JP2021521824A - 治療薬の選択および有効性のモニタリングのためのインジケーターバクテリオファージならびにそれを使用するための方法 - Google Patents

Abstract

サンプル中の微生物の検出のための方法およびシステム、ならびに治療法の選択およびモニタリングのためのかかる方法の利用が本明細書に開示される。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージなどのインジケーターバクテリオファージの特異性は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓなどの特定の微生物の検出を可能にし、インジケーターシグナルはアッセイ感度を最適化するために増幅することができる。本発明は、例えば、バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、組換えバクテリオファージを提供する。

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１８年４月２４日に出願された米国仮出願第６２／６６１，７３９号に基づく優先権を主張する。米国出願第１３／７７３，３３９号、第１４／６２５，４８１号、第１５／２６３，６１９号、および第１５／４０９，２５８号、ならびに米国仮出願６２／６６１，７３９の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、感染性因子を使用する、微生物の検出のための組成物、方法、システムおよびキットに関する。

背景
生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および臨床サンプル中の細菌、ウイルス、および他の微生物の検出のための速度および感度を改善することには、強い関心がある。微生物病原体は、ヒトおよび家畜動物において実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。また、微生物の検出は、ある種の微生物（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）で汚染された食品の摂取によって引き起こされる生命を脅かすもしくは致命的な病気の大流行を考慮すると、食品医薬品局（ＦＤＡ）および疾病対策センター（ＣＤＣ）にとっての優先順位は高い。

細菌を検出するための旧来からの微生物学的試験は、非選択的および選択的な富化培養、続いて、選択培地にプレートし、さらに試験して、疑わしいコロニーを確認することに依拠する。このような手順には、数日を要し得る。種々の迅速な方法が研究されてきており、時間要件を低減するために、実務に導入されてきた。しかし、これらの方法には欠点がある。例えば、直接的イムノアッセイもしくは遺伝子プローブを伴う技法は、一般に、適切な感度を得るために、一晩の富化工程を要する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験はまた、増幅工程を包含し、従って、非常に高い感度および選択性の両方の能力がある；しかし、経済的に、ＰＣＲ試験に供され得るサンプルサイズは、制限される。薄い細菌懸濁物を用いると、大部分の小さな副次サンプルには、細胞がなく、従って、精製および／もしくは長々とした富化工程がなお必要とされる。

旧来の生物学的富化のために必要とされる時間は、上記サンプルの標的細菌集団の増殖速度によって、上記サンプルマトリクスの効果によって、および必要とされる感度によって、規定される。実際には、大部分の高感度法は、一晩のインキュベーションを使用し、全体的には約２４時間かかる。培養のために必要とされる時間に起因して、これらの方法は、識別される予定の生物および上記サンプルの供給源に依存して、最大で３日間かかり得る。この遅延時間（lag time）は、一般に、汚染された食品、水（もしくは他の生成物）は既に、家畜もしくはヒトの中へと入り込んでしまっている可能性があるので、不適切である。さらに、抗生物質耐性細菌および生体防御の懸念事項の増加により、水サンプル、食品サンプルおよび臨床サンプル中の細菌病原体の迅速識別が、世界的に欠くことのできない優先事項になっている。

従って、微生物（例えば、細菌および他の潜在的に病原性の微生物）のより迅速で簡単かつ感度の高い検出および識別が必要である。

（要旨）
本発明の実施形態は、微生物の検出のための組成物、方法、システムおよびキットを含む。本発明は、種々の方法で具現化され得る。

いくつかの局面において、本発明は、バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、組換えバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージは、遺伝子改変されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージゲノムである。いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージは、遺伝子改変されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージゲノムである。さらなる実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。例えば、ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、遺伝子改変されたバクテリオファージゲノムである。いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージを調製するために使用されるバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的に感染する。一実施形態において、組換えバクテリオファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを区別することができる。

組換えインジケーターバクテリオファージのいくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子はコドン最適化され得、内因性シグナルを生成する可溶性タンパク質生成物または基質との反応の際にシグナルを生成する可溶性酵素をコードし得る。いくつかの組換えバクテリオファージは、コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に非翻訳領域をさらに含み、非翻訳領域が、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。ルシフェラーゼ遺伝子は天然に存在する遺伝子、例えばＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ遺伝子もしくはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子であってもよく、または、ルシフェラーゼ遺伝子はＮａｎｏＬｕｃなどの遺伝子操作された遺伝子であってもよい。

本明細書においてまた開示されるのは、組換えインジケーターバクテリオファージを調製するための方法である。いくつかの実施形態は、標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程、相同組換えプラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、形質転換された標的病原性細菌に、選択された野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、プラスミド／ベクターとバクテリオファージゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程を含む。いくつかの実施形態において、選択された野生型バクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、選択された野生型バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１、または上記で開示されるファージと少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１もしくは７０％の相同性を有するゲノムを有する別の天然に存在するファージである。

いくつかの実施形態では。相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程が、選択された上記バクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然のヌクレオチド配列を決定する工程、上記ゲノムを注釈し、選択された上記バクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を識別する工程、上記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する工程であって、上記配列がコドン最適化インジケーター遺伝子を含む工程、および相同組換えのために設計された上記配列をプラスミド／ベクターに組み込む工程を含む。上記配列を設計する工程は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を、上記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に挿入することをさらに含み得る。従って、いくつかの方法において、上記相同組換えプラスミドは、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を上記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に含む。

本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載される組換えインジケーターバクテリオファージを含む組成物である。例えば、組成物は、１種または複数種の野生型または遺伝子改変された感染性因子（例えば、バクテリオファージ）および１種または複数種のインジケーター遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、同じまたは異なるインジケータータンパク質をコードおよび発現し得る、異なるインジケーターファージのカクテルを含み得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物を検出するための方法を包含し、上記方法は、上記サンプルを、上記目的の微生物に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで上記組換えバクテリオファージは上記バクテリオファージの後期遺伝子領域へと挿入されたインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程、および上記インジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、上記目的の微生物が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。

組換えインジケーターバクテリオファージを調製するための方法のいくつかの実施形態において、野生型バクテリオファージはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージであり、標的病原性細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである。いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程は、インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを含む。

本発明の他の局面は、サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓなどの細菌を検出するための方法であって、サンプルをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程、および組換えバクテリオファージによって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここでインジケータータンパク質生成物の陽性検出はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓがサンプルに存在することを示す工程を含む、方法を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来する組換えバクテリオファージを使用した、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出のための方法を含む。サンプルは、食品サンプル、環境サンプル、水サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルであり得る。

細菌を検出するための方法のいくつかの実施形態において、サンプルは、１８時間もしくはそれ未満、１７時間もしくはそれ未満、１６時間もしくはそれ未満、１５時間もしくはそれ未満、１４時間もしくはそれ未満、１３時間もしくはそれ未満、１２時間もしくはそれ未満、１１時間もしくはそれ未満、１０時間もしくはそれ未満、または９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、または２時間もしくはそれ未満の富化時間の間、成長を有利にする条件で最初にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、結果までの合計時間が、２０時間未満、１９時間未満、１８時間未満、１７時間未満、１６時間未満、１５時間未満、１４時間未満、１３時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、または６時間未満である。いくつかの実施形態において、インジケーターを検出する工程によって生成されるシグナル対バックグラウンドの比は、少なくとも２．０または少なくとも２．５である。いくつかの実施形態において、本方法は、食品安全産業にとって標準サイズのサンプル中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個程度の少なさの特異的細菌を検出する。

さらなる実施形態は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを検出するためのシステムおよびキットを含み、システムまたはキットはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、システムおよびキットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するために使用されてもよく、ここでシステムまたはキットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来する組換えバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、システムおよびキットは、ＭＲＳＡを検出するために使用され得る。いくつかの実施形態は、組換えバクテリオファージによって発現される可溶性タンパク質生成物を検出するための、インジケーターと反応させるための基質をさらに含む。これらのシステムまたはキットは、本発明のバクテリオファージ、組成物および方法に関して記載される特徴を含み得る。さらに他の実施形態において、本発明は、本発明による方法またはシステムと使用するための非一時的なコンピューター可読媒体を含む。

別の局面において、本発明は、対象のための処置を選択するための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを取得する工程、（ｉｉ）インジケーターファージを使用して、生物学的サンプル中の特定の微生物または微生物のカテゴリーを検出する工程、および（ｉｉｉ）生物学的サンプルにおいて検出された特定の微生物のアイデンティティに基づいて処置を選択する工程を含む、方法を含み得る。

別の局面において、本発明は、病原性の医学的状態を有する対象に対する処置の有効性をモニタリングするための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを取得する工程、（ｉｉ）インジケーターファージを使用して、生物学的サンプル中の特定の微生物または微生物のカテゴリーを検出する工程、（ｉｉｉ）対象のための処置を開始する工程、（ｉｖ）対象から第１の生物学的サンプルと同じタイプの第２の生物学的サンプルを取得する工程、（ｖ）インジケーターファージを使用して、第２の生物学的サンプル中の特定の微生物または微生物のカテゴリーを検出する工程、ならびに（ｖｉ）第１および第２の生物学的サンプルにおいて検出された量に基づいて、対象における特定の微生物または微生物のカテゴリーの減少、増加、または定常レベルを決定する工程を含む、方法を含み得る。

本発明は、以下の非限定的な図面を参照することによって、よりよく理解され得る。

図１は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子と、バクテリオファージの後期（クラスＩＩＩ）領域に挿入されたＴ７後期プロモーターとを含む遺伝子構築物の挿入を図示する、本発明の一実施形態によるインジケーターファージ構築物を示す。リードスルーを防止するための３つ全てのリーディングフレームにおける終止コドンおよび非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む配列も示される。

図２は、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｄｉｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚのラボから入手した、ミオウイルスＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳ１６と約９５％の相同性を有するミオウイルス（Ｔ４バクテリオファージに関連）である、バクテリオファージＳＥＡ１のゲノムを示す。ロングテール繊維形成のための遺伝子５７Ａシャペロンは、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子からなる後期遺伝子領域の周辺にある。これらのビリオンタンパク質が非常に高レベルで発現されるので、この領域に挿入される任意の遺伝子は、後期遺伝子プロモーターおよび／または他の類似の制御エレメントが使用される限りにおいて、類似の発現レベルを有すると予測され得る。

図３は、相同組換えを促進するために挿入部位の上流および下流におよそ５００ｂｐのマッチングファージ配列を有する２つの異なるファージについてのルシフェラーゼ遺伝子を有する２つの相同組換えプラスミド構築物を示す。ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼは、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む上流非翻訳領域を有するｐＢＡＶ１ｋ−Ｔ５−ＧＦＰプラスミド骨格に挿入されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージ組換えプラスミドは、後期遺伝子領域内に、ただし安定性の問題により主要カプシドタンパク質（ＭＣＰ）から一定の距離で、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を挿入するように構築した。

図４は、図３に示されるプラスミド構築物などのプラスミド構築物を使用し、インジケーター遺伝子を発現する組換えファージを識別するために逐次的な感染および希釈の一連の工程を使用する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓバクテリオファージの改変物からの組換えファージの単離を示す。

図５は、本発明の一実施形態による、細菌細胞の感染中に子孫ファージの複製から生成されるルシフェラーゼの検出を介して細菌細胞を検出するための可溶性ルシフェラーゼをコードするインジケーターファージの使用を示す。

図６は、本発明の一実施形態による改変されたバクテリオファージを使用した目的の細菌を検出するためのフィルタープレートアッセイを示し、細菌および組換えファージはフィルタープレート上でインキュベートされ、子孫バクテリオファージの生成後、インジケータータンパク質が、インキュベーション培地を除去することなく直接検出される。

図７は、本発明の一実施形態による改変されたバクテリオファージを使用した目的の細菌を検出するための「濃縮なしアッセイ（Ｎｏ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）」を示す。

図８は、本発明の一実施形態による改変されたバクテリオファージを使用した目的の細菌を検出するためのハイブリッド免疫ファージ（ＨＩＰ）アッセイを示し、目的の微生物に対する抗体が、インジケーター遺伝子を有する組換え感染性因子とのインキュベーションの前に、アッセイウェルの表面上の微生物を捕捉するために使用される。

発明の詳細な説明
試験サンプル（例えば、生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および臨床サンプル）中の目的の微生物の検出に関して驚くべき感度を示す、組成物、方法およびシステムが本明細書で開示される。検出は、富化のための培養もなしに、もしくはいくつかの実施形態では最小限のインキュベーション時間（その間に、微生物が潜在的に増殖し得る）を伴って行われるアッセイにおいて、遺伝子改変された感染性因子を使用して、以前に可能と考えられた時間枠より短い時間枠で達成され得る。また、試験サンプルとともにインキュベートするために、潜在的に高い感染多重度（ＭＯＩ）、もしくは高濃度のプラーク形成単位（ＰＦＵ）を使用することの成功は驚くべきである。このような高いファージ濃度（ＰＦＵ／ｍＬ）は、細菌検出アッセイにおいて有害であると以前に主張された。なぜならそれらは、「非感染溶菌（ｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｗｉｔｈｏｕｔ）」を引き起こすと主張されたからである。しかし、高濃度のファージは、少数の標的細胞の発見、結合および感染を容易にし得る。

本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、かかる微生物の検出に使用するための感染性因子を含み得る。ある種の実施形態において、本発明は、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を有する組換えバクテリオファージを含む組成物を含み得る。ある種の実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間のインジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物の産生を生じる。ある種の実施形態において、インジケーター遺伝子は、バクテリオファージの後期遺伝子（すなわち、クラスＩＩＩ）領域に挿入されてもよい。バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１、もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージ、または別の野生型もしくは操作されたバクテリオファージに由来し得る。

いくつかの局面において、本発明は、目的の微生物を検出するための方法を包含する。上記方法は、上記目的の微生物の検出のために感染性因子を使用し得る。例えば、ある種の実施形態において、上記目的の微生物は、細菌であり、上記感染性因子は、バクテリオファージである。従って、ある種の実施形態において、上記方法は、サンプルを、目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートすることによる、サンプル中の目的の細菌の検出を包含し得る。ある種の実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、インジケーター遺伝子を含む。上記インジケーター遺伝子は、ある種の実施形態において、上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入され得、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、インジケータータンパク質生成物の産生を生じる。上記方法は、上記インジケータータンパク質生成物を検出する工程を包含し得、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は、上記目的の細菌が上記サンプルに存在することを示す。いくつかの実施形態では、上記インジケータータンパク質は、可溶性である。

ある種の実施形態において、本発明は、システムを包含し得る。上記システムは、本発明の組成物のうちの少なくともいくつかを含み得る。また、上記システムは、上記方法を行うために上記構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。ある種の実施形態において、上記システムは、キットとして編成される（formulated）。従って、ある種の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムを包含し得、上記システムは、上記サンプルを、上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素；および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含む。さらに他の実施形態において、本発明は、上記方法もしくはシステムとともに使用するためのソフトウェアを含む。

従って、本発明のいくつかの実施形態は、細菌の存在を示す検出可能なシグナルを増幅するためのバクテリオファージベースの方法を使用することによって、要求を解決する。ある種の実施形態において、１個程度のわずかな細菌が検出される。本明細書で適用される原理は、種々の微生物の検出に適用され得る。微生物の表面上に感染性因子のための多くの結合部位、感染の間に１００もしくはそれより多くの子孫因子を生成する能力、およびコードされたインジケーター部分の高レベル発現の潜在能力があるので、上記感染性因子もしくはインジケーター部分は、上記微生物自体より容易に検出可能であり得る。このようにして、本発明の実施形態は、実に単一感染細胞からの非常に大きなシグナル増幅を達成し得る。

本発明の局面は、サンプル中の特異的微生物を検出および／定量する手段として、感染性因子の結合構成要素などの、特定の微生物に結合し得る結合因子の高い特異性を利用する。いくつかの実施形態において、本発明は、感染性因子（例えば、バクテリオファージ）の高い特異性を利用する。

