BR112020020622A2 - Bacteriófago indicador para seleção e monitoramento para eficácia de terapêuticos e métodos para o uso do mesmo - Google Patents

Bacteriófago indicador para seleção e monitoramento para eficácia de terapêuticos e métodos para o uso do mesmo Download PDF

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Abstract

bacteriófago indicador para seleção e monitoramento para eficácia de terapêuticos e métodos para o uso do mesmo. são aqui divulgados métodos e sistemas para a detecção de microrganismos em uma amostra e a utilização dos referidos métodos para terapias de seleção e monitoramento. a especificidade do bacteriófago indicador, tal como o bacteriófago específico para staphylococcus, permite a detecção de um microrganismo específico, tal como staphylococcus e o sinal indicador pode ser amplificado para otimizar a sensibilidade do ensaio.

Description

BACTERIÓFAGO INDICADOR PARA SELEÇÃO E MONITORAMENTO PARA EFICÁCIA DE TERAPÊUTICOS E MÉTODOS PARA O USO DO MESMO REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO
[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido provisório norte-americano no. US 62/661.739, depositado em 24 de abril de 2018. As divulgações dos pedidos norte-americanos nos. US 13/773.339, 14/625.481, 15/263.619, e 15/409.258 e pedido provisório norte-americano no. US 62/661.739 são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] Esta invenção se refere a composições, métodos, sistemas, e kits para a detecção de microrganismos utilizando agente infecciosos.
ANTECEDENTES
[0003] Existe um forte interesse em melhorar a velocidade e sensibilidade para a detecção de bactérias, vírus e outros microrganismos em amostras biológicas, alimentares, de água e clínicas. Patógenos microbianos podem causar morbidade substancial entre humanos e animais domésticos, bem como imensa perda econômica. Ainda, a detecção de microrganismos é uma alta prioridade para a Administração de Alimentos e Fármacos (em inglês, Food and Drug Administration - FDA) e os Centros de Controle de Doenças (em inglês Centers for Disease Control - CDC) devido a surtos de doenças fatais ou com risco de vida causados pela ingestão de alimentos contaminados com determinados microrganismos, por exemplo, Staphylococcus spp.
[0004] Os testes microbiológicos tradicionais para a detecção de bactérias dependem de culturas de enriquecimento não seletivas e seletivas, seguidos de plaqueamento em meios seletivos e testes adicionais para confirmar colônias suspeitas. Os referidos procedimentos podem exigir diversos dias. Uma variedade de métodos rápidos tem sido investigada e introduzida na prática para reduzir a exigência de tempo. No entanto, estes métodos apresentam inconvenientes. Por exemplo, as técnicas que envolvem ensaios imunológicos diretos ou sondas genéticas geralmente requerem uma etapa de enriquecimento durante a noite a fim de obter a sensibilidade adequada. Os testes de reação em cadeia da polimerase (PCR) também incluem uma etapa de amplificação e, portanto, são capazes tanto de sensibilidade e seletividade muito altas; entretanto, o tamanho de amostra que pode ser submetido economicamente a testes de PCR é limitado. Com suspensões bacterianas diluídas, a maioria das sub-amostras pequenas estará livre de células e, portanto, etapas de purificação e / ou enriquecimento demorado ainda são necessárias.
[0005] O tempo necessário para o enriquecimento biológico tradicional é ditado pela taxa de crescimento da população bacteriana alvo da amostra, pelo efeito da matriz da amostra, e pela sensibilidade requerida. Na prática, a maioria dos métodos de alta sensibilidade emprega uma incubação durante a noite e leva cerca de 24 horas no total. Devido ao tempo requerido para o cultivo, estes métodos podem levar até três dias, dependendo do organismo a ser identificado e da fonte da amostra. Este tempo de atraso é geralmente inadequado, uma vez que o alimento, água (ou outro produto) contaminado pode já ter feito seu caminho em direção a rebanhos ou humanos. Em adição, aumentos nas bactérias resistentes a antibióticos e considerações biodefensivas torna uma prioridade crítica a identificação rápida de patógenos bacterianos em amostras de água, alimentares e clínicas em todo o mundo.
[0006] Sendo assim, existe uma necessidade de detecção e identificação mais rápida, simples e sensível de microrganismos, tais como bactérias e outros microrganismos potencialmente patogênicos.
SUMÁRIO
[0007] Modalidades da invenção compreendem composições, métodos, sistemas, e kits para a detecção de microrganismos. A invenção pode ser incorporada em uma variedade de formas.
[0008] Em alguns aspectos, a invenção compreende um bacteriófago recombinante compreendendo um gene indicador inserido em uma região de gene tardia de um genoma do bacteriófago. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é um genoma de bacteriófago específico para Staphylococcus geneticamente modificado. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é um genoma de bacteriófago específico para Staphylococcus aureus geneticamente modificado. Em modalidades adicionais, o Staphylococcus aureus é S. aureus resistente à meticilina (MRSA). Por exemplo, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é um genoma de bacteriófago geneticamente modificado. Em algumas modalidades, o bacteriófago utilizado para preparar o bacteriófago recombinante infecta especificamente Staphylococcus. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir Staphylococcus na presença de mais do que 100 outros tipos de bactérias.
[0009] Em algumas modalidades do bacteriófago indicador recombinante, o gene indicador pode ser com códon otimizado e pode codificar um produto de proteína solúvel que gera um sinal intrínseco ou uma enzima solúvel que gera sinal após a reação com o substrato. Alguns bacteriófagos recombinantes ainda compreendem uma região não traduzida a montante de um gene indicador com códon otimizado, em que a região não traduzida inclui um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada ribossomal. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase. O gene luciferase pode ser um gene de ocorrência natural, tal como Luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, ou luciferase de Renilla, ou ele pode ser um gene geneticamente projetado tal como NanoLuc.
[0010] São também aqui divulgados métodos para a preparação de bacteriófago indicador recombinante. Algumas modalidades incluem selecionar um bacteriófago do tipo selvagem o qual infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga compreendendo um gene indicador; transformar o plasmídeo / vetor de recombinação homóloga em bactérias patogênicas alvo; infectar as bactérias patogênicas alvo transformadas com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, o bacteriófago do tipo selvagem selecionado é um bacteriófago específico para Staphylococcus ou bacteriófago específico para
Staphylococcus aureus. Em algumas modalidades, o bacteriófago do tipo selvagem selecionado é um fago T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, ou outro fago de ocorrência natural apresentando um genoma com pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, ou 70 % de homologia para os fagos divulgados acima.
[0011] Em algumas modalidades, preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga inclui determinar a sequência de nucleotídeos natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para a recombinação homóloga a jusante do principal gene da proteína do capsídeo, em que a sequência compreende um gene indicador com códon otimizado; e incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga em um plasmídeo / vetor. A etapa de projetar uma sequência pode incluir inserir uma região não traduzida, incluindo um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada ribossomal, a montante do gene indicador com códon otimizado. Assim, em alguns métodos, o plasmídeo de recombinação homóloga compreende uma região não traduzida incluindo um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada ribossomal a montante do gene indicador com códon otimizado.
[0012] Algumas modalidades da invenção são composições as quais incluem um bacteriófago indicador recombinante tal como aqui descrito. Por exemplo, as composições podem incluir um ou mais agentes infecciosos do tipo selvagem ou geneticamente modificados (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes fagos indicadores que podem codificar e expressar proteínas indicadoras iguais ou diferentes.
[0013] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de incubar a amostra com um bacteriófago recombinante o qual infecta o microrganismo de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do bacteriófago de modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel, e detecção do produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que o microrganismo de interesse está presente na amostra.
[0014] Em algumas modalidades dos métodos para a preparação do bacteriófago indicador recombinante, o bacteriófago do tipo selvagem é bacteriófago específico para Staphylococcus e a bactéria patogênica alvo é Staphylococcus. Em algumas modalidades, isolar um clone particular do bacteriófago recombinante compreende um ensaio de diluição limitante para isolar um clone o qual demonstra a expressão do gene indicador.
[0015] Outros aspectos da invenção incluem métodos para a detecção de bactérias, tais como Staphylococcus em uma amostra, incluindo as etapas de incubar a amostra com um bacteriófago recombinante derivado do bacteriófago específico para Staphylococcus e detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo bacteriófago recombinante, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que o Staphylococcus está presente na amostra. Em algumas modalidades, a invenção inclui métodos para a detecção de S. aureus utilizando um bacteriófago recombinante derivado do S. aureus. A amostra pode ser uma amostra alimentar, ambiental, de água, comercial ou clínica.
[0016] Em algumas modalidades dos métodos para a detecção das bactérias, a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 18 horas ou menos, 17 horas ou menos, 16 horas ou menos, 15 horas ou menos, 14 horas ou menos, 13 horas ou menos, 12 horas ou menos, 11 horas ou menos, 10 horas ou menos, ou 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos. Em algumas modalidades, o tempo total para os resultados é menos do que 20 horas, menos do que 19 horas, menos do que 18 horas, menos do que 17 horas, menos do que 16 horas, menos do que 15 horas, menos do que 14 horas, menos do que 13 horas, menos do que 12 horas, menos do que 11 horas, menos do que 10 horas, menos do que 9 horas, menos do que 8 horas, menos do que 7 horas, ou menos do que 6 horas. Em algumas modalidades, a proporção do sinal para o fundo gerado pela detecção do indicador é pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5. Em algumas modalidades, o método detecta tão pouco quanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 da bactéria específica em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.
[0017] Modalidades adicionais incluem sistemas e kits para a detecção de Staphylococcus, em que os sistemas ou kits incluem um bacteriófago recombinante derivado do bacteriófago específico para Staphylococcus. Em algumas modalidades, os sistemas e kits podem ser utilizados para detectar S. aureus, em que os sistemas ou kits incluem um bacteriófago recombinante derivado do S. aureus. Em algumas modalidades, os sistemas e kits podem ser utilizados para detectar MRSA. Algumas modalidades ainda incluem um substrato para a reação com um indicador para detectar o produto de proteína solúvel expresso pelo bacteriófago recombinante. Estes sistemas ou kits podem incluir características descritas para o bacteriófago, composições, e métodos da invenção. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende mídia legível por computador não transitória para uso com os métodos ou sistemas de acordo com a invenção.
[0018] Em outro aspecto, a invenção pode compreender: um método para a seleção de um tratamento para um indivíduo compreendendo: (i) obter uma amostra biológica a partir do indivíduo; (ii) detectar um microrganismo específico ou categoria de microrganismos na amostra biológica utilizando um fago indicador; e (iii) selecionar um tratamento baseado na identidade de um microrganismo específico detectado na amostra biológica.
[0019] Em outro aspecto, a invenção pode compreender, um método para o monitoramento da eficácia de um tratamento para um indivíduo apresentando uma condição médica patogênica compreendendo: (i) obter uma amostra biológica a partir do indivíduo; (ii) detectar um microrganismo específico ou categoria de microrganismos na amostra biológica utilizando um fago indicador; (iii) iniciar um tratamento para o indivíduo; (iv) obter uma segunda amostra biológica do mesmo tipo que a primeira amostra biológica a partir do indivíduo; (v) detectar o microrganismo específico ou categoria de microrganismos na segunda amostra biológica utilizando o fago indicador; e (vi) determinar uma diminuição, aumento ou constância no nível do microrganismo específico ou categoria de microrganismos no indivíduo com base nas quantidades detectadas na primeira e na segunda amostras biológicas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0020] A presente invenção pode ser melhor entendida por referência às figuras não limitativas a seguir.
[0021] A Figura 1 mostra um constructo de fago indicador de acordo com uma modalidade da invenção que ilustra a inserção de um constructo genético compreendendo gene luciferase de vagalume e um promotor tardio T7 inserido em na região tardia (classe III) de um bacteriófago. É também mostrada uma sequência compreendendo códons de parada em todos os três quadros de leitura para evitar a leitura e uma região não traduzida (UTR).
[0022] A Figura 2 mostra o genoma do bacteriófago SEA1, um miovírus (relacionado ao bacteriófago T4) o qual foi obtido a partir do laboratório de Francisco Diez-Gonzalez e compartilha ~ 95 % de homologia com o fago S16 do miovírus Salmonella. O gene 57A da chaperona para a formação de fibras longas da cauda está na periferia da região de gene tardia, consistindo de genes estruturais, os quais codificam para proteínas de vírion. Uma vez que estas proteínas de vírion são expressas em um nível muito alto, espera-se que quaisquer genes inseridos nesta região apresentem níveis de expressão similares, contanto que promotores de genes tardios e / ou outros elementos de controle similares sejam utilizados.
[0023] A Figura 3 mostra dois constructos de plasmídeos de recombinação homóloga que carregam os genes da luciferase para 2 diferentes fagos com aproximadamente 500 bp de sequência de fago correspondente a montante e a jusante do sítio de inserção para promover a recombinação homóloga. A luciferase NANOLUC® é inserida em uma estrutura de plasmídeo pBAV1k-T5-GFP com uma região não traduzida a montante contendo um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada ribossomal. O plasmídeo de recombinação do fago de S. aureus foi construído para inserir o NANOLUC® dentro da região de gene tardia, porém a uma distância da proteína do capsídeo maior (MCP) devido a problemas de estabilidade.
[0024] A Figura 4 mostra o isolamento do fago recombinante a partir das modificações do bacteriófago de S. aureus utilizando os constructos de plasmídeo tais como aqueles mostrados na Figura 3 utilizando uma série de etapas sequenciais de infecção e diluição para identificar o fago recombinante que expressa um gene indicador.
[0025] A Figura 5 mostra o uso de fago indicador que codifica uma luciferase solúvel para detectar células bacterianas por meio da detecção de luciferase gerada a partir da replicação do fago da progênie durante a infecção das células bacterianas, de acordo com uma modalidade da invenção.
[0026] A Figura 6 mostra um ensaio de placa filtrante para a detecção de bactérias de interesse utilizando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção em que a bactéria e o fago recombinante são incubados em placas filtrantes e, após a geração do bacteriófago da progênie, a proteína indicadora é detectada diretamente sem a remoção do meio de incubação.
[0027] A Figura 7 mostra um “ensaio sem concentração” para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção.
[0028] A Figura 8 mostra um ensaio de fago imunológico híbrido (HIP) para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção em que os anticorpos para o microrganismo de interesse são utilizados para capturar o microrganismo na superfície do ensaio bem antes da incubação com um agente infeccioso recombinante apresentando um gene indicador.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0029] São aqui divulgadas composições, métodos e sistemas os quais demonstram sensibilidade surpreendente para a detecção de um microrganismo de interesse em amostras teste (por exemplo, amostras biológicas, alimentares, de água e clínicas). A detecção pode ser alcançada em um período de tempo mais curto do que se pensava ser previamente possível utilizando agentes infecciosos geneticamente modificados em ensaios realizados sem cultura para enriquecimento, ou em algumas modalidades com tempos de incubação mínimos durantes os quais os microrganismos poderiam potencialmente multiplicar-se. É também surpreendente o sucesso do uso de uma multiplicidade de infecção potencialmente alta (MOI), ou altas concentrações de unidades formadoras de colônia (UFC), pela incubação com uma amostra teste. As referidas altas concentrações de fago (UFC / mL) foram previamente supostamente prejudiciais em ensaios de detecção de bactérias, uma vez que eram considerados como causadores de “lise de fora”. No entanto, uma alta concentração de fago pode facilitar a localização, ligação e infecção de um baixo número de células-alvo.
[0030] As composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender agente infecciosos para uso na detecção dos referidos microrganismos. Em determinadas modalidades, a invenção pode compreender uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do bacteriófago. Em determinadas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de uma bactéria hospedeiro resulta na produção de um produto de proteína indicadora solúvel. Em determinadas modalidades, o gene indicador pode ser inserido em uma região de gene tardio (isto é, classe III) do bacteriófago. O bacteriófago pode ser derivado do T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, ou bacteriófago específico para Staphylococcus, ou outro bacteriófago do tipo selvagem ou projetado.
[0031] Em alguns aspectos, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse. O método pode utilizar um agente infeccioso para a detecção do microrganismo de interesse. Por exemplo, em determinadas modalidades, o microrganismo de interesse é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago. Então, em determinadas modalidades, o método pode compreender a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra ao incubar a amostra com um bacteriófago recombinante o qual infecta a bactéria de interesse. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador. O gene indicador pode, em determinadas modalidades, ser inserido em uma região de gene tardia do bacteriófago de modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta na produção de um produto de proteína indicadora. O método pode compreender a detecção do produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra. Em algumas modalidades, a proteína indicadora é solúvel.
[0032] Em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema. O sistema pode conter pelo menos alguma das composições da invenção. Ainda, o sistema pode compreender pelo menos algum dos componentes para a realização do método. Em determinadas modalidades, o sistema é formulado como um kit. Então, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, compreendendo: um componente para a incubação da amostra com um agente infeccioso específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; e um componente para a detecção da porção indicadora. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende software para uso com os métodos ou sistemas.
[0033] Então, algumas modalidades da presente invenção resolvem uma necessidade pelo uso de métodos baseados em bacteriófago para a amplificação de um sinal detectável que indica a presença de bactérias. Em determinadas modalidades, tão pouco quanto uma única bactéria é detectada. Os princípios aqui aplicados podem ser aplicados à detecção de uma variedade de microrganismos. Devido aos numerosos sítios de ligação para um agente infeccioso na superfície de um microrganismo, a capacidade de produzir cem ou mais progênies do agente durante a infecção, e o potencial para a expressão de alto nível de uma porção indicadora codificada, o agente infeccioso ou uma porção indicadora pode ser mais prontamente detectável do que o microrganismo por si só. Neste sentido, as modalidades da presente invenção podem alcançar uma tremenda amplificação de sinal até mesmo de uma única célula infectada.
[0034] Aspectos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos agentes de ligação que podem se ligar a microrganismos particulares, tais como o componente de ligação de agentes infecciosos, como um meio de detectar e / ou quantificar o microrganismo específico em uma amostra. Em algumas modalidades, a presente invenção utiliza a alta especificidade dos agentes infecciosos tais como bacteriófagos.
