestras tumorales, los tumores se procesaron manualmente en suspensiones de células individuales y se sometieron a una incubación con amortiguador de lisis ACK (Crystalgen) para eliminar los glóbulos rojos murinos contaminantes. A continuación, las células se tiñeron con un kit de tinción de células muertas LIVE/DEAD Fixable Aqua y se lavaron varias veces con amortiguador FACS. Tras un último lavado con amortiguador FACS, las células se analizaron en un citómetro de flujo BD LSR II (Becton Dickinson) utilizando como controles células sin teñir y células incubadas sólo con el medio. Para las muestras tumorales, se procesaron y utilizaron como controles los tumores puros parentales y KO ANTXR1 mCherry sin tratar. Todas las muestras experimentales se recolectaron y realizaron por triplicado. Los datos de las muestras tumorales representan el promedio de 4-5 tumores individuales. Se realizó una activación y análisis adicional con el software de análisis FlowJo (TreeStar). Los datos analizados y las desviaciones estándar se representaron con el software GraphPad Prism 6. Se realizaron pruebas t bilaterales no apareadas cuando procedía para determinar la significación estadística. Los asteriscos representan los siguientes niveles de significación: * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 y **** p<0,0001.

Análisis de la expresión génica

Los datos de expresión génica normalizados de las líneas celulares de cáncer se descargaron de la enciclopedia de líneas celulares de cáncer (CCLE) o del programa de pruebas preclínicas pediátricas (PPTP) (Barretina, J., et al. La enciclopedia de líneas celulares de cáncer permite la modelización predictiva de la sensibilidad a los fármacos contra el cáncer. Nature 483, 603-607 (2012); Neale, G., et al. Molecular characterization of the pediatric preclinical testing panel. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 14, 4572-4583 (2008)). Se utilizaron archivos descriptores de contenido (CDF) personalizados para ambos conjuntos de datos de expresión génica. Para los datos de la micomatriz CCLE, se utilizó un CDF correspondiente a ENTREZG-v15. Para los datos de la micromatriz y PPTP, que incluye el ARNm mezclado de origen humano y de ratón, utilizamos un CDF específico para humanos H-spec (Isella, C., et al. Stromal contribution to the colorectal cancer transcriptome. Nature genetics 47, 312-319 (2015)). Para determinar el punto de corte adecuado para las líneas celulares que expresan el ANTXR1, se identificaron los modos locales en la distribución de la densidad de la expresión del ANTXR1, el más bajo de los cuales se designó como no expresado. A continuación se determinó la desviación estándar de este pico y se estableció un límite de expresión igual a 10 desviaciones estándar por encima del modo, basándose en el trabajo de Zilliox et al (Zilliox, M.J. & Irizarry, R.A. A gene expression bar code for microarray data. Nature methods 4, 911-913 (2007)). Se obtuvieron resultados similares utilizando un modelo de mezcla gaussiana. El análisis de la expresión génica se realizó utilizando el entorno de programación estadística R y el conjunto de herramientas Bioconductor. Los genes expresados diferencialmente se identificaron utilizando LIMMa para ajustar un modelo lineal a cada gen y generar estadísticas t moderadas utilizando un enfoque empírico de Bayes. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó con CAMERA, un enfoque de prueba de conjuntos de genes puramente competitivo (Wu, D. & Smyth, G.K. Camera: a competitive gene set test accounting for inter-gene correlation. Nucleic Acids Res 40, e133 (2012)). El enriquecimiento por muestras se determinó mediante GSVA (Hanzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC bioinformatics 14, 7 (2013)).

Microscopía crioelectrónica

Se mezclaron volúmenes iguales de viriones a 0,2 mg/mL y de ANTXR1 a 1 mg/mL, dando una proporción de ~10:1 receptores por sitio de unión. Las muestras se mezclaron y se mantuvieron durante 90 minutos a 37°C y se transfirieron en hielo durante otros 90 minutos. Las muestras se prepararon aplicando 3 |^jL de virus purificado sobre rejillas de carbono holey Quantifoil descargadas con luz (Quantifoil Micro Tools GmbH, Grossloebichau/Jena, Alemania). El exceso de amortiguador se secó y la rejilla se sumergió en etano líquido utilizando un dispositivo de criofijación Leica KF80 (C. Reichert Optische Werke AG, Viena, Austria). Las rejillas se cargaron en un Cryoholder Gatan 914 (Pleasanton, CA, EE.UU.). Las imágenes se recolectaron en un microscopio JEOL JEM2200FS (JEOL Ltd, Tokio, Japón) operado a 200 kV utilizando condiciones de dosis mínima con una dosis de electrones de ~30 electrones/Á2. Se utilizó un filtro de energía omega en la columna para mejorar el contraste de la imagen mediante un filtro de pérdida cero con una anchura de ranura variable de 25 eV. La recogida de datos automatizada se llevó a cabo mediante el software SerialEM. Las micrografías se grabaron con un desenfoque de entre 1 y 3 jm , en una cámara CMOS de 4x4 k (TVIPS; Gauting, Alemania) con un aumento calibrado de 50.000 correspondiente a un tamaño de píxel de 3,12 Á.