いくつかの実施形態において、検出は、上記目的の微生物に特異的な結合因子と関連付けられたインジケーター部分を通じて達成される。例えば、感染性因子は、インジケーター部分（例えば、可溶性インジケーターをコードする遺伝子）を含み得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーターは、上記感染性因子（例えば、バクテリオファージ）によってコードされ得、上記バクテリオファージは、インジケーターファージと示される。

本明細書で開示および記載される本発明のいくつかの実施形態は、単一微生物が特異的認識因子（例えば、ファージ）を結合し得るという発見を利用する。上記ファージの感染および複製の後に、子孫ファージは、ファージ複製の間に発現されるインジケーター部分を介して検出され得る。この原理は、微生物表面レセプターの特異的認識に基づいて、１もしくは数個の細胞からのインジケーターシグナルの増幅を可能にする。例えば、細菌の実に単一細胞を複数のファージに曝露し、その後、上記ファージの増幅、および複製の間に、コードされたインジケーター遺伝子生成物の高レベル発現を可能にすることによって、上記インジケーターシグナルは、上記単一細菌が検出可能であるように増幅される。

本発明の方法およびシステムの実施形態は、食品サンプル、水サンプル、臨床サンプルおよび商業サンプルからの病原体の検出が挙げられるが、これらに限定されない種々の環境における種々の微生物（例えば、細菌、真菌、酵母）の検出および定量に適用され得る。いくつかの実施形態において、臨床サンプルは、微生物の存在について分析され得る。本発明の方法は、迅速にかつ旧来の生物学的富化（例えば、富化のための培養）の必要性なしに、高い検出感度および特異度を提供する。これは、全ての利用可能な方法が培養を要するので驚くべき局面である。いくつかの実施形態において、検出は、バクテリオファージの単一の複製サイクル内で可能であり、このことは、予想外である。

定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有するべきである。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むべきであり、複数の用語は、単数を含むべきである。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。公知の方法および技術は、他に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって、および本明細書を通して考察される様々な一般のおよびより特定の参考文献において記載されているように一般に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造元の仕様によって行われる。本明細書に記載されている実験室の手順および技術に関連して使用される命名法は当技術分野で周知のものであり、一般に使用される。

下記の用語は、他に示さない限り、下記の意味を有すると理解すべきである：

本明細書において使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、他に特に留意しない限り、１つまたは複数を指すことができる。

「または」という用語の使用は、代替物のみを言及することが明確に示されない限り、または代替物が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ超を意味することができる。

本出願を通して、「約」という用語は、その値が、値を決定するために用いられているデバイス、方法についての固有の誤差の変動、または試料の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。

「固体支持体」または「支持体」という用語は、その上に生体分子が結合し得る基材および／または表面を提供する構造物を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル（すなわち、例えば、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレート）であり得、または固体支持体は、フィルター、アレイ、または移動性の支持体（例えば、ビーズ）または膜（例えば、フィルタープレートまたはラテラルフローストリップ）上の位置であり得る。

「結合因子」という用語は、第２の（すなわち、異なる）対象分子に特異的および選択的に結合することができる分子を指す。相互作用は、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電相互作用もしくは疎水的相互作用の結果として非共有結合性であり得、あるいは相互作用は共有結合性であり得る。「可溶性結合因子」という用語は、固体支持体に会合（すなわち、共有結合または非共有結合）していない結合因子を指す。

本明細書で使用される場合、「分析物」とは、測定されている分子、化合物もしくは細胞をいう。目的の分析物は、ある種の実施形態において、結合因子と相互作用し得る。本明細書で記載される場合、用語「分析物」とは、目的のタンパク質もしくはペプチドをいい得る。分析物は、アゴニスト、アンタゴニスト、もしくはモジュレーターであり得る。あるいは、分析物は、生物学的効果を有しなくてもよい。分析物としては、低分子、糖、オリゴサッカリド、脂質、ペプチド、ペプチド模倣物、および有機化合物などが挙げられ得る。

用語「検出可能な部分」もしくは「検出可能な生体分子」もしくは「レポーター」もしくは「インジケーター」もしくは「インジケーター部分」とは、定量的アッセイにおいて測定され得る分子をいう。例えば、インジケーター部分は、基質を、測定され得る生成物に変換するために使用され得る酵素を含み得る。インジケーター部分は、生物発光の放射を生じる反応を触媒する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）であり得る。あるいは、インジケーター部分は、定量され得る放射性同位体であり得る。あるいは、インジケーター部分は、発蛍光団であり得る。あるいは、他の検出可能な分子が使用され得る。

本明細書で使用される場合、「バクテリオファージ」もしくは「ファージ」とは、複数の細菌のウイルスのうちの１種またはそれより多くを含む。本開示において、用語「バクテリオファージ」および「ファージ」は、生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母、および他の顕微鏡レベルの生存している生物に侵入し得るウイルスであって、そして上記生物を使用して、該ウイルス自体を複製するウイルスを指す、マイコバクテリオファージ（例えば、ＴＢおよびパラＴＢに関する）、マイコファージ（ｍｙｃｏｐｈａｇｅ）（例えば、真菌に関する）、マイコプラズマファージ、および任意の他の用語などのウイルスを含む。ここで、「顕微鏡レベルの」とは、最大寸法が１ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。バクテリオファージは、それらを複製する手段として、天然において細菌を使用するように進化したウイルスである。ファージは、このことを、ファージ自体を細菌に付着させ、そのＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）をその細菌の中に注入し、上記ファージを数百倍もしくはさらには数千倍も複製するようにその細菌を誘導することによって行う。これは、ファージ増幅ともいわれる。

本明細書で使用される場合、「後期遺伝子領域」とは、ウイルス生活環において後期に転写されるウイルスゲノムの領域をいう。上記後期遺伝子領域は、代表的には、最も豊富に発現される遺伝子（例えば、上記バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質）を含む。後期遺伝子は、クラスＩＩＩ遺伝子と同義であり、構造およびアセンブリ機能を有する遺伝子を含む。例えば、上記後期遺伝子（クラスＩＩＩと同義）は、ファージＴ７では、例えば、感染後８分から溶解するまでに、クラスＩ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）は、早期に４〜８分に、およびクラスＩＩは、６〜１５分に転写されるので、ＩＩおよびＩＩＩのタイミングは重なり合っている。後期プロモーターは、天然に位置し、このような後期遺伝子領域において活性であるプロモーターである。

本明細書で使用される場合、「富化のための培養」とは、旧来からの培養（例えば、微生物繁殖に都合のよい培地中でのインキュベーション）をいい、語句「富化」の他の考えられる使用（例えば、サンプルの液体構成要素を取り出して、その中に含まれる上記微生物を濃縮することによる富化）、または微生物繁殖の旧来の促進を含まない富化の他の形態と混同されるべきではない。非常に短期間にわたる富化のための培養は、本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において使用され得るが、それが全てで使用される場合、必須ではなく、かつ富化のための旧来からの培養よりはるかに短期間にわたる。

本明細書で使用される場合、「組換え（recombinant）」とは他の方法では見いだされない遺伝的物質を一緒にするために、通常は実験室で行われる場合、遺伝的な（すなわち、核酸）改変をいう。この用語は、本明細書において用語「改変された」と交換可能に使用される。

本明細書において使用する場合、「ＲＬＵ」は、ルミノメーター（例えば、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６）または光を検出する類似の機器によって測定される、相対発光量を指す。例えば、ルシフェラーゼと適当な基質（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）とＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標））の間の反応物の検出が、検出されるＲＬＵでしばしば報告される。

本明細書において使用する場合、「結果までの時間」は、サンプルのインキュベーションの開始から結果の生成までの合計時間量を指す。結果までの時間は、いかなる確認試験時間も含まない。データ収集は、結果が生成された後、いつでも行われ得る。

サンプル
本発明の方法およびシステムの実施形態の各々は、サンプル中の微生物の迅速検出および定量を可能にし得る。例えば、本発明に従う方法は、優れた結果を有する、短縮した期間で行われ得る。

本発明の方法およびシステムによって検出される微生物としては、天然の、商業的、医学的または獣医学的に懸念される病原体が挙げられる。このような病原体としては、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、およびマイコプラズマが挙げられる。特定の微生物に特異的な感染性因子が識別された任意の微生物は、本発明の方法によって検出され得る。当業者は、必須の特定の感染性因子／微生物の対の利用可能性以外に、本発明の方法の適用に制限はないことを認識する。

本発明によって検出可能な細菌細胞としては、食品または水で伝播する病原体である細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって検出可能な細菌細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのうちの全ての種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのうちの全ての株、Ｌｉｓｔｅｒｉａのうちの全ての種（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが挙げられるが、これに限定されない）、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒのうちの全ての種。本発明によって検出可能な細菌細胞としては、医学的にまたは獣医学的に重要な病原体である細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような病原体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．。いくつかの実施形態において、本発明によって検出可能な細菌細胞としては、抗生物質耐性細菌（例えば、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ））が挙げられる。

サンプルは、環境サンプルまたは食品サンプルまたは水サンプルであり得る。いくつかの実施形態は、医学的サンプルまたは獣医学的サンプルを含み得る。サンプルは、液体、固体、または半固体であり得る。サンプルは、固体表面のスワブであり得る。サンプルとしては、環境材料（例えば、水サンプル）、またはサイクロンコレクターからの空気サンプルもしくはエアロゾルサンプルに由来するフィルターが挙げられ得る。サンプルは、野菜、食肉、魚、家禽、ピーナッツバター、加工食品、乳児用調製粉乳、粉ミルク、茶、デンプン、卵、ミルク、チーズ、または他の酪農製品のサンプルであり得る。医学的サンプルまたは獣医学的サンプルとしては、血液サンプル、喀痰サンプル、脳脊髄液サンプル、および糞便サンプルならびに種々のタイプのスワブが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、サンプルは、調製も、濃縮も、希釈もなしに、本発明の検出法において直接使用され得る。例えば、液体サンプル（ミルクおよびジュースが挙げられるが、これらに限定されない）は、直接アッセイされ得る。サンプルは、緩衝化溶液または細菌培養培地が挙げられ得るが、これらに限定されない溶液中で希釈または懸濁され得る。固体または半固体であるサンプルは、液体中の固体を細かく刻むか、混合するか、または浸軟することによって、液体中に懸濁し得る。サンプルは、宿主細菌細胞へのバクテリオファージ付着を促進するｐＨ範囲内に維持されるべきである。サンプルはまた、２価カチオンおよび１価カチオン（Ｎａ^＋、Ｍｇ^２＋、およびＣａ２^＋が挙げられるが、これらに限定されない）の適切な濃度を含むべきである。好ましくは、サンプルは、サンプル内に含まれる任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。
好ましくは検出アッセイ全体を通じて、上記サンプルは、上記サンプルに存在する任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。バクテリオファージが細菌細胞に付着している工程の間に、上記サンプルを、バクテリオファージ付着を促進する温度で維持することは、好ましい。バクテリオファージが感染細菌細胞内で複製されているかもしくはこのような感染細胞を溶解する工程の間に、上記サンプルを、バクテリオファージ複製および上記宿主の溶解を促進する温度で維持することは好ましい。このような温度は、少なくとも約２５摂氏度（Ｃ）、より好ましくは、約４５℃以下、最も好ましくは約３７℃である。上記サンプルが、バクテリオファージ付着、複製および細胞溶解の間に穏やかな混合もしくは振盪に供されることもまた好ましい。

アッセイは、種々の適切なコントロールサンプルを含み得る。例えば、バクテリオファージを含まないコントロールサンプルまたは細菌なしのバクテリオファージを含むコントロールサンプルは、バックグラウンドシグナルレベルに関するコントロールとしてアッセイされ得る。

インジケーターバクテリオファージ
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、病原性微生物の検出において使用するための感染性因子を含み得る。ある種の実施形態において、本発明は、組換えインジケーターバクテリオファージを含み、ここで、バクテリオファージゲノムはインジケーターまたはレポーター遺伝子を含むように遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、本発明は、バクテリオファージのゲノムに組み込まれるインジケーター遺伝子を有する組換えバクテリオファージを含む組成物を含み得る。

組換えインジケーターバクテリオファージは、レポーターまたはインジケーター遺伝子を含み得る。上記感染性因子のある種の実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、ある種の実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる。ある種の実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入され得る。後期遺伝子は構造タンパク質をコードするので、他のファージ遺伝子より高レベルで一般的に発現される。後期遺伝子領域はクラスＩＩＩ遺伝子領域であってよく、主要カプシドタンパク質のための遺伝子を含み得る。

いくつかの実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する（および、必要に応じて調製する）ことを含む。他の実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の上流に相同組換えのための配列を設計する（および、必要に応じて調製する）ことを含む。いくつかの実施形態において、配列は、非翻訳領域の後にコドン最適化レポーター遺伝子を含む。非翻訳領域は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含み得る。

いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージ、またはＴ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージと少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の相同性を有するゲノムを有する別のバクテリオファージに由来する。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、特定の病原性微生物に高度に特異的なバクテリオファージに由来する。遺伝的改変は野生型遺伝子の欠失を回避することができ、したがって、改変されたファージは多くの市販のファージよりも野生型感染性因子に類似のままでいることができる。環境に由来するバクテリオファージは、環境中で見いだされる細菌に対し、より特異的であり得、このように、市販のファージとは遺伝的に異なり得る。

さらに、非必須であると考えられるファージ遺伝子は、認識されていない機能を有し得る。例えば、見かけは非必須の遺伝子は、アセンブリにおける巧妙な切断、適合、またはトリミング機能など、バーストサイズを上昇させることにおいて重要な機能を有し得る。それゆえ、遺伝子を欠失させてインジケーターを挿入することは、有害であり得る。大部分のファージは、それらの天然のゲノムより数パーセント大きいＤＮＡをパッケージし得る。この考察では、より小さなインジケーター遺伝子は、バクテリオファージ（特に、より小さなゲノムを有するバクテリオファージ）を改変するためのより適切な選択であり得る。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、わずか約２０ｋＤａ（コードするためにおよそ５００〜６００ｂｐ）である一方で、ＦＬｕｃは、約６２ｋＤａ（コードするためにおよそ１，７００ｂｐ）である。比較のために、Ｔ７のゲノムは約４０ｋｂｐである一方で、Ｔ４ゲノムは、約１７０ｋｂｐであり、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージのゲノムは約１５７ｋｂｐである。さらに、レポーター遺伝子は細菌によって内因的に発現されるべきでなく（すなわち、細菌ゲノムの一部でない）、高いシグナル対バックグラウンド比を生成するべきであり、タイムリーに容易に検出可能であるべきである。ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変されたＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン）と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、低いバックグラウンドで頑健なシグナルを提供し得る。

いくつかのインジケーターファージ実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、野生型ファージ遺伝子を無傷のままにして、機能的遺伝子の破壊を回避するために非翻訳領域へと挿入され得、これは、非実験室株の細菌に感染させる場合に、より大きな適合をもたらし得る。さらに、３つ全てのリーディングフレームに終止コドンを含めることは、リードスルー（発現漏れ（ｌｅａｋｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）としても公知）を低減することによって、発現を増加させる一助になり得る。このストラテジーはまた、上記ファージから分離できないバックグラウンドシグナル（例えば、ルシフェラーゼ）として現れる融合タンパク質が低レベルで作られるという可能性を排除し得る。

インジケーター遺伝子は、種々の生体分子を発現し得る。上記インジケーター遺伝子は、検出可能な生成物を発現する遺伝子もしくは検出可能な生成物を生成する酵素である。例えば、一実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素をコードする。種々のタイプのルシフェラーゼが使用され得る。代替の実施形態において、および本明細書でより詳細に記載されるように、ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたは工学技術で作製された（engineered）ルシフェラーゼのうちの１種である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子はＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）などの遺伝子改変されたルシフェラーゼ遺伝子である。

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、上記後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域において非バクテリオファージインジケーター遺伝子を含む遺伝子改変されたバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、後期プロモーターの制御下にある。ウイルス後期遺伝子プロモーターを使用することは、上記レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がウイルスカプシドタンパク質のように、高レベルで発現されるのみならず、内因性細菌遺伝子もしくはさらには初期ウイルス遺伝子のように停止もされないことを確実にする。

