CN109022374B - 一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法，属于病毒构建技术领域。本发明提供的塞内卡谷重组病毒为：衣壳VP2的GH环第177位氨基酸由S突变为A的塞内卡谷病毒。本发明提供的塞内卡谷重组病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

Description

一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法

技术领域

本发明涉及病毒构建技术领域，具体涉及一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法。

背景技术

塞内卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)，属于小RNA病毒中的一员，具有溶瘤特性，可以选择性地感染具有神经内分泌性的肿瘤细胞，它在临床前研究和早期临床试验中显示了癌症治疗的前景。已有文献报道通过全基因组功能损失的筛选，发现炭疽毒素受体1(ANTXR1)，也称为肿瘤内皮细胞标志物8(TEM8)蛋白，是塞内卡谷病毒入侵宿主细胞的必要受体。SVV与ANTXR1的相互作用直接且特殊，这种相互作用需要SVV结合到受体细胞上，并且为了避免干扰素基因的抗病毒活性，受体细胞上需要高表达ANTXR1，SVV的核衣壳直接识别ANTXR1受体。目前SVV的感染特征、宿主范围和流行病学的许多方面尚不清楚，而且还没有商品化的疫苗进行防控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法。本发明提供的塞内卡谷重组病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

本发明提供了一种塞内卡谷重组病毒，所述塞内卡谷重组病毒为：衣壳VP2的GH环第177位氨基酸由S突变为A的塞内卡谷病毒。

本发明还提供了一种塞内卡谷病毒重组质粒，所述塞内卡谷病毒重组质粒为负载上述技术方案所述塞内卡谷重组病毒全长核苷酸序列的质粒。

优选的是，用于负载上述技术方案所述塞内卡谷重组病毒全长核苷酸序列的质粒包括pBluescriptII SK。

优选的是，所述重组质粒的全序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

1)扩增SVV HB-CH-2016全长基因组序列；

2)将所述基因组序列克隆至质粒上，在所述基因组序列的5’端融合如SEQ IDNO.2所示的CMV启动子序列，在所述基因组序列的3’端融合如SEQ ID NO.3所示的丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列，得到含塞内卡谷病毒全长基因的质粒；

3)将所述含塞内卡谷病毒全长基因的质粒经DpnI消化、重组环化后，进行转化以完成定点突变，得到塞内卡谷病毒重组质粒。

优选的是，步骤1)所述SVV HB-CH-2016全长基因组序列分四段进行扩增。

优选的是，步骤3)所述定点突变采用快速定点突变试剂盒进行。

本发明还提供了上述技术方案所述塞内卡谷重组病毒的构建方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述重组质粒转染细胞，离心收集上清液，得到塞内卡谷重组病毒。

优选的是，所述细胞包括293T细胞。

优选的是，转染时所述重组质粒的质量与细胞的个数比为1.0μg：(0.8～1.5)×10⁶个。

本发明提供了一种塞内卡谷病毒重组质粒。本发明将塞内卡谷病毒衣壳的VP2的GH环第177位氨基酸由S突变为A，得到塞内卡谷重组病毒，所述塞内卡谷重组病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的pSKII-CMV-SVV/HB质粒构建路线图；

图2为本发明实施例1提供的野生病毒SVV和原始克隆病毒的鉴定图；

图3为本发明实施例1提供的质粒电泳鉴定结果图；

图4为本发明实施例1提供的病毒噬斑检测结果图；

图5为本发明实施例1提供的Western blot检测结果图；

图6为本发明实施例1提供的病毒滴度。

具体实施方式

本发明提供了一种塞内卡谷重组病毒，所述塞内卡谷重组病毒为：衣壳VP2的GH环第177位氨基酸由S突变为A的塞内卡谷病毒。本发明特定位点进行突变后得到的塞内卡古重组病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力(图6)，为未来疫苗的抗原表位的预测提供理论依据。

本发明还提供了一种塞内卡谷病毒重组质粒，所述塞内卡谷病毒重组质粒为负载上述技术方案所述塞内卡谷重组病毒全长核苷酸序列的质粒。本发明所述塞内卡谷病毒重组质粒中衣壳VP2的GH环的核苷酸序列对应的第177位氨基酸由S突变为A。