Se seleccionó un número de 17400 partículas virales individuales de las micrografías utilizando el software E2BOXER (Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology 157, 38-46 (2007)). Los parámetros de la función de transferencia de contraste se calcularon utilizando CTFFIND3 (Mindell, J.A. & Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. Journal of structural biology 142, 334-347 (2003)), y se descartaron las micrografías con estimaciones pobres de CTF. La orientación, la clasificación y el refinamiento se realizaron en Relion (Scheres, S.H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of structural biology 180, 519-530 (2012)) utilizando como referencia inicial una versión de paso muy bajo del modelo atómico del SVV (Venkataraman, S., et al. Structure of Seneca Valley Virus-001: an oncolytic picornavirus representing a new genus. Structure 16, 1555-1561 (2008)). Calculando la correlación de la cáscara de Fourier entre dos mitades del conjunto de datos, se estimó que la resolución del mapa era de 14,5 A. El mapa reconstruido se visualizó utilizando Chimera (Pettersen, E.F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry 25, 1605-1612 (2004)).

Ejemplo 2: Cribado de pérdida de función en todo el genoma identifican al ANTXR1 como esencial para la infección del SVV

La genoteca de ARNsg de GeCKO v2 humanos se dirige a más de 19.000 genes del genoma humano y tiene la capacidad de eliminar genes de forma eficiente utilizando la nucleasa de ADN Cas9 (Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 343, 84-87 (2014); Sanjana, N.E., Shalem, O. & Zhang, F., Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature methods 11,783-784 (2014); Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823- 826 (2013); Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012)). Debido a la alta eficiencia de la disrupción génica en las células haploides, realizamos un cribado GeCKO en una de las únicas líneas celulares haploides humanas conocidas, la línea celular HAP1 de leucemia mielógena crónica (LMC), que se encuentran permisivas al SVV a una MOI relativamente alta (Carette, J.E., et al. Ebola virus entry requires the cholesterol transporter Niemann-Pick Cl. Nature 477, 340-343 (2011)). Las células HAP1-Cas9 fueron transducidas por el lentivirus combinado de la biblioteca GeCKO y puestas a prueba con una infección del SVV a una MOI alta para seleccionar las células resistentes (Figura 1, panel a). Se extrajo el ADN genómico de la población celular superviviente expandida y se analizó subsecuentemente mediante secuenciación de alto rendimiento para determinar los cambios en la representación del ARNsg en comparación con los controles. La representación de los ARNsg de control no dirigidos se mantuvo desde los grupos de plásmidos hasta el final del cribado; sin embargo, se observaron cambios notables en los ARNsg dirigidos, lo que refleja la pérdida de ARNsg dirigidos a genes esenciales. Los ARNsg más significativamente enriquecidos en el acervo seleccionado del SVV se encontraron dirigidos al gen ANTXR1, que codifica el receptor 1 de la toxina del ántrax (Bradley, K.A., Mogridge, J., Mourez, M., Collier, R.J. & Young, J.A. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414, 225-229 (2001)). El ANTXR1 y el gen de expresión testicular 2, TEX2, fueron los únicos genes con múltiples ARNsg significativamente enriquecidos en la muestra resistente al SVV (Figura 1, panel b). Los ARNsg altamente enriquecidos se analizaron individualmente para comprobar la capacidad de conferir resistencia al SVV a las células HAP1 (Figura 1, panel c). Se observaron 6 ARNsg dirigidos a 3 genes diferentes que conferían resistencia al SVV tras la inactivación del gen en las células HAP1, incluyendo tres ARNsg separados dirigidos al gen ANTXR1. Ambos ARNsg enriquecidos dirigidos al gen TEX2 confirieron resistencia, así como 1 ARNsg dirigido al gen NR2C2.