[0035] Em algumas modalidades, a detecção é alcançada através de uma porção indicadora associada com o agente de ligação específico para o microrganismo de interesse. Por exemplo, um agente infeccioso pode compreender uma porção indicadora, tal como um gene que codifica um indicador solúvel. Em algumas modalidades, o indicador pode ser codificado pelo agente infeccioso, tal como um bacteriófago, e o bacteriófago é designado um fago indicador.
[0036] Algumas modalidades da invenção divulgadas e descritas aqui utilizam a descoberta de que um único microrganismo é capaz de se ligar a agentes de reconhecimento específicos, tais como fago. Após a infecção e replicação do fago, o fago da progênie pode ser detectado por meio de uma porção indicadora expressa durante a replicação do fago. Este princípio permite a amplificação do sinal indicador a partir de uma ou poucas células com base no reconhecimento específico dos receptores de superfície do microrganismo. Por exemplo, ao expor até mesmo uma única célula de uma bactéria a uma pluralidade de fagos, a partir daí permitindo a amplificação do fago e expressão de alto nível de um produto do gene indicador codificado durante a replicação, o sinal indicador é amplificado de tal modo que a única bactéria é detectável.
[0037] As modalidades dos métodos e sistemas da invenção podem ser aplicadas à detecção e quantificação de uma variedade de microrganismos (por exemplo, bactérias, fungos, leveduras) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, porém não limitada à detecção de patógenos de amostras alimentares, de água, clínicas e comerciais. Em algumas modalidades, as amostras clínicas podem ser analisadas para a presença de microrganismos. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade e especificidade de detecção rapidamente e sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional (por exemplo, cultivo para enriquecimento), o qual é um aspecto surpreendente uma vez que todos os métodos disponíveis requerem o cultivo. Em algumas modalidades, a detecção é possível dentro de um único ciclo de replicação do bacteriófago, o que é inesperado. Definições
[0038] A menos se aqui definido de outra forma, termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção devem apresentar os significados os quais são comumente entendidos por um técnico no assunto. Além disso, a menos se requerido pelo contexto de outra forma, os termos no singular deverão incluir pluralidades e os termos no plural deverão incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química das proteínas e ácidos nucleicos e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Os métodos e técnicas conhecidos são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e tal como descrito em diversas referências gerais e mais específicas as quais são discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, tal como comumente realizado na técnica ou tal como aqui descrito. As nomenclaturas utilizadas em conexão com os procedimentos de laboratório e técnicas aqui descritas são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados na técnica.
[0039] Os termos a seguir, a menos se aqui indicado de outra forma, devem ser entendidos por apresentar os seguintes significados:
[0040] Tal como aqui utilizados, os termos “um”, “uma” e “o / a” podem se referir a um ou mais, a menos se especificamente observado o contrário.
[0041] O uso do termo “ou” é utilizado para significar “e / ou” a menos se explicitamente indicado para se referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação apoie uma definição que se refere apenas às alternativas e “e / ou”. Tal como aqui utilizados, “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[0042] Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é utilizado para indicar que um valor inclui a variação inerente do erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre as amostras.
[0043] O termo “suporte sólido” ou “suporte” significa uma estrutura que fornece um substrato e / ou superfície na qual biomoléculas podem ser ligadas. Por exemplo, um suporte sólido pode ser um poço de ensaio (isto é, tal como uma placa de micro titulação ou placa de múltiplos poços), ou o suporte sólido pode ser uma localização em um filtro, uma matriz, ou um suporte móvel, tal como um grânulo ou uma membrana (por exemplo, uma placa filtrante ou faixa de fluxo lateral).
[0044] O termo “agente de ligação” se refere a uma molécula que pode se ligar especificamente e seletivamente a uma segunda molécula de interesse (isto é, diferente). A interação pode ser não covalente, por exemplo, como um resultado de ligação de hidrogênio, interações de van der
Waals ou interações eletrostáticas ou hidrofóbicas, ou elas podem ser covalentes. O termo “agente de ligação solúvel” se refere a um agente de ligação que não está associado com (isto é, covalentemente ou não covalentemente ligado) a um suporte sólido.
[0045] Tal como aqui utilizado, um “analito” se refere a uma molécula, composto ou célula que está sendo medido. O analito de interesse pode, em determinadas modalidades, interagir com um agente de ligação. Tal como aqui descrito, o termo “analito” pode se referir a uma proteína ou peptídeo de interesse. Um analito pode ser um agonista, um antagonista ou um modulador. Ou um analito pode não apresentar um efeito biológico. Os analitos podem incluir pequenas moléculas, açúcares, oligossacarídeos, lipídeos, peptídeos, peptídeo miméticos, compostos orgânicos e similares.
[0046] O termo “porção detectável” ou “biomolécula detectável” ou “repórter” ou “indicador” ou “porção indicadora” se refere a uma molécula a qual pode ser medida em um ensaio quantitativo. Por exemplo, uma porção indicadora pode compreender uma enzima a qual pode ser usada para converter um substrato a um produto que pode ser medido. Uma porção indicadora pode ser uma enzima que catalisa uma reação que gera emissões bioluminescentes (por exemplo, luciferase). Ou, uma porção indicadora pode ser um radioisótopo que pode ser quantificado. Ou, outras moléculas detectáveis podem ser utilizadas.
[0047] Tal como aqui utilizados, “bacteriófago” ou “fago” inclui um ou mais de uma pluralidade de vírus bacterianos. Nesta divulgação, os termos “bacteriófago” e
“fago” incluem vírus tais como mico bacteriófago (tal como para TB e paraTB), micófago (tal como para fungos), fago de micoplasma e qualquer outro termo que se refere a um vírus que pode invadir bactérias vivas, fungos, micoplasma, protozoários, leveduras e outros organismos vivos microscópicos e usos dos mesmos para se replicar. Aqui, “microscópico” significa que a maior dimensão é um milímetro ou menos. Os bacteriófagos são vírus os quais evoluíram na natureza para utilizar bactérias como um meio de se replicarem. Um fago faz isso ao se ligar a uma bactéria e injetar seu DNA (ou RNA) nesta bactéria, e induzi-la a replicar o fago centenas ou até mesmo milhares de vezes. Isto é referido como amplificação do fago.
[0048] Tal como aqui utilizado, “região de gene tardia” se refere a uma região de um genoma viral que é transcrita tardiamente no ciclo de vida viral. A região de gene tardia tipicamente inclui os genes mais abundantemente expressos (por exemplo, proteínas estruturais montadas na partícula do bacteriófago). Os genes tardios são sinônimos a genes da classe III e incluem genes com as funções de estrutura e montagem. Por exemplo, os genes tardios (sinônimos a classe III) são transcritos no T7 do fago, por exemplo, de 8 minutos após a infecção até a lise, classe I (por exemplo, RNA polimerase) é precocemente de 4 - 8 minutos e classe II de 6 - 15 minutos, então há sobreposição no tempo de II e III. Um promotor tardio é um que está naturalmente localizado e ativo na referida região de gene tardia.
[0049] Tal como aqui utilizado, “cultivo para enriquecimento” se refere ao cultivo tradicional, tal como incubação em meio favorável à propagação de microrganismos,
e não deve ser confundido com outros usos possíveis da palavra “enriquecimento”, tal como enriquecimento por remoção do componente líquido de uma amostra para concentrar o microrganismo nela contido, ou outras formas de enriquecimento as quais não incluem a facilitação tradicional da propagação do microrganismo. O cultivo para enriquecimento por períodos de tempo muito curtos pode ser empregado em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, porém não é necessário e é por um período de tempo muito mais curto do que o cultivo tradicional para enriquecimento, se este for usado de alguma forma.
[0050] Tal como aqui utilizado, “recombinante” se refere a modificações genéticas (isto é, ácido nucleico) tal como normalmente realizadas em um laboratório para reunir material genético que não seria encontrado de outra forma. Este termo é aqui utilizado de forma intercambiável com o termo “modificado”.
[0051] Tal como aqui utilizado, se refere a unidades de luz relativa tal como medida por um luminômetro (por exemplo, GLOMAX® 96) ou instrumento similar que detecta a luz. Por exemplo, a detecção da reação entre luciferase e o substrato adequado (por exemplo, NANOLUC® com NANO-GLO®) é com frequência reportada em RLU detectadas.
[0052] Tal como aqui utilizado “tempo para resultados” se refere à quantidade total de tempo a partir do começo da incubação da amostra para gerar resultados. O tempo para resultados não inclui qualquer tempo de teste confirmatório. A coleta de dados pode ser realizada em qualquer tempo após um resultado ter sido gerado. Amostras
[0053] Cada uma das modalidades dos métodos e sistemas da invenção pode permitir a rápida detecção e quantificação de micróbios em uma amostra. Por exemplo, métodos de acordo com a presente invenção podem ser realizados em período de tempo encurtado com resultados superiores.
[0054] Os micróbios detectados pelos métodos e sistemas da presente invenção incluem patógenos de interesse natural, comercial, médico ou veterinário. Os referidos patógenos incluem bactérias Gram-negativas, bactérias Gram- positivas e micoplasmas. Qualquer micróbio para o qual um agente infeccioso específico para o micróbio em particular tenha sido identificado pode ser detectado pelos métodos da presente invenção. Os versados na técnica apreciarão que não há limite para a aplicação dos presentes métodos além da disponibilidade dos pares de agentes infecciosos específicos / micróbios necessários.
[0055] Células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas, células bacterianas as quais são patógenos suportados em alimentos ou água. As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas, todas as espécies de Salmonella, todas as cepas de Escherichia coli, Cronobacter, Staphylococcus, todas as espécies de Listeria, incluindo, porém, não limitadas a L. monocytogenes, e todas as espécies de Campylobacter. As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas, células bacterianas as quais são patógenos de significância médica ou veterinária. Os referidos patógenos incluem, porém não estão limitados, Bacillus spp.,
Bordetella pertussis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Clostridium perfringens, Enterobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, e Streptococcus spp. Em algumas modalidades, as células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem bactérias resistentes a antibióticos (por exemplo, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)).
[0056] A amostra pode ser uma amostra ambiental ou alimentar ou de água. Algumas modalidades podem incluir amostras médicas ou veterinárias. As amostras podem ser líquidas, sólidas ou semissólidas. As amostras podem ser swabs de superfícies sólidas. As amostras podem incluir materiais ambientais, tais como amostras de água, ou os filtros de amostras de ar, ou amostras de aerossol de coletores ciclone. As amostras podem ser de vegetais, carne, peixe, aves, manteiga de amendoim, alimentos processados, fórmula infantil em pó, leite em pó, chás, amidos, ovos, leite, queijo, ou outros produtos de laticínios. Amostras médicas e veterinárias incluem, porém não estão limitadas a amostras de sangue, escarro, fluido cérebro-espinhal e fecal e diferentes tipos de swabs.
[0057] Em algumas modalidades, as amostras podem ser utilizadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação, concentração ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas, incluindo, porém, não limitadas a leite e sucos, podem ser testadas diretamente. As amostras podem ser diluídas ou suspendidas em solução, as quais podem incluir, porém, não limitadas a uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriano. Uma amostra que é sólida ou semissólida pode ser suspendida em um líquido ao picar, misturar ou macerar o sólido no líquido. Uma amostra deve ser mantida dentro de uma faixa de pH que promova a ligação do bacteriófago à célula bacteriana hospedeira. Uma amostra também deve conter as concentrações adequadas de cátions bivalentes e monovalentes, incluindo, porém, não limitado a Na+, Mg2+ e Ca2+. Preferencialmente, uma amostra é mantida em uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula de patógeno contida dentro da amostra.
[0058] Preferencialmente ao longo dos ensaios de detecção, uma amostra é mantida a uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula patogênica presente na amostra. Durante as etapas nas quais os bacteriófagos se ligam às células bacterianas, é preferível manter uma amostra a uma temperatura que facilite a ligação do bacteriófago. Durante as etapas nas quais os bacteriófagos estão se replicando dentro de uma célula bacteriana infectada ou lisando a referida célula infectada, é preferível manter a amostra a uma temperatura que promova a replicação do bacteriófago e a lise do hospedeiro. As referidas temperaturas são pelo menos cerca de 25 graus Celsius (C), mais preferencialmente não superiores a cerca de 45 graus C, mais preferencialmente cerca de 37 graus C. Também é preferido que as amostras sejam submetidas a mistura ou agitação suave durante a ligação, replicação e lise celular do bacteriófago.
[0059] Os ensaios podem incluir diversas amostras controle adequadas. Por exemplo, amostras controle contendo nenhum bacteriófago ou amostras controle contendo bacteriófagos sem bactérias podem ser avaliados como controles para os níveis do sinal de fundo. Bacteriófago indicador
[0060] Tal como aqui descrito em maiores detalhes, as composições, métodos, sistemas e kits da invenção podem compreender agentes infecciosos para uso na detecção de microrganismos patogênicos. Em determinadas modalidades, a invenção compreende um bacteriófago indicador recombinante, em que o genoma do bacteriófago é geneticamente modificado para incluir um gene indicador ou repórter. Em algumas modalidades, a invenção pode incluir uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador incorporado dentro do genoma do bacteriófago.
[0061] Um bacteriófago indicador recombinante pode incluir um gene repórter ou indicador. Em determinadas modalidades do agente infeccioso, o gene indicador não codifica uma proteína de fusão. Por exemplo, em determinadas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção de uma bactéria hospedeiro resulta em um produto de proteína indicadora solúvel. Em determinadas modalidades, o gene indicador pode ser inserido em uma região de gene tardia do bacteriófago. Os genes tardios são geralmente expressos em níveis mais altos do que outros genes de fago, uma vez que codificam proteínas estruturais. A região de gene tardia pode ser uma região de gene de classe III e pode incluir um gene para uma proteína do capsídeo maior.
[0062] Algumas modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga a jusante do gene da proteína do capsídeo maior. Outras modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga a montante do gene da proteína do capsídeo maior. Em algumas modalidades, a sequência compreende um gene repórter com códon otimizado precedido por uma região não traduzida. A região não traduzida pode incluir um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada ribossomal.
[0063] Em algumas modalidades, um bacteriófago indicador é derivado do bacteriófago T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, ou bacteriófago específico para Staphylococcus, ou outro bacteriófago apresentando um genoma com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de homologia para o bacteriófago T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, ou bacteriófago específico para Staphylococcus. Em algumas modalidades, o fago indicador é derivado de um bacteriófago que é altamente específico para um microrganismo patogênico particular. As modificações genéticas podem evitar deleções dos genes do tipo selvagem e, então, o fago modificado pode permanecer mais similar ao agente infeccioso do tipo selvagem do que muitos fagos comercialmente disponíveis. O bacteriófago derivado do meio ambiente pode ser mais específico para bactérias as quais se encontram no meio ambiente e, como tal, geneticamente distintas do fago comercialmente disponível.
[0064] Além disso, genes do fago considerados não essenciais podem apresentar função não reconhecida. Por exemplo, um gene aparentemente não essencial pode apresentar uma função importante no aumento do tamanho da explosão,
tais como funções sutis de corte, ajuste ou acabamento na montagem. Sendo assim, a deleção de genes para inserir um indicador pode ser prejudicial. A maioria dos fagos pode empacotar um DNA que é poucos porcento maior do que seu genoma natural. Com esta consideração, um gene indicador menor pode ser uma escolha mais adequada para modificar um bacteriófago, especialmente um com um genoma menor. As proteínas OpLuc e NANOLUC® têm apenas cerca de 20 kDa (aproximadamente 500 - 600 bp para codificar), enquanto FLuc tem cerca de 62 kDa (aproximadamente 1700 bp para codificar). Para comparação, o genoma do T7 tem cerca de 40 kbp, enquanto o genoma do T4 tem cerca de 170 kbp, e o genoma do bacteriófago específico para Staphylococcus tem cerca de 157 kbp. Além disso, o gene repórter não deve ser expresso endogenamente pelas bactérias (isto é, não faz parte do genoma bacteriano), deve gerar uma alta relação do sinal para o fundo e deve ser prontamente detectável em tempo hábil. O NANOLUC® da Promega é uma luciferase de Oplophorus gracilirostris (camarão do fundo do mar) modificada. Em algumas modalidades. Em algumas modalidades, o NANOLUC® combinado com NANO-GLO® da Promega, um substrato de imidazopirazinona (furimazina), pode fornecer um sinal robusto com fundo fraco.
[0065] Em algumas modalidades do fago indicador, o gene indicador pode ser inserido em uma região não traduzida para evitar o rompimento de genes funcionais, deixando os genes do fago de tipo selvagem intactos, o que pode levar a uma maior aptidão ao infectar cepas não laboratoriais de bactérias. Adicionalmente, incluir os códons de parada em todos os três quadros de leitura pode ajudar a aumentar a expressão ao reduzir a leitura, também conhecida como expressão vazada. Esta estratégia pode também eliminar a possibilidade de uma proteína de fusão ser feita a baixos níveis, o que se manifestaria como sinal de fundo (por exemplo, luciferase) que não pode ser separado do fago.
[0066] Um gene indicador pode expressar uma variedade de biomoléculas. O gene indicador é um gene que expressa um produto detectável ou uma enzima que produz um produto detectável. Por exemplo, em uma modalidade, o gene indicador codifica uma enzima luciferase. Diversos tipos de luciferase podem ser utilizados. Em modalidades alternativas, e tal como aqui descrito em maiores detalhes, a luciferase é uma de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, luciferase de Renilla, ou uma luciferase projetada. Em algumas modalidades, o gene luciferase é derivado de Oplophorus. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase geneticamente modificado, tal como NANOLUC®.
[0067] Logo, em algumas modalidades, a presente invenção compreende um bacteriófago geneticamente modificado compreendendo um gene indicador não bacteriófago na região do gene tardio (classe III). Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo está sob o controle de um promotor tardio. O uso de um promotor viral do gene tardio garante que o gene repórter (por exemplo, luciferase) não só se expresse em altos níveis, como as proteínas do capsídeo viral, mas também não se desligue como genes bacterianos endógenos ou mesmo genes virais precoces.
