CN108601802A - 塞尼卡谷病毒（svv）细胞受体靶向的肿瘤治疗 - Google Patents
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Abstract
通过如下来选择用塞尼卡谷病毒(SVV)进行治疗的癌症患者的方法：确定癌症患者的癌组织中的ANTXR1的表达；并且如果在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达，则将该癌症患者指定为用SVV进行治疗的候选者。还公开了用SVV治疗癌症患者的方法。
Description
本申请要求于2015年12月2日提交的美国临时申请第62/262,242号的优先权，其通过引用并入本文。本发明是在国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的T32CA009243和P30CA008748的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本申请一般性地涉及使用溶瘤病毒治疗的癌症的治疗方法，所述溶瘤病毒治疗包括用靶向在某些肿瘤细胞上发现的特定细胞受体的病毒进行感染。
背景技术
塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)(最近发现的溶瘤小RNA病毒)选择性地感染具有神经内分泌特征的癌症，例如小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和小儿神经内分泌实体瘤。这些癌症构成发病率和死亡率的主要原因——仅SCLC在美国每年导致约30,000人死亡。相对于临床评估中的其他溶瘤病毒，SVV由于其小尺寸、异常快速的倍增时间、对神经内分泌癌细胞的高选择性以及在患者中不存在预先存在的中和抗体而得到关注。先前在多个临床前小鼠模型中的研究证实了SVV通过脉管系统回归至肿瘤的能力，导致有效的抗癌功效。在神经内分泌癌(包括SCLC)患者中测试SVV作为病毒治疗的I期临床试验即使在产生SVV的中和抗体之后也显示出SCLC患者中高水平的持续病毒复制，并证实了SVV在静脉内施用之后选择性地感染癌细胞的能力。由于缺乏对该新病毒感染的细胞决定因素的理解(最显著的包括对SVV的细胞受体的鉴定)，该药剂的临床开发相对于其他溶瘤病毒的临床开发受到阻碍。
限定SVV容许性(permissivity)的决定因素(包括病毒受体的鉴定)会通过关注最终可从SVV病毒治疗中受益的患者来有力促进临床开发。本申请利用两个互补的全基因组功能丧失筛选公开了作为SVV的受体的炭疽毒素受体1(anthrax toxin receptor 1，ANTXR1)蛋白。ANTXR1直接且特异性地与SVV相互作用。这种相互作用是SVV与容许的细胞结合所必需的，并且ANTXR1表达是SVV感染所必需的。本申请限定了SVV容许性的临床上易处理的预测性生物标志物，并鉴定ANTXR1作为神经内分泌癌中SVV的高亲和力细胞受体。
发明内容
本申请的一个方面是选择用塞尼卡谷病毒(SVV)进行治疗的癌症患者的方法，其包括：确定从所述癌症患者获得的癌组织中的ANTXR1的表达水平；以及如果在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达，则将所述癌症患者指定为用SVV进行治疗的候选者。在一个特定的实施方案中，癌症患者是患有小细胞肺癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤或小儿神经内分泌实体瘤的患者。在另一个实施方案中，癌症患者是患有小细胞肺癌的患者。在另一个实施方案中，在转录水平下确定癌组织中的ANTXR1的表达水平。在另一个实施方案中，在翻译水平下确定癌组织中的ANTXR1的表达水平。
在本申请的另一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：确定癌组织中的先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的表达水平，以及如果(1)在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达和(2)在癌组织中检测到先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的表达水平降低，则指定所述癌症患者用SVV进行治疗。在一个特定的实施方案中，先天免疫应答途径是α-干扰素或β-干扰素途径。
本申请的另一个方面是用于治疗癌症的方法，所述方法包括：确定来自患者的癌组织中的ANTXR1的表达水平，以及如果在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达，则向患者施用有效量的SVV。在一个特定的实施方案中，所述方法还包括：确定癌组织中的先天免疫应答途径的一种或更多种生物标志物的表达水平；以及如果(1)在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达和(2)癌组织中的先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的水平降低，则向患者施用有效量的SVV。在一个特定的实施方案中，SVV与另一种治疗剂组合施用。在某些实施方案中，治疗剂选自检查点抑制剂、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、siRNA分子、信号传导调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、化学治疗化合物、抗转移化合物、及其任意组合。在一个特定的实施方案中，治疗剂是检查点抑制剂。在某些实施方案中，SVV通过直接注射到癌组织中来施用。
本申请的另一方面是用于选择用SVV进行治疗的癌症患者的试剂盒，其包含：用于检测ANTXR1的表达水平的试剂；和用于检测α-干扰素或β-干扰素途径的一种或更多种生物标志物的表达水平的试剂。
附图说明
当结合附图和段落考虑以下详细说明时，本申请的上述和其他目的和优点将是明显的。以下是本文中的附图的简要说明，其说明了本申请的某些方面和实施方案，但不应被认为以任何方式限制。
图1示出了作为SVV的必需宿主决定因素的ANTXR1的鉴定。a图)全基因组CRISPR敲除(GeCKO)筛选工作流程的描述。在sgRNA文库的慢病毒转导之后，通过嘌呤霉素选择转导的细胞。然后用SVV攻击细胞以选择抗性细胞。b图)筛选将ANTXR1(蓝色)和TEX2(红色)鉴定为最重要的命中。非靶向对照sgRNA以黑色突出显示。c图)用从HAP1GeCKO筛选中鉴定的单个sgRNA转导HAP1细胞。在不存在(浅灰色)或存在(黑色)SVV的情况下测定细胞生存力。每个条对应于6次重复的平均值，其中误差条表示标准偏差。虚线表示在不存在和存在SVV的情况下亲本HAP1细胞生存力。d图)在H446GeCKO筛选中鉴定的sgRNA的表。分离25个H446集落并通过Sanger测序对慢病毒插入物进行测序。鉴定了多个靶向基因ANTXR1的sgRNA。e图)用在25个H446GeCKO筛选集落中鉴定的单个sgRNA转导H446细胞。在不存在(浅灰色)或存在(黑色)SVV的情况下测试细胞生存力。在不存在和存在SVV的情况下的亲本H446细胞生存力用虚线表示。每个条对应于6次重复的平均值，其中误差条表示标准偏差。
图2示出了ANTXR1的敲除导致SVV容许性的丧失。a图)来自GeCKO筛选的5个选定的H446ANTXR1 KO集落中的ANTXR1插失(indel)的概要表。b图)用递增的MOI的SVV攻击H446ANTXR1 KO细胞系中的3个，进行72小时。通过AlamarBlue测定细胞生存力。亲本H446细胞和非容许的NSCLC细胞系A549分别用作阳性和阴性对照。每个数据点表示6次重复的平均值，其中误差条表示标准偏差。c图)用靶向ANTXR1的sgRNA转导容许的SCLC和小儿细胞系。用SVV-GFP攻击亲本(浅灰色)和ANTXR1 KO(黑色)细胞并通过流式细胞术分析。每个条形表示3次重复的平均值，其中误差条表示标准偏差。d图)用SVV-GFP攻击亲本H446细胞(顶部)、H446 ANTXR1 KO mCherry细胞(底部)或亲本：ANTXR1 KO mCherry细胞的1∶1混合物(中间)。白色箭头表示相邻的SVV-GFP感染的亲本H446和未感染的ANTXR1 KO mCherry细胞。比例尺表示100μm。e图)用WT SVV-001或PBS载剂攻击亲本H446肿瘤(浅绿色/深绿色)、H446ANTXR1 KO mCherry肿瘤(粉红色/红色)和亲本：ANTXRl KO mCherry肿瘤的1∶1混合物(浅紫色/深紫色)。每隔一天测量肿瘤体积。每个数据点对应于4至5个肿瘤的平均值，其中误差条表示标准偏差。f图)在实验终点切除肿瘤并通过流式细胞术分析。每个条表示4至5个肿瘤的平均值，其中误差条表示标准偏差。
图3示出了ANTXR1表达与容许性显著相关。a图)容许(顶部)、非容许(中间)和CCLE中的所有细胞系(底部)的经缩放的log2ANTXR1基因表达。ANTXR1表达与容许性显著相关(p＝0.0023；Fisher精确检验)。b图)描绘了容许细胞系中I型干扰素信号传导基因的负富集的富集条形码图(q＝.0046)。c图)对于顶部富集的基因集计算逐份样品(Sample-wise)的富集评分并基于起源肿瘤的组织学绘图。SCLC和神经母细胞瘤因缺乏参与I型干扰素信号传导的基因而突出。d图)在用SVV-GFP攻击之前，将H446、H82和H1618细胞(浅蓝色)用IFNβ预处理24小时，随后通过流式细胞术分析。未经处理的细胞(深蓝色)用作对照。d至f中的每个条表示3次重复的平均值，其中误差条表示标准偏差。e图)、f图)在用SVV-GFP攻击之前，将H1618和DMS79用HDAC抑制剂SAHA(浅蓝色)或MS-275(深蓝色)、IFNα/β(红色)或IFNα/β与相应的IFNα/β单克隆抗体(粉红色)预处理24小时并随后通过流式细胞术分析。未感染(黑色)和未经处理(绿色)的细胞用作对照。
图4示出了ANTXR1的再表达重建SVV容许性。用ANTXR1-HA和mCherry表达质粒(A、D、F)共转染细胞。a图)转染3个H446ANTXR1KO细胞系，然后用SVV-GFP攻击。比例尺表示100μm。b图)转染H446和LX22cl ANTXR1 KO细胞系，用SVV-GFP攻击，并通过流式细胞术分析。mCherry转染的亲本和ANTXR1 KO细胞分别用作阳性和阴性对照。每个条表示3次重复的平均值，其中误差条表示标准偏差。c图)用Dox诱导型ANTXR1-HA表达慢病毒转导H69和H146细胞。将亲本和ANTXR1表达细胞在不存在或存在1μg/mL多西环素的情况下孵育72小时，用SVV-GFP攻击，并通过流式细胞术分析。每个条表示3次重复的平均值，其中误差条表示标准偏差。
图5示出了SVV直接与ANTXR1相互作用。a图)SVV与递减量的ANTXR1-Fc嵌合体共免疫沉淀。洗脱结合的蛋白质并使用抗SVV抗体通过Western印迹进行分析。将输入SVV作为阳性对照进行免疫印迹。b图)SVV与ANTXR1-Fc嵌合体共免疫沉淀。用递增浓度的NaCl直至2M进行洗涤。如A中所述洗脱并分析结合的蛋白质。c图)如A中所述，SVV与ANTXR1-Fc嵌合体或递减量的ANTXR2-Fc嵌合体共免疫沉淀并进行分析。d图)在与亲本H446细胞一起孵育8小时之前，将SVV-GFP与ANTXR1-Fc嵌合体、ANTXR2-Fc嵌合体或IgG-Fc同种型对照一起预孵育。将细胞核用NucBlue LiveReady探针染色。比例尺表示100μm。e图)将ANTXR1 KO(蓝色)和TEX2KO(红色)细胞与SVV-Cy5一起孵育并通过流式细胞术分析。亲本H446(黑色)和DMS114(灰色)细胞分别用作SVV结合的阳性和阴性对照。f图)与ANTXR1-Fc嵌合体(绿色)结合的SVV衣壳(蓝色)的低温-EM密度图。
具体实施方式
用于实施本发明的一些方式就其各方面(本文中以下讨论的)而言呈现。然而，本发明不限于所描述的实施方案，并且本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的基本概念的情况下，本发明的许多其他实施方案是可能的，并且任何这样的变通方案也将落入本申请的范围。可以设想，本发明的其他样式和配置可以容易地并入本发明的教导中，并且为了清楚和公开的目的，仅示出和描述一个特定的配置，而不是限制范围。
本文中使用的标题仅用于组织目的并且不意味着用于限制说明书或所附段落的范围。如整个本申请中所使用的，单词“可以”以允许的意义(即，意指具有潜力)，而不是强制意义(即，意指必须)使用。本文中的没有数量词修饰的名词不表示数量的限制，而是表示存在至少一个/种所引用的项目。
在本文中范围可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施方案。还应理解，每个范围的端点与另一个端点相关和独立于另一个端点时均是有意义的。还应理解，本文中公开了许多值，并且每个值除了该值本身之外在本文中还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开一个值时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”和值之间的可能的范围，如技术人员适当地理解的。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。