Para confirmar los resultados en una línea celular de relevancia inmediata para los cánceres neuroendocrinos, se repitió el cribado del GeCKO en la línea celular H446 del SCLC, altamente permisiva al SVV. Las células H446-Cas9 transducidas con lentivirus GeCKO fueron puestas a prueba con el SVV a una MOI de 1 vp/célula. El porcentaje de células supervivientes después de la infección con el VVS fue mucho menor que en el cribado de HAP1, lo que permitió aislar colonias de células individuales, en lugar de una población combinada. Se extrajo el ADN genómico de cada colonia y se identificaron los ARNsg individuales mediante secuenciación de Sanger (Figura 1, panel d). En 23 de las 25 colonias resistentes (92 %) había ARNsg dirigidos al ANTXR1, y comprendían tres ARNsg independientes dirigidos al ANTXR1. Cada ARNsg identificado en el cribado de H446 se probó individualmente en un cribado secundario de células H446 parentales para comprobar la capacidad de conferir resistencia al SVV (Figura 1, panel e). Los tres ARNsg dirigidos a ANTXR1 identificados en el cribado fueron capaces de conferir resistencia al SVV; sin embargo, ningún otro ARNsg candidato alteró la permisividad del SVV en las células H446 parentales.

Ejemplo 3: El ANTXR1 es necesario para la permisividad en líneas celulares de cáncer neuroendocrino

Se evaluó la secuencia genómica del ANTXR1 en los clones aislados del cribado de H446 y se descubrió que los 5 clones KO ANTXR1 contenían inserciones o deleciones (indeles) en el exón 2 del gen ANTXR1. Estos indeles darían lugar a una mutación de cambio de marco y a un codón de parada prematuro, lo que se prevé que dé lugar a una proteína del ANTXR1 truncada (Figura 2, panel a). La pérdida de permisividad al SVV de los clones KO ANTXR1 se confirmó mediante un ensayo de viabilidad celular con células H446 parentales y células A549 no permisivas como controles positivos y negativos, respectivamente (Figura 2, panel b). Tras un periodo de incubación de 72 horas con el SVV, se observó una pérdida significativa de viabilidad con el aumento de la MOI del SVV en las células H446 parentales. Indicativo de células altamente resistentes al SVV, todas las líneas KO ANTXR1, así como las células A549, no mostraron cambios significativos en la viabilidad celular con MOI del SVV superiores a 5 logs de exposición efectiva para las células H446 parentales.

Para determinar si el ANTXR1 es esencial para la infección por el SVV en otras líneas celulares de cáncer neuroendocrino, se generaron líneas KO ANTXR1 en las líneas celulares ^h 446, LX22cl y H82 de SCLC, así como en HAP1 y en las líneas celulares de cáncer pediátrico Y79 y TC-71, permisivas al SVV. Cada línea KO ANTXR1 fue desafiada con un virus reportero infeccioso del SVV que expresa GFP dentro de la poliproteína viral (SVV-GFP) (Poirier, J.T., et al. Selective tropism of Seneca Valley virus for variant subtype small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst 105, 1059-1065 (2013); Poirier, J.T., et al. Characterization of a full-length infectious cDNA clone and a GFP reporter derivative of the oncolytic picornavirus SVV-001. J Gen Viral 93, 2606-2613 (2012)). Las células se analizaron por citometría de flujo utilizando la línea celular parental correspondiente como control positivo (Figura 2, panel c). Como control negativo, se creó una línea celular H446 que expresaba de forma estable un ARNsg dirigido a EGFP, para confirmar que la pérdida de permisividad se debía a los ARNsg dirigidos al ANTXR1 y no a efectos fuera del objetivo. En todos los casos el K^o ANTXR1 disminuyó profundamente la infección por SVV-GFP >70 % en las líneas celulares KO en comparación con las líneas parentales correspondientes. La inactivación del gen ANTXR1 conduce a una pérdida de permisividad del SVV en líneas celulares permisivas de múltiples tipos de tumores.