いくつかの実施形態において、後期プロモーターは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１プロモーター、または選択された野生型ファージにおいて見いだされる、すなわち、遺伝的改変なしの、プロモーターに類似の別のファージプロモーターである。後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であり得、バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージ、またはＴ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓもしくはＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％の相同性を有するゲノムを有する別の天然のバクテリオファージに由来し得る。

感染性因子に対する遺伝的改変は、核酸の小さなフラグメント、遺伝子の実質的部分、もしくは遺伝子全体の挿入、欠失、もしくは置換を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入もしくは置換された核酸は、非天然の配列を含む。非天然のインジケーター遺伝子は、バクテリオファージプロモーターの制御下にあるように、バクテリオファージゲノムへと挿入され得る。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、いくつかの実施形態において、遺伝的改変は、上記インジケータータンパク質生成物が上記野生型のバクテリオファージのポリペプチドを含まないように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記インジケータータンパク質生成物は、可溶性である。いくつかの実施形態において、本発明は、目的の細菌を検出するための方法を包含し、上記方法は、試験サンプルをこのような組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程を包含する。

いくつかの実施形態において、宿主細菌の感染後の子孫バクテリオファージにおけるインジケーター遺伝子の発現は、遊離の可溶性タンパク質生成物をもたらす。いくつかの実施形態において、非天然のインジケーター遺伝子は、ファージ構造タンパク質をコードする遺伝子と連結していないので、融合タンパク質を生じない。カプシドタンパク質への検出部分の融合（すなわち、融合タンパク質）を使用するシステムとは異なり、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性インジケーターまたはレポーター（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）を発現する。いくつかの実施形態において、インジケーターまたはレポーターは、理想的に、バクテリオファージ構造を含まない。すなわち、インジケーターまたはレポーターは、ファージ構造に付着していない。したがって、インジケーターまたはレポーターのための遺伝子は、組換えファージゲノム内の他の遺伝子と融合されない。これは、アッセイの感度を大いに増加させ得（単一細菌に至るまで）、アッセイを単純化し、検出可能な融合タンパク質を生成する構築物で必要とされるさらなる精製工程に起因する数時間とは対照的に、いくつかの実施形態に関しては１時間未満でアッセイが完了することを可能にする。さらに、融合タンパク質は、例えば、酵素活性部位のコンホメーションまたは基質へのアクセスを変化させ得るタンパク質折り畳みの制約に起因して、可溶性タンパク質より活性が低い場合がある。

さらに、定義による融合タンパク質は、上記バクテリオファージにおけるタンパク質のサブユニットに付着される部分の数を制限する。例えば、融合タンパク質のためのプラットフォームとして働くように設計された市販のシステムを使用すると、各Ｔ７バクテリオファージ粒子において遺伝子１０Ｂカプシドタンパク質の約４１５コピーに相当する、融合部分の約４１５コピーが生じる。この制約がなければ、感染した細菌は、上記バクテリオファージに適合し得るより多くの上記検出部分（例えば、ルシフェラーゼ）のコピーを発現すると予測され得る。さらに、大きな融合タンパク質（例えば、カプシド−ルシフェラーゼ融合物）は、上記バクテリオファージ粒子のアセンブリを阻害し得、そのようにして、より少ないバクテリオファージ子孫を生じる。従って、可溶性の非融合インジケーター遺伝子生成物が好ましいものであり得る。

いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、検出可能な酵素などのレポーターをコードする。上記インジケーター遺伝子産物は、光を生じ得、そして／または色の変化によって検出可能であり得る。種々の適切な酵素は、市販されている（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、もしくはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、上記インジケーター部分として働き得る。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、上記インジケーター部分である。他の工学技術で作製されたルシフェラーゼもしくは検出可能なシグナルを生成する他の酵素もまた、適切なインジケーター部分であり得る。

いくつかの実施形態では、可溶性検出部分の使用は、汚染している親ファージを、上記感染したサンプル細胞の溶解物から除去する必要性を排除する。融合タンパク質システムを用いると、サンプル細胞に感染させるために使用される任意のバクテリオファージは、付着される検出部分を有し、上記検出部分も含む娘バクテリオファージから区別できない。サンプル細菌の検出は、新たに作り出された（デノボ合成された）検出部分の検出に依拠するので、融合構築物の使用は、古い（親）部分を新たに作り出された（娘バクテリオファージ）部分から分離するためにさらなる工程を要する。これは、上記バクテリオファージの生活環の完了の前に、上記感染した細胞を複数回洗浄する工程、物理的もしくは化学的手段によって感染後に過剰な親ファージを不活性化する工程、および／または上記親バクテリオファージを結合部分（例えば、ビオチン）で化学的に改変する工程（これは、次いで、結合および分離され得る（例えば、ストレプトアビジン被覆セファロースビーズによって））によって達成され得る。しかし、除去時にすべてのこれら試みを使用したとしても、親ファージは、少ない数のサンプル細胞の感染を保証するために高濃度の親ファージが使用される場合に残存することができ、感染した細胞の子孫ファージからのシグナルの検出を不明確にし得るバックグラウンドシグナルを作り出す。

対照的に、本発明のいくつかの実施形態において発現される可溶性検出部分を用いると、最終溶解物からの上記親ファージの精製は不要である。なぜなら上記親ファージは、付着されるいかなる検出部分をも有しないからである。従って、感染後に存在する任意の検出部分は、感染した１個もしくは複数の細菌の存在を示して、新たに作り出されていなければならない。この利益を利用するために、親ファージの生成および調製は、細菌培養物中での親バクテリオファージの生成の間に生成された任意の遊離検出部分からの上記ファージの精製を含み得る。標準的なバクテリオファージ精製技術は、本発明に従うファージのいくつかの実施形態を精製するために使用され得る（例えば、スクロース密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度（isopycnic）密度勾配遠心分離、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、および透析または派生技術（例えば、Ａｍｉｃｏｎブランドの濃縮器 − Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｉｎｃ．）。塩化セシウム等密度超遠心分離は、親ファージ粒子を、上記細菌宿主中のファージの増殖の際に生成される汚染するルシフェラーゼタンパク質から分離するために、本発明の組換えファージの調製の一部として用いられ得る。このようにして、本発明の親組換えバクテリオファージは、上記細菌における生成の間に生成される任意のルシフェラーゼが実質的ない。上記ファージストックに存在する残りのルシフェラーゼの除去は、上記組換えバクテリオファージが試験サンプルとともにインキュベートされる場合に観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に低減し得る。

改変されたバクテリオファージのいくつかの実施形態において、上記後期プロモーター（クラスＩＩＩプロモーター、例えば、Ｔ７、Ｔ４もしくはＶｉＩ由来のもの）は、上記バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質の遺伝子を転写する同じバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼに対して高いアフィニティーを有する。これらのタンパク質は、各バクテリオファージ粒子が、これら分子の数十個もしくは数百個ものコピーを含むので、上記ファージによって作られる最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用は、最適には、上記ルシェラーゼ検出部分の発現の高レベルを確実にし得る。上記インジケーターファージが由来する元の野生型バクテリオファージに由来するか、これに特異的か、もしくはこれの下で活性である後期ウイルスプロモーター（例えば、Ｔ４ベースの、Ｔ７ベースの、もしくはＶｉＩベースのシステムに伴うＴ４もしくはＴ７後期プロモーター）の使用は、上記検出部分の最適な発現をさらに確実にし得る。標準的な細菌（非ウイルス／非バクテリオファージ）プロモーターの使用は、いくつかの場合では、発現に有害であり得る。なぜならこれらのプロモーターは、バクテリオファージ感染の間に（上記バクテリオファージがファージタンパク質生成のための細菌資源を優先するために）しばしばダウンレギュレートされるからである。従って、いくつかの実施形態において、上記ファージは、好ましくは、発現をファージ構造構成要素のサブユニットの数に制限しないゲノム内での配置を用いて、可溶性（遊離）インジケーター部分をコードし、高レベルで発現するように操作されている。

本発明の組成物は、１種または複数種の野生型または遺伝子改変された感染性因子（例えば、バクテリオファージ）および１種または複数種のインジケーター遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、同じまたは異なるインジケータータンパク質をコードおよび発現し得る、異なるインジケーターファージのカクテルを含み得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージのカクテルは、少なくとも２つの異なるタイプの組換えバクテリオファージを含む。

インジケーターバクテリオファージを調製する方法
インジケーターバクテリオファージを作製する方法の実施形態は、遺伝的改変のための野生型バクテリオファージの選択から始める。いくつかのバクテリオファージは、標的細菌に高度に特異的である。このことは、高度に特異的な検出の機会を提供する。

したがって、本発明の方法は、シグナルを増幅し、それによってサンプルに存在する低レベルの微生物（例えば、単一微生物）を検出する手段として、目的の特定の微生物を認識し、かつこれに結合する、感染性因子と関連した結合因子の高い特異度を利用する。例えば、感染性因子（例えば、バクテリオファージ）は、特定の微生物の表面レセプターを特異的に認識し、したがって、それらの微生物に特異的に感染する。よって、これらの感染性因子は、目的の微生物を標的とするために適した結合因子であり得る。

種々の感染性因子が使用され得る。代替の実施形態において、バクテリオファージ、ファージ、マイコバクテリオファージ（例えば、ＴＢおよびパラＴＢに関して）、マイコファージ（例えば、真菌に関して）、マイコプラズマファージ、および生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母、および他の顕微鏡レベルの生物に侵入し得る任意の他のウイルスは、目的の微生物を標的とするために使用され得る。例えば、一実施形態において、上記目的の微生物が細菌である場合、上記感染性因子は、バクテリオファージを含み得る。例えば、Ｅ． ｃｏｌｉの十分に研究されたファージとしては、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、およびラムダが挙げられる；ＡＴＣＣコレクションの中で入手可能な他のＥ． ｃｏｌｉファージとしては、例えば、ｐｈｉＸ１７４、Ｓ１３、Ｏｘ６、ＭＳ２、ｐｈｉＶ１、ｆｄ、ＰＲ７７２、およびＺＩＫ１が挙げられる。本明細書で考察されるように、バクテリオファージは、上記細菌の内部で複製して数百もの子孫ファージを生成し得る。上記バクテリオファージゲノムに挿入されたインジケーター遺伝子の生成物の検出は、上記サンプル中の細菌の尺度として使用され得る。

本発明のいくつかの実施形態は、感染させて、目的の細菌の検出を容易にするための迅速かつ高感度の標的化のために、組換えバクテリオファージの結合の特異性および高レベルの遺伝子発現能を利用する。いくつかの実施形態において、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージは、レポーター遺伝子を含むように遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの後期遺伝子領域が、レポーター遺伝子を含むように遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、レポーター遺伝子は、主要カプシド遺伝子の下流に配置される。他の実施形態において、レポーター遺伝子は、主要カプシド遺伝子の上流に配置される。

組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法のいくつかの実施形態は、標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程、相同組換えプラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、形質転換された標的病原性細菌に、選択された野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、プラスミド／ベクターとバクテリオファージゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程を含む。

相同組換えプラスミドを設計し、調製する種々の方法が公知である。熱ショック、Ｆ線毛媒介細菌接合、エレクトロポレーションおよび他の方法を含めて、プラスミドで細菌を形質転換するための種々の方法が公知である。相同組換えの後、特定のクローンを単離するための種々の方法も公知である。本明細書に記載されるいくつかの方法の実施形態は、特定の戦略を利用する。

したがって、インジケーターバクテリオファージを調製するための方法のいくつかの実施形態は、標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、選択されたバクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然の配列を決定する工程、ゲノムを注釈し、選択されたバクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を識別する工程、主要カプシドタンパク質遺伝子に隣接した相同組換えのための配列を設計する工程であって、配列がコドン最適化レポーター遺伝子を含む、工程、相同組換えのために設計された配列をプラスミド／ベクターに組み込む工程、プラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、形質転換された細菌について選択する工程、形質転換された細菌に選択された野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、プラスミドとバクテリオファージゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、結果として生じる組換えバクテリオファージ溶解物の力価を決定する工程、および組換えバクテリオファージを富化し、単離するために限界希釈アッセイを行う工程を含む。いくつかの実施形態は、第１の限界希釈アッセイの後に、組換えバクテリオファージが混合物の検出可能な割合を表すまで、必要に応じて限界希釈工程および力価工程を繰り返すことをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する前に、混合物中のバクテリオファージの少なくとも１／３０が組換え型になるまで、限界希釈工程および力価工程が繰り返され得る。１：３０の組換え型：野生型の比は、いくつかの実施形態において、９６プラーク（例えば、９６ウェルプレートにおいて）あたり平均３．２形質導入単位（ＴＵ）を与えると予測される。組換えファージ対野生型ファージの初期比は、米国出願第１５／４０９，２５８号において先に記載されているように、ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）に基づいて限界希釈アッセイを行うことによって決定され得る。ポアソン分布により、１：３０の比は、９６ウェルのいずれかにおいて少なくとも１ＴＵを観察する９６％の可能性をもたらす。

図１は、本発明の組換えバクテリオファージ、インジケーターファージＴ７ＳＥＬＥＣＴ（登録商標）４１５−Ｌｕｃのゲノム構造の概略図を示す。図１に示す実施形態について、検出部分は、ウイルス生活環において後期に発現される後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域１１０内に挿入されたホタルルシフェラーゼ遺伝子１００によってコードされる。後期遺伝子は構造タンパク質をコードするので、他のファージ遺伝子より高レベルで一般的に発現される。したがって、図１に示される組換えファージの実施形態において、インジケーター遺伝子（すなわち、ホタルルシフェラーゼ）は、遺伝子１０Ｂ（主要カプシドタンパク質）の直後の後期遺伝子領域に挿入されており、ホタルルシフェラーゼ遺伝子１００を含む構築物である。図１に示される構築物は、ルシフェラーゼが遺伝子１０Ｂ生成物に組み込まれないことを確実にするために、３つ全てのリーディングフレームに終止コドン１２０を含むように設計した。また、図１に示されるように、構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現を駆動するコンセンサスＴ７後期プロモーター１３０を含み得る。構築物は、いくつかのＴ７ ＵＴＲ１４０から合成された複合非翻訳領域も含み得る。この構築物は、発現がファージディスプレイシステムに固有のカプシドタンパク質の数に制限されないように可溶性ホタルルシフェラーゼが産生されることを確実にする。

本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明の感染性因子の生成に適した環境から単離された感染性因子を利用することが好ましい場合がある。このようにして、天然由来微生物に特異的な感染性因子が生成され得る。

例えば、図２は、Ｔ４関連ミオウイルスバクテリオファージＳ１６と約９５％の配列相同性を有する天然ファージであるバクテリオファージＳＥＡ１のゲノムを示す。ＳＥＡ１バクテリオファージをＦｒａｎｃｉｓｃｏ Ｍａｒｔｉｎｅｚのラボから入手し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑとデノボ配列アセンブリを使用して全ゲノム配列決定を行った。実施例で考察したように、主要カプシドタンパク質２２０および種々の他の構造遺伝子は、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子からなる後期遺伝子領域２１０内にある。ロングテール繊維形成のためのシャペロンをコードする遺伝子５７Ａ ２３０は、後期遺伝子領域の境界にある。これらのビリオンタンパク質が非常に高レベルで発現されるので、この領域に挿入される任意の遺伝子は、後期遺伝子プロモーターおよび／または他の類似の制御エレメントが使用される限りにおいて、類似の発現レベルを有すると予測され得る。