ANTXR1是SVV在肿瘤上的可靶向细胞受体
ANTXR1用作炭疽杆菌毒素的两种受体之一。SVV在使用ANTXR1或任何相关的蛋白质作为主要受体方面在已知的病毒中是独特的。与许多先前鉴定的其他小RNA病毒的受体相反，ANTXR1不是受体的免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IgSF)的成员。尽管ANTXR1在作为单次跨膜糖蛋白方面与IgSF受体共有共同的特征，但它在其作为哺乳动物病毒和细菌毒素二者的受体的作用方面可能是独特的。
如本文中公开的，与正常细胞相比，ANTXR1经常在肿瘤细胞表面上表达。开发靶向在肿瘤内皮中表达的ANTXR1的治疗性抗体的努力受到抗体与ANTXR2的交叉反应性的阻碍。SVV对ANTXR1的灵敏的选择性和本文中所述的中等分辨率低温-EM结构将使出于抗血管生成目的和选择神经内分泌癌的潜在新靶标二者的抗体空间中的未来治疗开发实现。本文中超出ANTXR1表达的基因表达数据、先天免疫应答中的癌细胞缺陷是成功的SVV复制的重要决定因素。该特征不是SVV所特有的并且可能是许多溶瘤病毒成功的共有要求。先天免疫应答途径中的缺陷在癌症中是常见的；特别是SCLC已经显示经常缺乏MHC I类抗原呈递的关键组分以及降低的免疫刺激细胞因子表达。二者均导致肿瘤细胞识别减少和被免疫系统除去。这些特征与ANTXR1表达一起可以定义一类特别适合于用SVV治疗的癌症。对细胞先天免疫应答途径如何决定容许性的增进的理解可以确定与靶向癌细胞中的这些途径的治疗剂的协同组合策略。
对于SVV，ANTXR1表达可以充当未来临床开发的预测性生物标志物，辅助最有可能受益于SVV病毒治疗的患者的鉴定。指导未来临床试验的预测性生物标志物对于SCLC患者是特别迫切的需求。这是一种高度侵袭性且几乎普遍致命的癌症，对于该癌症已经鉴定了很少的易处理的治疗靶标。在没有生物标志物选择的情况下进行的许多大规模临床试验未能推进该疾病的护理标准。将新的治疗研究集中在患者的响应子集上的仔细定义的标志物可以改变该领域。作为选择标准的ANTXR1和可能抑制的先天免疫的识别将帮助限定我们后续的临床试验的结构。
可通过SVV治疗的癌症包括但不限于小细胞肺癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤和其他小儿神经内分泌实体瘤。
定义
如本文中使用的，以下术语应具有以下含义：
如本文中使用的，术语“癌症”、“肿瘤”和“肿瘤细胞”可互换使用，并且是指表现出相对自主生长的细胞，因此它们表现出以显著丧失细胞增殖的控制为特征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性的或良性的。根据本发明，一种类型的优选的肿瘤细胞是具有嗜神经特性的肿瘤细胞。
如本文中使用的，术语“病毒”例如应当广义地理解为意指当例如病毒载体被转导或转染到合适的细胞或细胞系中以产生感染性颗粒时形成的感染性病毒颗粒，或者特别地使用SVV以感染需要治疗的对象。
如本文中使用的，术语“衍生物”、“突变体”、“变体”和“经修饰的”可互换使用以通常表明衍生物、突变体、变体或经修饰的病毒相对于模板病毒核酸或氨基酸序列可以具有核酸或氨基酸序列差异。例如，SVV衍生物、突变体、变体或经修饰的SVV可指相对于野生型SVV核酸或ATCC专利保藏号PTA-5343的氨基酸序列具有核酸或氨基酸序列差异的SVV。
如本文中使用的，“联合治疗”是指其中对象被给予两种或更多种治疗剂，例如至少两种或至少三种治疗剂以治疗单一疾病的治疗。出于本文中的目的，联合治疗可以包括这样的治疗方案：其包括施用溶瘤病毒和另一种抗癌剂，每种用于治疗相同的过度增殖疾病或病症，例如相同的肿瘤或癌症。
如本文中使用的，术语“生物标志物”和“感染原相关生物标志物”关于可以用作对SVV的敏感性指标的任何分子实体(“感染原”)可互换使用，特别地这指的是ANTXR1在肿瘤细胞中的表达增加，以及先天免疫应答途径在这样的肿瘤细胞中的相关下调，例如与γ-干扰素有关的那些。生物标志物可以是任何可检测的蛋白质、核酸，例如mRNA或微小RNA，脂质，或肿瘤活检样品中存在和/或差异表达的任何产物，其存在和/或浓度反映了对象中肿瘤对SVV的敏感性。在分子术语中，可使用基因组学、蛋白质组学技术或成像技术在对象中检测和定量生物标志物。
用于患者筛选的方法
本申请的一个方面涉及选择用于SVV治疗的癌症患者的方法。所述方法包括以下步骤：确定来自患者的癌组织中的ANTXR1的表达水平，以及如果在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达，则将患者指定为用SVV进行治疗的候选者。
分析可基于鉴定分离的癌组织样品中ANTXR1的存在、不存在和/或改变的表达谱。分析可通过将癌组织样品中的ANTXR1的表达谱与存储在数据库中的ANTXR1的正常表达谱相比较来进行。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定癌组织样品中的一种或更多种其他生物标志物的表达谱的步骤。在一个实施方案中，一种或更多种其他生物标志物是参与先天免疫应答途径的生物标志物，包括但不限于α-干扰素或β-干扰素途径。在一些实施方案中，所述方法还包括如下步骤：如果(1)在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达和(2)癌组织中先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的水平降低，则将患者指定为用SVV进行治疗的候选者。
术语“提高的水平”是指高于相关领域中通常定义或使用的正常或对照水平的表达水平。例如，来自肿瘤活检样品的制剂的提高的免疫染色水平是本领域普通技术人员认为高于对照制剂的免疫染色水平的免疫染色水平。如本文中使用的，相对于合适的参照水平，所描述的生物标志物可表现出提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍或更多的提高的表达水平。
术语“降低的水平”是指低于相关领域中通常定义或使用的正常或对照水平的表达水平。如本文中使用的，相对于合适的参照水平，所描述的生物标志物可表现出降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍或更多的降低的表达水平。
术语“生物标志物的表达水平”可在转录水平下测量，在这种情况下，确定多核苷酸的存在和/或量，或者可在翻译水平下测量，在这种情况下，确定多肽的存在和/或量。
可使用适用于鉴定感染原相关生物标志物的任何方法在转录水平或翻译水平下进行ANTXR1或其他生物标志物表达的检测，所述方法包括但不限于免疫组织化学、Western印迹、ELISA、HPLC、FPLC、质谱法(MS)、蛋白质测序、抗体阵列、RTPCR、定量RTPCR、核苷酸测序、寡核苷酸微阵列及其组合。
在一些实施方案中，通过免疫组织化学检测ANTXR1和/或其他生物标志物的表达。简言之，使来自对象的活检样品与和ANTXR1和/或其他生物标志物特异性结合的抗体接触。在用抗体孵育样品之后，洗涤样品并且可以检测形成的抗体-生物标志物复合物。这可以通过将经洗涤的样品与检测试剂一起孵育来实现。例如，该检测试剂可以是用可检测的标记物标记的二抗。示例性的可检测的标记包括磁珠(例如，DYNABEADSTM)、荧光染料、放射性标记、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)、以及比色标记例如胶体金或有色玻璃或塑料珠。
在某些实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测ANTXR1和/或其他生物标志物，其通常使用抗体包被的测定板或孔进行。常用的ELISA测定采用夹层免疫测定或竞争性结合免疫测定。
夹层ELISA可用于从少量的肿瘤活检样品中捕获、检测、表征和定量组织细胞。夹层ELISA使用两种抗体，其与抗原或配体上的不同位点结合。对抗原呈高度特异的一抗附着在固体表面上。然后添加抗原，随后添加被称为检测抗体的二抗。检测抗体与抗原在和一抗不同的表位处结合。这些抗体中的每一种可针对相同或不同蛋白质上的不同标志物表位，由此一抗通过第一蛋白质从其中捕获蛋白质，并且检测抗体促进与其结合的蛋白质的定量。结果，来自其的蛋白质被“夹在”两种抗体之间。
对抗原的结合亲和力(通过抗体)通常是免疫测定灵敏度的主要决定因素。随着抗原浓度增加，结合的结合剂的量增加，导致较高的测量响应。夹层结合测定的标准曲线具有正斜率。为了量化结合程度，可以使用不同的报道子。通常，酶与二抗连接，其必须在与一抗不同的物种中产生(即，如果一抗是兔抗体，则二抗将是来自山羊、鸡等但不是兔的抗兔)。将酶的底物添加到反应中，其形成作为检测信号的比色读出。产生的信号与存在于样品中的靶抗原的量成比例。用于测量结合事件的抗体连接的报道子决定检测方式。分光光度板读数器可用于比色检测。已经开发了几种类型的报道子以提高免疫测定中的灵敏度。例如，已经开发了化学发光底物，其进一步放大信号并且可以在发光板读数器上读取。此外，可获得荧光读出，其中用荧光团标记的抗体替换测定的酶步骤。然后使用荧光板读数器测量该读出。
在一些实施方案中，在使抗体与样品接触之前，将抗体与固体支持物连接以促进抗原-抗体复合物的洗涤和随后的分离。固体支持物的实例包括微量滴定板、棒、珠或微珠形式的玻璃或塑料。本文中涵盖的固体支持物的实例包括部分或全部由玻璃(例如，可控孔度玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、硅酮和塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇)形成的固体支持物。
在一些实施方案中，使用在基质表面上含有固定化ANTXR1特异性和/或其他生物标志物特异性抗体的抗体微阵列板检测ANTXR1和/或其他生物标志物。微阵列可以用于“夹层”测定，其中微阵列上的抗体捕获测试样品中的ANTXR1和/或其他生物标志物，并且通过与捕获的标志物特异性结合的标记的二抗检测捕获的标志物。在一个优选的实施方案中，二抗是生物素化的或酶标记的。通过随后与链霉亲和素-荧光团缀合物(用于荧光检测)或酶底物(用于比色检测)一起孵育来实现检测。
在另一个实施方案中，抗体微阵列提供竞争性免疫测定。简言之，在存在标记的ANTXR1和/或其他生物标志物标准物的情况下，将包含固定化抗标志物抗体的微阵列与测试样品一起孵育。标记的ANTXR1和/或其他生物标志物与测试样品中的未标记的ANTXR1和/或其他生物标志物竞争与固定化抗原特异性抗体结合。在这样的竞争性环境中，测试样品中ANTXR1和/或其他生物标志物浓度的增加将导致标记的ANTXR1和/或其他生物标志物标准物与固定化抗体的结合减少，并且因此导致标记物的信号强度降低。
在某些实施方案中，使用用于检测和定量mRNA表达水平的寡核苷酸微阵列检测ANTXR1和/或其他生物标志物。寡核苷酸微阵列由一系列排列的复数个寡核苷酸的显微斑点(称为特征)组成，各自含有少量(通常在皮摩尔的范围内)的特定寡核苷酸序列。特定寡核苷酸序列可以是基因或其他寡核苷酸元件的短部分，其用作探针以使cDNA或cRNA样品在高严格条件下杂交。通常通过荧光团标记的靶标的基于荧光的检测来检测和量化探针-靶标杂交，以确定靶标中的核酸序列的相对丰度。寡核苷酸探针通常通过与化学基质的共价键(通过环氧-硅烷、氨基-硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺或其他)与固体表面连接。固体表面可以是玻璃或硅芯片或微珠。寡核苷酸阵列与其他类型的微阵列的区别仅在于它们测量核苷酸或使用寡核苷酸作为其检测系统的一部分。
微阵列面板可以以手动、半自动或自动模式处理。手动模式是指对所有测定步骤进行手动操作，包括将试剂和样品递送到微阵列上、样品孵育和微阵列洗涤。半自动模式是指对将样品和试剂递送到微阵列上进行手动操作，而孵育和洗涤步骤进行自动操作。在自动模式中，可以通过计算机或具有小键盘的集成模拟板单元来控制三个步骤(样品/试剂递送、孵育和洗涤)。例如，可以用ProteinArray工作站(PerkinElmer Life Sciences，Boston，Mass.)或Assay 1200TM工作站(Zyomyx，Hayward，Calif)处理微阵列。通过荧光、比色和化学发光的扫描器可以用于检测微阵列信号和捕获微阵列图像。基于微阵列的测定的定量也可以通过其他方式实现，例如质谱法和表面等离子体共振。捕获的微阵列图像可以通过独立的图像分析软件或用图像采集和分析软件包进行分析。例如，抗原微阵列的定量可以用荧光基于PMT的扫描器-ScanArray3000(General Scanning，Watertown，Mass.)或比色基于CCD的扫描器-VisionSpot(Allied Biotech，Ijamsville，Md.)来实现。通常，图像分析将包括数据采集和用单独的软件包准备测定报告。为了加速从捕获图像到生成测定报告的整个测定过程，包括图像捕获、图像分析和报告生成的所有分析步骤可以被限制在一个软件包中和/或由一个软件包控制。这样的统一的控制系统将以用户友好的方式提供图像分析和测试报告的生成。
治疗方法