Se examinó además si las células secundarias que carecen de la expresión de ANTXR1 podían ser infectadas por células vecinas a través de la propagación célula-célula en una población celular mixta que contenía tanto células parentales como células KO ANTXR1. En primer lugar, se creó un clon H446 KO ANTXR1 que expresaba de forma estable la proteína fluorescente mCherry (KO ANTXR1 mCherry). A continuación, se cocultivaron células parentales H446 y KO ANTXR1 mCherry en una proporción de número de células de 1:1 y se desafiaron las células con SVV-GFP utilizando cultivos puros parentales y Ko ANTXR1 mCherry como controles (Figura 2, panel d). Como se esperaba, sólo se observaron células individuales positivas a la GFP (GFP+) o positivas a la mCherry (mCherry+), pero no identificamos células GFP+/mCherry+ en el cultivo celular mezclado. Además, el experimento anterior se repitió in vivo con WT SVV-001 injertando ratones desnudos inmunodeficientes con células parentales H446, células KO ANTXR1 mCherry, o una mezcla 1:1 de células parentales y KO ANTXR1 mCherry (Figura 2, panel e). Los tumores parentales H446 mostraron una regresión completa tras la administración de SVV-001, mientras que la cohorte tumoral 1:1 parental:KO ANTXR1 mCherry sólo mostró un retraso inicial en la progresión del tumor. Además, los tumores resultantes que finalmente progresaron en la cohorte 1:1 parental:KO ANTXR1 mCherry SVV-001 estaban significativamente enriquecidos en células mCherry+, indicando una pérdida de células H446 parentales (Figura 2, panel f). Como se esperaba, los tumores KO ANTXR1 mCherry no se vieron afectados por la administración del SVV-001 en comparación con el control.

Ejemplo 4: Los defectos en la señalización inmunitaria innata son necesarios para la replicación del SVV

Se determinó si el nivel de expresión del ANTXR1 en las líneas celulares es predictivo de la permisividad utilizando los datos de expresión génica disponibles públicamente de las 1.037 líneas celulares de la enciclopedia de líneas celulares de cáncer (CCLE) (Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature 483, 603-607 (2012)). En primer lugar, se determinó un límite de expresión basado en la distribución de la expresión en el CCLE (Zilliox, M.J.

& Irizarry, RA. A gene expression bar code for microarray data. Nature methods 4, 911-913 (2007)). Aproximadamente el 37 % de las líneas celulares quedaron por debajo del límite de expresión (Figura 3, panel a). De las líneas celulares del CCLE, 81 han sido evaluadas previamente en cuanto a su permisividad. De estas líneas, sesgadas hacia la inclusión de líneas de cáncer neuroendocrino, 20 resultaron ser permisivas. La expresión del ANTXR1 se asoció significativamente con la permisividad (p=0,0023, prueba exacta de Fisher). Lo más llamativo es que ninguna de las 20 líneas celulares permisivas carecía de expresión del ANTXR1, lo que apoya la hipótesis de que el ANTXR1 es un factor huésped necesario para la infección por el SVV.

Aunque la expresión de ANTXR1 parece ser un requisito para la permisividad del SVV, el conjunto de datos de CCLE sugiere que no es suficiente: 42/62 (67,7 %) de las líneas celulares con expresión del ANTXR1 analizadas para la permisividad resultaron ser no permisivas. Se identificaron diferencias significativas de expresión génica entre las clases permisivas y no permisivas que expresan el ANTXR1. Se utilizó el enriquecimiento competitivo de conjuntos de genes para identificar conjuntos de genes significativamente expresados de forma diferencial a partir de la base de datos Reactome (Milacic, M., et al. Annotating cancer variants and anti-cancer therapeutics in reactome. Cancers 4, 1180-1211 (2012); Croft, D., et al. The Reactome pathway knowledgebase. Nucleic Acids Res 42, D472-477 (2014)). Se identificaron 7 conjuntos de genes, todos ellos significativamente regulados a la baja en las líneas celulares permisivas que expresan el ANTXR1. El conjunto de genes más significativo fue INTERFERON_ALPHA_BETA_SIGNALING, en el que 34/44 (77 %) de los genes estaban significativamente disminuidos en las líneas celulares permisivas. El enriquecimiento de este conjunto de genes (q=0,0046) puede visualizarse en la Figura 3, panel b. Se realizó un análisis de la expresión génica por muestras para ver si el enriquecimiento de conjuntos de genes que se observaron estaba motivado por líneas celulares derivadas de una histología tumoral concreta. La falta de expresión de estos conjuntos de genes se encontró enriquecida entre las líneas celulares de SCLC y neuroblastoma (Figura 3, panel c). Para determinar si esta firma de expresión era operante in vivo, se realizó un análisis similar de los datos de xenoinjertos de tumores humanos del programa de pruebas preclínicas pediátricas (PPTP, por sus siglas en inglés) y se encontró que la permisividad al SVV era concordante con la disminución de la señalización del interferón al inicio del estudio (Morton, C.L., et al. Pruebas iniciales del virus del Valle de Séneca competente para la replicación (NTX-010) por el programa de pruebas preclínicas pediátricas. Pediatric Blood Cancer 55, 295-303 (2010); Neale, G., et al. Molecular characterization of the pediatric preclinical testing panel. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 14, 4572-4583 (2008)). En conjunto, estos resultados sugieren que la permisividad robusta al SVV requiere tanto la expresión del receptor celular ANTXR1 como la disminución de la expresión de los genes de señalización IFN antiviral al inicio del estudio.