[0068] Em algumas modalidades, o promotor tardio é um promotor T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112,
MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, ou outro promotor de fago similar àquele encontrado no fago do tipo selvagem selecionado, isto é, sem modificação genética. A região de gene tardia pode ser uma região de gene de classe III, e o bacteriófago pode ser derivado do bacteriófago específico para Staphylococcus ou S. aureus de T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, ou outro bacteriófago natural apresentando um genoma com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 % de homologia para bacteriófago específico para Staphylococcus ou S. aureus de T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1.
[0069] As modificações genéticas para bacteriófagos podem incluir inserções, deleções ou substituições de um pequeno fragmento de ácido nucleico, uma parte substancial de um gene, ou um gene inteiro. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos inseridos ou substituídos compreendem sequências não nativas. Um gene indicador não nativo pode ser inserido dentro de um genoma do bacteriófago de modo que esteja sob o controle de um promotor de bacteriófago. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não faz parte de uma proteína de fusão. Isto é, em algumas modalidades, uma modificação genética pode ser configurada de modo que o produto da proteína indicadora não compreenda polipeptídios do bacteriófago de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o produto da proteína indicadora é solúvel. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de uma bactéria de interesse compreendendo a etapa de incubar uma amostra teste com o referido bacteriófago recombinante.
[0070] Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador no bacteriófago da progênie após a infecção dos hospedeiros da bactéria resulta em um produto de proteína livre solúvel. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não é contíguo com um gene que codifica uma proteína de estrutural e, dessa forma, não fornece uma proteína de fusão. Diferente dos sistemas que empregam uma fusão de uma porção de detecção à proteína do capsídeo (isto é, uma proteína de fusão), algumas modalidades da presente invenção expressam um indicador ou repórter solúvel (por exemplo, luciferase solúvel). Em algumas modalidades, o indicador ou repórter está idealmente livre da estrutura do bacteriófago. Isto é, o indicador ou repórter não está fixado à estrutura do fago. Como tal, o gene para o indicador ou repórter não está fundido com outros genes no genoma do fago recombinante. Isso pode aumentar grandemente a sensibilidade do ensaio (para uma única bactéria), e simplificar o ensaio, permitindo que o ensaio seja concluído em menos de uma hora para algumas modalidades, diferente de diversas horas devido às etapas adicionais de purificação requeridas com constructos que produzem proteínas de fusão detectáveis. Além disso, as proteínas de fusão podem ser menos ativas do que proteínas solúveis devido, por exemplo, a restrições de enovelamento de proteínas que podem alterar a conformação de um sítio ativo de enzima ou acesso ao substrato.
[0071] Além disso, as proteínas de fusão, por definição, limitam o número das porções fixadas a subunidades de uma proteína no bacteriófago. Por exemplo, utilizando um sistema comercialmente disponível designado para servir como uma plataforma para uma proteína de fusão resultaria em cerca de 415 cópias da porção de fusão, correspondente a cerca de
415 cópias do gene 10B da proteína do capsídeo em cada partícula de bacteriófago T7. Sem esta restrição, espera-se que bactérias infectadas expressem muito mais cópias da porção de detecção (por exemplo, luciferase) do que pode caber no bacteriófago. Adicionalmente, proteínas de fusão grandes, tal como uma fusão capsídeo - luciferase, podem inibir a montagem da partícula de bacteriófago, assim, fornecendo menos progênies do bacteriófago. Logo, um produto do gene indicador solúvel, não fundido pode ser preferível.
[0072] Em algumas modalidades, o fago indicador codifica um repórter, tal como uma enzima detectável. O produto do gene indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectável por uma mudança de cor. Diversas enzimas adequadas estão comercialmente disponíveis, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem servir como a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis podem também ser porções indicadoras adequadas.
[0073] Em algumas modalidades, o uso de uma porção de detecção solúvel elimina a necessidade de remover fago parental contaminante a partir do lisado das células da amostra infectada. Com um sistema da proteína de fusão, qualquer bacteriófago utilizado para infectar as células da amostra teria a porção de detecção fixada, e seria indistinguível a partir do bacteriófago filho também contendo a porção de detecção. Como a detecção das bactérias da amostra depende da detecção de uma porção de detecção recém criada (sintetizada de novo), utilizar constructos de fusão requer etapas adicionais para separar porções antigas (parental) de porções recém criadas (bacteriófago filho). Isso pode ser alcançado pela lavagem das células infectadas múltiplas vezes, antes da conclusão do ciclo de vida do bacteriófago, inativando o excesso de fago parental após a infecção por meios físicos ou químicos, e / ou modificando quimicamente o bacteriófago parental com a porção de ligação (tal como biotina), a qual pode então ser ligada e separada (tal como por grânulos de sepharose revestidos com estreptavidina). No entanto, mesmo com todas essas tentativas de remoção, o fago parental pode permanecer quando uma alta concentração de fago parental é utilizada para garantir a infecção de um baixo número de células da amostra, criando um sinal de fundo que pode obscurecer a detecção do sinal de fago da progênie celular infectada.
[0074] Por outro lado, com a porção de detecção solúvel expressa em algumas modalidades da presente invenção, a purificação do fago parental a partir do lisado final é desnecessária, uma vez que o fago parental não apresenta qualquer porção de detecção fixada. Logo, qualquer porção de detecção presente após a infecção deve ter sido criada de novo, indicando a presença de uma bactéria ou bactérias infectadas. Para aproveitar este benefício, a produção e preparação do fago parental pode incluir a purificação do fago de qualquer porção de detecção livre produzida durante a produção de bacteriófago parental na cultura bacteriana. Técnicas de purificação de bacteriófago padrão podem ser empregadas para purificar algumas modalidades do fago de acordo com a presente invenção, tal como centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, centrifugação em gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio, HPLC, cromatografia de exclusão de tamanho, e diálise ou tecnologias derivadas (tal como concentradores da marca Amicon – Millipore, Inc.). A ultracentrifugação isopícnica de cloreto de césio pode ser empregada como parte da preparação de fago recombinante da invenção, para separar partículas de fago parental de proteína luciferase contaminante produzida após a propagação do fago no hospedeiro bacteriano. Neste sentido, o bacteriófago parental recombinante da invenção está substancialmente livre de qualquer luciferase gerada durante a produção nas bactérias. A remoção de luciferase residual presente no estoque de fago pode substancialmente reduzir o sinal de fundo observado quando o bacteriófago recombinante é incubado com uma amostra teste.
[0075] Em algumas modalidades do bacteriófago modificado, o promotor tardio (promotor de classe III, por exemplo, de T7, T4 ou ViI) apresenta alta afinidade para a RNA polimerase do mesmo bacteriófago que transcreve genes para proteínas estruturais montadas na partícula do bacteriófago. Essas proteínas são as proteínas mais abundantes feitas pelo fago, uma vez que cada partícula de bacteriófago compreende dezenas ou centenas de cópias destas moléculas. O uso de um promotor tardio viral pode garantir otimamente alto nível de expressão da porção de detecção da luciferase. O uso de um promotor viral tardio derivado de, específico para, ou ativo sob o bacteriófago de tipo selvagem original, o fago indicador é derivado de (por exemplo, um promotor tardio de T4, T7 ou ViI com um sistema baseado em T4, T7 ou ViI) pode ainda garantir a expressão ótima da porção de detecção. O uso de um promotor bacteriano padrão (não viral / não bacteriófago) pode, em alguns casos, ser prejudicial à expressão, uma vez que esses promotores são, com frequência, regulados negativamente durante a infecção do bacteriófago (a fim de que o bacteriófago priorize as fontes bacterianas para a produção de proteínas do fago). Logo, em algumas modalidades, o fago é preferencialmente projetado para codificar e expressar em alto nível uma porção indicadora solúvel (livre), utilizando o posicionamento no genoma que não limita a expressão do número de subunidades de um componente estrutural do fago.
[0076] As composições da invenção pode compreender um ou mais agentes infecciosos de tipo selvagem ou geneticamente modificados (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes fagos indicadores os quais podem codificar e expressar a mesma proteína indicadora ou proteínas indicadoras diferentes. Em algumas modalidades, o coquetel de bacteriófago compreende pelo menos dois diferentes tipos de bacteriófagos recombinantes. Métodos de preparação do bacteriófago indicador
[0077] As modalidades dos métodos para a fabricação do bacteriófago indicador começam com a seleção de um bacteriófago do tipo selvagem para modificação genética. Alguns bacteriófagos são altamente específicos para uma bactéria alvo. Isto apresenta uma oportunidade para a detecção altamente específica.
[0078] Logo, os métodos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos agentes de ligação associados com os agentes infeciosos, os quais reconhecem e se ligam a um microrganismo de interesse particular como um meio de amplificar um sinal e, assim, detectam baixos níveis de um microrganismo (por exemplo, um único microrganismo) presente em uma amostra. Por exemplo, agentes infecciosos (por exemplo, bacteriófago) reconhecem especificamente receptores de superfície de microrganismos particulares e, logo, infectam especificamente estes microrganismos. Como tal, estes agentes infecciosos podem ser agentes de ligação adequados para direcionar um microrganismo de interesse.
[0079] Uma variedade de agentes infecciosos pode ser utilizada. Em modalidades alternativas, os bacteriófagos, fagos, mico bacteriófagos (tal como para TB e paraTB), micófagos (tal como para fungos), fagos de micoplasma, e qualquer outro vírus que pode invadir bactérias vivas, fungos, micoplasma, protozoários, leveduras, e outros organismos vivos microscópicos podem ser empregados para direcionar um microrganismo de interesse. Por exemplo, em uma modalidade, quando o microrganismo de interesse é uma bactéria, o agente infeccioso pode compreender um bacteriófago. Por exemplo, fagos bem estudados de E. coli incluem T1, T2, T3, T4, T5, T7 e lambda; outros fagos de E. coli disponíveis na coleção ATCC, por exemplo, incluem phiX174, S13, Ox6, MS2, phiV1, fd, PR772 e ZIK1. Tal como aqui discutido, o bacteriófago pode se replicar dentro da bactéria para gerar centenas de fagos da progênie. A detecção do produto de um gene indicador inserido no genoma do bacteriófago pode ser utilizada como uma medida da bactéria na amostra.
[0080] Algumas modalidades da invenção utilizam a especificidade da capacidade de ligação e expressão genética de alto nível do bacteriófago recombinante para o direcionamento rápido e sensível para infectar e facilitar a detecção de uma bactéria de interesse. Em algumas modalidades, bacteriófago específico para Staphylococcus ou S. aureus é geneticamente modificado para incluir um gene repórter. Em algumas modalidades, a região de gene tardia de um bacteriófago é geneticamente modificada para incluir um gene repórter. Em algumas modalidades, um gene repórter é posicionado a jusante do gene do capsídeo maior. Em outras modalidades, um gene repórter é posicionado a montante do gene do capsídeo maior.
[0081] Algumas modalidades dos métodos para a preparação de um bacteriófago indicador recombinante incluem selecionar um bacteriófago do tipo selvagem o qual infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga o qual compreende um gene indicador; transformar o plasmídeo / vetor de recombinação homóloga em bactérias patogênicas alvo; infectar as bactérias patogênicas alvo transformadas com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante.
[0082] Diversos métodos para projetar e preparar um plasmídeo de recombinação homóloga são conhecidos. Diversos métodos para a transformação de bactérias com um plasmídeo são conhecidos, incluindo choque térmico, conjugação bacteriana mediada pelo pilus F, eletroporação, e outros métodos. Diversos métodos para o isolamento de um clone particular após a recombinação homóloga são também conhecidos. Algumas modalidades do método aqui descrito utilizam estratégias particulares.
[0083] Logo, algumas modalidades dos métodos para o preparo do bacteriófago indicador incluem as etapas de selecionar um bacteriófago do tipo selvagem o qual infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; determinar a sequência natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para a recombinação homóloga adjacente ao gene da proteína do capsídeo maior, em que a sequência compreende um gene repórter com códon otimizado; incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga em um plasmídeo / vetor; transformar o plasmídeo / vetor em bactérias patogênicas alvo; selecionar as bactérias transformadas; infectar as bactérias transformadas com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo e o genoma do bacteriófago; determinar o título do lisado de bacteriófago recombinante resultante; e realizar um ensaio de diluição limitante para enriquecer e isolar o bacteriófago recombinante. Algumas modalidades ainda compreendem repetir as etapas de diluição limitante e titulação, após o primeiro ensaio de diluição limitante, tal como necessário até que o bacteriófago recombinante represente uma fração detectável da mistura. Por exemplo, em algumas modalidades, as etapas de diluição limitante e titulação podem ser repetidas até que pelo menos 1 / 30 do bacteriófago na mistura seja recombinante antes de isolar um clone particular do bacteriófago recombinante. Uma proporção de 1:30 de recombinante:tipo selvagem é esperada, em algumas modalidades, para produzir uma média de 3.2 unidades de transdução (TU) por 96 placas (por exemplo, em uma placa de 96 poços). A proporção inicial de fago recombinante para o fago do tipo selvagem pode ser determinada pela realização de ensaios de diluição limitante com base no TCID50 (dose infecciosa de 50 % da cultura de tecidos), tal como previamente descrito no pedido norte-americano no. US 15/409.258. Pela distribuição de Poisson, uma proporção de 1:30 gera 96 % de chance de observar pelo menos uma TU em algum lugar dos 96 poços.
[0084] A Figura 1 mostra a representação esquemática da estrutura genômica de um bacteriófago recombinante da invenção, o fago indicador T7SELECT®415-Luc. Para a modalidade mostrada na Figura 1, a porção de detecção é codificada por um gene luciferase de vagalume 100 inserido dentro da região de gene tardia (classe III) 110, a qual é expressa tardiamente no ciclo de vida viral. Os genes tardios são geralmente expressos em níveis mais altos do que outros genes do fago, uma vez que eles codificam para proteínas estruturais. Logo, na modalidade do fago recombinante mostrado pela Figura 1, o gene indicador (isto é, luciferase de vagalume) está inserido na região de gene tardia, logo após o gene 10B (proteína do capsídeo maior), e é um constructo compreendendo o gene luciferase de vagalume 100. O constructo mostrado na Figura 1 foi projetado para incluir códons de parada 120 em todos os 3 quadros de leitura para garantir que a luciferase não está incorporada no produto do gene 10B. Tal como também mostrado na Figura 1, o constructo pode compreender o promotor tardio T7 consensus 130 para conduzir a transcrição e expressão do gene luciferase. O constructo pode também compreender uma região não traduzida compósita sintetizada a partir de diversos UTRs de T7 140. Este constructo garante que a luciferase de vagalume solúvel é produzida de tal modo que a expressão não está limitada ao número de proteínas do capsídeo inerentes ao sistema de exibição do fago.
[0085] Tal como aqui notado, em determinadas modalidades, pode ser preferido utilizar agentes infecciosos que tenham sido isolados a partir do meio ambiente para a produção dos agentes infecciosos da invenção. Neste sentido, os agentes infecciosos os quais são específicos a microrganismos naturalmente derivados podem ser gerados.
[0086] Por exemplo, a Figura 2 mostra o genoma do bacteriófago SEA1, um fago natural apresentando cerca de 95 % de homologia de sequência com um bacteriófago S16 de miovírus relacionado a T4. O bacteriófago SEA1 foi obtido a partir do laboratório de Francisco Martinez, e o sequenciamento do genoma completo foi realizado utilizando o Illumina MiSeq com o conjunto de sequência de novo. Tal como discutido nos Exemplos, a proteína do capsídeo maior 220 e diversas outros genes estruturais estão dentro da região de gene tardia 210, consistindo de genes estruturais, os quais codificam para proteínas de vírion. O gene 57A 230, que codifica para chaperona para a formação de fibra longa da cauda encontra-se na fronteira da região de gene tardia.
Uma vez que estas proteínas de vírion são expressas em um nível muito alto, espera-se que quaisquer genes inseridos nesta região apresentem níveis de expressão similares, desde que os promotores do gene tardio e / ou outros elementos de controle similares sejam utilizados.
[0087] Existem numerosos métodos e produtos comerciais conhecidos para a preparação de plasmídeos. Por exemplo, PCR, mutagênese direcionada ao sítio, digestão de restrição, ligação, clonagem e outras técnicas podem ser utilizadas em combinação para preparar plasmídeos. Os plasmídeos sintéticos também podem ser encomendados comercialmente (por exemplo, GeneWiz). Cosmídeos também podem ser empregados, ou o sistema CRISPR / CAS9 pode ser utilizado para editar seletivamente um genoma do bacteriófago. Algumas modalidades dos métodos de preparação de bacteriófago indicador recombinante inclui projetar um plasmídeo o qual pode recombinar prontamente com o genoma do bacteriófago do tipo selvagem para gerar genomas recombinantes. Ao projetar um plasmídeo, algumas modalidades incluem adicionar um gene repórter com códon otimizado, tal como um gene luciferase. Algumas modalidades ainda incluem a adição de elementos na região não traduzida a montante. Por exemplo, ao projetar um plasmídeo para recombinar com o genoma do bacteriófago específico para Staphylococcus ou S. aureus, uma região não traduzida a montante pode ser adicionada entre a sequência que codifica o C terminal da gp23 / proteína do capsídeo maior e o códon de início do gene repórter NANOLUC®. A região não traduzida pode incluir um promotor, tal como um promotor T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1. A região não traduzida pode também incluir um sítio de entrada / ligação ribossomal (RBS), também conhecido como “sequência Shine-Dalgarno” com sistemas bacterianos. Qualquer um ou ambos esses elementos, ou outros elementos não traduzidos, podem ser incorporados dentro de uma região curta não traduzida a montante feita a partir de sequências aleatórias compreendendo cerca do mesmo teor de GC como o resto do genoma do fago. A região aleatória não deve incluir uma sequência ATG, uma vez que esta atuará como um códon de início.
[0088] As composições da invenção podem compreender diversos agentes infecciosos e / ou genes indicadores. Por exemplo, a Figura 3 mostra dois constructos de plasmídeo de recombinação homóloga os quais carregam genes luciferase para 2 diferentes fagos com aproximadamente 500 bp de sequência de fago correspondente a montante e a jusante do sítio de inserção para promover a recombinação homóloga. A luciferase NANOLUC® é inserida em uma estrutura de plasmídeo pBAV1k-T5-GFP com uma região não traduzida a montante contendo um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada ribossomal. O plasmídeo de recombinação do fago S. aureus foi construído para inserir NANOLUC® dentro da região de gene tardia, porém em uma distância a partir da proteína do capsídeo maior (MCP) devido a problemas de estabilidade.