在本发明中，用于负载上述技术方案所述塞内卡谷重组病毒全长核苷酸序列的质粒包括pBluescript II SK。当选用pBluescript II SK质粒时，本发明优选在塞内卡谷重组病毒全长核苷酸序列的5’端融合CMV启动子序列，3’端融合丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列，本发明在所述基因组序列的5’端融合CMV启动子序列，3’端融合丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列的作用是可以被丁型肝炎病毒核酶识别，丁型肝炎病毒核酶可以把丁型肝炎病毒核酶识别序列从5'第一个碱基的上游切开。

在本发明中，所述重组质粒的全序列优选如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

1)扩增SVV HB-CH-2016全长基因组序列；

2)将所述基因组序列克隆至质粒上，在所述基因组序列的5’端融合如SEQ IDNO.2所示的CMV启动子序列，在所述基因组序列的3’端融合如SEQ ID NO.3所示的丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列，得到含塞内卡谷病毒全长基因的质粒；

3)将所述含塞内卡谷病毒全长基因的质粒经DpnI消化、重组环化后，进行转化以完成定点突变，得到塞内卡谷病毒重组质粒。

本发明扩增SVV HB-CH-2016全长基因组序列。本发明对所述SVV HB-CH-2016的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的SVV HB-CH-2016的常规来源即可。由于SVVHB-CH-2016全长基因组序列过长，本发明所述SVV HB-CH-2016全长基因组序列优选分四段进行扩增，本发明对具体四段基因的序列没有特殊限定，任意长度任意部位的四个片段或更多片段均可。在本发明具体实施例中，优选利用序列中有且只有一个酶切位点的酶(4个)，将整个基因组序列分成4断，再进行重叠PCR进行拼接在一起。

得到SVVHB-CH-2016全长基因组序列后，本发明将所述基因组序列克隆至质粒上，在所述基因组序列的5’端融合如SEQ ID NO.2所示的CMV启动子序列，在所述基因组序列的3’端融合如SEQ ID NO.3所示的丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列，得到含塞内卡谷病毒全长基因的质粒。在本发明中，所述质粒优选为pBluescript II SK质粒，对应得到的含塞内卡谷病毒全长基因的质粒命名为pSKII-CMV-SVV/HB质粒。本发明对所述克隆或融合的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的将基因片段构建入载体中的常规方法即可。当所述SVV HB-CH-2016全长基因组序列分四段进行扩增时，本发明优选将四段基因依次构建入载体中，本发明对所述构建方法没有特殊限定，采用常规构建方法即可。本发明在所述基因组序列的5’端融合CMV启动子序列，3’端融合丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列的作用是可以被丁型肝炎病毒核酶识别，丁型肝炎病毒核酶可以把丁型肝炎病毒核酶识别序列从5’第一个碱基的上游切开。在本发明中，所述CMV启动子序列优选来自pEGFP-N1。

得到pSKII-CMV-SVV/HB质粒后，本发明将所述含塞内卡谷病毒全长基因的质粒经DpnI消化、重组环化后，进行转化以完成定点突变，得到塞内卡谷病毒重组质粒。当所述质粒为pBluescript II SK质粒时，对应得到的塞内卡谷病毒重组质粒命名为pSKII-SVV-VP2-S177A。在本发明中，所述定点突变优选采用快速定点突变试剂盒进行，如快速定点突变试剂盒(Mut Express II Fast Mutagenesis KitV2，vazyme)。在本发明中，所述重组环化方法优选为

重组环化。

本发明还提供了上述技术方案所述塞内卡谷重组病毒的构建方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述重组质粒转染细胞，离心收集上清液，得到塞内卡谷重组病毒。在本发明中，所述细胞包括293T细胞。在本发明中，转染时所述重组质粒的质量与细胞的个数比优选为1.0μg：(0.8～1.5)×10⁶个；更优选为1.0μg：10⁶个。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

(1)构建路线如图1所示。根据SVV HB-CH-2016全长基因组序列，分4个大片段分段：F1、F2、F3、F4扩增其全长基因组。同时在该基因组5’端融合一段来自pEGFP-N1的CMV启动子序列，3’端融合丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列。将各片段依次克隆到低拷贝质粒pBluescript II SK，获得由CMV启动子介导转录的SVV HB-CH-2016株的感染性克隆质粒，命名为pSKII-CMV-SVV/HB；