本申请的另一个方面涉及治疗癌症的方法。所述方法包括以下步骤：确定来自患者的癌组织中的ANTXR1的表达水平，以及如果在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达，则向患者施用有效量的SVV。如本文中使用的，术语“SVV”涵盖以下讨论中的野生型SVV、SVV衍生物、突变体、变体或经修饰的SVV。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：确定癌组织中先天免疫应答途径的一种或更多种生物标志物的表达水平，以及如果(1)在癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达和(2)癌组织中先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的水平降低，则向患者施用有效量的SVV。
施用
将SVV以通过病毒在肿瘤细胞中的复制来有效抑制、预防或破坏肿瘤细胞生长的量施用于宿主或对象。利用SVV用于癌症治疗的方法包括以安全、可发展和耐受的剂量全身、区域或局部递送病毒以引发肿瘤细胞的治疗上有用的破坏。即使在全身施用后，SVV的治疗指数也为至少10，优选至少100或更优选至少1000。一般地，SVV以107vp/kg至1×1011vp/kg的量施用。待施用的确切剂量取决于多种因素，包括患者的年龄、体重和性别，以及所治疗的肿瘤的尺寸和严重程度。病毒可施用一次或更多次，这可取决于宿主的免疫应答潜力。可以以治疗医师选择的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次施用。如果需要，可通过使用多种免疫抑制剂来减少免疫应答，从而通过降低对病毒的免疫应答来容许重复施用和/或增强复制。抗癌病毒治疗可与其他抗癌方案组合。可以以多种方式，使用脂质体、直接注射、导管、表面施用、吸入、静脉内递送等实现递送。此外，SVV基因组RNA的DNA拷贝或其一部分也可以是递送方法，其中DNA随后被细胞转录以产生SVV病毒颗粒或特定SVV多肽。
SVV通常以治疗有效剂量施用。治疗有效剂量是指导致患者中症状改善或存活延长的病毒量。病毒的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准程序确定，例如，用于确定LDs0(对50％的动物或细胞群致死的剂量；对于病毒，剂量以vp/kg为单位)和ED50(在50％的动物或细胞群中治疗有效的剂量(vp/kg))或EC50(在50％的动物或细胞群中的有效浓度(vp/细胞)(例如参见表1))的标准程序。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数并且其可以表示为LD50与ED50或EC50之间的比例。表现出高治疗指数的病毒是优选的。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于配制用于人的一系列剂量。病毒的剂量优选落在具有很小或没有毒性的包括ED50或EC50的循环浓度范围内。剂量可在该范围内变化，这取决于采用的剂型和使用的施用途径。
制剂
本申请还涉及包含病毒和可药用载体的药物组合物。这样的组合物(其可以在可药用载体中包含有效量的SVV)适用于以单位剂量形式、无菌肠胃外溶液或混悬剂、无菌非肠胃外溶液或口服溶液或混悬剂、水包油或油包水乳剂等局部或全身施用于个体。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的制剂在本领域中是已知的。组合物还包含冻干和/或重构形式的SVV。可接受的药物载体是例如盐水溶液、硫酸鱼精蛋白(Elkins-Sinn，Inc.，CherryHill，NJ)、水、水性缓冲液例如磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液、或聚凝胺(Sigma Chemical，St.Louis，MO)以及磷酸盐缓冲盐水和蔗糖。根据本文中包含的教导，选择合适的药物载体对于本领域技术人员而言是明显的。这些溶液是无菌的并且通常不含除SVV之外的颗粒物质。组合物可含有接近生理条件所需的可药用辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。可包含通过SVV增强细胞感染的赋形剂。
SVV可以以多剂量和单剂量的量存在于组合物中，包括但不限于约1×105pfu至1×1012pfu、1×106pfu至1×1010pfu、或1×107pfu至1×1010pfu，包括每个端值，例如至少或约至少或1×106pfu、1×107pfu、1×108pfu、1×109pfu、2×109pfu、3×109pfu、4×109pfu、5×109pfu、1×1010pfu。
组合物的体积可以是任何体积，并且可以用于单剂量或多剂量施用，包括但不限于，约0.01mL至100mL、0.1mL至100mL、1mL至100mL、10mL至100mL、0.01mL至10mL、0.1mL至10mL、1mL至10mL、0.02mL至20mL、0.05mL至5mL、0.5mL至50mL、或0.5mL至5mL，包括每个端值。
SVV的感染性可以例如通过当暴露于体液(例如血液或血清)时溶瘤病毒的提高的滴度或半衰期来表现。感染性可以以任何量提高，包括但不限于，至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
联合治疗
在一些实施方案中，SVV治疗与免疫治疗组合使用。可与SVV组合使用的合适的免疫治疗包括但不限于使用检查点抑制剂，例如纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolzumab)和伊匹单抗(Ipilimumab)。SVV可与免疫治疗组合施用或与其按顺序(例如，之前或之后)施用。组合还可以包含另外的组合物，其在组合物中的一种或两种中包含另外的试剂，例如另一种活性剂，例如抗癌化合物或治疗剂或另一种不同的溶瘤病毒，和/或诊断剂。辅助治疗在本申请中也被考虑作为一种治疗形式，其中SVV可与其他试剂组合使用。如本文中使用的，“辅助治疗”是指其中另一种治疗与初级治疗一起使用以帮助或增强初级治疗的治疗。因此，其是除了初级治疗、主要治疗或初始治疗之外另外给予的治疗。辅助治疗提高了初级治疗在治疗疾病中的有效性。出于本文中的目的，用溶瘤病毒治疗是初级或主要治疗，并且采用一种或更多种不同的治疗来提高溶瘤病毒治疗的有效性，例如通过提高感染性。这样的试剂的示例是治疗性化合物、提高病毒感染性的试剂、治疗或诊断病毒、抗病毒或化学治疗剂、或用于调节由病毒编码的内源或异源基因的基因表达的试剂或化合物。
还提供了含有配制用于作为一种组合物递送的病毒的组合物和第二组合物的组合，所述第二组合物含有另外的活性剂，例如但不限于治疗性化合物、增加病毒感染性的试剂、治疗或诊断病毒、抗病毒或化学治疗剂、或用于调节由病毒编码的内源或异源基因的基因表达的试剂或化合物。另外的活性剂包括抗癌剂，以及调节或改变或改善病毒性质的试剂。治疗性化合物包括例如选自以下的任一种：细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、siRNA分子、酶/pro E药物对、抗代谢物、信号传导调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、化学治疗化合物、抗转移化合物、及其任意组合。
特别地，包含在组合中以及本文中提供的任何组合物中或作为本文中提供的任何组合的一部分的另外的试剂，其为调节或改变或改善病毒性质的试剂，例如提高病毒感染性的试剂。这些包括改变对病毒的免疫应答以便在施用时清除较少的病毒的试剂。另外的试剂包括诸如补体抑制剂的试剂，抑制补体激活或补体途径中的任何蛋白质的活性的试剂，例如抑制任何补体蛋白C1、C2、C3、C4、C5、C5a、C5aR、C3aR、因子B、因子P、Clq和MBP的活性的试剂。这样的试剂是本领域技术人员已知的，并且包括，例如，包括对这些蛋白质中的一种或更多种具有特异性的抗体。示例性抑制剂包括例如眼镜蛇毒因子(cobra venomfactor，CVF)、肝素、TA 106、TNX-234、抗备解素、C1-INH、补体抑制素(compstatin)或其衍生物或类似物、可溶性CR1、K76COOH、依库丽单抗、培克珠单抗(pexelizumab)、TSA12/22、MSA12/22、ARC 1005、TNX-558、NOX-D19、PMX-53、PMX-201、PMX-205、neutrazumab及其抑制补体活性的变体、类似物或衍生物。
试剂盒
本申请的另一个方面涉及用于选择预期可能对用SVV治疗有响应的癌症患者的试剂盒。这样的试剂盒可包含用于检测癌组织中的ANTXR1的表达水平的试剂，以及用于检测先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的表达的一种或更多种试剂，包括但不限于α-干扰素或β-干扰素途径。在一些实施方案中，用于检测ANTXR1的表达水平的试剂是抗ANTXR1抗体或一对ANTXR1特异性寡核苷酸引物。
以下是用于实践本发明之实施方案的公开的方法、材料和过程。普通技术人员将理解，本发明不限于以下公开的方法、材料和过程。普通技术人员将理解，本发明可与和植物和哺乳动物二者中的特定细胞类型有关的治疗和诊断方法结合使用。本申请的另外的方面和优点将从以下结合附图的描述中变得明显。
实施例
实施例1：材料和方法
试剂和细菌菌株
使用GeneAmp PCR System 9700热循环仪(Applied Biosystems)进行聚合酶链反应(PCR)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR片段。使用DNeasy Blood andTissue试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。感受态DH10B和Stbl3细胞购自Invitrogen。使用QIAquick Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从细菌中分离和纯化质粒。单个克隆和质粒的Sanger测序由Genewiz，Inc.进行。在Geneious Pro 4.7.6中进行核苷酸和蛋白质序列比对。前述内容仅说明了本公开内容的原理。
细胞系和病毒
所有细胞培养基和溶液均由纪念斯隆凯特琳癌症中心(Memorial SloanKettering Cancer Center，MSKCC)Media Prep核心设施生产。HAP1细胞购自HaplogenGmbH并保持在补充有10％胎牛血清的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)中。TC-71细胞获自儿童肿瘤学组(Children′s Oncology Group，COG)细胞培养库并保持在补充有10％胎牛血清和1×ITS补充剂的IMDM中。用于本研究中的所有其他细胞系均购自ATCC。将HEK293T/17细胞保持在补充有10％胎牛血清和1mM丙酮酸钠的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM HG)中。将所有另外的品系保持在补充有10％胎牛血清和10mM HEPES的RPMI1640中。通过STR分析常规确认所有细胞系并通过DDC Medical确认支原体阴性。如前所述培养、纯化和滴定SVV和SVV-GFP(Reddy，P.S.，等.Seneca Valley virus，a systemicallydeliverable oncolytic picornavirus，and the treatment of neuroendocrinecancers.J Natl Cancer Inst 99，1623-1633(2007)；Poirier，J.T.，等.Characterization of a full-length infectious cDNA clone and a GFP reporterderivative of the oncolytic picornavirus SVV-001.I Gen Virol 93，2606-2613(2012))。
人GeCKO v2文库
在作为实验室间转移的lentiGuide-Puro质粒骨架(Addgene质粒#52962)中获得作为两个半文库(文库A和B)的人GeCKO v2文库。如前所述，MSKCC RNAi核心设施通过Endura电感受态细胞(Lucigen)的电穿孔扩增合并的文库(Shalem，O.，等.Genome-scaleCRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science 343，84-87(2014)；Sanjana，N.E.，Shalem，O.&Zhang，F.Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPRscreening.Nature methods 11，783-784(2014))。质粒DNA文库在嵌套式PCR中用作模板以首先扩增含有sgRNA的质粒部分(表1(用于CRISPR构建体和ANTXR1表达构建体的克隆和测序中的引物的寡核苷酸列表。数字对应于正文中的寡核苷酸同一性。引物名称描述了sgRNA基因靶或引物最终产生的产物。从5’至3’显示的寡核苷酸)；SEQ ID NO.#1-2)，随后添加Illumina测序接头和条形码(SEQ ID NO.#3-18)。然后使用Illumina HiSeq2500(SEQ IDNO.#19)对嵌套式PCR产物进行测序以确认sgRNA表示。