プラスミドを調製するための多数の公知の方法および商品がある。例えば、プラスミドを調製するために、ＰＣＲ、部位特異的変異誘発、制限消化、ライゲーション、クローニングおよび他の技法が組み合わせて使用され得る。合成プラスミドを商業的に注文することもできる（例えば、ＧｅｎｅＷｉｚ）。バクテリオファージゲノムを選択的に編集するために、コスミドを用いることもでき、または、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムも使用され得る。組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法のいくつかの実施形態は、組換えゲノムを生成するために野生型バクテリオファージゲノムで容易に組み換え得るプラスミドを設計することを含む。プラスミドの設計において、いくつかの実施形態は、ルシフェラーゼ遺伝子などのコドン最適化レポーター遺伝子の付加を含む。いくつかの実施形態は、上流非翻訳領域へのエレメントへの付加をさらに含む。例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージゲノムで組み換えるためのプラスミドの設計では、ｇｐ２３／主要カプシドタンパク質のＣ末端をコードする配列とＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）レポーター遺伝子の開始コドンとの間に上流非翻訳領域を付加し得る。非翻訳領域は、プロモーター、例えばＴ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、またはＳＡＰＪＶ１プロモーターを含み得る。非翻訳領域は、細菌システムで「シャインダルガルノ配列」としても公知である、リボソーム進入／結合部位（ＲＢＳ）を含むこともできる。これらのエレメントのいずれかもしくは両方、または他の非翻訳エレメントは、ファージゲノムの残りとほぼ同じＧＣ含量を含むランダム配列でできている短い上流非翻訳領域の中に埋め込まれ得る。ランダム領域はＡＴＧ配列を含むべきでないが、その理由は、それが開始コドンとして作用するからである。

本発明の組成物は、種々の感染性因子および／またはインジケーター遺伝子を含み得る。例えば、図３は、相同組換えを促進するために挿入部位の上流および下流におよそ５００ｂｐのマッチングファージ配列を有する２つの異なるファージについてのルシフェラーゼ遺伝子を有する２つの相同組換えプラスミド構築物を示す。ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼは、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む上流非翻訳領域を有するｐＢＡＶ１ｋ−Ｔ５−ＧＦＰプラスミド骨格に挿入される。Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージ組換えプラスミドは、後期遺伝子領域内に、ただし安定性の問題により主要カプシドタンパク質（ＭＣＰ）から一定の距離に、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）を挿入するように構築した。

主要カプシドタンパク質断片４１６−９１５は、ビリオンタンパク質をコードする構造遺伝子の一部である。これらのビリオンタンパク質が非常に高レベルで発現されるので、この領域に挿入される任意の遺伝子は、後期遺伝子プロモーターおよび／または他の類似の制御エレメントが使用される限りにおいて、類似の発現レベルを有すると予測され得る。

いくつかの実施形態において、本発明によるインジケーターファージは、ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を含むように遺伝子操作されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージを含む。例えば、インジケーターファージは、ゲノムがＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子の配列を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージであってもよい。組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的ＮａｎｏＬｕｃバクテリオファージゲノムは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的、ＶｉＩなどのプロモーターまたは別の後期プロモーターをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージである。

したがって、組換えの結果として生成される組換えファージの実施形態において、インジケーター遺伝子（すなわち、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標））は主要カプシドタンパク質をコードする遺伝子の直ぐ下流の後期遺伝子領域に挿入され、したがって、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）遺伝子を含む組換えバクテリオファージゲノムを生み出す。構築物は、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージ、ＶｉＩのコンセンサスプロモーター、または別の後期プロモーター、またはルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現を駆動する別の適するプロモーターをさらに含み得る。構築物は、いくつかのＵＴＲから合成された複合非翻訳領域も含み得る。この構築物は、発現がファージディスプレイシステムに固有のカプシドタンパク質の数に制限されないように可溶性ルシフェラーゼが産生されることを確実にする。

図４は、野生型バクテリオファージと、相同組換えからもたらされる組換えバクテリオファージとの混合物からの組換えファージの単離を示す。

第１の工程４０２では、相同組換えプラスミドで形質転換されたＳ．ａｕｒｅｕｓ細菌は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓバクテリオファージＫで感染させられ、およそ１８６ 野生型：１ 組換えファージ４３４の比を有する親ファージおよび組換えファージの混合物を伴って、子孫ファージを生じる。得られる組換えファージミックスは、平均５の組換え形質導入単位（ＴＵ）／プレート（９．３ＰＦＵ／ウェル）を与えるために、９６ウェルプレート４０６へと希釈される４０４。９６ウェルプレートは、野生型バクテリオファージを含むウェル４４０と比較して、組換えファージを含むウェル４３６を識別するためにルシフェラーゼ活性についてアッセイされる。細菌４３８が添加される４０８；例えば、各ウェルは、濁ったＳ．ａｕｒｅｕｓ培養物の約５０μＬを含み得る。これは、ファージが複製してルシフェラーゼ酵素４４２を生成することを可能にする。４１０に示される３７℃で２時間のインキュベーションの後、ウェルは、ルシフェラーゼ４４２の存在についてスクリーニングされ得る。任意の陽性ウェルは、単一組換えファージを播種された可能性があり、この段階において、混合物は、元の１８６：１比を超える富化である、およそ９．３ 野生型ファージ：１ 組換え型の比を含み得る。一実施形態において、５つのウェルの１つは、ルシフェラーゼアッセイを介して可溶性ルシフェラーゼを含むことが見いだされ、２．４ 合計：１ 組換え型というおよその比でファージを含んだ。必要な場合（すなわち、組換え型：合計の比が１：３０より低い場合）、この富化した培養物４１２からの子孫は、その比を増大させ、組換えファージ形質導入単位の実際の濃度を決定するために、さらなる限界希釈アッセイ４１４（単数または複数）に供され得る。例えば、比が１：３８４ 組換え型：ＰＦＵであれば、９６ウェルプレート４１６あたり約５の組換えＴＵは１９２０（５×３８４＝１９２０）の汚染する合計ファージを伴って、以前の陽性ウェルからアリコートしてもよく４１４、第２の希釈アッセイプレート４２０のウェルあたり２０（１９２０ＰＦＵ／９６ウェル＝２０ＰＦＵ／ウェル）の主に野生型ファージのおよその播種をもたらす。任意の陽性ルシフェラーゼウェルは、１９ 野生型ファージとともに、単一組換え型を播種した可能性がある。これらのウェルは、ルシフェラーゼ４４２の存在について分析され得る。

細菌の添加およびインキュベーション（例えば、３７℃で２時間）４１８の後に、可溶性ルシフェラーゼおよびファージは、およそ２０ 合計：１ 組換え型で存在する４２０。この比は、組換え型についてのＴＵ５０滴定および全ＰＦＵについてのプラークアッセイによって検証してもよい。最後に、プラークアッセイは、ルシフェラーゼ４４６を発現する組換え型についてスクリーニングするために行われ得る４２２。少数の個々のプラーク（例えば、ｎ＝４８）は、ルシフェラーゼ活性４３６について、第３のマルチウェルプレート４２６で個別に採取され、スクリーニングされ得る。一実施形態において、このアプローチは、組換え型対合計ファージの既知の比に基づいて約３つの組換え型が、スクリーニングされるプラークのミックス中にあるように、十分なプラークがスクリーニングされることを確実にするはずである。１個のプラークを、プレートから９６ウェルプレートの各ウェルへと取り出し４２４、どのウェルがルシフェラーゼ活性４４２を示すファージを含んだかを決定するために、ルシフェラーゼアッセイを行い得る４２６。ルシフェラーゼ活性を示すウェル４２８は、純粋な組換えファージ４３４を表す一方で、ルシフェラーゼ活性なしのウェル４３０は、純粋な野生型ファージ４３２を表す。

次いで、個々のプラークは、緩衝液（例えば、１００μＬ ＴＭＳ）または培地中に懸濁され得、アリコート（例えば、約５μＬ）が濁ったＳ．ａｕｒｅｕｓ培養物を含むウェルに添加され得、インキュベーション（例えば、３７℃で約４５分〜１時間）後にアッセイされ得る。陽性ウェルは、組換えファージの純粋培養物を含むと予測される。ある種の実施形態は、プラーク精製のさらなるラウンドを含み得る。

したがって、図４に図示されるように、野生型ファージゲノムでの組換えのために設計されたプラスミドの相同組換えによって生成される組換えファージは、全ファージゲノムのうちのわずか０．００５％を含む混合物から単離され得る。単離後に、大規模生産を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ検出アッセイにおいて使用するために適した高力価組換えインジケーターファージストックを得るために行い得る。さらに、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離は、ファージ粒子を、汚染するルシフェラーゼタンパク質から分離して、バックグラウンドを低減するために使用され得る。

微生物を検出するために感染性因子を使用する方法
本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明は、微生物を検出するための感染性粒子を使用するための方法を包含し得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。

一実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の細菌を検出するための方法であって、サンプルを目的の細菌に感染するバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで、バクテリオファージは、インジケーター遺伝子を含み、その結果、目的の細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間のインジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程、およびインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここでインジケータータンパク質生成物の陽性検出は目的の細菌がサンプル中に存在することを示す工程を含む、方法を含み得る。

別の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の抗生物質耐性細菌を検出するための方法であって、（ｉ）サンプルを少なくとも１つの抗生物質とインキュベートして、抗生物質に耐性である細菌を富化させる工程、（ｉｉ）富化されたサンプルを、目的の細菌に感染するバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここでバクテリオファージはインジケーター遺伝子を含み、その結果、目的の細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間のインジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物の産生を生じる工程、および（ｉｉｉ）インジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここでインジケータータンパク質生成物の陽性検出は、目的の抗生物質耐性細菌がサンプルに存在することを示す工程を含む、方法を含み得る。

ある種の実施形態において、異なるサンプルタイプまたはサイズおよびアッセイフォーマットに適合するように改変し得る一般的な概念を利用して、アッセイが行われ得る。本発明の組換えバクテリオファージ（すなわち、インジケーターバクテリオファージ）を用いる実施形態は、サンプルタイプ、サンプルサイズおよびアッセイフォーマットに応じて、１．５時間、２．０時間、２．５時間、３．０時間、３．５時間、４．０時間、４．５時間、５．０時間、５．５時間、６．０時間、６．５時間、７．０時間、７．５時間、８．０時間、８．５時間、９．０時間、９．５時間、１０．０時間、１０．５時間、１１．０時間、１１．５時間、１２時間、１２．５時間、１３．０時間、１３．５時間、１４．０時間、１４．５時間、１５．０時間、１５．５時間、１６．０時間、１６．５時間、１７．０時間、１７．５時間、１８．０時間、１８．５時間、１９．０時間、１９．５時間または２０．０時間未満の合計アッセイ時間で、特異的細菌株の迅速検出を可能にし得る。例えば、必要とされる時間量は、バクテリオファージの株およびこのアッセイで検出される細菌の株、試験されるサンプルのタイプおよびサイズ、標的の生存性のために必要とされる条件、物理的／化学的環境の複雑性、ならびに「内因性」の非標的混在細菌の濃度に応じて、若干より短いかまたは長くてもよい。

図５は、本発明の一実施形態による可溶性ルシフェラーゼを生成するインジケーターファージを使用する戦略を示す。この方法において、ファージ（例えば、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、Ｒａｍｂｏ、ＳＡＰＪＶ１ファージ）は、ファージの複製中に可溶性ルシフェラーゼを発現するように操作され得る。ルシフェラーゼの発現は、ウイルスカプシドプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ７またはＴ４後期プロモーター）によって駆動され、高発現をもたらす。親ファージはルシフェラーゼを含まないので、アッセイで検出されるルシフェラーゼは、細菌細胞の感染の間に子孫ファージの複製から生じたにちがいない。したがって、一般に、親ファージを子孫ファージから分離する必要はない。

これらの実験において、定量される細菌５０２を含むサンプル５００の少なくとも一部をスピンカラムフィルターに入れて遠心分離してＬＢブロスを取り除き、可溶性ルシフェラーゼ５０３を発現するように遺伝子操作された適切な多重度のファージ５０４を添加する。感染した細胞は、子孫ファージの複製および細胞溶解が生じるのに十分な時間（例えば、３７℃で３０〜９０分）インキュベートされ得る。次いで、溶解物中の親ファージ５０４および子孫ファージ５１６に加えて遊離ルシフェラーゼ５０３が、例えば遠心分離によって収集され得、濾液中のルシフェラーゼのレベルが、ルミノメーター５１８を使用して定量され得る。あるいは、ハイスループット方法を採用してもよく、この方法では、細菌サンプルを９６ウェルフィルタープレートに適用し、上記に列挙した全ての操作を行った後、最終遠心分離工程を行わずに元の９６ウェルフィルタープレートでルシフェラーゼを直接アッセイし得る。

図６は、本発明の一実施形態による改変されたバクテリオファージを使用した目的の細菌を検出するためのフィルタープレートアッセイを示す。簡潔には、目的の細菌６１８を含むサンプル６１６をマルチウェルフィルタープレート６０４のウェル６０２に添加し、スピン６０６してサンプルから液体を除去することによってサンプルを濃縮し得る。遺伝子改変されたファージ６２０をウェルに添加し、吸着６０８に十分な時間、追加のさらなる培地とともにインキュベートし、続いて標的細菌を感染させ、ファージ生活環を進行させる６１０（例えば、約４５分）。最後に、ルシフェラーゼ基質を添加し、存在する任意のルシフェラーゼ６２４と反応させる。得られた発光は、ルシフェラーゼ活性６２６を検出するルミノメーター６１４で測定される。

ある種の実施形態において、捕捉表面上または捕捉表面付近に細菌を濃縮することなく、アッセイが行われ得る。図７は、本発明の一実施形態による改変されたバクテリオファージを使用した目的の細菌を検出するための「濃縮なしアッセイ（Ｎｏ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）」を図示する。インジケーターファージ７１４のアリコートを、マルチウェルプレート７０４の個々のウェル７０２に分配し、次に、細菌７１２を含む試験サンプルアリコートを添加し、ファージが複製して可溶性インジケーター７１６（例えば、ルシフェラーゼ）を生成するために十分な期間にわたって（例えば、３７℃で４５分）インキュベートする７０６。次いで、プレートでのインジケーター活性７１８を測定するために、可溶性インジケーターおよびファージを含むプレートウェル７０８をアッセイしてもよい７１０（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）。この実施形態において、試験サンプルは（例えば、遠心分離によって）濃縮されないが、ある期間にわたってインジケーターファージとともに直接、単にインキュベートされ、その後、ルシフェラーゼ活性についてアッセイされる。

いくつかの実施形態において、サンプルは、成長を助長する条件でのインキュベーションによる試験の前に富化することができる。このような実施形態において、富化期間は、サンプルタイプおよびサイズに応じて、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、もしくは１６時間、またはそれより長くてもよい。

いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージは検出可能なインジケーター部分を含み、単一の病原細胞（例えば、細菌）の感染は、インジケーター部分を介して生成される増幅されたシグナルによって検出され得る。従って、本方法は、ファージ複製の間に生成されるインジケーター部分を検出することを含み得、ここで、インジケーターの検出は、目的の細菌がサンプル中に存在することを示す。

一実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の細菌を検出するための方法であって、上記サンプルを、目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで、上記組換えバクテリオファージは上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程、および上記インジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで上記インジケータータンパク質生成物の陽性検出は上記目的の細菌が上記サンプル中に存在することを示す工程を含む、方法を含み得る。いくつかの実施形態において、検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中に存在する目的の細菌の量に相当する。

本明細書により詳細に記載されるように、本発明の方法およびシステムは、サンプルに存在する細菌に感染させるために、一連の濃度の親のインジケーターバクテリオファージを利用することができる。いくつかの実施形態において、上記インジケーターバクテリオファージは、単一細胞などの上記サンプル中に非常に少ない数で存在する標的細菌を迅速に見いだし、標的細菌に結合し、感染するのに十分な濃度で上記サンプルに加えられる。いくつかの実施形態において、ファージ濃度は、１時間未満で標的細菌を見いだし、標的細菌に結合し、感染するのに十分であり得る。他の実施形態において、これらの事象は、上記サンプルへのインジケーターファージの添加の後、２時間未満、または３時間未満に起こることができる。例えば、ある種の実施形態において、上記インキュベートする工程のためのバクテリオファージ濃度は、１×１０^５ＰＦＵ／ｍＬより高いか、１×１０^６ＰＦＵ／ｍＬより高いか、または１×１０^７ＰＦＵ／ｍＬより高い。