(2)SVV感染性病毒粒子(rSVV)的拯救

图2为rSVV的拯救，其中，图2-A为SVV HB-CH-2016株和rSVV感染BHK-21细胞18小时的细胞病变图，图2-B为rSVV的PCR鉴--采用SVV特异性5'UTR(366bp)、VP3/1(542bp)和3D(298bp)基因对rSVV进行PCR扩增，图2-C为感染rSVV和SVV HB-CH-2016株的BHK-21细胞的斑块形态，图2-D为感染后12小时，感染rSVV和SVV HB-CH-2016株的BHK-21细胞的免疫荧光分析(IFA)。用自制的小鼠抗SV VP1多克隆抗体，用原代抗体染色细胞，图2-E为在感染后12小时，用rSVV和SVV HB-CH-2016株感染BHK-21细胞的Western blot分析。用自制的小鼠多克隆抗SVV VP1抗体和小鼠抗tubulin抗体作为一抗。将质粒pSKII-CMV-SVV/HB(1.0μg)转染于293T细胞，36h后可观察到典型的细胞病变效应，与SVV HB-CH-2016致细胞病变效应一致(图2-A)。离心收集转染细胞的上清液，命名为rSVV。

为了进一步鉴定拯救病毒rSVV，将rSVV和亲本毒SVV HB-CH-2016感染BHK-21细胞，同时设置未感染病毒的阴性对照组，18h后收集样品分别进行分析。利用Trizol法提取总RNA，反转录获得cDNA模板，利用SVV特异性检测引物进行PCR检测。结果显示，rSVV和亲本毒SVV HB-CH-2016感染细胞组均能扩增出针对SVV 5′UTR，VP3/1和3D特异性条带，大小分别为366bp、542bp和298bp(图2-B)。病毒噬斑检测结果表明rSVV在BHK-21细胞上产生的噬斑大小与SVV HB-CH-2016没有差异(图2-C)。以SVV VP1蛋白特异性抗体为一抗，间接免疫荧光和Western blot实验结果均显示rSVV和SVV HB-CH-201感染细胞组样品均有强的绿色荧光信号，而阴性细胞对照组没有(图2-D和2-E)。综上可知，成功建立了CMV启动子介导的SVV感染性克隆，并成功拯救出与野生型SVV具有相似生物学特性的rSVV。

(2)在此感染性克隆质粒的基础上进行相关的定点突变：利用快速定点突变试剂盒(Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2，vazyme)将目标质粒扩增产物经DpnI消化、

重组环化后直接进行转化完成定点突变，建立所含氨基酸定点突变表达质粒(pSKII-SVV-VP2-S177A),经生工生物工程(上海)股份有限公司测序表明重组质粒构建成功。质粒电泳鉴定结果图如图3所示，重组质粒构建成功。

(3)上述重组病毒的检验：转染上述突变成功的重组SVV感染性克隆质粒于HEK293T细胞，36小时后可观察到类似SVV HB-CH-2016株感染的细胞病变效应，表明该感染性克隆具有感染能力。病毒噬斑检测(结果如图4所示)和Westernblot实验结果(结果如图5所示)表明，成功地拯救出重组SVV突变感染性克隆病毒SVV-VP2-S177A(MOCK即没有病毒感染的BHK-21细胞样品)。

为了进一步鉴定拯救病毒，将重组的突变病毒和亲本毒SVV HB-CH-2016感染BHK-21细胞，同时设置未感染病毒的阴性对照组，18h后分别收集细胞样品，利用Trizol法提取细胞的总RNA，反转录获得cDNA模板，扩增病毒的8个片段(引物如表1所示)，经过测序拼接表明拯救的病毒突变成功。

表1 SVV全基因组扩增用引物

如图6所示，SVV-VP2-S177A的突变病毒的病毒滴度(1.50x 10⁹PFU/ml、1.875x10⁹PFU/ml、1.075x 10⁹PFU/ml)1明显增加了，其效价比wt SVV(7.5x 10⁸PFU/ml、8.00x10⁸PFU/ml、5.625x 10⁸PFU/ml)高出10倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种塞内卡谷病毒重组质粒、重组病毒及构建方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10994