[0089] O fragmento da proteína do capsídeo maior 416 - 915 é uma parte de um gene estrutural que codifica uma proteína do vírion. Uma vez que essas proteínas de vírion são expressas em um nível muito alto, quaisquer genes inseridos nesta região podem apresentar níveis de expressão similares, desde que os promotores do gene tardio e / ou outros elementos de controle similares sejam utilizados.
[0090] Em algumas modalidades, o fago indicador de acordo com a invenção compreende bacteriófago específico para Staphylococcus geneticamente projetado para compreender um gene repórter tal como um gene luciferase. Por exemplo, um fago indicador pode ser bacteriófago específico para Staphylococcus em que o genoma compreende a sequência do gene NANOLUC®. Um genoma de bacteriófago NanoLuc específico para Staphylococcus recombinante pode ainda compreendem um promotor tal como um promotor T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, específico para Staphylococcus, ViI ou outro promotor tardio. Em algumas modalidades, o bacteriófago específico para Staphylococcus é um bacteriófago específico para Staphylococcus aureus.
[0091] Logo, na modalidade do fago recombinante gerado como um resultado da recombinação, o gene indicador (isto é, NANOLUC®) é inserido na região de gene tardia, logo a jusante do gene que codifica a proteína do capsídeo maior, e logo cria genomas de bacteriófago recombinante compreendendo o gene NANOLUC®. O constructo pode adicionalmente compreender o promotor consensus T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1, bacteriófago específico para Staphylococcus, ViI ou outro promotor tardio ou outro promotor adequado para conduzir a transcrição e expressão do gene luciferase. O constructo pode também compreender uma região não traduzida compósita sintetizada a partir de diversos UTRs. Este constructo garante que a luciferase solúvel é produzida de tal modo que a expressão não está limitada ao número de proteínas do capsídeo inerentes ao sistema de exibição do fago.
[0092] A Figura 4 mostra o isolamento do fago recombinante a partir da mistura do bacteriófago do tipo selvagem e recombinante resultante a partir da recombinação homóloga.
[0093] Na primeira etapa 402, bactérias S. aureus transformadas com o plasmídeo de recombinação homóloga são infectadas com o fago K do bacteriófago S. aureus, resultando no fago da progênie com uma mistura de fago parental e recombinante com uma proporção de aproximadamente 186 fagos do tipo selvagem para 1 fago recombinante 434. A mistura de fago recombinante resultante é diluída 404 em placas de 96 poços 406 para fornecer uma média de 5 unidades de transdução recombinantes (TU) por placa (9.3 UFC / poço). A placa de 96 poços é testada para a atividade da luciferase para identificar poços 436 contendo fago recombinante quando comparado com poços 440 contendo bacteriófago do tipo selvagem. As bactérias 438 são adicionadas 408; por exemplo, cada poço pode conter cerca de 50 µL de uma cultura turva de S. aureus. Isto permite que o fago se replique e produza a enzima luciferase 442. Após 2 horas de incubação a 37 °C mostrada em 410, os poços podem ser rastreados para a presença de luciferase 442. Quaisquer poços positivos são prováveis de terem sido inoculados com um único fago recombinante, e neste estágio, a mistura pode conter uma proporção de aproximadamente 9.3 fagos do tipo selvagem para 1 fago recombinante, um enriquecimento sobre a proporção original 186:1. Em uma modalidade, um dos 5 poços que continha luciferase solúvel por meio do ensaio da luciferase, continha fago em uma proporção aproximada de 2.4 de fagos totais para 1 fago recombinante. Se necessário (isto é, se a proporção de recombinante:total é menor do que 1:30), a progênie a partir desta cultura enriquecida 412 pode ser submetida a ensaio(s) de diluição limitante adicional(is) 414 para aumentar a proporção e determinar a concentração verdadeira das unidades de transdução do fago recombinante. Por exemplo, se a proporção foi de 1:384 recombinantes:UFC, cerca de 5 TU recombinantes junto com 1920 fagos totais recombinantes (5 x 384 = 1920) por placa de 96 poços 416 podem ser aliquotados 414 a partir dos poço previamente positivo, levando a uma inoculação aproximada de na maioria das vezes 20 fagos do tipo selvagem por poço (1920 PFU / 96 poços = 20 UFC / poço) de uma segunda placa de ensaio de diluição 420. Quaisquer poços de luciferase positivos são prováveis de terem sido inoculados com um único fago recombinante junto com 19 fagos do tipo selvagem. Estes poços podem ser analisados para a presença de luciferase 442.
[0094] Após a adição de bactérias e incubação (por exemplo, por 2 horas a 37 °C) 418, a luciferase solúvel e o fago estão presentes em aproximadamente 20 total para 1 recombinante 420. Esta proporção pode ser verificada por titulação TU50 para recombinantes e ensaio de placa para UFC total. Por fim, um ensaio de placa pode ser realizado 422 para o rastreio de recombinantes que expressam luciferase
446. Um pequeno número de placas individuais (por exemplo, n = 48) pode ser individualmente escolhido e rastreado em uma terceira placa de múltiplos poços 426 para a atividade da luciferase 436. Em uma modalidade, esta abordagem deve garantir que placas suficientes sejam rastreadas de modo que cerca de 3 recombinantes estariam na mistura de placas a ser rastreada com base na proporção conhecida de recombinantes para o fago total. Uma placa pode ser removida a partir da placa para cada poço de uma placa de 96 poços 424 e um ensaio da luciferase realizado 426 para determinar quais poços continham fago que exibe atividade da luciferase 442. Os poços 428 que demonstraram atividade da luciferase representam fago recombinante puro 434, enquanto os poços sem atividade da luciferase 430 representam fago do tipo selvagem puro 432.
[0095] Placas individuais podem então ser suspendidas em tampão (por exemplo, 100 µL de TMS) ou meio, e uma alíquota (por exemplo, cerca de 5 µL) adicionada a um poço contendo uma cultura turva de S. aureus, e testada após incubação (por exemplo, cerca de 45 minutos a 1 hora a 37 °C). Espera-se que os poços positivos contenham uma cultura pura de fago recombinante. Certas modalidades podem incluir rodadas adicionais de purificação da placa.
[0096] Logo, tal como ilustrado pela Figura 4, o fago recombinante gerado pela recombinação homóloga de um plasmídeo projetado para a recombinação com o genoma do fago do tipo selvagem pode ser isolado a partir de uma mistura compreendendo apenas 0.005 % de genomas de fago total. Após o isolamento, a produção em grande escala pode ser realizada para obter estoques de fago indicador recombinante de alto título adequados para uso no ensaio de detecção de S. aureus. Além disso, a centrifugação em gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio pode ser utilizada para separar as partículas de fago da proteína luciferase contaminante para reduzir o fundo. Métodos para uso de agentes infecciosos para a detecção de microrganismos
[0097] Tal como aqui notado, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender métodos para a utilização de partículas infecciosas para a detecção de microrganismos. Os métodos da invenção podem ser incorporados em uma variedade de formas.
[0098] Em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com bacteriófago o qual infecta a bactéria de interesse, em que o bacteriófago compreende um gene indicador de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria de interesse resulta na produção de um produto de proteína indicadora solúvel; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.
[0099] Em outra modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria de interesse resistente a antibiótico em uma amostra compreendendo as etapas de: (i) incubar a amostra com pelo menos um antibiótico para permitir o enriquecimento das bactérias as quais são resistentes ao antibiótico, (ii) incubar as amostras enriquecidas com o bacteriófago o qual infecta a bactéria de interesse, em que o bacteriófago compreende um gene indicador de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria de interesse resulta na produção de um produto de proteína indicadora solúvel; e (iii) detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse resistente a antibiótico está presente na amostra.
[0100] Em determinadas modalidades, o ensaio pode ser realizado para utilizar um conceito geral que pode ser modificado para acomodar diferentes tipos de amostras ou tamanhos e formatos de ensaio. As modalidades que empregam o bacteriófago recombinante da invenção (isto é, o bacteriófago indicador) podem permitir a rápida detecção de cepas bacterianas específicas, com tempos de ensaio total de
1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0,
7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12, 12.5,
13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5,
18.0, 18.5, 19.0, 19.5, ou 20.0 horas, dependendo do tipo de amostra, tamanho da amostra e formato do ensaio. Por exemplo, a quantidade de tempo requerida pode ser um pouco mais curta ou mais longa dependendo da cepa do bacteriófago e da cepa da bactéria a ser detectada no ensaio, tipo e tamanho da amostra a ser testada, condições requeridas para a viabilidade do alvo, complexidade do ambiente físico / químico, e a concentração de contaminantes bacterianos “endógenos” não alvo.
[0101] A Figura 5 mostra uma estratégia para o uso de fago indicador que produz luciferase solúvel de acordo com uma modalidade da invenção. Neste método, o fago (por exemplo, fago T7, T4, tipo T4, fago K, MP131, MP115, MP112, MP506, MP87, Rambo, SAPJV1) pode ser projetado para expressar uma luciferase solúvel durante a replicação do fago. A expressão da luciferase é conduzida por um promotor do capsídeo viral (por exemplo, o promotor tardio do bacteriófago T7 ou T4), produzindo alta expressão. O fago parental estará livre de luciferase, portanto a luciferase detectada no ensaio deve ser proveniente da replicação do fago da progênie durante a infecção das células bacterianas. Logo, geralmente não há necessidade de separar o fago parental do fago da progênie.
[0102] Nesses experimentos, pelo menos parte da amostra 500 compreendendo as bactérias 502 a serem quantificadas é posicionada em um filtro de coluna de rotação e centrifugada para remover o caldo LB, e uma multiplicidade adequada do fago 504 geneticamente projetado para expressar a luciferase solúvel 503 é adicionada. As células infectadas podem ser incubadas por um tempo suficiente para que a replicação do fago da progênie e a lise celular ocorra (por exemplo, 30 - 90 minutos a 37 ºC). O fago parental 504 e o fago da progênie 516 mais a luciferase livre 503 no lisado pode, então, ser coletada, por exemplo, por centrifugação, e o nível de luciferase no filtrado quantificado utilizando um luminômetro 518. Alternativamente, um método de alto rendimento pode ser empregado no qual as bactérias são aplicadas a uma placa filtrante de 96 poços e, depois que todas as manipulações listadas acima são realizadas, podem ser testadas diretamente para luciferase na placa filtrante de 96 poços original sem uma etapa de centrifugação final.
[0103] A Figura 6 mostra um ensaio de placa filtrante para a detecção de bactérias de interesse utilizando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção. Brevemente, as amostras 616 as quais incluem uma bactéria de interesse 618 podem ser adicionadas a poços 602 de uma placa filtrante de múltiplos poços 604 e giradas 606 para concentrar as amostras pela remoção de líquido a partir da amostra. Os fagos geneticamente modificados 620 são adicionados aos poços e incubados com meio adicional adicionado por tempo suficiente para adsorção 608 seguido por infecção da bactéria alvo e avanço do ciclo de vida do fago 610 (por exemplo, ~ 45 minutos). Por fim, o substrato de luciferase é adicionado e reage com qualquer luciferase presente 624. A emissão resultante é medida em um luminômetro 614 o qual detecta a atividade da luciferase 626.
[0104] Em determinadas modalidades, o ensaio pode ser realizado sem concentrar a bactéria em ou próxima da superfície de captura. A Figura 7 ilustra um “ensaio sem concentração” para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção. Alíquotas do fago indicador 714 são distribuídas nos poços individuais 702 de uma placa de múltiplos poços 704 e, então, as alíquotas de amostra teste contendo bactéria 712 são adicionadas e incubadas 706 (por exemplo, 45 minutos a 37 °C) por um período de tempo suficiente para que o fago replique e gere indicador solúvel 716 (por exemplo, luciferase). Os poços da placa 708 contendo indicador solúvel e fago podem, então, ser avaliados 710 para medir a atividade do indicador na placa 718 (por exemplo, ensaio da luciferase). Nesta modalidade, as amostras testes não são concentradas (por exemplo, por centrifugação) porém são simplesmente incubadas diretamente com fago indicador por um período de tempo e subsequentemente avaliadas para a atividade da luciferase.
[0105] Em algumas modalidades, a amostra pode ser enriquecida antes do teste pela incubação em condições que encorajem o crescimento. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16 horas ou maior, dependendo do tipo e tamanho da amostra.
[0106] Em algumas modalidades, o bacteriófago indicador compreende uma porção indicadora detectável, e a infecção de uma única célula patogênica (por exemplo, bactéria) pode ser detectada por um sinal amplificado gerado por meio da porção indicadora. Logo, o método pode compreender detectar uma porção indicadora produzida durante a replicação do fago, em que a detecção do indicador indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.
[0107] Em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com um bacteriófago recombinante o qual infecta a bactéria de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do bacteriófago de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta na produção de um produto de proteína indicadora solúvel; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra. Em algumas modalidades, a quantidade de porção indicadora detectada corresponde à quantidade da bactéria de interesse presente na amostra.
[0108] Tal como aqui descrito em maiores detalhes, os métodos e sistemas da invenção podem utilizar uma faixa de concentrações de bacteriófago indicador parental para infectar as bactérias presentes na amostra. Em algumas modalidades, o bacteriófago indicador são adicionados à amostra em uma concentração suficiente para rapidamente encontrar, se ligar e infectar as bactérias alvo as quais estão presentes em números muito baixos na amostra, tal como uma única célula. Em algumas modalidades, a concentração do fago pode ser suficiente para encontrar, se ligar e infectar as bactérias alvo em menos do que uma hora. Em outras modalidades, estes eventos podem ocorrer em menos do que duas horas, ou menos do que três horas, após a adição do fago indicador à amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, a concentração do bacteriófago para a etapa de incubação é maior do que 1 x 105 UFC / mL, maior do que 1 x 106 UFC / mL, ou maior do que 1 x 107 UFC / mL.
[0109] Em determinadas modalidades, o agente infeccioso recombinante pode ser purificado de modo a estar livre de qualquer proteína indicadora residual a qual pode ser gerada na produção do estoque do agente infeccioso. Logo, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser purificado utilizando centrifugação em gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio antes da incubação com a amostra. Quando o agente infeccioso é um bacteriófago, esta purificação pode apresentar o benefício adicional da remoção do bacteriófago que não apresenta DNA (isto é, fago vazio ou “fantasmas”).
[0110] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o microrganismo pode ser detectado sem qualquer isolamento ou purificação dos microrganismos a partir de uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma amostra contendo um ou poucos microrganismos de interesse pode ser aplicada diretamente a um recipiente de ensaio, tal como uma coluna de rotação, um poço de microtitulação ou um filtro e o ensaio é conduzido nesse recipiente de ensaio. Várias modalidades dos referidos ensaios são aqui divulgados.
[0111] As alíquotas de uma amostra teste podem ser distribuídas diretamente em poços de uma placa de múltiplos poços, o fago indicador pode ser adicionado, e após um período de tempo suficiente para a infecção, um tampão de lise pode ser adicionado ao poço como um substrato para a porção indicadora (por exemplo, substrato de luciferase para um indicador luciferase) e avaliadas para a detecção do sinal indicador. Algumas modalidades do método podem ser realizadas em placas filtrantes. Algumas modalidades do método podem ser realizadas com ou sem concentração da amostra antes da infecção com o fago indicador.
[0112] Por exemplo, em muitas modalidades, as placas de múltiplos poços são utilizadas para conduzir os ensaios. A escolha das placas (ou qualquer outro recipiente no qual a detecção pode ser realizada) pode afetar a etapa de detecção. Por exemplo, algumas placas podem incluir um fundo colorido ou branco, o qual pode afetar a detecção de emissões de luz. Geralmente, as placas brancas apresentam sensibilidade maior, porém, também produzem um sinal de fundo maior. Outras cores de placas podem gerar sinal de fundo menor, porém, também possuem sensibilidade levemente menor. Adicionalmente, uma razão para o sinal de fundo é o vazamento de luz de um poço para outro poço adjacente. Existem algumas placas que apresentam poços brancos, porém o restante da placa é preto. Isto permite um sinal alto dentro do poço, porém evita o vazamento de luz de um poço para outro poço e logo pode diminuir o fundo. Logo, a escolha da placa ou outro recipiente de ensaio pode influenciar na sensibilidade e sinal de fundo para o ensaio.
[0113] Os métodos da invenção podem compreender diversas outras etapas para aumentar a sensibilidade. Por exemplo, tal como aqui discutido em maiores detalhes, o método pode compreender uma etapa para lavar a bactéria capturada e infectada, após adicionar o bacteriófago, porém antes da incubação, para remover o excesso de bacteriófago parental e / ou luciferase ou outra proteína repórter contaminando a preparação do bacteriófago.
[0114] Em algumas modalidades, a detecção do microrganismo de interesse pode ser completada sem a necessidade de cultivo da amostra como uma forma de aumentar a população dos microrganismos. Por exemplo, em determinadas modalidades o tempo total requerido para a detecção é menos do que 16.0 horas, 15.0 horas, 14.0 horas, 13.0 horas, 12.0 horas, 11.0 horas, 10.0 horas, 9.0 horas, 8.0 horas, 7.0 horas, 6.0 horas, 5.0 horas, 4.0 horas, 3.0 horas, 2.5 horas,
2.0 horas, 1.5 horas, 1.0 hora, 45 minutos, ou menos do que 30 minutos. Minimizar o tempo para o resultado é crítico em testes de alimentos e ambientais para patógenos.
[0115] Em contraste com ensaios conhecidos na técnica, o método da invenção pode detectar microrganismos individuais. Logo, em determinadas modalidades, o método detectar ≤ 10 células do microrganismo (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 microrganismos) presentes em uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para Staphylococcus. Em algumas modalidades, a espécie de Staphylococcus é S. aureus.
Em modalidades adicionais, o S. aureus pode ser resistente à meticilina (MRSA). Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir Staphylococcus na presença de mais do que 100 outros tipos de bactérias. Ainda em outras modalidades, o bacteriófago recombinante pode distinguir Staphylococcus aureus na presença de mais do que 100 outros tipos de bactéria. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser utilizado para detectar uma única bactéria do tipo específico na amostra. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 da bactéria específica na amostra.