表1
单个sgRNA质粒
在hU6启动子下表达单个sgRNA并且在EFS启动子下表达WT Cas9核酸酶的lentiCRISPR v2质粒获赠于Feng Zhang(Addgene质粒#52961)。含有靶向具有5’突出端BsmBI消化位点的sgRNA的基因的寡核苷酸由Sigma Aldrich合成(SEQ ID NO.#22-53)。将寡核苷酸退火并插入如本文中上文所述的lentiCRISPR v2骨架中。通过Sanger测序确认sgRNA序列和质粒。
诱导型ANTXR1表达质粒构建
为了产生诱导型ANTXR1表达慢病毒质粒，获得作为实验室间转移的表达全长ANTXR1 cDNA的质粒。组成型表达与C端流感病毒血凝素(HA)标签融合的ANTXR1 cDNA的质粒(ANTXR1-HA)用作PCR中的模板，其中引物并入Gateway attB1和attB2克隆序列(SEQ IDNO.#57-58)。将PCR产物纯化并随后与Gateway目的载体pDONR221(Invitrogen)用于BP反应中，转化到DH10B细胞中，并在补充有50μg/ml卡那霉素(Sigma Aldrich)的LB琼脂平板上进行选择。将含有PCR片段的质粒纯化并与pInducer20(另一种实验室间转移(Addgene质粒#44012))用于LR反应中。将重组质粒转化到Stbl3细胞中并在补充有100μg/ml羧苄青霉素(Sigma)的LB琼脂平板上进行选择。通过Sanger测序确认含有具有HA融合标签的多西环素(Dox)诱导型ANTXR1 cDNA的纯化质粒并用于产生用来产生稳定细胞系的慢病毒。
ANTXR1-HA表达质粒截短克隆
使用上述全长ANTXR1-HA表达质粒作为PCR模板，利用引物在PCR中顺序除去N-末端cDNA序列(SEQ ID NO.#59-66)的区域。如先前所述设计引物(Hansson，M.D，Rzeznicka，K.，Rosenback，M.，Hansson，M.&Sirijovski，N.PCR-mediated deletion of plasmidDNA.Anal Biochem 375，373-375(2008))。为了确保所得ANTXR1-HA蛋白的正确定位，将编码完整信号肽序列的cDNA序列保留在表达质粒中。用DpnI(New England Biolabs)孵育PCR反应以除去模板质粒，转化到Stbl3细胞中，并在补充有100μg/ml羧苄青霉素(Sigma)的LB琼脂板上进行选择。通过Sanger测序确认含有N-末端ANTXR1截短的纯化质粒。
慢病毒产生
慢病毒包装质粒pMD2.G(Addgene质粒#12259)和psPAX2(Addgene质粒#12260)是来自Didier Trono的礼物。除非另有说明，否则慢病毒质粒的所有转染如下进行：在OptiMEM(Gibco)中2∶1 PEL∶DNA比例的1mg/mL聚醚酰亚胺(PEI；Sigma Aldrich)中以慢病毒质粒：psPAX2∶pMD2.G为3∶2∶1 DNA比例转染慢病毒质粒。转染后16小时更换培养基。转染后72小时收获含有病毒的培养基，并通过0.45μm PDVF注射器过滤器(Millipore)过滤以除去细胞碎片。将慢病毒等分试样储存在-80℃。
对于人GeCKO文库，用HEK 293T/17细胞(每板7.0×106个)接种20个15cm2培养皿(Corning)。用36mL OptiMEM中432μL的1mg/mL PEI，将GeCKO文库A和B 1∶1合并(每个文库54μg)并用psPAX2(72μg)和pMD2.G(36μg)共转染。然后将转染混合物平均分配在15cm2培养皿中。转染后16小时，更换每个培养皿上的培养基并补充1U/mL DNA酶I(New EnglandBiolabs)。转染后72小时，收获培养基慢病毒上清液，并通过0.45μm Stericup PVDF过滤器(Millipore)过滤。然后通过在4℃下以24,000rpm超速离心2小时使病毒沉淀。将病毒沉淀重悬于新鲜的DMEM中，并在4℃孵育过夜。将慢病毒等分试样储存在-80℃。
慢病毒转导
除非另有说明，否则所有慢病毒转导如下进行：将待转导的细胞(1.0×106)在转导前一天接种在75cm2烧瓶中。将慢病毒在冰上解冻并添加到补充有32μg/mL聚凝胺的OptiMEM中。将病毒-OptiMEM混合物添加到细胞中后，添加另外的培养基以使最终的聚凝胺浓度达到8μg/mL。转导后24小时更换培养基以除去聚凝胺。转导后48小时更换补充有0.5μg/mL嘌呤霉素(Sigma Aldrich)或6μg/mL杀稻瘟素(Fisher Scientific)的培养基以分别选择lentiCRISPRv2或lentiCas9-Blast转导细胞。将转导的细胞维持在含有嘌呤霉素或杀稻瘟素的培养基中。对于Dox诱导型ANTXR1慢病毒(pInducer20-ANTXR1)，转导SCLC H69和H146细胞系并维持在补充有500μg/mL G-418(Thermo Fisher)的无四环素(无tet)培养基中。
GeCKO文库筛选
如上所述在亲本HAP1和H446细胞上滴定人GeCKO v2文库慢病毒。用lentiCas9-Blast慢病毒转导亲本细胞，允许组成型地表达DNA核酸酶Cas9。lentiCas9-Blast质粒是来自Feng Zhang的礼物(Addgene质粒#52962)。用6μg/mL杀稻瘟素选择转导的细胞。将HAP1-Cas9细胞(2.0×108)同样地接种在70个15cm2培养皿中。将H446-Cas9细胞(1.5×108)接种到50个15cm2培养皿中。将GeCKO慢病毒在冰上解冻，在补充有32μg/mL聚凝胺的总体积为375mL的OptiMEM中混合，并等分到HAP1-Cas9或H446-Cas9板中。对于两种筛选，以MOI＝0.4转导单位/细胞(TU/细胞)添加慢病毒。向每个板中添加额外的培养基以使最终的聚凝胺浓度达到8μg/mL。转导后24小时更换培养基以除去聚凝胺。转导后48小时更换培养基以分别用0.5μg/mL或1.0μg/mL嘌呤霉素选择转导的H446-Cas9或HAP1-Cas9细胞。使转导的细胞再生长4天以允许完全敲低sgRNA靶向基因。在HAP1筛选中在转导后第7天，将2.0×108个细胞以相同细胞密度接种在40个15cm2培养皿中，并在第二天以MOI＝1,000vp/细胞用SVV感染。在H446筛选中在转导后第7天，将1.5×108个细胞以相等的细胞密度接种在50个15cm2培养皿中，并在第二天以MOI＝1.0vp/细胞用SVV感染。合并每个细胞系的剩余细胞，通过离心沉淀，并在-80℃下储存，作为相应的转导后第7天样品。对于HAP1筛选期间SVV感染后一周，每3天更换感染板上的15mL培养基以用新鲜培养基再补充细胞。合并存活细胞，通过离心沉淀，并在-80℃下储存作为SVV抗性样品。对于H446筛选期间SVV感染后的两周，每3天更换感染板上的10mL培养基以用新鲜培养基再补充细胞。通过克隆圆筒中的分离的胰蛋白酶消化收集存活细胞的可见集落，并接种在24孔板(Corning)的1个孔中。通过胰蛋白酶消化收获所有太小而不能分离的集落，并在扩增前合并。随着细胞繁殖，每个分离的集落最终从24孔扩增至75cm2烧瓶。通过离心沉淀来自每个集落的细胞并储存在-80℃。
鉴定sgRNA
对于HAP1筛选，将来自转导后第7天和SVV抗性群体的提取的基因组DNA用作GeCKOv2文库嵌套PCR的模板，并如上所述通过Illumina HiSeq分析sgRNA表现。从原始FASTQ文件导入测序的sgRNA，对于文库大小进行归一化，然后转换为每百万读数的log计数(logCPM)。然后计算对照和抗性样品之间的log倍数变化。基于非靶向sgRNA的分布，我们集中于其中≥2个独特的sgRNA具有平均logCPM＞6和logFC＞5的基因。通过Mann-Whitney检验进行全基因检验。可根据要求提供计算机代码。
对于H446筛选，将来自每个SVV抗性集落的提取的基因组DNA用作PCR模板以扩增含有基因靶向sgRNA(SEQ ID NO.#54)的慢病毒插入物。纯化PCR产物，然后通过Sanger测序进行测序。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将含有多个sgRNA的PCR产物(通过Sanger测序确定)连接到线性化的pCR2.1质粒中。将连接反应物转化到DH10B细胞(Invitrogen)中，并在补充有100μg/mL羧苄青霉素(Fisher)的LB琼脂板上进行选择。将来自每个转化板的集落进行分离、扩增并通过Sanger测序进行测序。
CRISPR二级筛选
如上所述，将各个靶向sgRNA克隆到lentiCRISPRv2质粒中。如上所述将sgRNA质粒各自转染到HEK 293T/17细胞中，并在亲本H446或HAP1细胞中转导。用0.5μg/mL嘌呤霉素选择转导的H446细胞。用1.0μg/mL嘌呤霉素选择转导的HAP1细胞。转导后使细胞生长至少7天以允许完全基因敲除。如下所述通过AlamarBlue荧光细胞生存力染料(ThermoFisherScientific)评估细胞生存力。
细胞生存力测定和分析
在感染前24小时，将细胞(5.0×103)接种到100μL培养基中的黑色不透明96孔板(Corning)中。用从MOI＝5,000vp/细胞到MOI＝5.0×10-5vp/细胞的SVV系列稀释液感染板并孵育24至72小时。每个MOI在3至6个重复孔中进行测试，用未感染的细胞作为对照。将AlamarBlue细胞生存力溶液加入到每个孔中并在37℃下孵育。使用Synergy Neo读板仪(BioTek)，在565nm激发后获得590nm的荧光发射，使用仅含有培养基的孔作为背景对照。减去背景荧光值并对重复孔求平均值以确定SVV的每个MOI的平均荧光和标准偏差。将每个MOI的平均荧光值除以对照孔的平均荧光值以计算细胞生存力百分比。使用GraphPadPrism 6软件将细胞生存力值和标准偏差相对于SVV的MOI作图。
鉴定ANTXR1 KO系中的ANTXR1插失
使用来自亲本H446细胞和ANTXR1 KO突变体克隆的提取的基因组DNA作为PCR模板，以使用序列特异性引物(SEQ ID NO.#55-56)扩增ANTXR1 sgRNA的靶标ANTXR1基因的外显子2。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物连接到线性化的pCR2.1质粒中。将连接反应物转化到DH10B细胞(Invitrogen)中，并在补充有100μg/mL羧苄青霉素(FisherScientific)的LB琼脂板上进行选择。将来自每个转化板的集落进行分离、扩增并通过Sanger测序进行测序。将来自ANTXR1 KO系的外显子2序列与WT H446外显子2序列和ANTXR1基因参考序列(NG_012649.1；Pubmed)进行比较以鉴定每个细胞系中的插失。
ANTXR1-KO系
如上所述用ANTXR1.3 sgRNA lentiCRISPRv2慢病毒转导所有细胞系。用1.0μg/mL嘌呤霉素选择每个细胞系中的转导细胞。转导后使细胞生长至少7天以允许完全基因敲低。作为阴性对照细胞系，用含有EGFP靶向sgRNA(实验室间转移(Addgene质粒#51764))的lentiCRISPRy2慢病毒类似地转导亲本H446细胞，并用嘌呤霉素选择。
H446 ANTXR1 KO mCherry细胞系
如上所述使用含有荧光mCherry蛋白cDNA的pLenti6W18-mCherry慢病毒表达质粒来产生慢病毒。如先前所述用mCherry慢病毒转导从H446 GeCKO筛选分离的H446 ANTXR1KO 4克隆。转导后48小时，使用荧光激活细胞分选(FACS)和BD FACSAria(BectonDickinson)通过阳性mCherry荧光分离转导的细胞，随后培养为稳定细胞系(H446 ANTXR1KO mCherry)。
体内SVV-001效力
所有动物实验和程序均根据纪念斯隆凯特林癌症中心的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee at Memorial Sloan KetteringCancer Center)给出的指导方针进行。6至8周龄的雌性无胸腺裸鼠购自Envigo，Inc。小鼠皮下植入Hanks平衡盐溶液(HBSS)中的基质胶(Corning)与以下的1∶1混合物：亲本H446细胞、H446ANTXR1KO mCherry细胞、或亲本：KO mCherry细胞的1∶1混合物。一旦肿瘤达到约100mm3的体积，将每个组内的小鼠随机分配并通过腹膜内注射施用SVV-001(1×1013vp/kg)或作为载体对照的pH 7.4的PBS。每48小时用外部卡尺测量肿瘤大小。通过公式V＝(L×W2)/2估计肿瘤体积，其中L是长度或直径，W是宽度。使用GraphPad Prism 6软件绘制每个组的计算的肿瘤平均值和标准偏差。在研究结束时，对小鼠安乐死，切除肿瘤，并通过流式细胞术进行分析。
ANTXR1表达实验