ある種の実施形態において、上記組換え感染性因子は、上記感染性因子ストックの生産の際に生成され得るいかなる残留インジケータータンパク質も含まないように、精製され得る。従って、ある種の実施形態において、上記組換えバクテリオファージは、上記サンプルとともにインキュベートする前に、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用して精製され得る。上記感染性因子がバクテリオファージである場合、この精製は、ＤＮＡを有しないバクテリオファージ（すなわち、空のファージまたは「ゴースト」）を除去するという、追加の利点を有し得る。

本発明の方法のいくつかの実施形態において、上記微生物はサンプルからの上記微生物のいかなる単離または精製もなしに、検出され得る。例えば、ある種の実施形態において、１または数個の目的の微生物を含むサンプルは、アッセイ容器（例えば、スピンカラム、マイクロタイターウェル、またはフィルター）に直接適用され得、上記アッセイはそのアッセイ容器の中で行われる。このようなアッセイの種々の実施形態は、本明細書に開示される。

試験サンプルアリコートは、マルチウェルプレートのウェルへと直接分配され得、インジケーターファージが添加され得、そして感染のための十分な期間の後、溶解緩衝液は、インジケーター部分のための基質（例えば、ルシフェラーゼインジケーターのためのルシフェラーゼ基質）と同様に添加され得、インジケーターシグナルの検出のためにアッセイされ得る。本方法のいくつかの実施形態は、フィルタープレートの上で行うことができる。本方法のいくつかの実施形態は、インジケーターファージによる感染の前のサンプルの濃縮の有りまたはなしで行われ得る。

例えば、多くの実施形態において、マルチウェルプレートは、上記アッセイを行うために使用される。プレート（もしくは検出する工程が行われ得る任意の他の容器）の選択は、上記検出する工程に影響を及ぼし得る。例えば、いくつかのプレートは、光の放射の検出に影響を及ぼし得る、着色したもしくは白色のバックグラウンドを含み得る。概して、白色のプレートは、より高い感度を有するが、より高いバックグラウンドシグナルをも生じる。プレートの他の色は、より低いバックグラウンドシグナルを生成し得るが、わずかにより低い感度を有し得る。さらに、バックグラウンドシグナルに関する１つの理由は、１つのウェルから別の隣接するウェルへの光の漏れである。白色のウェルを有するいくつかのプレートがあるが、上記プレートの残りは黒色である。これは、上記ウェルの内部での高いシグナルを可能にするが、ウェルからウェルへの光の漏れを防止し、従って、バックグラウンドを低減し得る。従って、プレートもしくは他のアッセイ容器の選択は、上記アッセイのための感度およびバックグラウンドシグナルに影響を与え得る。

本発明の方法は、感度を増加させるための種々の他の工程を包含し得る。例えば、本明細書でより詳細に考察されるように、上記方法は、過剰な親バクテリオファージおよび／または上記バクテリオファージ調製物を汚染するルシフェラーゼもしくは他のレポータータンパク質を除去するために、上記バクテリオファージを添加した後であるが、インキュベートする前に、上記捕捉されかつ感染した細菌を洗浄する工程を包含し得る。

いくつかの実施形態において、目的の微生物の検出は、微生物の集団を増加させる方法としてサンプルを培養する必要性なしに完了し得る。例えば、ある種の実施形態において、検出に必要とされる合計時間は、１６．０時間未満、１５．０時間、１４．０時間、１３．０時間、１２．０時間、１１．０時間、１０．０時間、９．０時間、８．０時間、７．０時間、６．０時間、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間、１．０時間、４５分または３０分未満である。結果までの時間を最小にすることは、病原体に対する食品および環境の試験において重大である。

当該分野で公知のアッセイと対照的に、本発明の方法は、個々の微生物を検出し得る。したがって、ある種の実施形態において、方法は、サンプルに存在する微生物の≦１０個の細胞（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個の微生物）を検出し得る。例えば、ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに高度に特異的である。いくつかの実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓである。さらなる実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、メチシリン耐性（ＭＲＳＡ）であり得る。一実施形態において、組換えバクテリオファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを区別することができる。さらに他の実施形態において、組換えバクテリオファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを区別することができる。ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、サンプル中の特定のタイプの単一細菌を検出するために使用することができる。ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、サンプル中の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個程度の少なさの特異的細菌を検出する。

本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明は、抗生物質に対する微生物の耐性を検出するために、または述べた別の方法で、微生物に対する抗生物質の有効性を検出するために組換えバクテリオファージを使用する方法を含み得る。別の実施形態において、本発明は、感染症の処置のための抗生物質を選択するための方法を含む。さらに、本方法は、サンプル中の抗生物質耐性細菌を検出するための方法を含み得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。

本方法は、微生物を含むサンプルを、上述のように抗生物質および感染性因子と接触させることを含み得る。いくつかの実施形態において、本開示は、微生物を死滅させることまたは微生物の成長を阻害することにおける抗生物質の有効用量を決定する方法であって、（ａ）１つまたは複数の抗生物質溶液のそれぞれを、微生物を含む１つまたは複数のサンプルとともに別々にインキュベートする工程であって、ここで１つまたは複数の抗生物質溶液の濃度は異なり、範囲を画定する工程、（ｂ）１つまたは複数のサンプル中の微生物を、インジケーター遺伝子を含む感染性因子とともにインキュベートする工程であって、ここで感染性因子は目的の微生物に特異的である工程、および（ｃ）１つまたは複数のサンプルにおいて感染性因子によって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで複数のサンプルのうちの１つまたは複数におけるインジケータータンパク質生成物の検出は、１つまたは複数のサンプルのうちの１つまたは複数を処置するために使用される抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、インジケータータンパク質の検出の欠如は抗生物質が有効であることを示し、それによって抗生物質の有効用量を決定する工程を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、抗生物質および感染性因子は、サンプルが抗生物質および感染性因子の両方と接触するように、サンプルに同時に添加される。他の実施形態において、抗生物質および感染性因子は、逐次的に添加され、例えば、サンプルは抗生物質と接触し、その後、サンプルは感染性因子と接触する。ある種の実施形態において、本方法は、サンプルを抗生物質とともに一定時間インキュベートし、その後、サンプルを感染性因子と接触させることを含み得る。インキュベーション時間は、抗生物質および微生物の性質に応じて、例えば、微生物の倍増時間に基づいて、異なり得る。いくつかの実施形態において、インキュベーション時間は、２４時間未満、１８時間未満、１２時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分未満、３０分未満、１５分未満、１０分未満、または５分未満である。感染性因子との微生物のインキュベーション時間も、特定の感染性因子の生活環に応じて変動し得、いくつかの場合では、インキュベーション時間は、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分未満、３０分未満、１５分未満、１０分未満、または５分未満である。抗生物質に耐性のある微生物は生存し、増殖し得、微生物に特異的な感染性因子が複製される；逆に、抗生物質に感受性の微生物は死滅し、したがって感染性因子は複製されない。この方法による感染性因子は、インジケーター部分を含み、その量は、抗生物質で処置されたサンプルに存在する微生物の量に対応する。したがって、インジケーター部分の陽性検出は、微生物が抗生物質に耐性であることを示す。

いくつかの実施形態において、方法は、抗生物質耐性微生物が臨床サンプルに存在するかどうかを決定するために使用され得る。例えば、方法は、特定の抗生物質に耐性であるかまたは感受性であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに患者が感染しているかどうかを決定するために使用され得る。次いで、患者から得られた臨床サンプルは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な抗生物質とともにインキュベートし得る。次いで、サンプルは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な組換えファージとともに一定時間インキュベートし得る。抗生物質に耐性のあるＳ．ａｕｒｅｕｓを有するサンプルでは、組換えファージによって生成されるインジケータータンパク質の検出は陽性となる。抗生物質に感受性のＳ．ａｕｒｅｕｓを有するサンプルでは、インジケータータンパク質の検出は陰性となる。いくつかの実施形態において、抗生物質耐性の検出のための方法は、病原性細菌が感受性である有効な治療薬を選択するために使用され得る。

ある種の実施形態において、検出に必要とされる合計時間は、６．０時間未満、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間、または１．０時間未満である。検出に必要とされる合計時間は、目的の細菌、ファージのタイプ、および試験される抗生物質に応じて異なる。

必要に応じて、方法は、インジケーター部分を検出する前に微生物を溶解することをさらに含む。微生物を溶解することができる任意の溶液を使用し得る。いくつかの場合において、溶解緩衝液は、非イオン性洗剤、キレート剤、酵素、または種々の塩および因子の独自の組み合わせを含み得る。溶解緩衝液は、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、またはＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒからも市販されている。実験は、感染した溶解されていない細胞が、いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ基質の添加の際に検出可能であり得ることを示唆する。おそらくは、ルシフェラーゼは、完全な細胞溶解なしに、細胞から出ていき得る、および／またはルシフェラーゼ基質が細胞に入り得る。したがって、スピンフィルターシステムを利用する実施形態のために、溶解物へと放出されるルシフェラーゼ（かつ依然として無傷細菌内にあるルシフェラーゼでない）のみが、ルミノメーターにおいて分析される場合、溶解は、検出のために必要とされる。しかしながら、以下に説明するように、無傷の細胞および溶解した細胞をルミノメーターで直接アッセイし得る、溶液または懸濁液中のファージ感染されたサンプルを有するフィルタープレートまたは９６ウェルプレートを利用する実施形態では、溶解は検出に必要ではない場合がある。したがって、いくつかの実施形態において、抗生物質耐性の検出方法は、微生物の溶解を伴わない。

アッセイの実施形態の驚くべき局面は、サンプル中の微生物を感染性因子とともにインキュベートする工程が、感染性因子、例えばファージの単一の生活環にとって十分長いことのみを必要とすることである。ファージを使用することの増幅力は、ファージが数サイクルにわたって複製するように、より時間を要すると以前は考えられていた。インジケーターファージの単一の複製が、本発明のいくつかの実施形態による高感度かつ迅速な検出を容易にするために十分であり得る。アッセイの実施形態の別の驚くべき局面は、試験サンプルに感染するために利用される高濃度のファージ（すなわち、高ＭＯＩ）が、抗生物質で処理された非常に少ない数の抗生物質耐性標的微生物の検出を成功させたことである。ファージのバーストサイズを含むいくつかの要因は、ファージ生活環の数、したがって検出に要する時間の量に、影響を及ぼし得る。大きなバーストサイズ（およそ１００ＰＦＵ）を有するファージは、検出のために１サイクルしか必要としない場合があるが、より小さいバーストサイズ（例えば、１０ＰＦＵ）を有するファージは、検出のために複数のファージサイクルを必要とし得る。いくつかの実施形態において、ファージと試験サンプルとのインキュベーションは、単一のファージ生活環にとって十分長いことのみを必要とする。他の実施形態において、ファージと試験サンプルとのインキュベーションは、単一の生活環より長い時間量にわたるインキュベーションである。インキュベートする工程のファージ濃度は、使用されるファージのタイプに応じて異なる。いくつかの実施形態において、このインキュベートする工程のファージ濃度は、１．０×１０^５ＰＦＵ／ｍＬより高く、１．０×１０^６ＰＦＵ／ｍＬより高く、１．０×１０^７ＰＦＵ／ｍＬより高く、または１．０×１０^８ＰＦＵ／ｍＬより高い。ファージのこのような高濃度での成功は驚くべきことである。なぜならファージの多数が、「非感染溶菌」と以前に関連しており、これは、標的細胞を直ぐに死滅させ、それによって、より早期のファージアッセイからの有用なシグナルの生成を妨げたからである。本明細書で記載されるファージストックの精製（例えば、塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離による精製）は、この問題を軽減する助けとなることがあり得る。なぜならファージと関連付けられたいかなる汚染するルシフェラーゼを除去する工程に加えて、この精製はまた、ゴースト粒子（ｇｈｏｓｔ ｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＤＮＡを失った粒子）を除去し得るからである。ゴースト粒子は、「非感染溶菌」を介して細菌細胞を溶解し得、細胞を早期に死滅させ、それによってインジケーターシグナルの生成を防止し得る。電子顕微鏡法は、粗製の組換えファージ溶解物（すなわち、塩化セシウム精製前）が５０％より多いゴーストを有し得ることを明らかに示す。これらのゴースト粒子は、細胞膜に穴をあける多くのファージ粒子の作用を通じて、微生物の早期の死滅に寄与し得る。したがって、ゴースト粒子は、高いＰＦＵ濃度が有害であると報告された以前の問題の一因であった可能性がある。

本開示に記載されるインジケーター部分のいずれかは、抗生物質処理後の微生物の生存性を検出し、それによって抗生物質耐性を検出するために使用し得る。いくつかの実施形態において、感染性因子と関連するインジケーター部分は、感染性因子の複製の間または後に検出可能であり得る。例えば、上述のように、いくつかの場合では、インジケーター部分は、内因性シグナルを放射するタンパク質、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質など）であり得る。インジケーターは光を生成し得る、および／または色の変化によって検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、ルミノメーターを使用して、インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）を検出し得る。しかしながら、他の機械またはデバイスも使用してもよい。例えば、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラは、色の変化および他の光放射を検出し得る。

いくつかの実施形態において、サンプルの抗生物質への曝露は、５分またはそれより長くにわたって続き得、種々の時点での検出は、感度を最適化するために望ましいことであり得る。例えば、抗生物質で処理された一次サンプルのアリコートは、異なる時間間隔（例えば、５分、１０分、または１５分）で採取し得る。次いで、種々の時間間隔からのサンプルを、ファージに感染させ、基質の添加後にインジケーター部分を測定し得る。

いくつかの実施形態において、シグナルの検出は、抗生物質耐性を決定するために使用される。いくつかの実施形態において、サンプルによって生成されるシグナルは、実験的に決定された値と比較される。さらなる実施形態において、実験的に決定された値は、コントロールサンプルによって生成されたシグナルである。いくつかの実施形態において、バックグラウンド閾値は、微生物を含まないコントロールを使用して決定される。いくつかの実施形態において、実験的に決定された値は、平均バックグラウンドシグナル＋平均バックグラウンドシグナルの１〜３倍またはそれより大きい標準偏差から算出されたバックグラウンド閾値である。いくつかの実施形態において、バックグラウンド閾値は、平均バックグラウンドシグナル＋平均バックグラウンドシグナルの２倍の標準偏差から算出され得る。他の実施形態において、バックグラウンド閾値は、いくつかの倍数（例えば、２または３）の平均バックグラウンドシグナルから算出され得る。バックグラウンド閾値を超えるサンプルシグナルの検出は、サンプル中の１つまたは複数の抗生物質耐性微生物の存在を示す。例えば、平均バックグラウンドシグナルは、２５０ＲＬＵであり得る。閾値バックグラウンド値は、平均バックグラウンドシグナル（例えば、２５０）に３を乗じて７５０ＲＬＵの値を計算することによって算出され得る。シグナル値が７５０ＲＬＵを超える細菌を有するサンプルは、抗生物質耐性細菌の含有について陽性であると決定される。

あるいは、実験的に決定された値は、コントロールサンプルによって生成されたシグナルである。アッセイは、種々の適切なコントロールサンプルを含み得る。例えば、微生物に特異的な感染性因子を含まないサンプル、または感染性因子を含むが微生物を含まないサンプルが、バックグラウンドシグナルレベルのためのコントロールとしてアッセイされ得る。いくつかの場合では、抗生物質で処理されていない微生物を含むサンプルが、感染性因子を使用して抗生物質耐性を決定するためのコントロールとしてアッセイされる。

いくつかの実施形態において、サンプルシグナルは、抗生物質耐性微生物がサンプルに存在するかどうかを決定するために、コントロールシグナルと比較される。感染性因子と接触したが抗生物質と接触していないコントロールサンプルと比較して、シグナルの検出に変化がないことは、微生物が抗生物質に耐性であることを示し、感染性因子と接触したが抗生物質と接触していないコントロールサンプルと比較して、インジケーター部分の検出の減少は、微生物が抗生物質に感受性であることを示す。検出に変化がないとは、抗生物質および感染性因子で処理されたサンプルから検出されたシグナルが、抗生物質で処理されていないコントロールサンプルからのシグナルの少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であることを指す。検出の減少とは、抗生物質および感染性因子で処理されたサンプルから検出されたシグナルが、抗生物質で処理されていないコントロールサンプルからのシグナルの８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、または少なくとも３０％であることを指す。