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtacctt 660

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 720

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 780

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 840

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 900

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 960

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 1020

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 1080

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 1140

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 1200

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgttttgaaa 1260

tggggggctg ggccctcatg cccagtcctt cctttcccct tccggggggt aaaccggctg 1320

tgtttgctag aggcacagag gagcaacatc caacctgctc ttgtggggaa cggtgcggct 1380

ccaattcctg cgtcgccaaa ggtgttagcg cacccaaacg gcgcatctac caatgctatt 1440

ggtgtggtct gcgagttcta gcctactcgt ttctccccta tccactcact cacgcacaaa 1500

aagtgtgttg taactacaag acttagccct cgcacgagat gtgcgataac cgcaagattg 1560

actcaagcgc ggaaagcgct gtaaccacat gctgttagtc cctttatggc tgcgagatgg 1620

ctatccacct cggatcactg aactggagct cgaccctcct tagtaaggga accgagaggc 1680

cttcttgcaa caagctccga cacagagtcc acgtgattgc taccaccatg agtacatggt 1740

tctcccctct cgacccagga cttctttttg aatatccacg gctcgatcca gagggtgggg 1800

catgatcccc ctagcatagc gagctacagc gggaactgta gctaggcctt agcgtgcttt 1860

ggatactgcc tgatagggcg acggcctagt cgtgtcggtt ctataggtag cacatacaaa 1920

tatgcagaac tctcattttt ctttcgatac agcctctggc acctttgaag acgtaaccgg 1980

aacaaaagtc aagatcgttg aataccctag atcggtgaac aatggtgttt acgattcgtc 2040

cactcattta gagatactga acctacaggg tgaaattgaa attttaaggt ctttcaatga 2100

ataccaaatt cgcgccgcca aacaacaact tggactggac atcgtatatg aactacaggg 2160

taatgttcag acaacctcaa agaatgattt tgattcccgc ggcaataatg gtaacatgac 2220

cttcaattac tacgcaaaca cttatcagaa ttcagtagac ttctcgacct cctcgtcggc 2280

gtcaggcgcc ggacccggga actcccgggg cggattagcg ggtctcctca caaatttcag 2340

tggaatcttg aaccctcttg gctacctcaa agaccacaat accgaagaaa tggaaaactc 2400

tgctgatcga gtcataacac aaacggcggg caacactgcc ataaacacgc aatcatcact 2460

gggtgtgttg tgtgcctacg ttgaagaccc gaccaaatct gaccctccgt ccagcagcac 2520

agatcaaccc accaccactt ttactgccat cgacaggtgg tacactggac gcctcaattc 2580

ttggacaaaa gctgtaaaaa ccttctcttt tcaggccgtc ccgctccctg gagccttcct 2640

gtctagacag ggaggcctca atggaggggc cttcacggct accctacata gacatttctt 2700

aatgaagtgc gggtggcagg tgcaggtcca atgcaatttg acacaattcc accaaggtgc 2760

tcttcttgtt gccatggtcc ccgaaaccac ccttgatgtc aagcccgacg gcaaggcaaa 2820

gagcctacag gagctgaatg aagagcagtg ggtagaaatg tctgacgatt accggaccgg 2880

gaaaaacatg ccttttcagg ctcttggcac atactatcgg ccccctaact ggacttgggg 2940

ccctaatttc atcaacccct atcaagtaac agttttccca caccaaattc tgaacgcgag 3000

aacctctacc tcggtagaca taagtgtccc atacatcggg gagactccta cacaatcctc 3060

agagacacag aactcctgga ccctcctcgt tatggtgctt gtccccctgg actacaagga 3120

gggagccaca actgacccag aaattacatt ttccgtaagg cctacaagtc cttacttcaa 3180

tgggcttcgt aaccgctaca cgaccgggac ggacgaggaa caggggccca ttcccacagc 3240

acccagagaa aattcgctta tgtttctctc gaccatccct gacgacactg tccctgctta 3300

cgggaatgtg cgtacccctc ccgtcaatta ccttcctggt gaaataaccg acctcttaca 3360

actggcccgt atacccactc tcatggcgtt tgggcgggtg cctgaacctg aacctgcctc 3420

agacgcttat gtgccctacg ttgccgttcc cacccagttc gatgacaagc ctctcatctc 3480

cttcccgatc accctttcag atcctgtcta ccagaatact ctggtaggcg ccatcagttc 3540

aaatttcgcc aactaccggg ggtgtatcca aatcactctg acattttgtg gacctatgat 3600

ggcaagaggg aaattcctac tctcgtattc tcccccaaat ggaacacaac cacagaccct 3660

ttctgaagcc atgcagtgca catattctat ttgggatata ggcttaaact ctagttggac 3720

ctttgtcatc ccctacatct cgcccagtga ctaccgtgaa actcgggcca ttaccaattc 3780

ggtttattct gctgatggct ggtttagcct gcacaagctg accaaaatta ctctaccacc 3840