除非另有说明，否则如下转染和分析细胞：用ANTXR1-HA表达质粒进行ANTXR1挽救实验。在转染前24小时将细胞接种在组织培养物处理的6孔板中。将细胞用OptiMEM中的1mg/mL PEI中的ANTXR1-HA和组成型表达荧光蛋白mCherry的pLenti6W18-mCherry瞬时共转染，以未转染的细胞作为对照。转染后16小时更换培养基。然后如下所述收获细胞用于Western印迹分析或用SVV-GFP攻击用于流式细胞术分析。对于Western印迹裂解物，在转染后48小时收获转染的细胞，并通过离心沉淀。在补充有IX Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Pierce)的放射免疫沉淀测定(RIP A)缓冲液(Pierce)中裂解细胞沉淀，随后通过离心澄清。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)定量蛋白质裂解物，并通过在NuPAGE样品还原剂和LDS样品缓冲液(Invitrogen)中在90℃煮沸10分钟准备用于Western印迹分析。如下所述进行western印迹分析。
对于SCLC ANTXR1 KO系中的再表达实验，将细胞在OptiMEM中的1mg/mL PEI中用10∶1摩尔比的ANTXR1-HA和pLenti6W118-mCherry表达质粒瞬时共转染，用单独mCherry转染的细胞作为对照。在转染后48小时，对于每个细胞系用TCID50的SVV-GFP攻击细胞，并在SVV-GFP感染后6小时收获用于分析。对于非容许性SCLC细胞系中的表达实验，在实验开始前16小时将pInducer20-ANTXR1转导的H69或H146细胞接种在6孔板中。在加入SVV-GFP之前，将细胞维持在单独的或补充有1μg/mL多西环素的无tet培养基中72小时。将细胞用SVV-GFP孵育6小时，然后收获用于分析。对于测试ANTXR1 N-末端截短的再表达实验，将细胞在OptiMEM中的1mg/mL PEI中用10∶1摩尔比的全长或截短的ANTXR1-HA和pLenti6W118-mCherry表达质粒瞬时共转染，用未转染的细胞作为对照。转染后24小时，将细胞用MOV＝0.5vp/细胞的SVV-GFP攻击16小时，并如下所述成像。收获转染细胞的平行样品并通过Western印迹进行分析。
SVV-GFP感染
除非另有说明，否则在感染前24小时将细胞接种在组织培养物处理的孔板(Corning)中。将板用MOI＝5.0vp/细胞的SVV-GFP感染，并在37℃下孵育8或16小时。向每个孔中加入NucBlue Live ReadyProbe试剂(Invitrogen)并在37℃下孵育20分钟。使用EVOSFL Auto荧光显微镜(Invitrogen)获得细胞图像。对于混合培养物体外实验，将亲本H446和H446 ANTXR1 KO mCherry细胞接种为纯培养物或接种为1∶1比例的混合培养物。然后将细胞用SVV-GFP(MOI＝0.1vp/细胞)在37℃下攻击16小时，随后成像。对于IFN响应活性测定，将DMS79和H1618细胞用单独的培养基，补充有4μM组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂MS-275(Selleck)或伏立诺他(SAHA；LC labs)、25个单位/mL的IFN-α(Thermo)或IFN-β(R&DSystems)、或25U/mL IFN-α/β和相应的5μg/mL IFN-α(Thermo)或IFN-β抗体(R&D Systems)的培养基在37℃下处理24小时。将H446、H82和H1618细胞用单独的培养基或补充有25U/mLIFN-β的培养基在37℃下处理24小时。然后将细胞用SVV-GFP(H1618：MOI＝0.5vp/细胞；DMS79、H446、H82：MOI＝0.1vp/细胞)在37℃下攻击16小时，随后通过流式细胞术分析。对于阻断实验，将SVV-GFP(MOI＝5)用在冰上的5μg/mL ANTXR1-Fc或ANTXR2-Fc嵌合体IgG-Fc(Sino Biological)或对照(R&D Systems)孵育1个小时，并随后添加到细胞在37℃下保持16小时。
SVV-Cy5结合实验
将SVV用胺反应性Cy5染料(GE Healthcare)在碳酸钠缓冲液(pH9.3)中在室温(RT)下孵育1小时。在HEPES缓冲液中通过凝胶过滤柱(GE Healthcare)过滤除去过量的染料。将病毒等分试样储存在-80℃。将亲本、ANTXR1 KO和TEX2 KO H446细胞用SVV-Cy5在37℃下在OptiMEM中孵育30分钟。非容许性SCLC细胞系DMS114用作阴性对照。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤三次，然后用LrVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit染色，并如上所述进行固定。在BD LSR II流式细胞仪(Becton Dickinson)上运行样品，使用未染色的细胞和用单独OptiMEM孵育的细胞作为对照。所有补偿和设门均使用FlowJo分析软件(TreeStar)如下所述进行。
共免疫沉淀(Co-IP)
磁性蛋白G Dynabead(Invitrogen)用于所有免疫沉淀实验。除非另有说明，否则将Dynabead和Dynabead-蛋白质复合物用补充有0.02％Tween-20(Sigma Aldrich)的pH7.4的PBS洗涤三次。使用DynaMag磁体(Life Technologies)固定Dynabeads用于操作和洗涤。通过使用补充有NuPAGE样品还原剂和LDS样品缓冲液的RIPA缓冲液在90℃下煮沸Dynabead-蛋白质复合物10分钟来洗脱蛋白质。对于最初的ANTXR1-Fc和ANTXR2-Fc Co-IP实验，将pH 7.4的PBS中Fc嵌合蛋白(0.25μg)的系列稀释液用1μL 30mg/mL Dynabead在室温下孵育10分钟。洗涤Dynabead-Fc复合物，随后在4℃下用SVV(2.0×1010vp)孵育2小时。重复三次洗涤，然后将dynabead-蛋白质复合物进行蛋白质洗脱。对于使用高严格洗涤的co-IP，在SVV添加后，使用补充有0.02％Tween-20和从125mM至2M的增加量的NaCl的pH 7.4的PBS洗涤Dynabead-蛋白质复合物。
Western印迹
用MOPS运行缓冲液(Life Technologies)在4至12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上解析洗脱的Dynabead蛋白质或蛋白质提取物，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。对于co-IP实验，用抗SVV的兔抗血清(Neotropix)对膜进行印迹。对于ANTXR1转染细胞裂解物，用抗HA标签(Cell Signaling目录号3724S)或磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；Santa Cruz目录号sc-25778)或作为上样对照的黏着斑蛋白(Cell Signaling目录号13901 S)的商业第一抗体对膜进行印记。使用辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(CellSignaling)进行免疫印迹，并通过化学发光(GE Life Sciences)进行检测。
流式细胞术分析
在SVV-GFP感染之前24小时，将亲本和ANTXR1 KO细胞系接种在组织培养物处理的6孔板中。对于每个细胞系用TCID50的SVV-GFP感染细胞，并在37℃下孵育6至16小时，用未感染的细胞作为对照。随后使用Accutase酶细胞分离培养基(Gibco)收获细胞，通过离心沉淀，并用补充有2％FCS和0.5mM EDTA的pH 7.4的无菌PBS(FACS缓冲液)洗涤。将细胞用LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain试剂盒(Invitrogen)在4℃下染色30分钟，用FACS缓冲液洗涤，然后在4℃下用4％多聚甲醛溶液固定10分钟。对于肿瘤样品，将肿瘤手动加工成单细胞悬浮液，并进行ACK裂解缓冲液(Crystalgen)孵育以除去污染的鼠红细胞。然后将细胞用LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain试剂盒染色，并用FACS缓冲液洗涤多次。在用FACS缓冲液最后洗涤后，在BD LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson)上运行细胞，使用未染色的细胞和用单独培养基孵育的细胞作为对照。对于肿瘤样品，对未处理的纯亲本和ANTXR1 KO mCherry肿瘤进行处理并用作对照。所有实验样品一式三份地收集和进行。来自肿瘤样品的数据代表4至5个单独肿瘤的平均值。使用FlowJo分析软件(TreeStar)进行另外的设门和分析。使用GraphPad Prism 6软件绘制分析的数据和标准偏差。在适用的情况下进行不成对的双侧t检验以确定统计学显著性。星号表示显著性水平如下：*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，和****p≤0.0001。
基因表达分析
从Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)或Pediatric Preclinical TestingProgram(PPTP)下载癌细胞系的标准化基因表达数据(Barretina，J.，等The Cancer CellLine Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drugsensitivity.Nature 483，603-607(2012)；Neale，G等.Molecular characterization ofthe pediatric preclinical testing panel.Clinical cancer research：an officialjournal of the American Association for Cancer Research14，4572-4583(2008))。自定义内容描述符文件(content descriptor file，CDF)用于两个基因表达数据集。对于CCLE微阵列数据，我们使用对应于ENTREZG-v15的CDF。对于包括人和小鼠来源两者的混合mRNA的PPTP微阵列数据，我们使用人特异性H-spec CDF(Isella，C，等.Stromalcontribution to the colorectal cancer transcriptome.Nature genetics 47，312-319(2015))。为了确定表达ANTXR1的细胞系的适当截止值，鉴定了ANTXR1表达中的密度分布的局部模式，其中下限被认为是未表达。然后基于Zilliox等的工作(Zilliox，M.J.&Irizarry，R.A.A gene expression bar code for microarray data.Nature methods 4，911-913(2007))确定该峰的标准偏差并且设定等于模式以上10个标准偏差的表达截止值。使用高斯混合模型获得了类似结果。使用R统计编程环境和Bioconductor工具套件进行基因表达分析。使用LIMMA鉴定差异表达的基因以将线性模型拟合于每个基因并使用经验贝叶斯方法产生调节的t-统计。使用CAMERA进行基因集富集分析，CAMERA是纯竞争性基因集测试方法(Wu，D.&Smyth，G.K.Camera：a competitive gene set test accounting forinter-gene correlation.Nucleic Acids Res 40，e133(2012))。使用GSVA测定逐样品富集(Hanzelmann，S.，Castelo，R.&Guinney，J.GSVA：gene set variation analysis formicroarray and RNA-seq data.BMC biointormatics 14，7(2013))。
低温电子显微术
将等体积的0.2mg/ml病毒体和1mg/ml的ANTXR1混合，得到每个结合位点约10∶1的受体比例。将样品混合并在37℃下保持90分钟，再转移至冰上经90分钟。通过在辉光放电的Quantifoil多孔碳网格(Quantifoil Micro Tools GmbH，Grossloebichau/Jena，Germany)上施加3μL纯化的病毒来制备试样。将过量的缓冲液吸干并使用Leica KF80低温固定装置(C.Reichert Optische Werke AG，Vienna，Austria)将网格快速插入到液体乙烷中。将网格加载到Gatan 914 Cryoholder(Pleasanton，CA，USA)上。使用电子剂量为约30电子/的最小剂量条件，在200kV下操作的JEOL JEM2200FS显微镜(JEOL Ltd，Tokyo，Japan)上收集图像。柱内Ω能量滤波器用于通过零损耗滤波来改善图像对比度，狭缝宽度为25eV。使用SerialEM软件进行自动数据收集。在4×4k CMOS相机(TVIPS；Gauting，Germany)上以1至3μm的离焦记录显微照片，校准放大倍数为50,000，对应于像素大小为