必要に応じて、目的の微生物を含むサンプルは、培養されていないサンプルである。必要に応じて、感染性因子はファージであり、宿主細菌の感染後のファージ複製の間のインジケーター遺伝子の発現が可溶性インジケータータンパク質生成物をもたらすようにファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む。上述のように、本方法で使用される組成物のそれぞれの特徴は、目的の微生物の抗生物質耐性を検出するための方法においても利用することができる。

微生物を死滅させるための抗生物質の有効用量を決定する方法も本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、抗生物質とは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種を死滅させるために有効である。例えば、抗生物質は、ほとんどのメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）に有効であるセフォキシチンであり得る。典型的には、異なる濃度を有する１つまたは複数の抗生物質溶液は、溶液の異なる濃度の範囲が画定するように調製される。いくつかの場合において、最も濃度の低い抗生物質溶液の最も濃度の高い抗生物質溶液に対する濃度比は、１：２〜１：５０、例えば、１：５〜１：３０、または１：１０〜１：２０の範囲である。いくつかの場合において、１つまたは複数の抗生物質溶液の最低濃度は、少なくとも１μｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬである。１つまたは複数の抗生物質溶液のそれぞれは、目的の微生物を含むサンプルの１つのアリコートとともにインキュベートされる。いくつかの場合では、微生物に特異的であり、インジケーター部分を含む感染性因子は、抗生物質溶液と同時に添加される。いくつかの場合において、サンプルのアリコートは、感染性因子の添加前の一定時間にわたって抗生物質溶液とともにインキュベートされる。インジケーター部分は検出することができ、陽性検出は、抗生物質溶液が有効でないことを示し、陰性検出は、抗生物質溶液が有効であり、抗生物質溶液の濃度が有効用量であることを示す。したがって、いくつかの実施形態において、目的の微生物を死滅させることにおける抗生物質の有効用量を決定する方法は、１つまたは複数の抗生物質溶液のそれぞれを、サンプル中の目的の微生物とともに別々にインキュベートする工程であって、ここで１つまたは複数の抗生物質溶液の濃度は異なり、範囲を画定する工程、１つまたは複数のサンプル中の微生物を、インジケーター部分を含む感染性因子とともにインキュベートする工程、１つまたは複数のサンプルにおいて感染性因子のインジケーター部分を検出する工程であって、ここで１つまたは複数のサンプルのうちの１つまたは複数におけるインジケーター部分の陽性検出は、１つまたは複数のサンプルのうちの１つまたは複数を処理するために使用される抗生物質溶液の濃度が有効でないことを示し、インジケータータンパク質の検出の欠如は抗生物質が有効であることを示し、それによって抗生物質の有効用量を決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、２つまたはより多くの抗生物質溶液が試験され、１つまたは複数の抗生物質溶液において最も濃度の低い溶液および最も濃度の高い溶液の濃度比は、１：２〜１：５０、例えば、１：５〜１：３０、または１：１０〜１：２０の範囲である。いくつかの場合において、１つまたは複数の抗生物質溶液の最低濃度は、少なくとも１μｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬ、または少なくとも１００μｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態において、本発明は、抗生物質感受性微生物の存在下で抗生物質耐性微生物を検出するための方法を含む。ある種の事例において、抗生物質耐性細菌の検出は、医療現場における感染の拡大を防止するために使用することができる。いくつかの実施形態において、医療現場における患者は、抗生物質耐性細菌の定植についてモニタリングされ得る。次いで、抗生物質耐性細菌の拡大を防止するための予防的措置を実施し得る。

抗生物質耐性微生物を検出するための方法のいくつかの実施形態において、サンプルは、抗生物質耐性細菌と抗生物質感受性細菌の両方を含み得る。例えば、サンプルは、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方を含み得る。いくつかの実施形態において、ＭＲＳＡは、サンプルからＭＲＳＡを単離する必要性なしに、ＭＳＳＡの存在下で検出され得る。抗生物質の存在下で、ＭＳＳＡは閾値を超えるシグナルを生成しないが、サンプルに存在するＭＲＳＡは、閾値を超えるシグナルを生成することができる。したがって、両方がサンプルに存在する場合、閾値を超えるシグナルは、抗生物質耐性株（例えば、ＭＲＳＡ）の存在を示す。

したがって、本発明の局面は、インジケーター部分を介して試験サンプル中の微生物を検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、目的の微生物が細菌である場合、インジケーター部分は、感染性因子（例えば、インジケーターバクテリオファージ）と関連付けられ得る。インジケーター部分は、基質と反応して、検出可能なシグナルを放射してもよいし、内因性のシグナル（例えば、蛍光タンパク質）を放射してもよい。いくつかの実施形態において、検出感度は、試験サンプル中の目的の微生物の５０個、２０個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個程度の少なさの細胞の存在を明らかにし得る。いくつかの実施形態において、目的の微生物の実に１個の細胞が、検出可能なシグナルを生じ得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ４様またはＶｉＩ様バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来する。ある種の実施形態において、組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに高度に特異的である。

いくつかの実施形態において、上記感染性因子によってコードされる上記インジケーター部分は、上記感染性因子の複製の間もしくは後に検出可能であり得る。インジケーター部分としての使用に適した検出可能な生体分子の多くの異なるタイプが、当該分野で公知であり、多くは市販されている。いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、酵素を含み、これは上記インジケーター部分として働く。いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージのゲノムは、可溶性タンパク質をコードするように改変される。いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、検出可能な酵素をコードする。上記インジケーターは、光を放射し得る、および／または色の変化によって検出可能であり得る。種々の適切な酵素は、市販されている（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、もしくはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、上記インジケーター部分として働き得る。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、上記インジケーター部分である。他の工学技術で作製されたルシフェラーゼもしくは検出可能なシグナルを生成する他の酵素はまた、適切なインジケーター部分であり得る。

したがって、いくつかの実施形態において、本方法、システムまたはキットの組換えバクテリオファージは、野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージから調製される。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、内因性シグナルを放射するタンパク質、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質など）をコードする。インジケーターは、光を放射し得る、および／または色の変化によって検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、基質と相互作用してシグナルを発生する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼまたは工学技術で作製されたルシフェラーゼ、例えばＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）、Ｒｌｕｃ８．６−５３５もしくはオレンジナノ−ランタンのうちの１つである。

上記インジケーターを検出する工程は、光の放射を検出する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、ルミノメーターは、基質とのインジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）の反応を検出するために使用され得る。ＲＬＵの検出はルミノメーターで達成することができ、または、他の機械もしくはデバイスもまた、使用され得る。例えば、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラが、色の変化および他の光の放射を検出し得る。検出にとって絶対ＲＬＵが重要であるが、単一細胞または少数の細胞が確実に検出されるためにはシグナル対バックグラウンド比も高い（例えば、＞２．０、＞２．５または＞３．０）ことが必要である。

いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、上記ファージが特異的に認識しかつ感染する細菌の感染の際にのみ生成される酵素（例えば、ルシフェラーゼ）の遺伝子を含むように遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、上記インジケーター部分は、ウイルス生活環において後期に発現される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される場合、上記インジケーターは、可溶性タンパク質（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）であり、そのコピー数を制限するファージ構造タンパク質と融合されない。

従って、インジケーターファージを利用するいくつかの実施形態において、本発明は、目的の微生物を検出するための方法を包含し、上記方法は、少なくとも１個のサンプル細菌を捕捉する工程；該少なくとも１個の細菌を、複数のインジケーターファージとともにインキュベートする工程；子孫ファージを生成し、可溶性インジケーター部分を発現するための、感染および複製の時間を与える工程；ならびに上記子孫ファージ、好ましくは上記インジケーターを検出する工程であって、ここで上記インジケーターの検出は、上記細菌が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。

例えば、いくつかの実施形態において、試験サンプル細菌は、プレートの表面に結合することによって、または上記サンプルを細菌学的フィルター（例えば、０．４５μｍ孔サイズのスピンフィルターまたはプレートフィルター）を介してろ過することによって、捕捉され得る。一実施形態において、上記感染性因子（例えば、インジケーターファージ）は、最小限の体積で、上記フィルター上に直接捕捉されたサンプルに添加される。一実施形態において、上記フィルターまたはプレート表面上に捕捉された微生物は、その後、過剰な結合されていない感染性因子を除去するために、１回または複数回洗浄される。一実施形態において、培地（例えば、本明細書でＬＢとも呼ばれるＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロスまたは本明細書でＴＳＢとも呼ばれるＴｒｙｐｔｉｃ ＳｏｙブロスもしくはＴｒｙｐｔｏｎｅ Ｓｏｙブロス）は、細菌細胞およびファージの複製ならびに上記インジケーター部分をコードする遺伝子の高レベル発現を可能にするために、さらなるインキュベーション時間にわたり添加され得る。しかし、試験アッセイのいくつかの実施形態の驚くべき局面は、インジケーターファージによる上記インキュベーション工程が単一のファージ生活環にとって十分長いことのみが必要であるということである。バクテリオファージを使用することの増幅力は、上記ファージが数サイクルにわたって複製するように、より時間を要すると以前は考えられていた。インジケーターファージの単一の複製サイクルが、本発明のいくつかの実施形態に従って高感度かつ迅速検出を容易にするために十分であり得る。

いくつかの実施形態において、細菌を含む試験サンプルのアリコートをスピンカラムに適用し得、組換えバクテリオファージでの感染および任意の過剰なバクテリオファージを除去するための任意選択の洗浄後に、検出される可溶性インジケーターの量は、感染した細菌によって生成されるバクテリオファージの量に比例する。

上記細菌の溶解の際に周囲の液体へと放出された可溶性インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）は、次いで、測定および定量され得る。一実施形態において、上記溶液は、フィルターを通して遠心され、その濾液はアッセイ（例えば、ルミノメーターでの）のために新しい容器に収集され、その後、上記インジケーター酵素のための基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）が添加される。あるいは、インジケーターシグナルは、フィルター上で直接測定され得る。

種々の実施形態において、上記精製された親インジケーターファージは、上記検出可能なインジケーター自体を含まない。なぜなら上記親ファージは、これが試験サンプルとともにインキュベーションするために使用される前に精製され得るからである。後期（クラスＩＩＩ）遺伝子の発現は、ウイルス生活環において後期に起こる。本発明のいくつかの実施形態において、親ファージは、いかなる存在するインジケータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をも排除するために精製され得る。いくつかの実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる。従って、多くの実施形態において、上記検出工程の前に親ファージを子孫ファージから分離することは必須ではない。一実施形態において、上記微生物は、細菌であり、上記インジケーターファージは、バクテリオファージである。一実施形態において、上記インジケーター部分は、可溶性ルシフェラーゼであり、これは、上記宿主微生物の溶解の際に放出される。

従って、代替の一実施形態において、上記インジケーター基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）は、フィルター上にあるままであるかまたはプレート表面に結合したままである上記サンプルの一部とともにインキュベートされ得る。よって、いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、９６ウェルフィルタープレート（もしくは通常の９６ウェルプレート）であり、上記基質反応は、上記プレートを上記ルミノメーターの中に直接置くことによって検出され得る。

例えば、一実施形態において、本発明は、ＭＲＳＡを検出するための方法であって、９６ウェルフィルタープレート上に捕捉された細胞を、感染に際してルシフェラーゼを発現することができる複数の親インジケーターファージで感染させる工程、過剰なファージを洗い流す工程、抗生物質を含むＬＢブロスを添加し、ファージが特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ標的を複製および溶解するための時間（例えば、３０〜９０分）を可能にする工程、ならびにルシフェラーゼ基質を添加し、９６ウェルプレート中でルシフェラーゼ活性を直接測定することによってインジケータールシフェラーゼを検出する工程であって、ここでルシフェラーゼ活性の検出は、ＭＲＳＡがサンプルに存在することを示す工程を含む、方法を含み得る。

いくつかの実施形態において、上記細菌の溶解は、上記検出工程の前、その間、もしくはその後に起こり得る。実験は、感染した溶解されていない細胞が、いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ基質の添加の際に検出可能であり得ることを示唆する。おそらくは、ルシフェラーゼは、完全な細胞溶解なしに、細胞から出ていき得る、および／またはルシフェラーゼ基質が細胞に入り得る。従って、スピンフィルターシステムを利用する実施形態のために、上記溶解物へと放出されルシフェラーゼのみ（かつルシフェラーゼはさらに無傷の細菌の中にない）が、上記ルミノメーターにおいて分析される場合、溶解は、検出のために必要とされる。しかし、溶液もしくは懸濁物のサンプルとともにフィルタープレートもしくは９６ウェルプレートを利用する実施形態のために、無傷の細胞および溶解した細胞で満ちている元のプレートが上記ルミノメーターにおいて直接アッセイされる場合、溶解は、検出に必須ではない。

いくつかの実施形態において、インジケーター部分（例えば、ルシフェラーゼ）と基質との反応は、３０分またはそれより長くにわたって続き得、種々の時点での検出は、感度を最適化するために望ましいことであり得る。例えば、上記固体支持体として９６ウェルフィルタープレートを、および上記インジケーターとしてルシフェラーゼを使用する実施形態において、ルミノメーター読み取りは、最初に、および１０分もしくは１５分の間隔で、上記反応が完了するまで行われ得る。

驚くべきことに、試験サンプルに感染させるために利用される高濃度のファージは、非常に短い時間枠で、標的微生物の非常に少数の検出を成功裏に達成した。ファージを試験サンプルとともにインキュベートすることは、いくつかの実施形態において、単一のファージ生活環にとって十分長いことのみを必要とする。いくつかの実施形態において、このインキュベートする工程のためのバクテリオファージの濃度は、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１．０×１０^７、１．１×１０^７、１．２×１０^７、１．３×１０^７、１．４×１０^７、１．５×１０^７、１．６×１０^７、１．７×１０^７、１．８×１０^７、１．９×１０^７、２．０×１０^７、３．０×１０^７、４．０×１０^７、５．０×１０^７、６．０×１０^７、７．０×１０^７、８．０×１０^７、９．０×１０^７、もしくは１．０×１０^８ ＰＦＵ／ｍＬより高い。

ファージのこのような高濃度での成功は驚くべきことである。なぜならファージの多数が、「非感染溶菌」と以前に関連しており、これは、標的細胞を死滅させ、それによって、より早期のファージアッセイからの有用なシグナルの生成を妨げたからである。本明細書で記載される調製されたファージストックの浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）は、この問題を軽減する助けとなると考えられる（例えば、塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離による浄化）。なぜなら上記ファージと関連付けられたいかなる汚染するルシフェラーゼをも除去する工程に加えて、この浄化はまた、ゴースト粒子（ｇｈｏｓｔ ｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＤＮＡを失った粒子）を除去し得るからである。上記ゴースト粒子は、「非感染溶菌」を介して細菌細胞を溶解し得、上記細胞を早期に死滅させ、それによってインジケーターシグナルの生成を防止することができる。電子顕微鏡法は、粗製のファージ溶解物（すなわち、塩化セシウム浄化前）が５０％より多いゴーストを有し得ることを明らかに示す。これらのゴースト粒子は、細胞膜に穴をあける多くのファージ粒子の作用を通じて、上記微生物の早期の死滅に寄与し得る。従って、ゴースト粒子は、高いＰＦＵ濃度が有害であると報告された以前の問題の一因であった可能性がある。さらに、非常にきれいなファージ調製物は、上記アッセイが洗浄工程なしで行われることを可能にし、このことは、初期濃縮工程なしで上記アッセイが行われることを可能にする。いくつかの実施形態は初期濃縮工程を含み、いくつかの実施形態において、この濃縮工程はより短い富化インキュベーション時間を可能にする。