[0116] Tal como aqui notado, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender métodos de utilização do bacteriófago recombinante para a detecção da resistência dos microrganismos a um antibiótico ou, indicado de outra forma, para a detecção da eficácia de um antibiótico contra um microrganismo. Em outra modalidade, a invenção compreende métodos para a seleção de um antibiótico para o tratamento de uma infecção. Adicionalmente, os métodos podem compreender métodos para a detecção de bactérias resistentes a antibiótico em uma amostra. Os métodos da invenção podem ser incorporados em uma variedade de formas.
[0117] O método pode compreender colocar em contato a amostra compreendendo o microrganismo com o antibiótico e um agente infeccioso tal como descrito acima. Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método de determinação da dose eficaz de um antibiótico na morte ou inibição do crescimento de um microrganismo compreendendo: (a) incubar cada um ou mais das soluções de antibiótico separadamente com uma ou mais amostras compreendendo o microrganismo, em que as concentrações de uma ou mais das soluções de antibiótico são diferentes e definem uma faixa, (b) incubar os microrganismos em uma ou mais das amostras com um agente infeccioso compreendendo um gene indicador, e em que o agente infeccioso é específico para o microrganismo de interesse, e (c) detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo agente infeccioso na uma ou mais das amostras, em que a detecção do produto de proteína indicadora em uma ou mais da pluralidade das amostras indica que as concentrações das soluções de antibiótico utilizadas para tratar a uma ou mais amostras não são eficazes, e a ausência de detecção da proteína indicadora indica que o antibiótico é eficaz, assim, determinando a dose eficaz do antibiótico.
[0118] Em algumas modalidades, o antibiótico e o agente infeccioso são simultaneamente adicionados à amostra de tal modo que a amostra entre em contato com ambos o antibiótico e o agente infeccioso. Em outras modalidades, o antibiótico e o agente infeccioso são adicionados sequencialmente, por exemplo, a amostra é colocada em contato com o antibiótico antes da amostra ser colocada em contato com o agente infeccioso. Em determinadas modalidades, o método pode compreender incubar a amostra com o antibiótico por um período de tempo antes de colocar a amostra em contato com o agente infeccioso. O tempo de incubação pode variar dependendo da natureza do antibiótico e o microrganismo, por exemplo, com base no tempo de duplicação do microrganismo. Em algumas modalidades, o tempo de incubação é menos do que 24 horas, menos do que 18 horas, menos do que 12 horas, menos do que 6 horas, menos do que 5 horas, menos do que 4 horas, menos do que 3 horas, menos do que 2 horas, menos do que 1 hora, menos do que 45 min, menos do que 30 min, menos do que 15 min, menos do que 10 min ou menos do que 5 min. O tempo de incubação do microrganismo com o agente infeccioso pode também variar dependendo do ciclo de vida do agente infeccioso particular, em alguns casos, o tempo de incubação é menos do que 4 horas, menos do que 3 horas, menos do que 2 horas, menos do que 1 hora, menos do que 45 min, menos do que 30 min, menos do que 15 min, menos do que 10 min ou menos do que 5 min. Os microrganismos os quais são resistentes ao antibiótico irão sobreviver e podem se multiplicar, e o agente infeccioso que é específico para o microrganismo irá se replicar; por outro lado, os microrganismos os quais são sensíveis ao antibiótico serão mortos e logo o agente infeccioso não irá se replicar. O agente infeccioso de acordo com este método compreende uma porção indicadora, a quantidade do qual corresponde à quantidade de microrganismos presentes na amostra os quais foram tratados com o antibiótico. De acordo, uma detecção positiva da porção indicadora indica que o microrganismo é resistente ao antibiótico.
[0119] Em algumas modalidades, os métodos podem ser utilizados para determinar se um microrganismo resistente a antibiótico está presente na amostra clínica. Por exemplo, os métodos podem ser utilizados para determinar se um paciente está infectado com Staphylococcus aureus o qual é resistente ou susceptível a um antibiótico particular. Uma amostra clínica obtida a partir de um paciente pode, então, ser incubada com um antibiótico específico para S. aureus.
A amostra pode, então, ser incubada com fago recombinante específico para S. aureus por um período de tempo. Em amostras com S. aureus resistente ao antibiótico, a detecção da proteína indicadora produzida pelo fago recombinante irá ser positiva. Em amostras com S. aureus susceptível ao antibiótico, a detecção da proteína indicadora será negativa. Em algumas modalidades, os métodos para a detecção de resistência a antibiótico podem ser utilizados para selecionar um agente terapêutico eficaz ao qual a bactéria patogênica é susceptível.
[0120] Em determinadas modalidades, o tempo total requerido para a detecção é menos do que 6.0 horas, 5.0 horas, 4.0 horas, 3.0 horas, 2.5 horas, 2.0 horas, 1.5 horas, ou menos do que 1.0 hora. O tempo total requerido para a detecção irá depender das bactérias de interesse, o tipo de fago e o antibiótico a ser testado.
[0121] Opcionalmente, o método ainda compreende lisar o microrganismo antes de detectar a porção indicadora. Qualquer solução que possa lisar o microrganismo pode ser utilizada. Em alguns casos, o tampão de lise pode conter detergentes não iônicos, agentes quelantes, enzimas ou combinações patenteadas de diversos sais e agentes. Tampões de lise também estão comercialmente disponíveis na Promega, Sigma-Aldrich ou Thermo-Fisher. Os experimentos sugerem que as células não lisadas infectadas podem ser detectáveis após a adição de substrato de luciferase em algumas modalidades. Presumivelmente, a luciferase pode sair das células e / ou o substrato de luciferase pode entrar nas células sem a lise celular completa. Logo, para modalidades que utilizam o sistema de filtro de rotação, no qual apenas a luciferase liberada no lisado (e não a luciferase ainda dentro da bactéria intacta) é analisada no luminômetro, a lise é requerida para a detecção. No entanto, para as modalidades que utilizam placas filtrantes ou placas de 96 poços com amostra infectada com fago em solução ou suspensão, tal como descritas abaixo, nas quais as células intactas e lisadas podem ser analisadas diretamente no luminômetro, a lise pode não ser necessária para a detecção. Logo, em algumas modalidades, o método de detecção de resistência a antibiótico não envolve lisar o microrganismo.
[0122] Um aspecto surpreendente das modalidades dos ensaios é que a etapa de incubação do microrganismo em uma amostra com o agente infeccioso necessita apenas ser longa o suficiente para um único ciclo de vida do agente infeccioso, por exemplo, um fago. O poder de amplificação do uso do bacteriófago foi previamente pensado para exigir mais tempo, de tal modo que o fago se replicaria por diversos ciclos. Uma única replicação do fago indicador pode ser suficiente para facilitar a detecção sensível e rápida de acordo com algumas modalidades da presente invenção. Outro aspecto surpreendente das modalidades dos ensaios é que altas concentrações de fago utilizadas para a infecção das amostras teste (isto é, alto MOI) alcançou de forma bem-sucedida a detecção de números muito baixos de microrganismos alvo resistentes a antibiótico os quais tinham sido tratados com antibiótico. Fatores, incluindo o tamanho da explosão do fago, podem afetar o número de ciclos de vida do fago, e sendo assim, a quantidade de tempo necessária para a detecção. O fago com um tamanho de explosão grande (aproximadamente 100 UFC) pode requerer apenas um ciclo para detecção, enquanto o fago com um tamanho de explosão menor (por exemplo, 10 UFC) pode requerer múltiplos ciclos do fago para a detecção.
Em algumas modalidades, a incubação do fago com uma amostra teste necessita somente ser longa o suficiente para um único ciclo de vida do fago.
Em outras modalidades, a incubação do fago com uma amostra teste é para uma quantidade de tempo maior do que um único ciclo de vida.
A concentração do fago para a etapa de incubação irá variar dependendo do tipo de fago utilizado.
Em algumas modalidades, a concentração do fago para esta etapa de incubação é maior do que 1.0 x 105, maior do que 1.0 x 106, maior do que 1.0 x 107, ou maior do que 1.0 x 108 UFC / mL.
O sucesso com as referidas altas concentrações de fago é surpreendente porque o grande número de fagos foi previamente associado à “lise de fora”, a qual matou as células alvo e, assim, impediu a geração de sinal útil a partir dos ensaios prévios do fago.
É possível que a limpeza dos estoques de fago preparados aqui descrita ajude a aliviar este problema (por exemplo, limpeza por ultracentrifugação em gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio), uma vez que, além da remoção de qualquer luciferase contaminante associada ao fago, esta limpeza pode também remover partículas fantasma (partículas as quais tenham perdido o DNA). As partículas fantasma podem lisar células bacterianas por meio da “lise de fora”, matando as células prematuramente e, assim, evitando a geração de sinal indicador.
A microscopia eletrônica demonstra que um lisado de fago bruto (isto é, antes da limpeza com cloreto de césio) pode apresentar mais de 50 % de fantasmas.
Essas partículas fantasmas podem contribuir para a morte prematura do microrganismo através da ação de muitas partículas de fago perfurando a membrana celular. Logo, as partículas fantasmas podem ter contribuído para problemas prévios, nos quais as altas concentrações de UFC foram relatadas como prejudiciais.
[0123] Quaisquer uma das porções indicadoras tal como descritas nesta divulgação pode ser utilizada para a detecção da viabilidade dos microrganismos após o tratamento com antibiótico, assim, detectando resistência ao antibiótico. Em algumas modalidades, a porção indicadora associada com o agente infeccioso pode ser detectável durante ou após a replicação do agente infeccioso. Por exemplo, tal como descrito acima, em alguns casos, a porção indicadora pode ser uma proteína a qual emite um sinal intrínseco, tal como uma proteína fluorescente (por exemplo, (por exemplo, proteína verde fluorescente ou outras). O indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectável por uma mudança na cor. Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser utilizado para detectar o indicador (por exemplo, luciferase). No entanto, outras máquinas ou dispositivos podem também ser utilizadas. Por exemplo, um espectrofotômetro, câmera CCD ou câmera CMOS podem detectar mudanças de cor e outras emissões de luz.
[0124] Em algumas modalidades, a exposição da amostra ao antibiótico pode continuar por 5 minutos ou mais e a detecção de diversos pontos no tempo pode ser desejável para a sensibilidade ótima. Por exemplo, alíquotas de uma amostra primária tratada com antibiótico pode ser tomada em diferentes intervalos de tempo (por exemplo em 5 minutos, 10 minutos ou 15 minutos). As amostras de intervalos de tempo variados podem então ser infectadas com o fago e a porção indicadora medida após a adição do substrato.
[0125] Em algumas modalidades, a detecção do sinal é utilizada para determinar a resistência a antibiótico. Em algumas modalidades, o sinal produzido pela amostra é comparado a um valor determinado experimentalmente. Em modalidades adicionais, o valor determinado experimentalmente é um sinal produzido por uma amostra controle. Em algumas modalidades, o valor limite do fundo é determinado utilizando um controle sem microrganismos. Em algumas modalidades, o valor determinado experimentalmente é um valor limite do fundo calculado a partir de um sinal de fundo médio mais o desvio padrão de 1 - 3 vezes o sinal de fundo médio, ou maior. Em algumas modalidades, o valor limite do fundo pode ser calculado a partir do sinal de fundo médio mais o desvio padrão de 2 vezes o sinal de fundo médio. Em outras modalidades, o valor limite do fundo pode ser calculado a partir do sinal de fundo médio vezes algum múltiplo (por exemplo, 2 ou 3). A detecção de um sinal da amostra maior do que o valor limite do fundo indica a presença de um ou mais microrganismos resistentes a antibióticos na amostra. Por exemplo, o sinal de fundo médio pode ser 250 RLU. O valor limite do fundo pode ser calculado pela multiplicação do sinal de fundo médio (por exemplo, 250) por 3 para calcular um valor de 750 RLU. As amostras com bactérias apresentando um valor do sinal maior do que 750 RLU são determinados como sendo positivos por conter bactérias resistentes a antibiótico.
[0126] Alternativamente, o valor determinado experimentalmente é o sinal produzido por uma amostra controle. Os ensaios podem incluir várias amostras controle adequadas. Por exemplo, as amostras contendo agentes infecciosos os quais sejam específicos para o microrganismo, ou amostras contendo agentes infecciosos, porém sem o microrganismo, podem ser avaliadas como controles para os níveis de sinal de fundo. Em alguns casos, as amostras contendo os microrganismos os quais não foram tratados com o antibiótico, são avaliadas como controles para a determinação da resistência a antibiótico utilizando o agente infeccioso.
[0127] Em algumas modalidades, o sinal da amostra é comparado com o sinal controle para determinar se os microrganismos resistentes a antibiótico estão presentes na amostra. A detecção não modificada do sinal tal como comparado a uma amostra controle que é colocada em contato com o agente infeccioso, porém não com o antibiótico indica que o microrganismo é resistente ao antibiótico, e reduz a detecção da porção indicadora tal como comparada a uma amostra controle a qual é colocada em contato com o agente infeccioso, porém não com o antibiótico indica que o microrganismo é susceptível ao antibiótico. A detecção não modificada se refere ao sinal detectado a partir de uma amostra que tenha sido tratada com o antibiótico e o agente infeccioso é de pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % de sinal de uma amostra controle que não tenha sido tratada com o antibiótico. A detecção reduzida se refere ao sinal detectado a partir da amostra a qual tenha sido tratada com o antibiótico e agente infeccioso é menos do que 80 %, menos do que 70 %, menos do que 60 %, menos do que 50 %, menos do que 40 %, ou pelo menos 30 % de sinais a partir de uma amostra controle que não tenha sido tratada com o antibiótico.
[0128] Opcionalmente, a amostra compreendendo o microrganismo de interesse é uma amostra não cultivada. Opcionalmente, o agente infeccioso é um fago e compreende um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do fago de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do fago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel. Características de cada uma das composições utilizadas nos métodos, tal como descrito acima, podem também ser utilizadas nos métodos para a detecção de resistência a antibiótico dos microrganismos de interesse.
[0129] É também aqui fornecido um método de determinação da dose eficaz de um antibiótico para matar um microrganismo. Em algumas modalidades, o antibiótico é eficaz em matar espécies de Staphylococcus. Por exemplo, o antibiótico pode ser cefoxitina, o qual é eficaz contra a maioria dos S. aureus sensíveis a meticilina (MSSA). Tipicamente, uma ou mais soluções de antibiótico que apresentam diferentes concentrações são preparadas de tal modo que as diferentes concentrações das soluções definem uma faixa. Em alguns casos, a proporção da concentração da solução de antibiótico menos concentrada para a solução de antibiótico mais concentrada varia de 1:2 a 1:50, por exemplo, de 1:5 a 1:30, ou de 1:10 a 1:20. Em alguns casos, a concentração mais baixa de uma ou mais soluções de antibiótico é de pelo menos 1 µg / mL, por exemplo, pelo menos 2 µg / mL, pelo menos 5 µg / mL pelo menos 10 µg / mL, pelo menos 20 µg / mL, pelo menos 40 µg / mL, pelo menos 80 µg / mL, ou pelo menos 100 µg / mL. Cada uma das uma ou mais soluções de antibiótico é incubada com uma alíquota da amostra compreendendo o microrganismo de interesse.
Em alguns casos, o agente infeccioso que é específico para o microrganismo e compreende uma porção indicadora é adicionado simultaneamente às soluções de antibiótico.
Em alguns casos, as alíquotas da amostra são incubadas com as soluções de antibiótico por um período de tempo antes da adição do agente infeccioso.
A porção indicadora pode ser detectada, e a detecção positiva indica que a solução de antibiótico não é eficaz e a detecção negativa indica que a solução de antibiótico é eficaz e a concentração da solução de antibiótico é uma dose eficaz.
De acordo, em algumas modalidades, o método de determinação da dose eficaz de um antibiótico na morte de um microrganismo de interesse compreende incubar cada uma das uma ou mais soluções de antibiótico separadamente com um microrganismo de interesse em uma amostra, em que as concentrações das uma ou mais soluções de antibiótico são diferentes e definem uma faixa; incubar o microrganismo na uma ou mais amostras com um agente infeccioso compreendendo uma porção indicadora; detectar a porção indicadora do agente infeccioso na uma ou mais amostras, em que a detecção positiva da porção indicadora em uma ou mais das uma ou mais amostras indica que as concentrações das soluções de antibiótico utilizadas para tratar a uma ou mais amostras não é eficaz, e a ausência de detecção da proteína indicadora indica que o antibiótico é eficaz, assim, determinando a dose eficaz do antibiótico.
Em algumas modalidades, duas ou mais soluções de antibiótico são testadas e a proporção da concentração da solução menos concentrada e da solução mais concentrada em uma ou mais soluções de antibiótico varia de 1:2 a 1:50, por exemplo, de 1:5 a 1:30, ou de 1:10 a 1:20. Em alguns casos, a concentração mais baixa de um ou mais soluções de antibiótico é de pelo menos 1 µg / mL, por exemplo, pelo menos 2 µg / mL, pelo menos 5 µg / mL pelo menos 10 µg / mL, pelo menos 20 µg / mL, pelo menos 40 µg / mL, pelo menos 80 µg / mL, ou pelo menos 100 µg / mL.
[0130] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende métodos para a detecção de microrganismo resistente a antibióticos na presença de microrganismos sensíveis a antibiótico. Em determinados casos, a detecção de bactérias resistentes à antibiótico pode ser utilizada para prevenir a propagação da infecção em ambientes de saúde. Em algumas modalidades, os pacientes em um ambiente de saúde podem ser monitorados quanto à colonização de bactérias resistentes a antibiótico. Medidas preventivas podem então ser implementadas para prevenir a propagação de bactérias resistentes a antibiótico.
[0131] Em algumas modalidades dos métodos para a detecção de microrganismos resistentes a antibióticos, as amostras podem conter ambas bactérias resistentes a antibiótico e bactérias sensíveis a antibiótico. Por exemplo, as amostras podem compreender ambos MRSA e MSSA. Em algumas modalidades, MRSA pode ser detectado na presença de MSSA sem a necessidade de isolamento de MRSA a partir da amostra. Na presença de antibiótico, o MSSA não gera um sinal acima do valor limite, porém o MRSA presente na amostra é capaz de produzir um sinal acima do valor limite. Logo, se ambos estão presentes em uma amostra, um sinal acima do valor limite indica a presença de uma cepa resistente a antibiótico
(por exemplo, MRSA).