使用E2BOXER软件从显微照片中选择数量为17400个的单独的病毒颗粒(Tang，G，等.EMAN2：an extensible image processing suite for electron microscopy.Journalof structural biology 157，38-46(2007))。使用CTFFIND3计算对比度转移函数参数(Mindell，J.A.&Grigorieff，N.Accurate determination of local defocus andspecimen tilt in electron microscopy.Journal of structural biology 142，334-347(2003))，丢弃具有不良CTF估计的显微照片。使用SVV原子模型的强低通版本作为初始参考(Venkataraman，S.，等.Structure of Seneca Valley Virus-001：an oncolyticpicornavirus representing a new genus.Structure 16，1555-1561(2008))，在Relion上进行定向、分类和细化(Scheres，S.H.RELION：implementation of a Bayesianapproach to cryo-EM structure determination.Journal of structural biology180，519-530(2012))。通过计算数据集的两半之间的傅里叶壳相关性，估计图像的分辨率为使用Chimera将重建的图可视化(Pettersen，E.F.，等.UCSF Chimera-avisualization system for exploratory research and analysis.Journal ofcomputational chemistry 25，1605-1612(2004))。
实施例2：全基因组功能损失筛选鉴定出ANTXR1是SVV感染必需的
合并的GeCKO v2人sgRNA文库靶向人基因组内超过19,000个基因，并且具有使用Cas9DNA核酸酶有效敲除基因的能力(Shalem，O.，等.Genome-scale CRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science 343，84-87(2014)；Sanjana，N.E.，Shalem，O.&Zhang，F.，Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPRscreening.Nature methods 11，783-784(2014)；Cong，L.，等.Multiplex genomeengineering using CRISPR/Cas systems.Science 339，819-823(2013)；Mali，P.，等.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 339，823-826(2013)；Jinek，M.，等.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity.Science 337，816-821(2012))。由于单倍体细胞中基因破坏的高效率，我们在唯一已知的人单倍体细胞系之一慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenousleukemia，CML)细胞系HAP1中进行了GeCKO筛选，我们发现它们允许相当高MOI的SVV(Carette，J.E.，等.Ebola virus entry requires the cholesterol transporterNiemann-Pick C1.Nature 477，340-343(2011))。通过合并的GeCKO文库慢病毒转导HAP1-Cas9细胞，并以高MOI用SVV感染攻击以选择抗性细胞(图1，a图)。从扩增的存活细胞群中提取基因组DNA，随后通过高通量测序分析以确定与对照相比sgRNA表现的变化。从质粒库维持非靶向对照sgRNA的表现直至筛选结束；然而，在靶向sgRNA中观察到显著变化，反映了靶向必需基因的sgRNA的损失。发现SVV选择库中最显著富集的sgRNA靶向编码炭疽毒素受体1的ANTXR1基因(Bradley，K.A.，Mogridge，J.，Mourez，M.，Collier，R.J.&Young，J.A.Identification of the cellular receptor for anthrax toxin.Nature 414，225-229(2001))。ANTXR1和睾丸表达2个基因，TEX2是唯一在SVV抗性样品中具有多个sgRNA显著富集的基因(图1，b图)。分别测试高度富集的sgRNA赋予HAP1细胞对SVV的抗性的能力(图1，c图)。观察到6种sgRNA靶向在HAP1细胞中基因敲除后赋予SVV抗性的3种不同的基因，包括靶向ANTXR1基因的三种单独的sgRNA。靶向TEX2基因的两种富集的sgRNA以及靶向NR2C2基因的1种sgRNA均赋予抗性。
为了证实与神经内分泌癌直接相关的细胞系中的结果，在高度SVV容许的H446SCLC细胞系中重复GeCKO筛选。在MOI为1vp/细胞下用SVV攻击GeCKO慢病毒转导的H446-Cas9细胞。SVV感染后存活细胞的百分比远低于HAP1筛选，允许分离单个细胞集落，而不是合并的群体。提取来自每个集落的基因组DNA，并通过Sanger测序鉴定单个sgRNA(图1，d图)。在25个抗性集落中的23个(92％)中存在靶向ANTXR1的sgRNA，并且包含靶向ANTXR1的三个独立的sgRNA。将在H446筛选中鉴定的每个sgRNA在亲本H446细胞的二级筛选中单独测试赋予SVV抗性的能力(图1，e图)。筛选中鉴定的所有三种ANTXR1靶向sgRNA均能够赋予对SVV的抗性；然而，没有其他候选sgRNA改变亲本H446细胞中的SVV容许性。
实施例3：ANTXR1对于神经内分泌癌细胞系中的容许性是必需的
在从H446筛选中分离的集落中评估ANTXR1的基因组序列，发现所有5个ANTXR1 KO克隆在ANTXR1基因的外显子2中包含插入或缺失(插失)。这些插失会导致移码突变和过早终止密码子，预计会导致截短的ANTXR1蛋白(图2，a图)。使用细胞生存力测定确认ANTXR1KO克隆的SVV容许性的损失，其中亲本H446细胞和非容许的A549细胞分别作为阳性和阴性对照(图2，b图)。在用SVV的72小时孵育期后，观察到在亲本H446细胞中随着SVV的MOI增加生存力显著损失。指示在比亲本H446细胞的有效暴露高5个对数的SVV的MOI下，高度SVV抗性细胞、所有ANTXR1 KO系以及A549细胞没有显示出细胞生存力的显著变化。
为了在另外的神经内分泌癌细胞系中确定ANTXR1是否是SVV感染必需的，我们在SCLC细胞系H446、LX22cl和H82以及HAPL和SVV容许性小儿癌细胞系Y79和TC-71中产生了ANTXR1 KO系。对每种ANTXR1 KO系用在病毒多蛋白内表达GFP的感染性SVV报告病毒(SVV-GFP)攻击(Poirier，J.T.，等.Selective tropism of Seneca Valley virus for variantsubtype small cell lung cancer.J Natl Cancer Inst 105，1059-1065(2013)；Poirier，J.T.，等.Characterization of a full-length infectious cDNA clone and aGFP reporter derivative of the oncolytic picornavirus SVV-001.J Gen Virol 93，2606-2613(2012))。通过流式细胞术分析细胞，使用相应的亲本细胞系作为阳性对照(图2，c图)。作为阴性对照，我们产生了稳定表达靶向EGFP的sgRNA的H446细胞系，以确认容许性的损失是由于靶向ANTXR1 sgRNA而非脱靶效应。在所有情况下，与相应的亲本系相比，ANTXR1 KO显著降低了≥70％的KO细胞系中的SVV-GFP感染。ANTXR1基因敲除导致多种肿瘤类型的容许细胞系中SVV容许性的损失。
进一步检查缺少ANTXR1表达的旁观者细胞是否可以通过在含有亲本和ANTXR1 KO细胞的混合细胞群中的细胞-细胞扩散被相邻细胞感染。首先，产生稳定表达mCherry荧光蛋白的H446 ANTXR1 KO克隆(ANTXR1 KO mCherry)。然后，将亲本H446和ANTXR1 KOmCherry细胞以1∶1的细胞数比例共培养，并且用SVV-GFP攻击细胞，使用纯亲本和ANTXR1KO mCherry培养物作为对照(图2，d图)。正如所料，在混合细胞培养物中仅观察到单GFP阳性(GFP+)或mCherry阳性(mCherry+)细胞，但未鉴定出GFP+/mCherry+细胞。另外，通过用亲本H446细胞、ANTXR1 KO mCherry细胞、或亲本和ANTXR1 KO mCherry细胞的1∶1混合物移植免疫缺陷裸小鼠，用WT SVV-001在体内重复上述实验(图2，e图)。在施用SVV-001后，亲本H446肿瘤显示完全消退，而1∶1亲本：ANTXR1 KO mCherry肿瘤组仅显示肿瘤进展的初始延迟。此外，在1∶1亲本：ANTXR1 KO mCherry SVV-001群中最终进展的所得肿瘤在mCherry+细胞中显著富集，表明亲本H446细胞的损失(图2，f图)。正如所料，与对照相比，ANTXR1 KOmCherry肿瘤不受SVV-001施用的影响。
实施例4：先天免疫信号传导的缺陷是SVV复制所需要的
使用Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)中的1,037个细胞系的公开可得基因表达数据确定细胞系中ANTXR1表达水平是否可预测容许性(Barretina，J.，等.TheCancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drugsensitivity.Nature 483，603-607(2012))。首先，基于CCLE中的表达分布确定表达截止值(Zilliox，MJ.&Irizarry，R.A.A gene expression bar code for microarraydata.Nature methods 4，911-913(2007))。约37％的细胞系低于表达截止值(图3，a图)。在CCLE中的细胞系中，先前已经评估了81种的容许性。在这些系中，偏向于包含神经内分泌癌症系，其中20种被认为是容许的。ANTXR1表达与容许性显著相关(p＝0.0023，Fisher精确检验)。最引人注目的是，20种容许细胞系中没有一个缺少ANTXR1的表达，支持了ANTXR1是SVV感染所需的宿主因子的假设。
虽然ANTXR1表达似乎是SVV的容许性所需要的，CCLE数据集表明其是不够的：在分析容许性的ANTXR1表达细胞系中，42/62(67.7％)被报道为非容许的。鉴定了表达ANTXR1的容许和非容许类别之间有意义的基因表达差异。使用竞争性基因集富集鉴定来自Reactome数据库的显著差异表达的基因集(Milacic，M.，等.Annotating cancer variants andanti-cancer therapeutics in reactome.Cancers 4，1180-1211(2012)；Croft，D.，等.The Reactome pathway knowledgebase.Nucleic Acids Res 42，D472-477(2014))。鉴定了在表达ANTXR1的容许细胞系中显著下调的7个基因集。最显著的基因集是INTERFERON_ALPHA_BETA_SIGNALING(干扰素α_β信号传导)，其中34/44(77％)基因在容许细胞系中显著下调。该基因集的富集(q＝0.0046)可以在图3的b图中可视化。进行基因表达的逐样品分析以观察我们观察到的基因集富集是否由来自特定肿瘤组织学的细胞系驱动。发现这些基因集表达的缺失在SCLC和神经母细胞瘤细胞系中富集(图3，c图)。为了确定该表达特征是否在体内是可操作的，对来自Pediatric Preclinical Testing Program(PPTP)的人肿瘤异种移植物数据进行了类似的分析，并且发现对SVV的容许性与基线时干扰素信号传导的下调一致(Morton，C.L.，等.Initial testing of the replication competent SenecaValley virus(NTX-010)by the pediatric preclinical testing program.PediatricBlood Cancer 55，295-303(2010)；Neale，G.，等.Molecular characterization of thepediatric preclinical testing panel.Clinical cancer research：an officialjournal of the American Association for Cancer Research 14，4572-4583(2008))。总之，这些结果表明对SVV的稳健容许需要细胞受体ANTXR1的表达以及基线时抗病毒IFN信号传导基因表达的下调。