Se evaluó la actividad de la vía IFN en las líneas celulares que expresan el ANTXR1. Se planteó la hipótesis de que las células altamente permisivas con el VVS tienen vías de respuesta al IFN significativamente disminuidas y, por lo tanto, pueden no responder a la activación exógena de la vía del IFN. Se comprobó la capacidad del IPNp exógeno para disminuir la permisividad del VVS en las líneas celulares de CPC altamente permisivas H446 y H82, así como en las células H1618 refractarias al VVS (Figura 3, panel d). La permisividad relativa de cada línea celular se correlacionó fuertemente con el grado en que el IPNp exógeno podía limitar la infección por el SVV. Estudios anteriores han demostrado que la permisividad a otros virus oncolíticos podría aumentar debido a la represión indirecta de la vía del IFN mediante el tratamiento previo de las células con inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC), como SAHA (vorinostat) o MS-275 (Nguyen, T.L., et al. Chemical targeting of the innate antiviral response by histone deacetylase inhibitors renders refractory cancers sensitive to viral oncolysis. Proc Natl Acad Sci US A 105, 14981-14986 (2008)). Las líneas celulares del SCLC no permisivas que expresan ANTXR1, H1618 y DMS79, fueron pretratadas con SAHA o MS-275 antes de ponerlas a prueba con el SVV-GFP y el posterior análisis por citometría de flujo (Figura 3, panel e-f). En comparación con las células no tratadas, se observó un aumento significativo de las células GFP+ tras el tratamiento con HDAC en ambas líneas celulares. Por el contrario, tras la activación de las vías del IFN mediante el tratamiento previo con IFNa o IFNp exógeno y la posterior puesta a prueba del SVV-GFP, se produjo una disminución de las células permisivas al SVV, o GFP+, en ambas líneas celulares. Además, la disminución de las células permisivas al SVV pudo restaurarse parcialmente mediante el tratamiento previo de las células con IFNa/p y un anticuerpo monoclonal IFNa/p correspondiente que podía bloquear la actividad del IFN. Estos resultados confirman que la permisividad del SVV puede ser dictada en las células que expresan el ANTXR1 por la expresión de las vías de respuesta al IFN. Además, la actividad de estas vías dentro de la célula en el momento de la infección puede alterar la permisividad del SVV, pero sólo en las células en las que las vías no están significativamente disminuidas.

Ejemplo 5: La reexpresión de ANTXR1 rescata la permisividad del VVS

Para confirmar la especificidad de los ARNsg del ANTXR1, se evaluó si la reexpresión exógena de ANTXR1 podía rescatar la permisividad del SVV en las células KO ANTXR1. Se cotransfectaron tres líneas H446 KO ANTXR1 con un plásmido de expresión del ANTXR1-HA y un plásmido de expresión de la proteína fluorescente mCherry y se desafiaron las células con SVV-GFP 16 h después de la transfección (Figura 4, panel a). En comparación con las células KO ANTXR1 no transfectadas que no mostraron ninguna célula GFP+, las células KO ANTXR1 transfectadas con el plásmido de expresión ANTXR1-HA mostraron sistemáticamente células GFP+, lo que indica una infección productiva con SVV-GFP y el rescate de la permisividad del SVV. Para comprobar aún más la importancia de la expresión de ANTXR1 en las células permisivas, se cotransfectaron las líneas H446 y LX22cl KO ANTXR1 con los plásmidos de expresión ANTXR1-HA y mCherry, y posteriormente incubamos las células con el SVV-GFP. Las células se analizaron por citometría de flujo y se seleccionaron las células transfectadas (mCherry+). En comparación con las células parentales mCherry+/GFP+, se observó una disminución significativa de la población mCherry+/GFP+ en las células KO ANTXR1 H446 y LX22cl, que fue rescatada tras la transfección con el plásmido de expresión ANTXR1-HA (Figura 4, panel b). La expresión de la proteína de fusión ANTXR1-HA se confirmó en cada línea celular transfectada con ANTXR1-HA mediante inmunoblot utilizando un anticuerpo específico de la etiqueta HA. La reexpresión de la proteína del ANTXR1 en las líneas celulares KO ANTXR1 es suficiente para rescatar la permisividad del s Vv .