[0132] Logo, aspectos da presente invenção fornecem métodos para a detecção de microrganismos em uma amostra teste por meio de uma porção indicadora. Em algumas modalidades, em que o microrganismo de interesse é uma bactéria, a porção indicadora pode estar associada com um agente infeccioso tal como um bacteriófago indicador. A porção indicadora pode reagir com um substrato para emitir um sinal detectável ou pode emitir um sinal intrínseco (por exemplo, proteína fluorescente). Em algumas modalidades, a sensibilidade da detecção pode revelar a presença de tão pouco quanto 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 células do microrganismo de interesse em uma amostra teste. Em algumas modalidades, até mesmo uma única célula do microrganismo de interesse pode produzir um sinal detectável. Em algumas modalidades, o bacteriófago é um bacteriófago tipo T4 ou tipo ViI. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é derivado do bacteriófago específico para Staphylococcus. Em determinadas modalidades, um bacteriófago específico para Staphylococcus recombinante é altamente específico para Staphylococcus.
[0133] Em algumas modalidades, a porção indicadora codificada pelo agente infeccioso pode ser detectável durante ou após a replicação do agente infeccioso. Muitos diferentes tipos de biomoléculas detectáveis adequadas para uso como porções indicadoras são conhecidos no estado da técnica, e muitas estão comercialmente disponíveis. Em algumas modalidades, o fago indicador compreende uma enzima, a qual atua como a porção indicadora. Em algumas modalidades, o genoma do fago indicador é modificado para codificar uma proteína solúvel. Em algumas modalidades, o fago indicador codifica uma enzima detectável. O indicador pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança na cor. Diversas enzimas adequadas estão comercialmente disponíveis, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de rábano silvestre (HRP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem atuar como uma porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas as quais geram sinais detectáveis podem também ser porções indicadoras adequadas.
[0134] Logo, em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante dos métodos, sistemas ou kits é preparado a partir do bacteriófago específico para Staphylococcus do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o gene indicador codifica uma proteína que emite um sinal intrínseco, tal como uma proteína fluorescente (por exemplo, proteína verde fluorescente ou outras). O indicador pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma mudança na cor. Em algumas modalidades, o gene indicador codifica uma enzima (por exemplo, luciferase) a qual interage com um substrato para gerar sinal. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene luciferase. Em algumas modalidades, o gene luciferase é uma luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Renilla, luciferase de Gaussia externa, luciferase de Lucia ou uma luciferase projetada tal como NANOLUC®, Rluc8.6-535 ou nano-lanterna laranja.
[0135] A detecção do indicador pode incluir a detecção de emissões de luz. Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser utilizado para detectar a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com um substrato. A detecção das RLU pode ser alcançada com um luminômetro, ou outras máquinas ou dispositivos podem também ser utilizadas. Por exemplo, um espectrofotômetro, câmera CCD ou câmera CMOS podem detectar mudanças de cor e outras emissões de luz. As RLU absolutas são importantes para a detecção, porém a relação do sinal para o fundo também necessita ser alta (por exemplo, > 2.0, > 2.5, ou > 3.0) a fim de que células únicas ou baixos números de células sejam detectados de forma confiável.
[0136] Em algumas modalidades, o fago indicador está geneticamente projetado para conter o gene para uma enzima, tal como uma luciferase, a qual é apenas produzida após a infecção da bactéria que o fago especificamente reconhece e infecta. Em algumas modalidades, a porção indicadora é expressa tardiamente no ciclo de vida viral. Em algumas modalidades, tal como aqui descrito, o indicador é uma proteína solúvel (por exemplo, luciferase solúvel) e não está fundido com uma proteína estrutural do fago que limita seu número de cópia.
[0137] Logo, em algumas modalidades que utilizam o fago indicador, a invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse compreendendo as etapas de captura de pelo menos uma bactéria da amostra; incubar a pelo menos uma bactéria com uma pluralidade de fagos indicadores; permitir tempo para a infecção e replicação para gerar o fago da progênie e expressar a porção indicadora solúvel; e detectar o fago da progênie, ou preferencialmente o indicador, em que a detecção do indicador demonstra que a bactéria está presente na amostra.
[0138] Por exemplo, em algumas modalidades, a bactéria da amostra teste pode ser capturada pela ligação à superfície de uma placa, ou pela filtragem da amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, filtro de rotação de 0.45 μm de tamanho de poro ou placa filtrante). Em uma modalidade, o agente infeccioso (por exemplo, fago indicador) é adicionado em um volume mínimo à amostra capturada diretamente no filtro. Em uma modalidade, o microrganismo capturado no filtro ou superfície da placa é subsequentemente lavado uma ou mais vezes para remover o excesso de agente infeccioso não ligado. Em uma modalidade, um meio (por exemplo, caldo Luria-Bertani, também aqui chamado LB, ou caldo de soja tríptico / caldo triptona de soja, também aqui chamado TSB) pode ser adicionado para um tempo de incubação adicional, para permitir a replicação das células bacterianas e fago e expressão de alto nível do gene que codifica a porção indicadora. No entanto, um aspecto surpreendente de algumas modalidades de ensaios de teste é que a etapa de incubação com fago indicador necessita apenas ser longa o suficiente para um único ciclo de vida do fago. O poder de amplificação do uso do bacteriófago foi previamente pensado para exigir mais tempo, de tal modo que o fago se replicaria por diversos ciclos. Um único ciclo de replicação do fago indicador pode ser suficiente para facilitar a detecção sensível e rápida de acordo com algumas modalidades da presente invenção.
[0139] Em algumas modalidades, alíquotas de uma amostra teste compreendendo bactérias podem ser aplicadas a uma coluna de rotação e após a infecção com um bacteriófago recombinante e uma lavagem opcional para remover qualquer excesso de bacteriófago, a quantidade de indicador solúvel detectada irá ser proporcional à quantidade de bacteriófago que é produzida pela bactéria infectada.
[0140] O indicador solúvel (por exemplo, luciferase) liberado no líquido circundante após a lise da bactéria pode então ser medido e quantificado. Em uma modalidade, a solução é girada através do filtro, e o filtrado é coletado para ensaio em um novo recipiente (por exemplo, em um luminômetro) após a adição de um substrato para a enzima indicadora (por exemplo, substrato de luciferase). Alternativamente, o sinal indicador pode ser medido diretamente no filtro.
[0141] Em diversas modalidades, o fago indicador parental purificado não compreende o indicador detectável por si só, uma vez que o fago parental pode ser purificado antes de ser utilizado para a incubação com uma amostra teste. A expressão dos genes tardios (classe III) ocorre tardiamente no ciclo de vida viral. Em algumas modalidades da presente invenção, o fago parental pode ser purificado para excluir qualquer proteína indicadora existente (por exemplo, luciferase). Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel. Logo, em muitas modalidades, não é necessário separar o fago parental do fago da progênie antes da etapa de detecção. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o fago indicador é um bacteriófago. Em uma modalidade, a porção indicadora é luciferase solúvel, a qual é liberada após a lise do microrganismo hospedeiro.
[0142] Logo, em uma modalidade alternativa, o substrato indicador (por exemplo, substrato de luciferase) pode ser incubado com a porção da amostra que permanece em um filtro ou ligado a uma superfície da placa. De acordo, em algumas modalidades, o suporte sólido é uma placa filtrante de 96 poços (ou uma placa regular de 96 poços) e a reação do substrato pode ser detectada pelo posicionamento da placa diretamente no luminômetro.
[0143] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de MRSA compreendendo as etapas de: infectar as células capturadas em uma placa filtrante de 96 poços com uma pluralidade de fago indicador parental capaz de expressar luciferase após a infecção; lavar o excesso de fago; adicionar caldo LB com antibiótico e permitir tempo para que o fago se replique e lise o alvo de Staphylococcus aureus específico (por exemplo, 30 - 90 minutos); e detectar o indicador luciferase pela adição de substrato de luciferase e a medição da atividade da luciferase diretamente na placa de 96 poços, em que a detecção de atividade da luciferase indica que o MRSA está presente na amostra.
[0144] Em algumas modalidades, a lise da bactéria pode ocorrer antes, durante ou após a etapa de detecção. Experimentos sugerem que células não lisadas infectadas podem ser detectáveis após a adição de substrato de luciferase em algumas modalidades. Presumivelmente, a luciferase pode sair das células e / ou o substrato de luciferase pode entrar nas células sem a lise celular completa. Logo, para as modalidades que utilizam o sistema de filtro de rotação, no qual apenas a luciferase liberada no lisado (e não a luciferase ainda dentro da bactéria intacta) é analisada no luminômetro, a lise é requerida para a detecção. No entanto, para as modalidades que utilizam placas filtrantes ou placas de 96 poços com amostra em solução ou suspensão, nas quais as placas originais cheias de células intactas e lisadas são analisadas diretamente no luminômetro, a lise não é necessária para a detecção.
[0145] Em algumas modalidades, a reação da porção indicadora (por exemplo, luciferase) com substrato pode continuar por 30 minutos ou mais, e a detecção em diversos pontos no tempo pode ser desejável para otimizar a sensibilidade. Por exemplo, nas modalidades que utilizam placas filtrantes de 96 poços como o suporte sólido e luciferase como o indicador, as leituras do luminômetro podem ser tomadas inicialmente e em intervalos de 10 ou 15 minutos até que a reação seja concluída.
[0146] De forma surpreendente, altas concentrações de fago utilizadas para a infecção das amostras teste alcançaram, de forma bem-sucedida, a detecção de números muito baixos de microrganismo alvo em um intervalo de tempo muito curto. A incubação do fago com uma amostra teste em algumas modalidades precisam apenas ser longas o suficiente para um único ciclo de vida do fago. Em algumas modalidades, a concentração do bacteriófago para esta etapa de incubação é maior do que 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 1.0 x 107, 1.1 x 107, 1.2 x 107, 1.3 x 107, 1.4 x 107, 1.5 x 107, 1.6 x 107,
1.7 x 107, 1.8 x 107, 1.9 x 107, 2.0 x 107, 3.0 x 107, 4.0 x 107, 5.0 x 107, 6.0 x 107, 7.0 x 107, 8.0 x 107, 9.0 x 107, ou
1.0 x 108 UFC / mL.
[0147] O sucesso com as referidas altas concentrações de fago é surpreendente porque o grande número de fagos foi previamente associado à “lise de fora”, a qual matou as células alvo e, assim, impediu a geração de sinal útil a partir dos ensaios prévios do fago. É possível que a limpeza dos estoques de fago preparados aqui descrita ajude a aliviar este problema (por exemplo, limpeza por ultracentrifugação em gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio), uma vez que, além da remoção de qualquer luciferase contaminante associada ao fago, esta limpeza pode também remover partículas fantasma (partículas as quais tenham perdido o DNA). As partículas fantasma podem lisar células bacterianas por meio da “lise de fora”, matando as células prematuramente e, assim, evitando a geração de sinal indicador. A microscopia eletrônica demonstra que um lisado de fago bruto (isto é, antes da limpeza com cloreto de césio) pode apresentar mais de 50 % de fantasmas. Essas partículas fantasmas podem contribuir para a morte prematura do microrganismo através da ação de muitas partículas de fago perfurando a membrana celular. Logo, as partículas fantasmas podem ter contribuído para problemas prévios, nos quais as altas concentrações de UFC foram relatadas como prejudiciais. Além disso, uma preparação de fago muito limpa permite que o ensaio seja realizado sem etapas de lavagem, o que torna o ensaio possível de ser realizado sem uma etapa de concentração inicial. Algumas modalidades incluem uma etapa de concentração inicial, e em algumas modalidades, esta etapa de concentração permite um tempo de incubação para enriquecimento mais curto.
[0148] Algumas modalidades dos métodos de teste podem ainda incluir ensaios confirmatórios. Uma variedade de ensaios são conhecidos no estado da técnica para confirmar um resultado inicial, geralmente em um momento posterior. Por exemplo, as amostras podem ser cultivadas (por exemplo, o ensaio CHROMAGAR® / DYNABEADS® tal como descrito no Exemplo 4), PCR pode ser utilizado para confirmar a presença do DNA microbiano, ou outros ensaios confirmatórios podem ser utilizados para confirmar o resultado inicial.
[0149] Em determinadas modalidades, os métodos da presente invenção combinam o uso de um agente de ligação (por exemplo, anticorpo) para purificar e / ou concentrar um microrganismo de interesse a partir da amostra em adição à detecção com um agente infeccioso. Por exemplo, em determinadas modalidades, a presente invenção compreende um método para a detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: captura do microrganismo a partir da amostra em um suporte anterior utilizando um anticorpo de captura específico para o microrganismo de interesse; incubar a amostra com um bacteriófago recombinante que infecta o microrganismo de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do bacteriófago de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel; e detectar o produto de proteína indicadora, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que o microrganismo de interesse está presente na amostra.
[0150] Por exemplo, a Figura 8 mostra um ensaio de fago imunológico híbrido (HIP) para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando um bacteriófago modificado de acordo com uma modalidade da invenção. A amostra é primeiro aplicado ao poço da placa de microtitulação revestido com anticorpos específicos para a bactéria 802. A placa é então centrifugada para facilitar a ligação da bactéria aos anticorpos de captura 804. Após tempo suficiente para permitir a captura da bactéria completa, uma solução contendo fago NANOLUC® específico para a bactéria é adicionada a cada amostra 806. A incubação com o fago resulta na ligação e fixação de um único ou múltiplos fagos à bactéria capturada 808. Por fim, a amostra é incubada para facilitar a replicação do fago e a expressão da luciferase, o que leva à lise celular e liberação da luciferase solúvel
810.
[0151] Avanços recentes na biologia sintética aumentaram o interesse em abordagens terapêuticas baseadas em bacteriófago para tratar doenças patogênicas (vide, por exemplo, Phago Therapy in the Era of Synthetic Biology, Cold Spring Harb Perspect Biol 2016; 8: a023879; e patente norte- americana no. US 9.597.407 e pedidos de patente norte- americanos nos. 20170266306 e 20160331804, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência tal como se recitados na íntegra. O bacteriófago desenhado e projetado para detectar patógenos em amostras médicas de um paciente para a presença de micróbios particulares, tais como tipos específicos de bactérias, podem aumentar a utilidade do referido fago terapêutico.
[0152] Em algumas modalidades, o fago indicador pode ser empregado para testar amostras iniciais de pacientes para a presença de patógenos particulares, tais como um gênero ou espécie particular de bactéria. Em algumas modalidades, o fago indicador pode ser utilizado para detectar um patógeno particular na amostra clínica. Neste sentido, o fago indicador pode ser utilizado de maneira similar como um diagnóstico de companhia, de modo a avaliar a potencial eficácia para terapias específicas, tal como antibióticos particulares, outros fármacos, ou fagos terapêuticos, por exemplo, no contexto de uma determinada infecção ou outra condição médica patogênica do paciente. Em algumas modalidades, o fago indicador do diagnóstico pode ser preparado por modificação genética de bacteriófagos de ocorrência natural tal como previamente descrito.
[0153] Em algumas modalidades, o fago indicador preparado através de tecnologias sintéticas pode ser utilizado para usos não clínicos. Por exemplo, o fago indicador pode ser utilizado como um diagnóstico de segurança alimentar para identificar a presença de uma bactéria particular em alimentos. Em outras modalidades, o fago indicador do diagnóstico pode ser preparado através de tecnologias sintéticas. Por exemplo, um genoma de fago sintético pode ser projetado e construído para a transformação e propagação do fago correspondente em diversos tipos de bactérias. Em alguns casos, as técnicas de biologia sintética podem ser utilizadas para gerar um fago indicador utilizando a bactéria alvo do fago indicador. Em outros casos, uma bactéria mais conveniente pode ser utilizada para gerar um fago indicador. Por exemplo, um genoma sintético para um fago indicador que direciona Listeria pode ser gerado em Listeria, ou uma espécie mais conveniente (por exemplo, Lactobacillus).
[0154] Em algumas modalidades, os fagos sintéticos são projetados para otimizar características desejáveis para uso em ensaios de detecção de patógenos. Em algumas modalidades, a bioinformática e as análises prévias de modificações genéticas são empregadas para otimizar as características desejáveis. Por exemplo, em algumas modalidades, os genes que codificam as proteínas da cauda do fago podem ser otimizados para reconhecer e se ligar a espécies particulares de bactérias. Em outras modalidades, os genes que codificam as proteínas da cauda do fago podem ser otimizados para reconhecer e se ligar a um gênero inteiro de bactérias, ou um grupo particular de espécies dentro de um gênero. Neste sentido, o fago pode ser otimizado para detectar grupos mais amplos ou mais restritos de patógenos. Em algumas modalidades, o fago sintético pode ser projetado para melhorar a expressão do gene repórter. Adicionalmente e / ou alternativamente, em alguns casos, o fago sintético pode ser projetado para aumentar o tamanho da explosão do fago para melhorar a detecção.
[0155] Em algumas modalidades, a estabilidade do fago pode ser otimizada para melhorar a validade. Por exemplo, a solubilidade enzibiótica pode ser aumentada a fim de aumentar a estabilidade subsequente do fago. Adicionalmente e / ou alternativamente, a termo estabilidade do fago pode ser otimizada. O fago termoestável preserva melhor a atividade funcional durante o armazenamento aumentando, assim, a validade. Logo, em algumas modalidades, a termo estabilidade e / ou a tolerância ao pH podem otimizadas.
[0156] Algumas espécies de bactérias constroem paredes de biofilme para se proteger contra-ataques do sistema imunológico. Esses biofilmes podem dificultar o direcionamento eficaz das bactérias. Uma série de enzimas (por exemplo, glicosídeo hidrolases PelAh e PslGh) foram identificadas as quais são capazes de romper o biofilme bacteriano. Em algumas modalidades, o fago pode ser modificado para codificar tanto proteínas de vírion solúvel quanto de fusão para permitir a incorporação de enzimas para romper biofilmes.