tgattgccca cagagcccct gtattctctt tttcgcctct gctggtgagg attacaccct 3900

ccgtctcccc gttgattgta atccttctta tgtgttccac tccaccgaca acgccgagac 3960

tggggttatt gaggcgggta acactgacac cgatttctct ggtgaattgg cggctcctgg 4020

ctctaaccac actaatgtca agttcctgtt tgaccgatct cgattactga atgtaattaa 4080

ggtactggag aaggacgccg tcttcccccg ccctttcccc acagcaactg gtacacaaca 4140

ggacgatggt tacttttgtc ttctaacacc ccgcccaaca gtcgcctccc gacccgccac 4200

tcgtttcggc ctgtacgtca gtccgtctga cagtggcgtt ctcgccaaca cttcactgga 4260

tttcaatttt tacagcttgg cctgtttcac ttactttaga tcagaccttg aagtcacggt 4320

ggtctcactg gagccagatc tggaattcgc tgtagggtgg ttcccctctg gcagtgagta 4380

ccaggcttcc agctttgtct acgaccaact gcatgtaccc taccacttta ctgggcgcac 4440

tccccgcgct ttcgccagca agggtgggaa ggtatctttc gtgctccctt ggaactctgt 4500

ctcatccgtg cttcccgtgc gctggggggg cgcttccaag ctttcttctg ccacgcgggg 4560

tctgccggct catgctgact gggggactat ttacgccttt atcccccgtc ccaacgagaa 4620

gaaaagcacc gctgtaaagc atgtggccgt gtacgttcgg tacaagaacg cgcgtgcctg 4680

gtgccccagc atgcttccct ttcgcagcta caagcagaag atgctgatgc aatcaggcga 4740

cgtcgagacc aacccaggcc ctgcttctga caacccaatc ttggaatttc ttgaagcaga 4800

aaatgatcta gtcactctgg cctctctctg gaagatggta cactctgttc aacagacctg 4860

gagaaagtat gtgaagaacg acaatttttg gcccaattta ctcagtgagt tagtggggga 4920

aggctccatc gccttggccg ccacgctgtc taaccaagct tcagtaaaag ctctcttggg 4980

cctgcatttt ctctctcgag ggctcaatta cacagacttt tactctttac tgatagagaa 5040

atgctctagt ttctttactg tagaaccgcc tcctccacca gctgaaaatc tgatgaccaa 5100

gccctccgtg aagtcgaaat tccgaaagct gtttaagatg caaggaccca tggacaaagt 5160

caaagactgg aaccaaatag ccgccggctt gaagaatttt caatttgttc gtgacctagt 5220

caaagaggtg gtcgactggc tccaggcctg gatcaacaaa gagaaagcca gccctgtcct 5280

ccagtaccag ttggagatga agaagctcgg gcccgtggct ttggctcatg atgccttcat 5340

ggccggttcc gggccccctc ttagtgacga ccagattgaa tacctccaaa acctcaaatc 5400

tcttgcccta acactgggga agactaattt ggcccaaagt ctcaccacta tgatcaatgc 5460

caagcaaagt tccgcccaac gagtcgaacc cgttgtggtg gtcctcagag gcaagccggg 5520

atgcggcaag agcttggcct ccacgttgat tgcccaggct gtgtccaagc gtctctacgg 5580

ctcacaaagt gtgtattctc ttcctccgga cccagacttc ttcgacggat acaaaggaca 5640

gtttgtaacc ttgatggatg atttgggaca aaacccggat gggcaagatt tctccacctt 5700

ttgtcagatg gtgtcgaccg cccaatttct tcccaacatg gcggaccttg cagagaaggg 5760

gcgccccttt acctccaatc ttatcattgc aactacaaac ctcccccact tcagccctgt 5820

caccattgct gatccttctg cggtctctcg tcggatcaac tacgacttga ctctagaagt 5880

atctgaggcc tacaaaaagc acacacggct gaattttgac ctggctttca ggcgcacaga 5940

cgcccccccc atttatcctt ttgctgccca tgtgcctttc gtggacgtgg ctgtgcgctt 6000

caaaaatggc caccagagct tcaatctcct agagttggtc gactctattt gtgcagacat 6060

tcgagccaag caacaaggtg cccgaaatat gcagactcta gttctacaga gccctaacga 6120

gaatgatgac acccccgtcg acgaggcgct gggtagagtt ctcactcccg ctgcggtcga 6180

cgaggcgctt gtcgacctcg ctcaagaggc cgatccggtt ggccgcttgg ctattcttgc 6240

caaactaggt cttgctctag ctgcggtcac ccccggcttg ataatcttgg cagtgggact 6300

ctataggtac ttctctggct ctgatgcaga ccaagaagaa acggaaagtg aggaacctgc 6360

taaagcgcct aggagcgaga atgcttatga cggcccgaag aaaaactcta agccccctgg 6420

agcgctctct cttatggaaa tgcaacagcc caacgtggac atgggctttg aggctgcggt 6480

cgctaagaaa gtggtcgtcc ccattacatt catggttccc aacagacctt ctggacttac 6540

acagtccgcc cttcttgtgg ccggccggac cttcctaatt aatgagcata catggtccaa 6600

cccctcctgg accagtttca caatccgtgg tgaggtgcac actcgtgatg agcctttcca 6660

aacggttcat tttactcacc atggtgttcc cacagacctg atgatggtac gtctcggacc 6720

gggcaactct ttccctaaca atctagacaa gtttggactt gaccagatgc cggcacgtaa 6780

ctcccgtgtg gttggcgttt cggctagtta cggtaatttc ttcttctctg ggaatttcct 6840

tgggtttgtt gactccatca cctctgaaca aggaacttat gcaagacttt ttaggtacag 6900

ggtgaccacc tacaagggat ggtgcggttc ggccctggtc tgtgaggccg gtggtgtccg 6960

gcgcatcatt ggcctgcatt ctgctggtgc cgctggtatc ggcgccggga cctacatctc 7020