試験方法のいくつかの実施形態は、確認アッセイをさらに含み得る。初期の結果を通常後の時点で確認するために、様々なアッセイが当該分野で公知である。例えば、サンプルが培養され得（例えば、実施例４に記載されるＣＨＲＯＭＡＧＡＲ（登録商標）／ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）アッセイ）、微生物ＤＮＡの存在を確認するためにＰＣＲが利用され得、または、初期の結果を確認するために他の確認アッセイが使用され得る。

ある種の実施形態において、本発明の方法は、感染性因子での検出に加えて、サンプルから目的の微生物を精製および／または濃縮するための結合因子（例えば、抗体）の使用を組み合わせる。例えば、ある種の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物を検出するための方法であって、先の支持体上のサンプル由来の微生物を目的の微生物に特異的な捕捉抗体を使用して捕捉する工程、サンプルを目的の微生物に感染する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程であって、ここで組換えバクテリオファージはバクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されるインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間のインジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる工程、およびインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここでインジケータータンパク質生成物の陽性検出は目的の微生物がサンプルに存在することを示す工程を含む、方法を含む。

例えば、図８は、本発明の一実施形態による改変されたバクテリオファージを使用した目的の細菌を検出するためのハイブリッドイムノファージ（Ｈｙｂｒｉｄ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｐｈａｇｅ、ＨＩＰ）アッセイを図示する。サンプルを、細菌特異的抗体で十分にコーティングされたマイクロタイタープレートに最初に適用する８０２。次いで、プレートを遠心分離して、細菌の捕捉抗体への結合を促す８０４。完全な細菌捕捉を可能にするのに十分な時間が経過した後、細菌特異的ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ファージを含む溶液を各サンプルに添加する８０６。ファージとのインキュベーションは、単一または複数のファージの捕捉された細菌への結合および付着をもたらす８０８。最後に、サンプルをインキュベートしてファージ複製およびルシフェラーゼ発現を促し、細胞溶解および可溶性ルシフェラーゼの放出を導く８１０。

合成生物学における最近の進歩は、病原性疾患を処置するためのバクテリオファージベースの治療アプローチにおける関心を高めている（例えば、Phage Therapy in the Era of Synthetic Biology, Cold Spring Harb Perspect Biol 2016; 8:a023879；ならびに米国特許第９，５９７，４０７号、ならびに米国特許出願第２０１７０２６６３０６号および第２０１６０３３１８０４号を参照、これらの内容は、全体が本明細書に引用されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。特定のタイプの細菌などの特定の微生物の存在について患者からの医学的サンプル中の病原体を検出するように設計および操作されたバクテリオファージは、かかる治療ファージの有用性を増強することができる。

いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、特定の病原体、例えば、特定の属または種の細菌の存在について患者の最初のサンプルを試験するために利用され得る。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、臨床サンプル中の特定の病原体を検出するために使用され得る。このようにして、インジケーターファージは、特定の抗生物質、他の薬物、または治療ファージなどの特定の治療について潜在的な有効性を評価するために、例えば、所与の患者の感染症または他の病原性の医学的状態との関連で、コンパニオン診断と同様の方法で使用することができる。いくつかの実施形態において、診断インジケーターファージは、前述のように、天然に存在するバクテリオファージの遺伝的改変によって調製することができる。

いくつかの実施形態において、合成技術を通じて調製されるインジケーターファージは、非臨床用途のために使用され得る。例えば、インジケーターファージは、食品中の特定の細菌の存在を特定するための食品安全性診断として使用され得る。他の実施形態において、診断インジケーターファージは、合成技術を通じて調製され得る。例えば、合成ファージゲノムは、種々のタイプの細菌における対応するファージの形質転換および増殖のために設計および構築され得る。いくつかの事例において、合成生物学的技法を使用して、インジケーターファージ標的細菌を使用してインジケーターファージを生成することができる。他の事例において、より都合のよい細菌を使用して、インジケーターファージを生成することができる。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａを標的とするインジケーターファージのための合成ゲノムは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、またはより都合のよい種（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）で生成され得る。

いくつかの実施形態において、合成ファージは、病原体検出アッセイにおいて使用するための所望の形質を最適化するように設計される。いくつかの実施形態において、バイオインフォマティクスおよび遺伝的改変の以前の分析が、所望の形質を最適化するために用いられる。例えば、いくつかの実施形態において、ファージテールタンパク質をコードする遺伝子が、特定の種の細菌を認識し、それに結合するように最適化され得る。他の実施形態において、ファージテールタンパク質をコードする遺伝子は、細菌の属全体、または属内の種の特定の群を認識し、それに結合するように最適化され得る。このようにして、ファージを最適化して、病原体のより広いまたはより狭い群を検出することができる。いくつかの実施形態において、合成ファージは、レポーター遺伝子の発現を改善するように設計され得る。加えて、および／または代替的に、いくつかの事例において、合成ファージは、検出を改善するためにファージのバーストサイズを増加させるように設計され得る。

いくつかの実施形態において、ファージの安定性は、貯蔵寿命を改善するために最適化され得る。例えば、その後のファージ安定性を高めるために、エンザイバイオティック（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ）溶解度を高めてもよい。加えて、および／または代替的に、ファージの熱安定性を最適化してもよい。熱安定性ファージは、貯蔵の間の機能活性をより良好に保存し、それによって貯蔵寿命を向上させる。したがって、いくつかの実施形態において、熱安定性および／またはｐＨ耐性が最適化され得る。

いくつかの種の細菌は、免疫系による攻撃から自身を保護するためにバイオフィルム壁を構築する。これらのバイオフィルムは、細菌を効果的に標的化することを困難にし得る。細菌バイオフィルムを分解することができるいくつかの酵素（例えば、グリコシドヒドラーゼＰｅｌＡｈおよびＰｓｌＧｈ）が識別されている。いくつかの実施形態において、ファージは、可溶性または融合ビリオンタンパク質のいずれかをコードするように改変して、酵素の組込みによりバイオフィルムが分解されるようにし得る。

いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたファージまたは合成により誘導されたファージは、検出可能なインジケーターを含む。いくつかの実施形態において、インジケーターは、ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ファージゲノムは、インジケーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子または検出可能なインジケーターをコードする別の遺伝子）を含む。

別の局面において、本発明は、対象のための処置を選択するための方法であって、（ｉ）対象から生物学的サンプルを取得する工程、（ｉｉ）インジケーターファージを使用して、生物学的サンプル中の特定の微生物または微生物のカテゴリーを検出する工程、および（ｉｉｉ）生物学的サンプルにおいて検出された特定の微生物のアイデンティティに基づいて処置を選択する工程を含む、方法を含み得る。

いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、合成により調製されたか否かにかかわらず、患者サンプル中の病原体を検出し、続けていくつかのタイプの処置を開始するために使用することができる。いくつかの実施形態において、処置は、ファージベースの治療薬であり得る。他の実施形態において、処置は、抗生物質（例えば、ペニシリンまたはシクロスポリンなどの旧来の抗生物質）であり得る。他の実施形態において、処置は、別のタイプの薬物または治療であり得る。このようにして、インジケーターファージは、任意のタイプの処置または治療の進行または有効性をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、処置の開始の数時間後または数日後に採取された患者サンプルの病原体含量を検出およびモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、慢性感染症との関連においてサンプルをモニタリングするために使用することができ、処置の開始後、数日間、数週間、数ヶ月間、または数年間であり得る。

本発明のシステムおよびキット
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で開示される方法を行うための構成要素を含むシステム（例えば、自動化システムもしくはキット）を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるシステムまたはキットにはインジケーターファージが含まれる。本明細書に記載される方法は、このようなインジケーターファージシステムまたはキットも利用し得る。本明細書で記載されるいくつかの実施形態は、上記方法を行うために必要とされる試薬および材料の最小限の量を考慮すると、自動化もしくはキットに特に適している。ある種の実施形態において、上記キットの構成要素の各々は、第１の部位から第２の部位へと送達可能である自己充足式ユニットを含み得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムもしくはキットを含む。上記システムもしくはキットは、ある種の実施形態において、上記サンプルを上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素、および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含み得る。本発明のシステムおよびキットの両方のいくつかの実施形態において、上記感染性因子は、上記目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージであり、上記組換えバクテリオファージは、上記インジケーター部分として上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含み、その結果、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる。いくつかのシステムは、上記目的の微生物を固体支持体上に捕捉するための構成要素をさらに含む。

他の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物を迅速に検出するための方法、システム、またはキットであって、目的の微生物に特異的な感染性因子構成要素であって、感染性因子がインジケーター部分を含む感染性因子構成要素と、インジケーター部分を検出するための構成要素とを含む、方法、システム、またはキットを含む。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージである。一実施形態において、組換えバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来する。ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、特定の細菌に高度に特異的である。例えば、ある種の実施形態において、組換えバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに高度に特異的である。一実施形態において、組換えバクテリオファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下で、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒを区別することができる。別の実施形態において、組換えバクテリオファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを区別することができる。ある種の実施形態において、システムまたはキットは、サンプル中の特定のタイプの単一の細菌を検出する。いくつかの実施形態において、システムまたはキットは、サンプル中の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個程度の少なさの特異的細菌を検出する。

ある種の実施形態において、上記システムおよび／もしくはキットは、上記捕捉された微生物サンプルを洗浄するための構成要素をさらに含み得る。さらにもしくは代わりに、上記システムおよび／もしくはキットは、上記インジケーター部分の量を決定するための構成要素をさらに含み得、ここで検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中の微生物の量に相当する。例えば、ある種の実施形態において、上記システムもしくはキットは、ルシフェラーゼ酵素活性を測定するための、ルミノメーターもしくは他のデバイスを含み得る。

いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、同じ構成要素は、複数工程（multiple steps）のために使用され得る。いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、上記工程は、ユーザーによってコンピューター入力を介して自動化もしくは制御され、そして／または液体取り扱いロボットが少なくとも１つの工程を行う。

従って、ある種の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムまたはキットを包含し得、上記システムまたはキットは、上記サンプルを上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素；上記微生物を上記サンプルから固体支持体上に捕捉するための構成要素；上記捕捉された微生物サンプルを洗浄して、結合されていない感染性因子を除去するための構成要素；および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含む。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、捕捉する工程および／またはインキュベートする工程および／または洗浄する工程のために使用され得る（例えば、フィルター構成要素）。いくつかの実施形態は、上記サンプル中の上記目的の微生物の量を決定するための構成要素であって、ここで検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中の微生物の量に相当する構成要素をさらに含む。このようなシステムは、微生物の迅速検出のための方法に関して上記に記載されるものに類似の種々の実施形態および下位実施形態を含み得る。一実施形態において、上記微生物は、細菌であり、上記感染性因子は、バクテリオファージである。コンピューター化システムにおいて、上記システムは、完全に自動化されていても、半自動化されていても、もしくはコンピューターを介してユーザーによって指示されてもよい（もしくはこれらのいくつかの組み合わせ）。

いくつかの実施形態において、上記システムは、上記サンプル中の他の構成要素から上記目的の微生物を単離するための構成要素を含み得る。

一実施形態において、本発明は、目的の微生物を検出するための構成要素を含むシステムまたはキットであって、少なくとも１つの微生物をサンプル中の他の構成要素から単離するための構成要素、少なくとも１つの微生物を複数の親感染性因子で感染させるための構成要素、少なくとも１つの感染させた微生物を溶解して微生物に存在する子孫感染性因子を放出するための構成要素、ならびに子孫感染性因子、またはより高感度で、感染性因子によってコードされおよび発現される可溶性タンパク質を検出するための構成要素を含み、感染性因子または感染性因子の可溶性タンパク質生成物の検出は、微生物がサンプルに存在することを示す、システムまたはキットを含む。感染性因子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的ＮＡＮＯＬＵＣバクテリオファージを含み得る。

上記システムまたはキットは、子孫感染性因子の検出のために種々の構成要素を含み得る。例えば、一実施形態において、上記子孫感染性因子（例えば、バクテリオファージ）は、インジケーター部分を含み得る。一実施形態において、上記子孫感染性因子（例えば、バクテリオファージ）における上記インジケーター部分は、複製の間に発現される検出可能な部分（例えば、可溶性ルシフェラーゼタンパク質）であり得る。

他の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのキットを包含し得、上記システムは、上記サンプルを上記目的の微生物に特異的な感染性因子とともにインキュベートするための構成要素であって、ここで上記感染性因子はインジケーター部分を含む構成要素；上記微生物を上記サンプルから固体支持体上に捕捉するための構成要素；上記捕捉された微生物サンプルを洗浄して、結合されていない感染性因子を除去するための構成要素；および上記インジケーター部分を検出するための構成要素を含む。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、捕捉する工程および／もしくはインキュベートする工程および／もしくは洗浄する工程のために使用され得る。いくつかの実施形態は、上記サンプル中の上記目的の微生物の量を決定するための構成要素をさらに含み、ここで検出されるインジケーター部分の量は、上記サンプル中の微生物の量に相当する。このようなキットは、微生物の迅速検出の方法に関して上記で記載されるものに類似の種々の実施形態および下位実施形態を含み得る。一実施形態において、上記微生物は細菌であり、上記感染性因子はバクテリオファージである。

いくつかの実施形態において、キットは、上記サンプル中の他の構成要素から上記目的の微生物を単離するための構成要素を含み得る。

本発明のこれらのシステムおよびキットは、種々の構成要素を含む。本明細書で使用される場合、用語「構成要素」とは、広く定義され、記載される方法を実施するための任意の適した装置もしくは適した装置の集まりを含む。上記構成要素は、いかなる特定の方法においても互いに関して一体的に接続される必要も据え付けられる必要もない。本発明は、互いに関して上記構成要素の任意の適切な配置を含む。例えば、上記構成要素は、同じ空間の中に存在する必要はない。しかしいくつかの実施形態において、上記構成要素は、一体ユニットにおいて互いに接続される。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、複数機能を実行し得る。

コンピューターシステムおよびコンピューター可読媒体
上記システムは、現在の技術もしくはその構成要素のうちのいずれかにおいて記載されるように、コンピューターシステムの形態で具現化され得る。コンピューターシステムの代表例としては、汎用コンピューター、プログラムされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラー、周辺集積回路素子、および本技術の方法を構成する工程を実装し得る他のデバイスもしくはデバイスの配置が挙げられる。

コンピューターシステムは、コンピューター、入力デバイス、ディスプレイユニット、および／もしくはインターネットを含み得る。上記コンピューターは、マイクロプロセッサをさらに含み得る。上記マイクロプロセッサは、通信バスへと接続され得る。上記コンピューターはまた、メモリを含み得る。上記メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）およびリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含み得る。上記コンピューターシステムは、記憶デバイスをさらに含み得る。上記記憶デバイスは、ハードディスクドライブもしくはリムーバル記憶デバイス（例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、光学ディスクドライブなど）であり得る。上記記憶デバイスはまた、コンピュータープログラムもしくは他の指示を上記コンピューターシステムへとロードするための他の類似の手段であり得る。上記コンピューターシステムはまた、通信ユニットを含み得る。上記通信ユニットは、Ｉ／Ｏインターフェイスを通じて、上記コンピューターが他のデータベースおよびインターネットに接続することを可能にする。上記通信ユニットは、他のデータベースへの転送、ならびに他のデータベースからのデータの受領を可能にする。上記通信ユニットは、モデム、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）カード、もしくは上記コンピューターシステムをデータベースおよびネットワーク（例えば、ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮおよびインターネット）に接続することを可能にする任意の類似のデバイスを含み得る。上記コンピューターシステムは、従って、Ｉ／Ｏインターフェイスを介して上記システムへとアクセス可能な入力デバイスを通じてユーザーからの入力を容易にし得る。

コンピューティングデバイスは、代表的には、そのコンピューティングデバイスの一般管理およびオペレーションのための実行可能なプログラム指示を提供するオペレーティングシステムを含み、代表的には、サーバーのプロセッサによって実行される場合に、上記コンピューティングデバイスにその意図された機能を行わせる指示を記憶するコンピューター可読記憶媒体（例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリなど）を含む。上記オペレーティングシステムに適した実装および上記コンピューティングデバイスの一般的な機能性は、公知であるかもしくは市販されており、当業者によって、特に本明細書の開示に鑑みて、容易に実装される。