[0157] Em algumas modalidades, o fago geneticamente modificado ou o fago sinteticamente derivado compreende um indicador detectável. Em algumas modalidades, o indicador é uma luciferase. Em algumas modalidades, o genoma do fago compreende um gene indicador (por exemplo, um gene luciferase ou outro gene que codifica um indicador detectável).
[0158] Em outro aspecto, a invenção pode compreender: um método para a seleção de um tratamento para um indivíduo compreendendo: (i) obter uma amostra biológica a partir do indivíduo; (ii) detectar um microrganismo específico ou categoria de microrganismos na amostra biológica utilizando um fago indicador; e (iii) selecionar um tratamento baseado na identidade de um microrganismo específico detectado na amostra biológica.
[0159] Em algumas modalidades, o fago indicador, sinteticamente preparado ou não, pode ser utilizado para detectar patógenos em amostras de paciente subsequente ao início de algum tipo de tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser um terapêutico baseado em fago. Em outras modalidades, o tratamento pode ser um antibiótico
(por exemplo, um antibiótico tradicional tal como penicilina ou ciclosporina). Em outras modalidades, o tratamento pode ser outro tipo de fármaco ou terapia. Neste sentido, o fago indicador pode ser utilizado para monitorar o progresso ou eficácia de qualquer tipo de tratamento ou terapia. Em algumas modalidades, o fago indicador pode ser utilizado para detectar e monitorar o teor patogênico das amostras de paciente tomadas horas ou dias após o início do tratamento. Em algumas modalidades, o fago indicador pode ser utilizado para monitorar amostras no contexto de uma infecção crônica e podem ser dias, semanas, meses ou anos após o início de um tratamento. Sistemas e Kits da invenção
[0160] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas (por exemplo, sistemas automatizados ou kits) compreendendo componentes para a realização dos métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o fago indicador está compreendido em sistemas ou kits de acordo com a invenção. Os métodos aqui descritos podem também utilizar os referidos sistemas ou kits de fago indicador. Algumas modalidades aqui descritas são particularmente adequadas para automação e / ou kits, dada a quantidade mínima de reagentes e materiais requeridos para a realização dos métodos. Em determinadas modalidades, cada um dos componentes de um kit pode compreender uma unidade autônoma, isto é, capaz de ser distribuída de um primeiro local para um segundo local.
[0161] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas ou kits para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra. Os sistemas ou kits podem, em determinadas modalidades, compreender um componente para a incubação da amostra com um agente infeccioso específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades de ambos os sistemas e os kits da invenção, o agente infeccioso é um bacteriófago recombinante que infecta a bactéria de interesse, e o bacteriófago recombinante compreende um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do bacteriófago como a porção indicadora de tal modo que a expressão do gene indicador durante a replicação do bacteriófago após a infecção da bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel. Alguns sistemas ainda compreendem um componente para a captura do microrganismo de interesse em um suporte sólido.
[0162] Em outras modalidades, a invenção compreende um método, sistema, ou kit para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, compreendendo um componente do agente infeccioso que é específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora, e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o bacteriófago é um bacteriófago específico para Staphylococcus tipo T4, ViI, tipo ViI. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante é derivado do bacteriófago específico para Staphylococcus. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para uma bactéria particular. Por exemplo, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é Staphylococcus altamente específico. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir Cronobacter na presença de mais do que 100 outros tipos de bactérias. Em outra modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir Staphylococcus na presença de mais do que 100 outros tipos de bactérias. Em determinadas modalidades, um sistema ou kit detecta uma única bactéria do tipo específico na amostra. Em determinadas modalidades, um sistema ou kit detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 bactérias específicas na amostra.
[0163] Em determinadas modalidades, os sistemas e / ou kits podem ainda compreender um componente para a lavagem da amostra de microrganismo capturado. Adicionalmente ou alternativamente, os sistemas e / ou kits podem ainda compreender um componente para a determinação da quantidade da porção indicadora, em que a quantidade de porção indicadora detectada corresponde à quantidade de microrganismo na amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, o sistema ou kit podem compreender um luminômetro ou outro dispositivo para medir a atividade da enzima luciferase.
[0164] Em alguns sistemas e / ou kits, o mesmo componente pode ser utilizado para múltiplas etapas. Em alguns sistemas e / ou kits, as etapas são automatizadas ou controladas pelo usuário por meio de uma entrada de computador e / ou em que um robô de manipulação de líquidos realiza pelo menos uma etapa.
[0165] Logo, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema ou kit para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, compreendendo: um componente para a incubação da amostra com um agente infeccioso específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; um componente para a captura do microrganismo a partir da amostra em um suporte sólido; um componente para a lavagem da amostra de microrganismo capturado para remover agente infeccioso não ligado; e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o mesmo componente pode ser utilizado para as etapas de captura e / ou incubação e / ou lavagem (por exemplo, um componente de filtro). Algumas modalidades adicionalmente compreendem um componente para a determinação da quantidade do microrganismo de interesse na amostra, em que a quantidade de porção indicadora detectada corresponde à quantidade de microrganismo na amostra. Os referidos sistemas podem incluir diversas modalidades e sub modalidades análogas àquelas descritas acima para os métodos de rápida detecção de microrganismos. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago. Em um sistema computadorizado, o sistema pode ser completamente automatizado, semiautomatizado ou direcionado pelo usuário através de um computador (ou alguma combinação dos mesmos).
[0166] Em algumas modalidades, o sistema pode compreender um componente para o isolamento do microrganismo de interesse a partir de outros componentes na amostra.
[0167] Em uma modalidade, a invenção compreende um sistema ou kit compreendendo componentes para a detecção de um microrganismo de interesse compreendendo: um componente para o isolamento de pelo menos um microrganismo a partir de outros componentes na amostra; um componente para a infecção do pelo menos um microrganismo com uma pluralidade de um agente infeccioso parental; um componente para a lise do pelo menos um microrganismo infectado para liberar os agentes infecciosos da progênie presente no microrganismo; e um componente para a detecção dos agentes infecciosos da progênie, ou com maior sensibilidade, um proteína solúvel codificada e expressa pelo agente infeccioso, em que a detecção do agente infeccioso ou de um produto de proteína solúvel do agente infeccioso indica que o microrganismo está presente na amostra. O agente infeccioso pode compreender bacteriófago NANOLUC específico para Staphylococcus.
[0168] Os sistemas ou kits podem compreender uma variedade de componentes para a detecção de agentes infecciosos da progênie. Por exemplo, em uma modalidade, o agente infeccioso da progênie (por exemplo, bacteriófago) podem compreender uma porção indicadora. Em uma modalidade, a porção indicadora no agente infeccioso da progênie (por exemplo, bacteriófago) pode ser uma porção detectável que é expressa durante a replicação, tal como uma proteína luciferase solúvel.
[0169] Em outras modalidades, a invenção pode compreender um kit para a rápida detecção de um microrganismo de interesse em uma amostra, o sistema compreendendo: um componente para a incubação da amostra com um agente infeccioso específico para o microrganismo de interesse, em que o agente infeccioso compreende uma porção indicadora; um componente para a captura do microrganismo a partir da amostra em um suporte sólido; um componente para a lavagem da amostra de microrganismo capturado para remover agente infeccioso não ligado; e um componente para a detecção da porção indicadora. Em algumas modalidades, o mesmo componente pode ser utilizado para as etapas de captura e /
ou incubação e / ou lavagem. Algumas modalidades adicionalmente compreendem um componente para a determinação da quantidade do microrganismo de interesse na amostra, em que a quantidade da porção indicadora detectada corresponde à quantidade de microrganismo na amostra. Os referidos kits podem incluir diversas modalidades e sub modalidades análogas àquelas descritas acima para os métodos de rápida detecção de microrganismos. Em uma modalidade, o microrganismo é uma bactéria e o agente infeccioso é um bacteriófago.
[0170] Em algumas modalidades, um kit pode compreender um componente para o isolamento do microrganismo de interesse a partir de outros componentes na amostra.
[0171] Esses sistemas e kits da invenção incluem diversos componentes. Tal como aqui utilizados, o termo “componente” é amplamente definido e inclui qualquer aparelho ou coleção de aparelhos adequados para a realização do método recitado. Os componentes não precisam estar integralmente conectados ou situados em relação uns aos outros de nenhuma maneira particular. A invenção inclui quaisquer disposições adequadas dos componentes em relação uns aos outros. Por exemplo, os componentes não precisam de estar no mesmo cômodo. Porém, em algumas modalidades, os componentes estão conectados uns aos outros em uma unidade integral. Em algumas modalidades, os mesmos componentes podem desempenhar funções múltiplas. Sistemas de computador e mídia legível por computador
[0172] O sistema, tal como descrito na presente técnica ou qualquer um de seus componentes, pode ser incorporado na forma de um sistema de computador. Exemplos típicos de um sistema de computador incluem um computador de uso geral, um microprocessador programado, um microcontrolador, um elemento de circuito integrado periférico, e outros dispositivos ou arranjos de dispositivos os quais são capazes de implementar as etapas as quais constituem o método da presente técnica.
[0173] Um sistema de computador pode compreender um computador, um dispositivo de entrada, uma unidade de exibição e / ou a Internet. O computador pode ainda compreender um microprocessador. O microprocessador pode estar conectado a uma porta de comunicação. O computador pode também incluir uma memória. A memória pode incluir memória de acesso aleatório (RAM) e memória somente de leitura (ROM). O sistema de computador pode ainda compreender um dispositivo de armazenamento. O dispositivo de armazenamento pode ser uma unidade de disco rígido ou uma unidade de armazenamento removível, tal como uma unidade de disquete, unidade de disco óptico, etc. O dispositivo de armazenamento também pode ser outro meio similar para carregar programas de computador ou outras instruções no sistema de computador. O sistema de computador também pode incluir uma unidade de comunicação. A unidade de comunicação permite que o computador se conecte a outros bancos de dados e à Internet por meio de uma interface de E / S. A unidade de comunicação permite a transferência para, bem como a recepção de dados a partir de outras bases de dados. A unidade de comunicação pode incluir um modem, um cartão Ethernet, ou qualquer dispositivo similar que permita que o sistema de computador se conecte a bases de dados e redes tais como LAN, MAN, WAN e a Internet. Logo, o sistema de computador pode facilitar as entradas de um usuário por meio do dispositivo de entrada, acessível ao sistema por meio da interface E / S.
[0174] Um dispositivo de computação irá incluir tipicamente um sistema operacional o qual fornece instruções de programa executáveis para a administração geral e operação desse dispositivo de computação, e tipicamente irá incluir um meio de armazenamento legível por computador (por exemplo, um disco rígido, memória de acesso aleatório, memória somente de leitura, etc.) que armazena instruções que, quando executadas por um processador do servidor, permitem que o dispositivo de computação realize suas funções pretendidas. Implementações adequadas para o sistema operacional e funcionalidade geral do dispositivo de computação são conhecidas ou estão comercialmente disponíveis, e são prontamente implementadas por pessoas versadas na técnica, particularmente à luz desta divulgação.
[0175] O sistema de computador executa um conjunto de instruções as quais são armazenadas em um ou mais elementos de armazenamento, a fim de processar os dados de entrada. Os elementos de armazenamento também podem conter dados ou outras informações, tal como desejado. O elemento de armazenamento pode estar na forma de uma fonte de informação ou um elemento de memória física presente na máquina de processamento.
[0176] O ambiente pode incluir uma variedade de armazenamentos de dados e outros meios de memória e armazenamento, tal como discutido acima. Eles podem residir em uma variedade de localizações, tal como em um meio de armazenamento local para (e / ou residente em) um ou mais computadores ou remotos a partir de qualquer ou todos os computadores ao longo da rede. Em um conjunto particular de modalidades, a informação pode residir em uma rede de área de armazenamento (“SAN”) familiar para um técnico no assunto. De forma similar, quaisquer arquivos necessários para desempenhar as funções atribuídas aos computadores, servidores, ou outros dispositivos de rede podem ser armazenados localmente e / ou remotamente, conforme o caso. Nos casos em que um sistema inclui dispositivos de computação, cada um desses dispositivos pode incluir elementos de hardware os quais podem estar eletricamente acoplados por meio de uma porta, os elementos incluindo, por exemplo, pelo menos uma unidade de processamento central (CPU), pelo menos um dispositivo de entrada (por exemplo, um mouse, teclado, controlador, tela de toque, ou teclado numérico), e pelo menos um dispositivo de saída (por exemplo, um dispositivo de exibição, impressora, ou alto-falante). O referido sistema também pode incluir um ou mais dispositivos de armazenamento, tais como unidades de disco, dispositivos de armazenamento óptico, e dispositivos de armazenamento de estado sólido, tal como memória de acesso aleatório (“RAM”) ou memória somente de leitura (“ROM”), bem como dispositivos de mídia removíveis, cartões de memória, cartões flash, etc.
[0177] Os referidos dispositivos também podem incluir um leitor de mídia de armazenamento legível por computador, um dispositivo de comunicação (por exemplo, um modem, uma placa de rede (sem fio ou com fio), um dispositivo de comunicação infravermelho, etc.) e memória de trabalho tal como descrito acima. O leitor de mídia de armazenamento legível por computador pode estar conectado com, ou configurado para receber, um meio de armazenamento legível por computador, representando dispositivos de armazenamento remoto, local, fixo e / ou removível, bem como mídia de armazenamento para conter temporariamente e / ou mais permanentemente, armazenamento, transmissão e recuperação de informações legíveis por computador. O sistema e diversos dispositivos também irão incluir tipicamente um número de aplicações de software, módulos, serviços, ou outros elementos localizados dentro de pelo menos um dispositivo de memória de trabalho, incluindo um sistema operacional e programas de aplicativo, tal como um aplicativo para o cliente ou navegador da Web. Deve ser apreciado que as modalidades alternativas podem apresentar inúmeras variações a partir daquelas descritas acima. Por exemplo, o hardware personalizado também pode ser utilizado e / ou elementos particulares podem ser implementados em hardware, software (incluindo software portátil, tal como applets), ou ambos. Além disso, a conexão a outros dispositivos de computação, tais como dispositivos de entrada / saída de rede, pode ser empregada.
[0178] Mídia de armazenamento não transiente e mídia legível por computador para conter código, ou partes de código, pode incluir qualquer mídia adequada conhecida ou utilizada na técnica, incluindo mídia de armazenamento e mídia de comunicação, tal como, porém não limitado, mídia volátil e não volátil, removível e não removível implementada em qualquer método ou tecnologia para o armazenamento e / ou a transmissão de informações, tal como instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programa, ou outros dados, incluindo RAM, ROM, EEPROM, memória flash ou outra tecnologia de memória, CD-ROM, disco versátil digital (DVD) ou outro armazenamento óptico, cassetes magnéticas, fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnético, ou qualquer outro meio que possa ser utilizado para armazenar a informação desejada e o qual possa ser acessado pelo dispositivo do sistema. Com base na divulgação e nos ensinamentos aqui fornecidos, uma pessoa com conhecimento comum na técnica irá apreciar outras maneiras e / ou métodos para implementar as diversas modalidades.
[0179] Um meio legível por computador pode compreender, porém não está limitado, um dispositivo de armazenamento eletrônico, óptico, magnético ou outro capaz de fornecer um processador com instruções legíveis por computador. Outros exemplos incluem, porém não estão limitados, um disquete, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memória, ROM, RAM, SRAM, DRAM, memória endereçável por conteúdo (“CAM”), DDR, memória flash tal como NAND flash ou NOR flash, um ASIC, um processador configurado, armazenamento óptico, fita magnética ou outro armazenamento magnético ou qualquer outro meio a partir do qual um processador do computados pode ler as instruções. Em uma modalidade, o dispositivo de computação pode compreender um único tipo de meio legível por computador tal como memória de acesso aleatório (RAM). Em outras modalidades, o dispositivo de computação pode compreender dois ou mais tipos de meio legível por computador tal como memória de acesso aleatório (RAM), uma unidade de disco, e cache. O dispositivo de computação pode estar em comunicação com um ou mais meio legível por computador externos, tal como uma unidade de disco rígido externa ou uma unidade de DVD ou Blu-Ray externa.
[0180] Tal como discutido acima, a modalidade compreende um processador o qual está configurado para executar instruções de programas executáveis em computador e / ou para acessar informações armazenadas na memória. As instruções podem compreender instruções específicas para processador geradas por um compilador e / ou intérprete a partir de um código escrito em qualquer linguagem de programação de computador adequada, incluindo, por exemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, JavaScript e ActionScript (Adobe Systems, Mountain View, Califórnia). Em uma modalidade, o dispositivo de computação compreende um único processador. Em outras modalidades, o dispositivo compreende dois ou mais processadores. Os referidos processadores podem compreender um microprocessador, um processador de sinal digital (DSP), um circuito integrado de aplicação específica (ASIC), matrizes de portas programáveis em campo (FPGAs), máquinas de estado. Os referidos processadores podem ainda compreender dispositivos eletrônicos programáveis, tais como PLCs, controladores de interrupção programáveis (PICs), dispositivos lógicos programáveis (PLDs), memórias somente de leitura programáveis (PROMs), memórias somente de leitura programáveis eletronicamente (EPROMs ou EEPROMs), ou outros dispositivos similares.
[0181] O dispositivo de computação compreende uma interface de rede. Em algumas modalidades, a interface de rede está configurada para comunicação por meio de links de comunicação com ou sem fio. Por exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação ao longo de redes por meio de Ethernet, IEEE 802.11 (Wi-Fi), 802.16 (Wi-Max), Bluetooth, infravermelho, etc. Como outro exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação ao longo de redes tal como CDMA, GSM, UMTS, ou outras redes de comunicação celular. Em algumas modalidades, a interface de rede pode permitir conexões ponto a ponto com outro dispositivo, como via porta serial universal (em inglês, universal serial bus - USB), 1394 FireWire, conexões em série ou paralelas ou interfaces similares. Algumas modalidades de dispositivos de computação adequados podem compreender duas ou mais interfaces de rede para a comunicação ao longo de uma ou mais redes. Em algumas modalidades, o dispositivo de computação pode incluir um armazenamento de dados em adição a ou no lugar da interface de rede.