Ejemplo 6: La expresión ectópica de ANTXR1 es suficiente para inducir la permisividad del SVV

Se determinó si la expresión de la proteína del ANTXR1 era suficiente para aumentar la permisividad de las líneas celulares H69 y H146 del SCLC no permisivas, que no expresan el gen. Tras la transducción con un lentivirus de expresión de ANTXR1-HA inducible por doxiciclina, se incubaron las células H69 y H146 parentales y las que expresaban ANTXR1, en presencia o ausencia de 1 |jg/mL de doxiciclina durante 72 h, puestas a prueba con el SVV-GFP, y analizadas por citometría de flujo (Figura 4, panel c). Las células H69 y H146 parentales y las células transducidas por ANTXR1, en ausencia de doxiciclina, mostraron poblaciones GFP+ por debajo del 1,5 %, como se esperaba. Tras el tratamiento con doxiciclina, tanto las células H69 como las H146 transducidas por ANTXR1 mostraron un aumento significativo de las células infectadas por SVV-GFP hasta el 7,46 ± 0,17 % y el 18,3 ± 0,20 %, respectivamente. La expresión de la proteína ANTXR1-HA en las células inducidas por doxiciclina se confirmó mediante Western blot. Estos datos confirman que la expresión de la proteína ANTXR1 es suficiente para inducir la permisividad en las líneas celulares del SCLC resistentes al SVV.

Ejemplo 7: El ANTXR1 interactúa directamente con el SVV

Dado que el ANTXR1 es una proteína transmembrana y es necesaria para la infección por el SVV en varias líneas celulares del SCLC permisivas, se determinó si el ANTXR1 interactúa directamente con el SVV. Se utilizó una quimera ANTXR1-Fc o una proteína IgG1 Fe de control para los estudios de coinmunoprecipitación. Después de incubar los complejos Fc-perlas con el SVV, se eluyeron todas las proteínas unidas y se analizaron por Western blot utilizando antisueros de conejo del SVV (Figura 5, panel a). En todas las muestras de ANTXR1- Fc diluidas en serie e incubadas con el SVV, se observaron bandas de proteínas virales, así como una disminución de la intensidad de las bandas correspondiente a una disminución de la proteína ANTXR1-Fc unida. No se detectó ninguna banda de la proteína SVV en las muestras incubadas con el control de isotipo IgG1 Fc o en las muestras no incubadas con el s Vv . Después de confirmar una interacción directa, se repitieron los estudios de coinmunoprecipitación de la quimera ANTXR1-Fc en presencia de cantidades crecientes de cloruro de sodio (NaCl) para investigar la fuerza de la interacción in vitro bajo alta fuerza iónica (Figura 5, panel b). La intensidad de las bandas de proteínas virales no cambió significativamente con el aumento de la concentración de sal hasta 2M de NaCl. Como el ANTXR1 tiene una gran similitud de secuencia con el receptor de alta afinidad del ántrax, ANTXR2, se realizó la coinmunoprecipitación con la proteína quimérica ANTXR2-Fc utilizando la proteína ANTXR1-Fc como control positivo (Bradley, K.A., Mogridge, J., Mourez, M., Collier, R.J. & Young, J.A. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414, 225- 229 (2001)). No se observó ninguna banda correspondiente a proteínas virales en las muestras del ANTXR2-Fc incubadas con el SVV, lo que indica la ausencia de una interacción entre el dominio extracelular del ANTXR2 y el SVV (Figura 5, panel c). Sólo se observaron bandas correspondientes a la proteína viral en las muestras del ANTXR1-Fc. Estos resultados indican que el ANTXR1, y no el ANTXR2, puede interactuar directamente con el SVV en una interacción estable y de alta afinidad.