上記コンピューターシステムは、入力データを処理するために、１以上の記憶素子の中に記憶される一群の指示を実行する。上記記憶素子はまた、記載されるとおりのデータもしくは他の情報を保持し得る。上記記憶素子は、処理機械に存在する情報ソースもしくは物理的メモリ素子の形態にあり得る。

環境は、上記で考察されるとおりの種々のデータストアならびに他のメモリおよび記憶媒体を含み得る。これらは、種々の位置に存在し得る（例えば、上記コンピューターのうちの１以上にローカルな（および／もしくは中に存在する）、またはネットワーク全体にわたって記コンピューターのうちのいずれかもしくはすべてから遠隔にある記憶媒体において）。実施形態の特定の一群において、情報は、当業者が精通しているストレージエリアネットワーク（「ＳＡＮ」）に存在し得る。同様に、上記コンピューター、サーバー、もしくは他のネットワークデバイスに帰した機能を行うための任意の必須のファイルは、適切な場合、ローカルにおよび／もしくは遠隔に保存され得る。システムが、コンピューティングデバイスを含む場合、各々のこのようなデバイスは、バスを介して電気的に連結され得るハードウェア要素を含み得、上記要素は、例えば、少なくとも１つの中央処理装置（ＣＰＵ）、少なくとも１つの入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、コントローラー、タッチスクリーン、もしくはキーパッド）、および少なくとも１つの出力デバイス（例えば、ディスプレイデバイス、プリンター、もしくはスピーカー）を含む。このようなシステムはまた、１つ以上の記憶デバイス（例えば、ディスクドライブ、光学記憶デバイス、およびソリッドステート記憶デバイス（例えば、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）もしくはリードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」）、ならびにリムーバブルメディアデバイス、メモリカード、フラッシュカードなどを含み得る。

このようなデバイスはまた、コンピューター可読記憶媒体リーダー、通信デバイス（例えば、モデム、ネットワークカード（無線もしくは有線）、赤外線通信デバイスなど）、および上記のとおりのワーキングメモリを含み得る。上記コンピューター可読記憶媒体リーダーは、遠隔、ローカル、固定、および／もしくはリムーバブル記憶デバイスを代表するコンピューター可読記憶媒体、ならびにコンピューター可読情報を一時的におよび／もしくはより恒久的に含む、記憶する、伝達する、および検索するための記憶媒体と接続され得るかまたはこれらを受容するように構成され得る。上記システムおよび種々のデバイスはまた、代表的には、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラム（例えば、クライアントアプリケーションもしくはウェブブラウザ）を含む、少なくとも１つのワーキングメモリデバイス内に位置した多くのソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービス、もしくは他の要素を含む。代替の実施形態が、上記のものからの多くのバリエーションを有し得ることは認識されるべきである。例えば、カスタマイズされたハードウェアがまた使用され得る、および／または特定の要素が、ハードウェア、ソフトウェア（ポータブルソフトウェア（例えば、アプレット）を含む）、または両方において実装され得る。さらに、他のコンピューティングデバイス（例えば、ネットワーク入力／出力デバイス）への接続が使用され得る。

コード、もしくはコードの一部を含むための非一時的な記憶媒体およびコンピューター可読媒体としては、当該分野で公知であるかもしくは使用される任意の適切な媒体（記憶媒体および通信媒体（例えば、コンピューター可読の指示、データ構造、プログラムモジュール、もしくは他のデータなどの情報の記憶および／または伝達のための任意の方法または技術において実装される、揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブルの媒体が挙げられるが、これらに限定されない）を含む）が挙げられ得、これらとしては、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多目的ディスク（ＤＶＤ）もしくは他の光学記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶もしくは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報を記憶するために使用され得、上記システムデバイスによってアクセスされ得る任意の他の媒体が挙げられる。上記開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、上記種々の実施形態を実装するための他のやり方および／または方法を認識する。

コンピューター可読媒体は、プロセッサにコンピューター可読指示を提供することができる電子式、光学式、磁気、もしくは他の記憶デバイスを含み得るが、これらに限定されない。他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、連想メモリ（「ＣＡＭ」）、ＤＤＲ、フラッシュメモリ（例えば、ＮＡＮＤフラッシュもしくはＮＯＲフラッシュ、ＡＳＩＣ、構成されたプロセッサ、光学記憶媒体、磁気テープもしくは他の磁気記憶媒体、またはコンピュータープロセッサが指示を読み得る任意の他の媒体。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ））の単一タイプを含み得る。他の実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ディスクドライブ、およびキャッシュ）のうちの２またはそれより多くのタイプを含み得る。上記コンピューティングデバイスは、１またはそれより多くの外付けのコンピューター可読媒体（例えば、外付けハードディスクドライブ、または外付けＤＶＤもしくはブルーレイドライブ）と通信状態にあり得る。

上記で考察されるように、上記実施形態は、コンピューター実行可能なプログラム指示を実行および／またはメモリに記憶された情報にアクセスするように構成されているプロセッサを含む。上記指示は、任意の適切なコンピュータープログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、およびＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる）で書かれたコードから、コンパイラおよび／もしくはインタープリターによって生成されたプロセッサ特異的指示を含み得る。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、単一のプロセッサを含む。他の実施形態において、上記デバイスは、２またはそれより多くのプロセッサを含む。このようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および状態機械を含み得る。このようなプロセッサは、プログラマブル電子デバイス（例えば、ＰＬＣ）、プログラマブル割り込みコントローラー（ＰＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電子的にプログラム可能なリードオンリーメモリ（electronically programmable read-only memory）（ＥＰＲＯＭもしくはＥＥＰＲＯＭ）、または他の類似のデバイスをさらに含み得る。

上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスを含む。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、有線もしくは無線の通信リンクを介して通信するように構成されている。例えば、上記ネットワークインターフェイスは、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、ＩＥＥＥ ８０２．１１（Ｗｉ−Ｆｉ）、８０２．１６（Ｗｉ−Ｍａｘ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、赤外線などを介して、ネットワーク上での通信を可能にし得る。別の例として、ネットワークインターフェイスは、ネットワーク（例えば、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＵＭＴＳ、もしくは他の携帯通信ネットワーク（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ））上での通信を可能にし得る。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、別のデバイスでの、例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、１３９４ ＦｉｒｅＷｉｒｅ、シリアル接続もしくはパラレル接続、または類似のインターフェイスを介したポイントツーポイント接続を可能にし得る。適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、１以上のネットワーク上での通信のための２以上のネットワークインターフェイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスに加えてもしくはその代わりに、データストアを含み得る。

適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、多くの外付けもしくは内部デバイス（例えば、マウス、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、オーディースピーカー、１以上のマイクロフォン、または任意の他の入力もしくは出力デバイス）を含み得るかまたはこれらと通信状態にあり得る。例えば、上記コンピューティングデバイスは、種々のユーザーインターフェイスデバイスおよびディスプレイと通信状態にあり得る。上記ディスプレイは、任意の適切な技術（ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＣＲＴなどが挙げられるが、これらに限定されない）を使用し得る。

上記コンピューターシステムによる実行のための指示セットは、特定のタスク（例えば、本技術の方法を構成する工程）を行うための処理機械を指示する種々のコマンドを含み得る。上記指示セットは、ソフトウェアプログラムの形態にあり得る。さらには、上記ソフトウェアは、本技術におけるように、別個のプログラムの集まり、より大きなプログラムを有するプログラムモジュールもしくはプログラムモジュールの一部の形態にあり得る。上記ソフトウェアはまた、オブジェクト指向プログラミングの形態でのモジュラープログラミングを含み得る。処理機械による入力データの処理は、ユーザーコマンド、以前の処理の結果、もしくは別の処理機械によって作成されたリクエストに応じ得る。

本発明は、ある種の実施形態を参照して開示されてきた一方で、記載される実施形態に対する多くの改変、変化および変更は、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく可能である。よって、本発明は、上記記載される実施形態に限定されないことは意図されるが、以下の特許請求の範囲の文言およびその均等物によって定義される全範囲を有する。

以下の実施例に示される結果は、結果までの時間が短縮された、少数の細胞、さらに単一細菌の検出を実証する。
（実施例１）
培地でのサンプルのインキュベーション後にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージＮａｎｏＬｕｃインジケーターファージを使用する細菌検出

メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）のサンプルを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む１３５μｌのサンプルを富栄養培地に添加することによって、プライミングした。富栄養培地には、ＭＲＳＡの特異的な富化および誘導を可能にするための副阻害性（ｓｕｂ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）抗生物質（セフォキシチン）を含めた。サンプルを富栄養培地で１〜２時間インキュベートした。サンプルのプライミング後、培地に追加のセフォキシチンを加え、サンプルをさらに２時間インキュベートした。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージＮａｎｏＬｕｃインジケーターファージをサンプルに加え、２時間インキュベートした。溶解緩衝液およびＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）試薬を加えた。５分間のインキュベーション後、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６機器を使用して生物発光の測定を行った。シグナル／バックグラウンド比≧７５０ＲＬＵは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの陽性検出を示した。シグナル／バックグラウンド比＜７５０ＲＬＵは、サンプルがＳ．ａｕｒｅｕｓについて陰性であることを示した。

（実施例２）
培地でのサンプルのインキュベーション後にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）インジケーターファージを使用するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染の診断およびモニタリング

患者から臨床サンプルを取得する。臨床サンプルをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）インジケーターファージとともに２時間インキュベートする。インキュベーション後、溶解緩衝液およびＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）試薬を添加する。溶解緩衝液およびＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）試薬との５分間のインキュベーション後、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６機器を使用して生物発光を測定し、臨床サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの存在を決定する。シグナル／バックグラウンド比≧７５０ＲＬＵは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの陽性検出を示す。シグナル／バックグラウンド比＜７５０ＲＬＵは、サンプルがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓについて陰性であることを示す。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓについて陽性のサンプルを有する患者は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的な治療ファージで処置する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的な治療ファージで７２時間処置した後、患者から第２の臨床サンプルを取得する。次いで、臨床サンプルをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）インジケーターファージとともに２時間インキュベートする。インキュベーション後、溶解緩衝液およびＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）試薬を添加し、５分間インキュベートする。次に、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６機器を使用して生物発光を測定し、処置後の臨床サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの存在の変化をモニタリングする。シグナル／バックグラウンド比≧７５０ＲＬＵは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの陽性検出を示す。シグナル／バックグラウンド比＜７５０ＲＬＵは、サンプルがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓについて陰性であることを示す。サンプルがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓについて陽性である場合、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的な治療ファージでの処置を継続し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）インジケーターファージを使用して処置の有効性をモニタリングし続ける。

Claims (36)

1. バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、組換えバクテリオファージ。
2. Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的に感染する、請求項１に記載の組換えバクテリオファージ。
3. 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである、請求項２に記載の組換えバクテリオファージ。
4. 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓがメチシリン耐性である、請求項３に記載の組換えバクテリオファージ。
5. 前記インジケーター遺伝子がコドン最適化され、内因性シグナルを生成する可溶性タンパク質生成物または基質との反応の際にシグナルを生成する可溶性酵素をコードする、請求項１に記載の組換えバクテリオファージ。
6. 前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に非翻訳領域をさらに含み、前記非翻訳領域が、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む、請求項５に記載の組換えバクテリオファージ。
7. 少なくとも２つの異なるタイプの組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物であって、前記組換えバクテリオファージの少なくとも１つが、請求項１に記載のインジケーター遺伝子を含む、カクテル組成物。
8. 組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法であって、
   標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、
   インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程、
   前記相同組換えプラスミド／ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、
   形質転換された前記標的病原性細菌に、選択された前記野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、前記プラスミド／ベクターとバクテリオファージゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および
   組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程
   を含む、方法。
9. 相同組換えプラスミド／ベクターを調製する工程が、
   選択された前記バクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然のヌクレオチド配列を決定する工程、
   前記ゲノムを注釈し、選択された前記バクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を識別する工程、
   前記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する工程であって、前記配列がコドン最適化インジケーター遺伝子を含む工程、および
   相同組換えのために設計された前記配列をプラスミド／ベクターに組み込む工程
   を含む、請求項８に記載の方法。
10. 配列を設計する工程が、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を、前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に挿入することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記相同組換えプラスミドが、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に含む、請求項８に記載の方法。
12. 前記野生型バクテリオファージがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージであり、前記標的病原性細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである、請求項８に記載の方法。
13. 前記ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓがメチシリン耐性（ＭＲＳＡ）である、請求項１３に記載の方法。
15. 組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程が、前記インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを含む、請求項８に記載の方法。
16. サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを検出するための方法であって、
    前記サンプルを、バクテリオファージゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程、および
    前記組換えバクテリオファージによって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで前記インジケータータンパク質生成物の陽性検出はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが前記サンプルに存在することを示す工程
    を含む、方法。
17. 前記ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓがメチシリン耐性である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記サンプルが、食品サンプル、環境サンプル、水サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである、請求項１６に記載の方法。
20. 食品安全産業のための標準サイズのサンプル中の１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個程度の少なさの細菌を検出する、請求項１６に記載の方法。
21. 前記食品サンプルが、食肉、魚、野菜、卵、または乳児用調製粉乳を含む、請求項１９に記載の方法。
22. 前記サンプルが、少なくとも２つの異なるタイプの組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物とともにインキュベートされ、前記組換えバクテリオファージの少なくとも１つが、請求項１６に記載のインジケーター遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。
23. 前記サンプルが、９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、または２時間もしくはそれ未満の富化時間の間、成長を有利にする条件で最初にインキュベートされる、請求項１６に記載の方法。
24. 結果までの合計時間が、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、または６時間未満である、請求項１６に記載の方法。
25. 前記インジケーターを検出する工程によって生成されるシグナル対バックグラウンドの比が、少なくとも２．０または少なくとも２．５である、請求項１６に記載の方法。
26. Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを検出するためのキット。
27. 前記ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓであり、前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージである、請求項２６に記載のキット。
28. 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓがメチシリン耐性であり、前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージがメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージである、請求項２７に記載のキット。
29. 前記組換えバクテリオファージによって発現される可溶性タンパク質生成物を検出するための、インジケーターと反応させるための基質をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
30. Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的バクテリオファージに由来する組換えバクテリオファージを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓを検出するためのシステム。
31. 前記ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである、請求項３０に記載のシステム。
32. 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓがメチシリン耐性である、請求項３１に記載のシステム。
33. 対象のための処置を選択するための方法であって、
    （ｉ）前記対象から生物学的サンプルを取得する工程、
    （ｉｉ）インジケーターファージを使用して、前記生物学的サンプル中の特定の微生物または微生物のカテゴリーを検出する工程、および
    （ｉｉｉ）前記生物学的サンプルにおいて検出された特定の微生物のアイデンティティに基づいて処置を選択する工程
    を含む、方法。
34. 前記インジケーターファージが合成により調製されたファージである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記インジケーターファージが、遺伝子改変された、天然に存在するファージである、請求項３３に記載の方法。
36. 病原性の医学的状態を有する対象に対する処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
    （ｉ）前記対象から生物学的サンプルを取得する工程、
    （ｉｉ）インジケーターファージを使用して、前記生物学的サンプル中の特定の微生物または微生物のカテゴリーを検出する工程、
    （ｉｉｉ）前記対象のための処置を開始する工程、
    （ｉｖ）前記対象から第１の生物学的サンプルと同じタイプの第２の生物学的サンプルを取得する工程、
    （ｖ）前記インジケーターファージを使用して、前記第２の生物学的サンプル中の前記特定の微生物または微生物のカテゴリーを検出する工程、ならびに
    （ｖｉ）前記第１および第２の生物学的サンプルにおいて検出された量に基づいて、前記対象における前記特定の微生物または微生物のカテゴリーの減少、増加、または定常レベルを決定する工程
    を含む、方法。

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