评估了ANTXR1表达细胞系内的IFN途径活性。假设高度SVV容许细胞具有显著下调的IFN应答途径，因此可能不响应于外源IFN途径激活。测试了外源IFNβ在高度容许的SCLC细胞系H446和H82以及SVV抗性H1618细胞中降低SVV容许性的能力(图3，d图)。每个细胞系的相对容许性与外源IFNβ可限制SVV感染的程度强烈相关。以前的研究表明，通过用组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂如SAHA(伏立诺他)或MS-275预处理细胞，对其他溶瘤病毒的容许性可由于间接IFN途径抑制而增加(Nguyen，T.L.，等.Chemical targeting of the innateantiviral response by histone deacetylase inhibitors renders refractorycancers sensitive to viral oncolysis.Proc Natl Acad Sci U S A 105，14981-14986(2008))。用SAHA或MS-275预处理表达ANTXR1的非容许SCLC细胞系H1618和DMS79，然后用SVV-GFP攻击并随后通过流式细胞术分析(图3，e图-f)。与未处理的细胞相比，在两种细胞系中HDAC处理后观察到GFP+细胞的显著增加。相反，在通过用外源IFNα或IFNβ预处理激活IFN途径和随后的SVV-GFP攻击后，在两种细胞系中具有SVV容许或GFP+细胞的减少。另外，通过用IFNα/β和可以阻断IFN活性的相应IFNα/β单克隆抗体预处理细胞，可以部分恢复SVV容许细胞的减少。这些结果证实，通过IFN应答途径的表达，可以在ANTXR1表达细胞中进一步确定SVV容许性。另外，感染时细胞内这些途径的活性可以改变SVV的容许性，但仅在途径没有显著下调的细胞中。
实施例5：ANTXR1的重表达挽救SVV容许性
为了证实ANTXR1 sgRNA的特异性，我们评估了ANTXR1的外源重表达是否可以挽救ANTXR1 KO细胞中对SVV的容许性。我们用ANTXR1-HA表达质粒和mCherry荧光蛋白表达质粒共转染三个H446 ANTXR1 KO系，并在转染后16小时用SVV-GFP攻击细胞(图4，a图)。与未显示任何GFP+细胞的未转染的ANTXR1 KO细胞相比，用ANTXR1-HA表达质粒转染的ANTXR1 KO细胞始终显示GFP+细胞，表明生产性SVV-GFP感染和SVV容许性的挽救。为了进一步测试容许细胞中ANTXR1表达的重要性，我们用ANTXR1-HA和mCherry表达质粒共转染H446和LX22clANTXR1 KO系，随后用SVV-GFP孵育细胞。通过用流式细胞术分析细胞以及设门以选择转染的细胞(mCherry+)。与亲本mCherry+/GFP+细胞相比，我们观察到ANTXR1 KO H446和LX22cl细胞中mCherry+/GFP+群体的显著降低，其在用ANTXR1-HA表达质粒转染后被挽救(图4，b图)。使用HA标签特异性抗体通过免疫印迹在每个ANTXR1-HA转染的细胞系中证实ANTXR1-HA融合蛋白的表达。ANTXR1 KO细胞系中ANTXR1蛋白的重表达足以挽救SVV容许性。
实施例6：ANTXR1的异位表达足以诱导SVV容许性
确定了ANTXR1蛋白的表达是否足以提高不表达该基因的非容许SCLC细胞系H69和H146的容许性。在用多西环素诱导型ANTXR1-HA表达慢病毒转导后，我们在存在或不存在1μg/mL多西环素的情况下孵育亲本和表达ANTXR1的H69和H146细胞72小时，用SVV-GFP攻击，并通过流式细胞术分析(图4，c图)。如所预期的，在不存在多西环素的情况下，亲本H69和H146细胞和ANTXR1转导的细胞显示小于1.5％的GFP+群体。在多西环素处理后，ANTXR1转导的H69和H146细胞均显示出SVV-GFP感染细胞分别显著增加至7.46±0.17％和18.3±0.20％。通过Western印迹证实多西环素诱导的细胞中ANTXR1-HA蛋白的表达。这些数据证实ANTXR1蛋白的表达足以诱导SVV抗性SCLC细胞系的容许性。
实施例7：ANTXR1与SVV直接相互作用
由于ANTXR1是跨膜蛋白并且是多种容许性SCLC细胞系中SVV感染所必需的，因此确定ANTXR1是否与SVV直接相互作用。将ANTXR1-Fc嵌合体或对照同种型IgG1 Fc蛋白用于共免疫沉淀研究。在用SVV孵育Fc-珠复合物后，洗脱所有结合的蛋白质并使用SVV兔抗血清通过Western印迹分析(图5，a图)。在用SVV孵育的所有连续稀释的ANTXR1-Fc样品中，观察到病毒蛋白质带并且观察到带强度的降低，对应于结合的ANTXR1-Fc蛋白的减少。在用IgG1Fc同种型对照孵育的样品中或未用SVV孵育的样品中未检测到任何SVV蛋白带。在确认直接相互作用后，在存在增加量的氯化钠(NaCl)的情况下重复ANTXR1-Fc嵌合体共免疫沉淀研究以研究在高离子强度下体外相互作用的强度(图5，b图)。随着盐浓度增加至2M NaCl，病毒蛋白带的强度没有显著变化。由于ANTXR1与高亲和力炭疽受体ANTXR2具有高度序列相似性，使用ANTXR2-Fc嵌合蛋白进行共免疫沉淀，使用ANTXR1-Fc蛋白作为阳性对照(Bradley，K.A.，Mogridge，J.，Mourez，M.，Collier，R.J.&Young，J.A.Identification of thecellular receptor for anthrax toxin.Nature 414，225-229(2001))。在用SVV孵育的ANTXR2-Fc样品中未观察到对应于病毒蛋白的任何带，表明不存在ANTXR2的细胞外结构域与SVV之间的相互作用(图5，c图)。仅在ANTXR1-Fc样品中观察到对应于病毒蛋白的带。这些结果表明ANTXR1而非ANTXR2可以以高亲和力和稳定的相互作用直接与SVV相互作用。
此外，研究了ANTXR1细胞外结构域的哪个区域对于与SVV的相互作用是必需的，因此对于ANTXR1 KO细胞中的SVV容许性的挽救是必需的。产生了ANTXR1-HA表达质粒的N末端缺失系列，其缺失ANTXR1蛋白的细胞外结构域序列的增加区域，同时保留信号肽序列。然后测试截短的表达质粒在一个H446 ANTXR1 KO克隆中挽救SVV容许性的能力。与全长ANTXR1蛋白不同，当用SVV-GFP攻击时，所有ANTXR1截短都不能挽救SVV容许性。通过Western印迹确认全长和截短的ANTXR1-HA蛋白表达。这些结果表明在ANTXR1蛋白的最N末端区域中存在对于SVV和ANTXR1相互作用必需的残基。
实施例8：可溶性ANTXR1-Fc嵌合体阻断体外SVV感染
确定SVV和ANTXR1-Fc或ANTXR2-Fc嵌合体之间的相互作用是否可以减弱细胞SVV感染。将SVV-GFP与ANTXR1-Fc、ANTXR2-Fc或IgG1-Fc蛋白一起孵育，然后与亲本H446细胞孵育过夜，随后通过荧光显微术分析(图5，d图)。与SVV-GFP和IgG1-Fc或ANTXR2-Fc蛋白一起孵育的细胞显示高水平的GFP+细胞，表明生产性SVV感染。与SVV-GFP和ANTXR1-Fc蛋白一起孵育的细胞未显示可检测的GFP+细胞，表明这些细胞中实质上缺少SVV-GFP感染。这些结果证明仅外源ANTXR1蛋白而非ANTXR2蛋白能够阻断细胞SVV-GFP感染，并进一步支持ANTXR1是SVV的主要细胞受体。
实施例9：ANTXR1蛋白表达的损失消除了SVV与容许细胞的结合
确定ANTXR1 KO细胞是否损失了与SVV结合的能力。还评估了来自HAP1筛选的另一候选物TEX2在结合SVV中的潜在作用。将亲本、ANTXR1 KO和TEX2KO H446细胞与用荧光团Cy5标记的WT SVV(SVV-Cy5)一起孵育，并通过流式细胞术分析细胞的SVV结合，使用非容许SCLC细胞系DMS 114作为阴性对照(图5，e图)。与用SVV-Cy5孵育的DMS 114细胞(MF＝425)相比，用SVV-Cy5孵育的亲本H446显示高水平的荧光(平均荧光(MF)＝2,373)。TEX2 KOH446细胞显示与亲本H446细胞相似的荧光谱(MF＝2,233)，表明对应于TEX2蛋白表达缺失，SVV结合能力没有损失。相比之下，ANTXR1 KO H446细胞显示出与阴性对照系DMS 114类似的显著减少的荧光谱(MF＝358)。仅在ANTXR1 KO细胞中观察到SVV结合的损失，表明基于co-IP数据不仅ANTXR1与SVV直接结合，并且其是完整细胞中病毒的主要结合决定簇。
实施例10：衣壳-受体复合物的低温-EM
通过低温电子显微术分析SVV复合物与ANTXR1-Fc嵌合蛋白的结合。小RNA病毒具有由三种主要衣壳蛋白VP1、VP2和VP3、以及位于衣壳内部第四种小得多的蛋白质VP4组成的原聚体(protomer)的60个拷贝形成的二十面体衣壳。VP1的拷贝围绕五重轴组装，而VP2和VP3围绕三重轴交替(Tuthill，T.J.，Groppelli，E.，Hogle，J.M.&Rowlands，DJ.Picornaviruses.Current topics in microbiology and immunology 343，43-89(2010))。当过滤到分辨率时(图5，f图)，重建与现有的病毒原子模型(Venkataraman，S.，等.Structure of Seneca Valley Virus-001：an oncolyticpicornavirus representing a new genus.Structure 16，1555-1561(2008))相匹配。此外，图显示了围绕五重轴径向分布的受体亚结构域，其呈冠状几何形状，类似于其他小RNA病毒，如脊髓灰质炎病毒(Strauss，M.，等.Nectin-like interactions betweenpoliovirus and its receptor trigger conformational changes associated withcell entry.Journal of virology 89，4143-4157(2015))、鼻病毒(Kolatkar，PR.，等.Structural studies of two rhinovirus serotypes complexed with fragments oftheir cellular receptor.The EMBO journal 18，6249-6259(1999))或柯萨奇病毒(Organtini，L.J.，Makhov，A.M.，Conway，J.F.，Hafenstein，S.&Carson，S.D.Kinetic andstructural analysis of coxsackievirus B3 receptor interactions and formationof the A-particle.Journal of virology 88，5755-5765(2014))。该图显示受体结合准垂直于靠近原聚体中心的衣壳，与所有三种主要衣壳蛋白接触，并以VP2的“抽吸(puff)”环为中心。
已经出于说明和描述的目的给出了本申请的一些特定实施方案的前述描述。它们并非旨在穷举或将应用和使用方法限制于所公开的精确形式。根据本文的教导，所述实施方案的各种修改和更改对于本领域技术人员而言将是明显的。因此，应当理解，本领域技术人员能够设计出许多系统、布置和过程，这些系统、布置和过程虽然未在本文中明确示出或描述，但体现了本公开内容的原理并因此可以在本公开内容的精神和范围内。另外，上面提到的所有出版物和参考文献都可以通过引用整体并入本文。应当理解，虽然这些词和/或可以彼此同义的其他词可以在本文中同义使用，但是可以存在这样的词可以不同义地使用的情况。此外，就本领域普通技术人员的知识尚未通过上文引用明确并入的程度而言，其可以明确地以其整体并入本文。
序列表
<110> MEMORIAL SLOAN-KETTERING CANCER CENTER
<120> 塞尼卡谷病毒（SVV）细胞受体靶向的肿瘤治疗
<130> P300125.WO.01 (263742)
<150> US 62/262,242
<151> 2015年12月2日
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: lentiCRISPR v2扩增F
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ctttagtttg tatgtctgtt gctattatgt ctactattct ttcc 44
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: lentiCRISPR v2扩增R
<400> 2
aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc g 41
<210> 3
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: HiSeq F#1
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttt 60
cttgtggaaa ggacgaaaca ccg 83
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: HiSeq F#2