Además, se investigó qué región del dominio extracelular del ANTXR1 era esencial para la interacción con el SVV y, por tanto, era esencial para rescatar la permisividad del SVV en las células KO ANTXR1. Se creó una serie de plásmidos de expresión del ANTXR1-HA de eliminación N-terminal que eliminaban regiones crecientes de la secuencia del dominio extracelular de la proteína ANTXR1, conservando la secuencia del péptido señal. A continuación se comprobó la capacidad de los plásmidos de expresión truncados para rescatar la permisividad del SVV en uno de los clones H446 KO ANTXR1. A diferencia de la proteína ANTXR1 de longitud completa, todos los truncamientos del ANTXR1 fueron incapaces de rescatar la permisividad del SVV cuando se les desafió con el SVV-GFP. La expresión de la proteína el ANTXR1-HA completa y truncada se confirmó mediante Western blot. Estos resultados sugieren que hay residuos necesarios para la interacción del SVV y ANTXR1 localizados en la región más N-terminal de la proteína ANTXR1.

Ejemplo 8: La quimera ANTXRI-Fc soluble bloquea la infección por el SVV in vitro

Se determinó si la interacción entre el SVV y la quimera ANTXR1-Fc o ANTXR2-Fc podía atenuar una infección celular del SVV. Se incubó el SVV-GFP con la proteína ANTXR1-Fc, ANTXR2-Fc o IgG1-Fc antes de una incubación de una noche con células H446 parentales y el posterior análisis mediante microscopía de fluorescencia (Figura 5, panel d). Las células incubadas con s Vv -GFP y la proteína IgG1-Fc o ANTXR2-Fc mostraron altos niveles de células GFP+ indicativos de una infección productiva por el s Vv . Las células incubadas con el SVV-GFP y la proteína ANTXR1-Fc no mostraron células GFP+ detectables, lo que indica una falta sustancial de infección por el SVV-GFP en estas células. Estos resultados demuestran que sólo la proteína ANTXR1 exógena, y no la proteína ANTXR2, es capaz de bloquear una infección celular por el ^s V^v -GFP, y apoyan aún más al ANTXR1 como receptor celular primario para el SVV.

Ejemplo 9: La pérdida de la expresión de la proteína ANTXR1 anula la unión del SVV a las células permisivas

Se determinó si las células KO ANTXR1 habían perdido la capacidad de unirse al SVV. También se evaluó el papel potencial del TEX2, otro candidato del cribado HAP1, en la unión del SVV. Las células H446 parentales, KO ANTXR1 y KO TEX2 se incubaron con el SVV WT marcado con el fluoróforo Cy5 (SVV-Cy5) y las células se analizaron por citometría de flujo utilizando la línea celular de SCLC no permisiva, DMS114, como control negativo para la unión del SVV (Figura 5, panel e). Las células H446 parentales incubadas con el SVV-Cy5 mostraron un alto nivel de fluorescencia (fluorescencia media (MF)=2.373) en comparación con las células DMS114 incubadas con SVV-Cy5 (MF=425). Las células H446 KO TEX2 mostraron un perfil de fluorescencia similar al de las células H446 parentales (MF=2.233), lo que indica que no hubo pérdida de la capacidad de unión al SVV correspondiente a la pérdida de expresión de la proteína TEX2. Por el contrario, las células H446 KO ANTXR1 mostraron un perfil de fluorescencia notablemente disminuido, similar al de la línea de control negativo, DMS114 (MF=358). La pérdida de unión al SVV sólo se observó en las células KO ANTXR1, lo que indica que no sólo ANTXR1 se une directamente al SVV según los datos de co-IP, sino que es el principal determinante de unión al virus en las células intactas.