[0182] Algumas modalidades de dispositivos de computação adequados podem compreender ou estar em comunicação com um número de dispositivos externos ou internos tais como um mouse, um CD-ROM, DVD, um teclado, uma exibição, alto-falantes de áudio, um ou mais microfones, ou qualquer outro dispositivo de entrada ou saída. Por exemplo, o dispositivo de computação pode estar em comunicação com diversos dispositivos de interface de usuário e uma exibição. A exibição pode utilizar qualquer tecnologia adequada incluindo, porém não limitada, LCD, LED, CRT e similares.
[0183] O conjunto de instruções para execução pelo sistema de computador pode incluir diversos comandos os quais instruem a máquina de processamento a realizar tarefas específicas tais como as etapas que constituem o método da presente técnica. O conjunto de instruções pode estar na forma de um programa de software. Além disso, o software pode estar na forma de uma coleção de programas separados, um módulo de programa com um programa maior ou uma porção de um módulo de programa, tal como na presente técnica. O software pode também incluir a programação modular na forma de programação orientada para objetos. O processamento de dados de entrada pela máquina de processamento pode ser em resposta a comandos do usuário, resultados de processamento prévio ou uma solicitação feita por outra máquina de processamento.
[0184] Embora a presente invenção tenha sido divulgada com referências a determinadas modalidades, inúmeras modificações, alterações e mudanças nas modalidades descritas são possíveis sem se afastar do escopo e âmbito da presente invenção, tal como definido nas reivindicações anexas. De acordo, pretende-se que a presente invenção não se limite às modalidades descritas, porém, que tenha o escopo completo definido pela linguagem das reivindicações a seguir, e equivalentes das mesmas.
EXEMPLOS
[0185] Os resultados mostrados nos exemplos a seguir demonstram a detecção de um baixo número de células, até mesmo de uma única bactéria, em um tempo mais curto para os resultados. Exemplo 1. Detecção bacteriana utilizando fago indicador NanoLuc do bacteriófago específico para Staphylococcus aureus após a incubação da amostra em meio
[0186] Amostras de S. aureus resistente à meticilina (MRSA) foram preparadas adicionando 135 µl de amostras contendo S. aureus ao meio enriquecido. O meio enriquecido incluiu antibiótico sub-inibitório (cefoxitina) para permitir o enriquecimento específico e a indução do MRSA.
As amostras foram incubadas em meio enriquecido por 1 - 2 horas.
Após a preparação das amostras, cefoxitina adicional foi adicionada ao meio e as amostras foram incubadas por mais 2 horas.
O fago indicador NanoLuc do bacteriófago específico para Staphylococcus aureus foi adicionado às amostras e incubado por 2 horas.
Tampão de lise e reagente NANO-GLO® foram adicionados.
Após 5 minutos de incubação, medidas da bioluminescência foram tomadas utilizando um instrumento GLOMAX® 96. Uma proporção sinal / fundo ≥ 750 RLU indicou a detecção positiva de S. aureus.
Uma proporção sinal / fundo de < 750 RLU indicou que a amostra foi negativa para S. aureus.
Tabela 1.1 Detecção mediada por fago de Staphylococcus aureus MR / UFC Cepa Fonte RLU Resultado MS detectadas 33592 ATCC MRSA 140 1552 Positivo 011-719 Emory MRSA 146 6159 Positivo 041-332 Emory MRSA 152 32550 Positivo 045-188 Emory MRSA 115 1845 Positivo 045-696 Emory MRSA 444 38110 Positivo 049-841 Emory MRSA 134 4800 Positivo AR0461 CDC Panel MRSA 159 16000 Positivo AR0462 CDC Panel MRSA 72 616 Negativo AR0463 CDC Panel MRSA 149 5058 Positivo AR0464 CDC Panel MRSA 167 32430 Positivo AR0465 CDC Panel MRSA 111 8831 Positivo AR0466 CDC Panel MRSA 205 575 Negativo
AR0467 CDC Panel MRSA 198 7002 Positivo AR0468 CDC Panel MRSA 203 29460 Positivo AR0469 CDC Panel MRSA 21 3395 Positivo AR0469 CDC Panel MRSA 287 30000 Positivo AR0469 CDC Panel MRSA 473 19030 Positivo AR0470 CDC Panel MRSA 314 2409 Positivo AR0471 CDC Panel MRSA 219 584 Negativo AR0472 CDC Panel MRSA 79 12720 Positivo AR0473 CDC Panel MRSA 211 26910 Positivo AR0474 CDC Panel MRSA 24 2888 Positivo AR0475 CDC Panel MRSA 162 98540 Positivo AR0476 CDC Panel MRSA 136 104400 Positivo AR0477 CDC Panel MRSA 178 58230 Positivo AR0478 CDC Panel MRSA 190 50920 Positivo AR0479 CDC Panel MRSA 158 11460 Positivo AR0480 CDC Panel MRSA 162 31600 Positivo AR0480 CDC Panel MRSA 205 74630 Positivo AR0481 CDC Panel MRSA 133 106300 Positivo Tabela 1.2 Detecção mediada por fago de Staphylococcus aureus MR / UFC Cepa Fonte RLU Resultado MS detectadas AR0482 CDC Panel MRSA 134 452 Negativo AR0483 CDC Panel MRSA 125 7415 Positivo BAA-1683 ATCC MRSA 91 41560 Positivo BAA-1717 ATCC MRSA 184 57700 Positivo BAA-1720 ATCC MRSA 110 29120 Positivo BAA-1754 ATCC MRSA 178 37590 Positivo BAA-2094 ATCC MRSA 117 37280 Positivo
BAA-2313 ATCC MRSA 122 40430 Positivo BAA-41 ATCC MRSA 110 25720 Positivo BAA-41 ATCC MRSA 161 3616 Positivo BAA-42 ATCC MRSA 111 4350 Positivo BAA-44 ATCC MRSA 307 58850 Positivo USA300 Emory MRSA 216 7325 Positivo 6358 ATCC MSSA 123 53340 Positivo 12600 ATCC MSSA 228 4472 Positivo 14775 ATCC MSSA 193 55190 Positivo 25923 ATCC MSSA 107 45600 Positivo 27660 ATCC MSSA 486 28160 Positivo 29213 ATCC MSSA 192 5820 Positivo 502A ATCC MSSA 237 1427 Positivo AR0484 CDC Panel MSSA 106 18540 Positivo AR0485 CDC Panel MSSA 76 7876 Positivo AR0485 CDC Panel MSSA 248 17100 Positivo AR0486 CDC Panel MSSA 158 13010 Positivo AR0487 CDC Panel MSSA 198 7182 Positivo AR0488 CDC Panel MSSA 360 57240 Positivo AR0489 CDC Panel MSSA 169 27370 Positivo AR0490 CDC Panel MSSA 109 11900 Positivo AR0491 CDC Panel MSSA 198 21290 Positivo AR0492 CDC Panel MSSA 130 41150 Positivo BAA-1718 ATCC MSSA 180 16710 Positivo BAA-1721 ATCC MSSA 141 77000 Positivo Universidade RN4220 MSSA 138 2500 Positivo de Iowa Tabela 1.3 Detecção mediada por fago de Staphylococcus aureus
Concentração de cefoxitina
MR / UFC 0 µg / 1 µg / 2 µg / 4 µg / Cepa Fonte MS detectadas mL mL mL mL
AR0461 CDC Panel MRSA 25 3460 1846 910
AR0463 CDC Panel MRSA 265 8987 3377 339
AR0465 CDC Panel MRSA 101 8263 4086 3006
AR0467 CDC Panel MRSA 171 9908 6497 4401
AR0468 CDC Panel MRSA 169 10330 10070 5002
AR0469 CDC Panel MRSA 523 35110 22030 9007
AR0470 CDC Panel MRSA 215 3502 1846 179
AR0472 CDC Panel MRSA 142 72720 19210 240
AR0473 CDC Panel MRSA 219 76160 60000 17500 338
AR0474 CDC Panel MRSA 477 15220 3449 2235 1684
AR0475 CDC Panel MRSA 134 43580 52460 57660 34040
AR0476 CDC Panel MRSA 95 384500 245000 52910 21
AR0477 CDC Panel MRSA 471 1052000 478000 95970 4068
AR0478 CDC Panel MRSA 183 394500 279700 73090 1519
AR0479 CDC Panel MRSA 52 64460 51560 34730 6803
AR0480 CDC Panel MRSA 356 1046000 1038000 430200 127400
AR0481 CDC Panel MRSA 82 144300 150100 109000 27170
AR0482 CDC Panel MRSA 75 10220 6741 2477 204
AR0483 CDC Panel MRSA 12 31200 39250 24390 9081
BAA- ATCC MRSA 147 252900 96700 1971 2094
BAA- ATCC MRSA 192 363300 52440 2409 2313
BAA-42 ATCC MRSA 165 8634 775 240
Tabela 1.4 Detecção mediada por fago de Staphylococcus aureus
Concentração de cefoxitina MR / UFC 0 µg / 1 µg / 2 µg / 4 µg / Cepa Fonte MS detectadas mL mL mL mL 12600 ATCC MSSA 406 18310 178 196 AR0484 CDC Panel MSSA 525 1902000 8875 172 182 AR0485 CDC Panel MSSA 190 13930 236 301 AR0486 CDC Panel MSSA 220 9217 236 252 AR0487 CDC Panel MSSA 221 10420 167 188 AR0488 CDC Panel MSSA 151 259700 15430 207 197 AR0489 CDC Panel MSSA 144 56600 30590 188 207 AR0490 CDC Panel MSSA 940 910000 40620 254 582 AR0491 CDC Panel MSSA 217 193100 40760 215 266 AR0492 CDC Panel MSSA 178 288400 13040 194 207 BAA-1721 ATCC MSSA 197 21900 172 164 Tabela 1.5 Detecção mediada por fago de Staphylococcus aureus Concentração de cefoxitina UFC 0 µg / 1,8 µg Cepa Fonte MR / MS detectadas mL / mL BAA- ATCC 16 MRSA 3335 4034 1720 1260 ATCC 59 MSSA 12470 508 AR0463 CDC Panel 28 MRSA 4339 1941 AR0472 CDC Panel 14 MRSA 2948 2694 Exemplo 2. Diagnose e monitoramento de infecção por Staphylococcus utilizando fago indicador NanoLuc® de bacteriófago específico para Staphylococcus após a incubação da amostra em meio
[0187] Obtenha uma amostra clínica a partir de um paciente. Incube a amostra clínica com fago indicador NanoLuc® do bacteriófago específico para Staphylococcus por 2 horas. Após a incubação, adicione tampão de lise e reagente NANO-GLO®. Após 5 minutos de incubação com tampão de lise e reagente NANO-GLO®, meça a bioluminescência utilizando um instrumento GLOMAX® 96 para determinar a presença de Staphylococcus na amostra clínica. Uma proporção sinal / fundo ≥ 750 RLU indica a detecção positiva de Staphylococcus. Uma proporção sinal / fundo de < 750 RLU indica que a amostra é negativa para Staphylococcus.
[0188] Pacientes com amostras positivas para Staphylococcus são tratados com um fago terapêutico específico para Staphylococcus. Após o tratamento com um fago terapêutico específico para Staphylococcus por 72 horas, uma segunda amostra clínica é obtida a partir do paciente. A amostra clínica é, então, incubada com fago indicador NanoLuc® do bacteriófago específico para Staphylococcus por 2 horas. Após a incubação, adicione tampão de lise e reagente NANO-GLO® e incube por 5 minutos. Em seguida, meça a bioluminescência utilizando um instrumento GLOMAX® 96 para monitorar as mudanças na presença de Staphylococcus em amostras clínicas após o tratamento. A proporção sinal / fundo ≥ 750 RLU indica a detecção positiva de Staphylococcus. Uma proporção sinal / fundo de < 750 RLU indica que a amostra é negativa para Staphylococcus. Se a amostra é positiva para Staphylococcus, continuar o tratamento com um fago terapêutico específico para Staphylococcus e continuar o monitoramento da eficácia do tratamento utilizando o fago indicador NanoLuc® do bacteriófago específico para Staphylococcus.

Claims (36)

REIVINDICAÇÕES
1. Bacteriófago recombinante CARACTERIZADO pelo fato de compreender um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do genoma do bacteriófago.
2. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago recombinante infectar especificamente Staphylococcus.
3. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus ser Staphylococcus aureus.
4. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus aureus ser resistente à meticilina.
5. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o gene indicador ser com códon otimizado e codificar um produto de proteína solúvel o qual gera um sinal intrínseco ou uma enzima solúvel a qual gera sinal após a reação com o substrato.
6. Bacteriófago recombinante, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender uma região não traduzida a montante do gene indicador com códon otimizado, em que a região não traduzida inclui um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada ribossomal.
7. Composição de coquetel CARACTERIZADA pelo fato de compreender pelo menos dois tipos diferentes de bacteriófagos recombinantes, em que pelo menos um dos bacteriófagos recombinantes compreende um gene indicador conforme definido na reivindicação 1.
8. Método de preparação de bacteriófago indicador recombinante CARACTERIZADO pelo fato de compreender: selecionar um bacteriófago do tipo selvagem o qual infecta especificamente uma bactéria patogênica alvo; preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga compreendendo um gene indicador; transformar o plasmídeo / vetor de recombinação homóloga em bactérias patogênicas alvo; infectar as bactérias patogênicas alvo transformadas com o bacteriófago do tipo selvagem selecionado, assim permitindo que a recombinação homóloga ocorra entre o plasmídeo / vetor e o genoma do bacteriófago; e isolar um clone particular do bacteriófago recombinante.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de preparar um plasmídeo / vetor de recombinação homóloga compreender: determinar a sequência de nucleotídeos natural na região tardia do genoma do bacteriófago selecionado; anotar o genoma e identificar o principal gene da proteína do capsídeo do bacteriófago selecionado; projetar uma sequência para a recombinação homóloga a jusante do principal gene da proteína do capsídeo, em que a sequência compreende um gene indicador com códon otimizado; e incorporar a sequência projetada para a recombinação homóloga em um plasmídeo / vetor.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de projetar uma sequência ainda compreender inserir uma região não traduzida incluindo um promotor do gene tardio do fago e sítio de entrada ribossomal a montante do gene indicador com códon otimizado.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de o plasmídeo de recombinação homóloga compreender uma região não traduzida incluindo um promotor do gene tardio do bacteriófago e um sítio de entrada ribossomal a montante do gene indicador com códon otimizado.
12. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago do tipo selvagem ser um bacteriófago específico para Staphylococcus e a bactéria patogênica alvo ser Staphylococcus.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus ser Staphylococcus aureus.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus aureus ser resistente à meticilina (MRSA).
15. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de isolar um clone particular do bacteriófago recombinante compreender um ensaio de diluição limitante para isolar um clone o qual demonstra a expressão do gene indicador.
16. Método para a detecção de Staphylococcus em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender: incubar a amostra com um bacteriófago recombinante derivado do bacteriófago específico para Staphylococcus compreendendo um gene indicador inserido em uma região de gene tardia do genoma do bacteriófago; e detectar um produto de proteína indicadora produzido pelo bacteriófago recombinante, em que a detecção positiva do produto de proteína indicadora indica que Staphylococcus está presente na amostra.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus ser Staphylococcus aureus.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus aureus ser resistente à meticilina.
19. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser uma amostra alimentar, ambiental, de água, comercial ou clínica.
20. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o método detectar tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra alimentar compreender carne, peixe, vegetais, ovos ou fórmula infantil em pó.
22. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser incubada com uma composição de coquetel compreendendo pelo menos dois tipos diferentes de bacteriófagos recombinantes, em que pelo menos um dos bacteriófagos recombinantes compreende um gene indicador conforme definido na reivindicação 16.
23. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.
24. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de o tempo total para os resultados ser de menos do que 12 horas, menos do que 11 horas, menos do que 10 horas, menos do que 9 horas, menos do que 8 horas, menos do que 7 horas, ou menos do que 6 horas.
25. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de a proporção do sinal para o fundo gerado pela detecção do indicador ser pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5.
26. Kit para a detecção de Staphylococcus CARACTERIZADO pelo fato de compreender um bacteriófago recombinante derivado do bacteriófago específico para Staphylococcus.
27. Kit, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus ser Staphylococcus aureus e o bacteriófago específico para Staphylococcus ser bacteriófago específico para Staphylococcus aureus.
28. Kit, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus aureus ser resistente à meticilina e o bacteriófago específico para Staphylococcus aureus ser bacteriófago específico para Staphylococcus aureus resistente à meticilina.
29. Kit, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de ainda compreender um substrato para reagir com um indicador para detectar o produto de proteína solúvel expresso pelo bacteriófago recombinante.
30. Sistema para a detecção de Staphylococcus CARACTERIZADO pelo fato de compreender um bacteriófago recombinante derivado do bacteriófago específico para
Staphylococcus.
31. Sistema, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus ser Staphylococcus aureus.
32. Sistema, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de o Staphylococcus aureus ser resistente à meticilina.
33. Método para a seleção de um tratamento para um indivíduo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (i) obter uma amostra biológica a partir do indivíduo; (ii) detectar um microrganismo específico ou categoria de microrganismos na amostra biológica utilizando um fago indicador; e (iii) selecionar um tratamento baseado na identidade de um microrganismo específico detectado na amostra biológica.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de o fago indicador ser um fago preparado sinteticamente.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de o fago indicador ser um fago de ocorrência natural geneticamente modificado.
36. Método para o monitoramento da eficácia de um tratamento para um indivíduo apresentando uma condição médica patogênica CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (i) obter uma amostra biológica a partir do indivíduo; (ii) detectar um microrganismo específico ou categoria de microrganismos na amostra biológica utilizando um fago indicador; (iii) iniciar um tratamento para o indivíduo; (iv) obter uma segunda amostra biológica do mesmo tipo que a primeira amostra biológica a partir do indivíduo; (v) detectar o microrganismo específico ou categoria de microrganismos na segunda amostra biológica utilizando o fago indicador; e (vi) determinar uma diminuição, aumento ou constância no nível do microrganismo específico ou categoria de microrganismos no indivíduo com base nas quantidades detectadas na primeira e na segunda amostras biológicas.
BR112020020622-9A 2018-04-24 2019-04-24 Bacteriófago indicador para seleção e monitoramento para eficácia de terapêuticos e métodos para o uso do mesmo BR112020020622A2 (pt)

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