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctat 60
tcttgtggaa aggacgaaac accg 84
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: HiSeq F#3
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctga 60
ttcttgtgga aaggacgaaa caccg 85
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<213> 人工序列
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctcg 60
attcttgtgg aaaggacgaa acaccg 86
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caagcagaag acggcatacg agatcgtgat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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caagcagaag acggcatacg agatacatcg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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caagcagaag acggcatacg agatgcctaa gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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caagcagaag acggcatacg agattggtca gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: HiSeq R#10
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caagcagaag acggcatacg agataagcta gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成寡核苷酸: HiSeq R#12
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caagcagaag acggcatacg agattacaag gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atcttctact attctttccc ctgcactgt 89
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: HiSeq seq引物
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸: lentiGuide F
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aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc g 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: lentiGuide R
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ctttagtttg tatgtctgtt gctattatgt ctactattct ttcc 44
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<223> 合成寡核苷酸: ANTXR1.1 F
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caccgggaga cacttacatg catga 25
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: ANTXR1.2 R
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<223> 合成寡核苷酸: ANTXR1.3 F
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<220>
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<223> 合成寡核苷酸: G3BP1 F
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caccgcgcac tctttgatcc cgctg 25
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aaaccagcgg gatcaaagag tgcgc 25
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: KCNJ1 F
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caccgcgtgt caaacacatt ccgac 25
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: KCNJ1 R
<400> 31
aaacgtcgga atgtgtttga cacgc 25
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 32
caccggagtg aatccctgcg catcc 25
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<212> DNA
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<220>
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: NR2C2 F
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caccgaactg acagccccat agtga 25
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: NR2C2 R
<400> 35
aaactcacta tggggctgtc agttc 25
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<220>
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caccgacagc cccgtgaagc gtccg 25
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: NTHL1 R
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸: PLXNB2 F
<400> 38
caccgctgcg gctggtgcgt cgtcg 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PLXNB2 R
<400> 39
aaaccgacga cgcaccagcc gcagc 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PPBP F
<400> 40
caccgcaact tacatcactt cgact 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PPBP R
<400> 41
aaacagtcga agtgatgtaa gttgc 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: SCAF8 F
<400> 42
caccgtagca taccttgtca tcccc 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: SCAF8 R
<400> 43
aaacggggat gacaaggtat gctac 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: TACO1 F
<400> 44
caccggcgac acacctctaa gatat 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: TACO1 R
<400> 45
aaacatatct tagaggtgtg tcgcc 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: TEX2.1 F
<400> 46
caccgtaccc catttgtatc gagct 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: TEX2.1 R
<400> 47
aaacagctcg atacaaatgg ggtac 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: TEX2.2 F
<400> 48
caccgctgaa tgtgtcaaag tcgca 25
<210> 49
<211> 25
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<213> 人工序列
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Claims (14)
1.选择用塞尼卡谷病毒(SVV)进行治疗的癌症患者的方法，其包括：
确定从所述癌症患者获得的癌组织中的ANTXR1的表达水平；以及
如果在所述癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达，则将所述癌症患者指定为用SVV进行治疗的候选者。
2.权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者是患有小细胞肺癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤或小儿神经内分泌实体瘤的患者。
3.权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者是患有小细胞肺癌的患者。
4.权利要求1或2所述的方法，其中在转录水平上确定所述癌组织中的ANTXR1的表达水平。
5.权利要求1或2所述的方法，其中在翻译水平上确定所述癌组织中的ANTXR1的表达水平。
6.权利要求1、2、4或5所述的方法，其还包括如下步骤：确定所述癌组织中先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的表达水平，以及如果(1)在所述癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达和(2)在所述癌组织中检测到所述先天免疫应答途径中的所述一种或更多种生物标志物的表达水平降低，则指定所述癌症患者用SVV进行治疗。
7.权利要求6所述的方法，其中所述先天免疫应答途径是α-干扰素或β-干扰素途径。
8.用于治疗癌症的方法，其包括：
确定来自患者的癌组织中的ANTXR1的表达水平，以及
如果在所述癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达，则向所述患者施用有效量的SVV。
9.权利要求8所述的方法，其还包括：
确定所述癌组织中的先天免疫应答途径的一种或更多种生物标志物的表达水平；以及
如果(1)在所述癌组织中检测到正常水平或升高水平的ANTXR1表达和(2)所述癌组织中所述先天免疫应答途径中的一种或更多种生物标志物的水平降低，则向所述患者施用有效量的SVV。
10.权利要求8或9所述的方法，其中所述SVV与另一种治疗剂组合施用。
11.权利要求10所述的方法，其中治疗剂选自：检查点抑制剂、细胞因子、生长因子、光敏剂、放射性核素、毒素、siRNA分子、信号传导调节剂、抗癌抗生素、抗癌抗体、血管生成抑制剂、化学治疗化合物、抗转移化合物、及其任意组合。
12.权利要求11所述的方法，其中治疗剂是检查点抑制剂。
13.权利要求8、9、10或11所述的方法，其中所述SVV通过直接注射到所述癌组织中来施用。
14.用于选择用SVV进行治疗的癌症患者的试剂盒，其包含：
用于检测ANTXR1的表达水平的试剂；和
用于检测γ-干扰素信号转导途径的一种或更多种生物标志物的表达水平的试剂。
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