Ejemplo 10: Crio-EM del complejo cápside-receptor

Se analizó el complejo del SVV unido a la proteína quimérica ANTXR1-Fc mediante criomicrografía electrónica. Los picornavirus tienen una cápside icosaédrica formada por 60 copias de un protómero que consiste en tres proteínas principales de la cápside, VP1, VP2 y VP3, y una cuarta proteína mucho más pequeña, VP4, situada en el interior de la cápside. Las copias de la VP1 se montan alrededor del eje quíntuple, mientras que las VP2 y VP3 se alternan alrededor del eje triple (Tuthill, T.J., Groppelli, E., Hogle, J.M. & Rowlands, D.J. Picornaviruses. Current topics in microbiology and immunology 343, 43-89 (2010)). La reconstrucción coincide con el modelo atómico existente del virus (Venkataraman, S., et al. Structure of Seneca Valley Virus- 001: an oncolytic picornavirus representing a new genus. Structure 16, 1555-1561 (2008)) when filtered to 14.5 A resolution (Figure 5, panel f). Además, el mapa muestra los subdominios del receptor distribuidos radialmente alrededor del quíntuple eje, en una geometría similar a la de otros picornavirus, como el poliovirus (Strauss, M., et al. Nectin-like inter- actions between poliovirus and its receptor trigger conformational changes associated with cell entry. Journal of virology 89, 4143-4157 (2015)), rhinovirus (Kolatkar, P.R., et al. Structural studies of two rhinovirus serotypes complexed with fragments of their cellular receptor. The EMBO journal 18, 6249-6259 (1999)) o los coxackievirus (Organtini, L.J., Makhov, A.M., Conway, J.F., Hafenstein, S. & Carson, S.D. Kinetic and structural analysis of coxsackievirus B3 receptor interactions and formation of the A-particle. Journal of virology 88, 5755-5765 (2014)). El mapa reveló que el receptor se une de forma casi perpendicular a la cápside, cerca del centro del protómero, haciendo contacto con las tres principales proteínas de la cápside y centrado alrededor del bucle “puff” de VP2.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para seleccionar a un paciente con cáncer para el tratamiento con el virus del Valle del Séneca (SVV), que comprende:

determinar el nivel de expresión del ANTXR1 en un tejido canceroso de un paciente y designar al paciente como candidato para el tratamiento con el SVV si se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el paciente con cáncer es un paciente con cáncer de pulmón de células pequeñas, neuroblastoma, retinoblastoma, meduloblastoma, rabdomiosarcoma o tumor sólido neuroendocrino pediátrico.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el paciente con cáncer es un paciente con cáncer de pulmón de células pequeñas.

4. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el nivel de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso se determina a nivel transcripcional.

5. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el nivel de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso se determina a nivel traduccional.

6. El método de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 5, que comprende además la etapa de determinar el nivel de expresión de uno o más biomarcadores en las vías de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso, y designar al paciente con cáncer para el tratamiento con el SVV si (1) se detectan niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 en el tejido canceroso y si (2) se detectan niveles de expresión disminuidos de uno o más biomarcadores en las vías de respuesta inmunitaria innata en el tejido canceroso.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la vía de respuesta inmunitaria innata es la vía del interferón a o del interferón P.

8. Una composición farmacéutica que comprende el SVV para su uso en el tratamiento del cáncer en pacientes con niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 detectados en su tejido canceroso.

9. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8, en donde el cáncer está en pacientes con niveles normales o niveles elevados de expresión del ANTXR1 detectados en su tejido canceroso y niveles disminuidos de uno o más biomarcadores de la respuesta inmunitaria innata.

10. La composición farmacéutica para su uso de las reivindicaciones 8 o 9, que comprende además otro agente terapéutico.

11. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 10, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de puntos de control, citocinas, factores de crecimiento, agentes fotosensibilizantes, radionucleidos, toxinas, moléculas del ARNsi, moduladores de señalización, antibióticos anticancerosos, anticuerpos anticancerosos, inhibidores de la angiogénesis, compuestos quimioterapéuticos, compuestos antimetastáticos y una combinación de cualquiera de ellos.

12. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 11, en donde el agente terapéutico es un inhibidor del punto de control.

13. La composición farmacéutica para su uso de las reivindicaciones 8, 9, 10 u 11, en donde la composición está adaptada para su administración por inyección directa en el tejido canceroso.

14. El uso de un kit en un método de selección de un paciente con cáncer para el tratamiento con el SVV como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el kit comprende:

un reactivo para la detección de los niveles de expresión del ANTXR1; y

un reactivo para la detección de los niveles de expresión de uno o más biomarcadores de la vía de transducción de señales del interferón gamma.

15. El uso de la reivindicación 14, en donde el reactivo para la detección de los niveles de expresión del ANTXR1 es un anticuerpo anti-ANTXR1 o un par de cebadores oligonucleótidos específicos del ANTXR1.

16. El uso de un kit en un método de selección de un paciente con cáncer para el tratamiento con el SVV como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el kit comprende:

un reactivo para la detección de los niveles de expresión del ANTXR1; y

un reactivo para la detección de los niveles de expresión de uno o más biomarcadores de la vía de transducción de señales del interferón alfa o de la vía de transducción de señales del interferón beta.

17. El uso de la reivindicación 14, en donde el reactivo para la detección de los niveles de expresión del ANTXR1 es un anticuerpo anti-ANTXR1 o un par de cebadores oligonucleótidos específicos del ANTXR1.