aaaattagga ctgatcaaag cccttaaaca cctcggtgaa cctctggcta caatgcaagg 7080

actgatgact gagctagagc ctggagtcac cgtgcatgta ccccggaaat ctaaattgag 7140

aaagacgacc gcacacgcgg tgtacaaacc ggagtttgaa cctgctgtgt tgtcaaaatt 7200

tgatcccaga ctgaacaagg atgttgacct agatgaggta atttggtcta aacacactgc 7260

caacgtccct tatcaacctc ctttgttcta cacatacatg tcagagtacg ctcatcgggt 7320

tttctccttt ttgggaaaag acaatgacat tctgaccgtt aaagaagcaa tcctgggcat 7380

ccctggacta gaccctatgg atccccacac agctccgggt ctgccctacg ccattagcgg 7440

ccttcgacgt actgatctcg tcgattttgt gaacggtacg gtagacgcag cactggccat 7500

gcaaatccag aaattcttag acggtgacta ctctgatcat gtcttccaaa cttttctgaa 7560

agatgaaatc agaccctcag agaaggtccg agcgggaaaa acccgcattg tcgatgtgcc 7620

ctccctggca cactgcattg tgggcagaat gctgctcggg cgtttcgccg ccaagtttca 7680

atcccatccc ggctttcttc ttggttctgc tatcgggtcc gaccctgatg tcttctggac 7740

cgtcataggg gctcagctcg agggaagaaa gaacacgtac gacgtggact acagtgcctt 7800

tgactcttca cacggcactg gctccttcga ggctctcatc tctcactttt tcaccgttga 7860

caatggtttt agccctgcgc tgggaccgta tctcagatcc ctggctgtct cggtgcacgc 7920

ttacggcgag cgtcgcatca agattaccgg aggccttccc tctggttgtg ccgcgaccag 7980

ccttctgaac acagtgctca acaatgtgat catcaggact gctctggcat tgacttacaa 8040

ggaatttgag tatgacatgg ttgatatcat cgcctacggt gacgaccttt tggttggtac 8100

ggattatgat ctggacttca atgaagtggc gcggcgcgct gccaaactgg ggtataagat 8160

gactcctgcc aacaagggtt ccgtcttccc tccgacttcc tctctctccg atgctgtttt 8220

tctaaaacgc aaattcgtcc aaaacaatga cggcttatat aaaccagtta tggatttaaa 8280

gaatttggaa gccatgctct cctacttcaa accaggaaca ctactcgaga agctgcaatc 8340

tgtttctatg ttggctcaac attctggaaa agaagaatat gatagattga tgcacccctt 8400

cgctgactac ggtgccgtac cgagtcacga gtacctgcag gcaagatgga gggccttgtt 8460

cgattgacct agatagccca acgcgcttcg gtgccgccgg cgattctggg agaactcagt 8520

cggaacagaa aagggaaaag ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagggtcggc 8580

atggcatctc cacctcctcg cggtccgacc tgggctactt cggtaggcta agggagaaga 8640

acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 8700

ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 8760

atcatgtctg cggccgccac cgcggtggag ctccagcttt tgttcccttt agtgagggtt 8820

aattgcgcgc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct 8880

cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 8940

agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 9000

gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 9060

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 9120

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 9180

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 9240

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 9300

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 9360

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 9420

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 9480

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 9540

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 9600

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 9660

gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 9720

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 9780

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 9840

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 9900

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 9960

ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 10020

cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 10080

cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 10140

accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 10200

ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 10260

ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 10320

tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 10380

acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 10440

tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 10500

actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 10560

ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 10620

aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 10680

ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 10740

cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 10800

aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 10860

actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 10920

cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 10980

ccgaaaagtg ccac 10994

<210> 2

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 60

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 120

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 180

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 240

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 300

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 360

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 420

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 480

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 540

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgt 595

<210> 3

<211> 197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggctacttcg gtaggctaag 60

ggagaagaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 120

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 180

tgtatcttat catgtct 197

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgaaatgg ggggctgggc cctc 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgagaagt ctactgaatt ctg 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agggtaatgt tcagacaacc tc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggggacaag caccataacg agg 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacaccaaat tctgaacgcg ag 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agaaatcggt gtcagtgtta cc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctctgctggt gaggattaca cc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agtctgtgta attgagccct cg 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagacctgga gaaagtatgt g 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgggcagcaa aaggataaat gg 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgatccttc tgcggtctct cg 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcattgtagc cagaggttca c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acaagggatg gtgcggttcg g 21

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatcacattg ttgagcactg tg 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcatctctc actttttcac c 21

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tttttttccc ttttcccttt tctgttccga ctg 33

Claims (10)

1.一种塞内卡谷重组病毒，其特征在于，所述塞内卡谷重组病毒为：衣壳VP2的GH环第177位氨基酸由S突变为A的塞内卡谷病毒。

2.一种塞内卡谷病毒重组质粒，其特征在于，所述塞内卡谷病毒重组质粒为负载权利要求1所述塞内卡谷重组病毒全长核苷酸序列的质粒。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，用于负载权利要求1所述塞内卡谷重组病毒全长核苷酸序列的质粒包括pBluescript II SK。

4.根据权利要求2或3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的全序列如SEQ IDNO.1所示。

5.权利要求2～4任一项所述重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

1)扩增SVV HB-CH-2016全长基因组序列；

2)将所述基因组序列克隆至质粒上，在所述基因组序列的5’端融合如SEQ ID NO.2所示的CMV启动子序列，在所述基因组序列的3’端融合如SEQ ID NO.3所示的丁型肝炎病毒核酶识别序列HDVr-poly序列，得到含塞内卡谷病毒全长基因的质粒；

3)将所述含塞内卡谷病毒全长基因的质粒经DpnI消化、重组环化后，进行转化以完成定点突变，得到塞内卡谷病毒重组质粒。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述SVV HB-CH-2016全长基因组序列分四段进行扩增。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述定点突变采用快速定点突变试剂盒进行。

8.权利要求1所述塞内卡谷重组病毒的构建方法，包括以下步骤：

将权利要求2～4任一项所述重组质粒转染细胞，离心收集上清液，得到塞内卡谷重组病毒。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述细胞包括293T细胞。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，转染时所述重组质粒的质量与细胞的个数比为1.0μg∶(0.8～1.5)×10⁶个。

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